ORIGINS-Project Laboratory Manuals. free educational use as long as unmodified. version_fi. (c) the ORIGINS team

HTML
DOWNLOAD

Koko: px

Aloita esitys sivulta:

Download "ORIGINS-Project Laboratory Manuals. free educational use as long as unmodified. version_fi. (c) the ORIGINS team"

Leena Nurminen
9 vuotta sitten
Katselukertoja:

1 ORIGINS-Project Laboratory Manuals free educational use as long as unmodified version_fi (c) the ORIGINS team

2 Säädettävien pipettien käyttö Pipetointivälineistöön kuuluu 4 säädettävää pipettiä, jotka on helppo tunnistaa värien avulla. Myös pipettien kärjet ovat värikoodattuja. Pidä pipetin kärki aina alaspäin. Pidä pipetistä kiinni kuvan osoittamalla tavalla. Pipetin kärkeä vaihdettaessa, nosta aina kärkilaatikon kantta itseesi päin minimoidaksesi kärkien kontaminaation. Älä paina liikaa uutta kärkeä asentaessasi. Huomioi pipetin min- ja maxtilavuus.ylempi luku ilmoittaa minimi- alempi maksimitilavuuden. Alarajalla valitse pienempi pipetti. Säädä tilavuus mustasta pyörästä. Huomaa, että keltaisia pipettejä on kaksi. Pipetti täytetään painamalla männästä ensimmäiseen pysäytyskohtaan asti. Kärki painetaan liuokseen ja mäntä vapautetaan. Haluttu määrä nestettä siirtyy pipettiin. Peukalon asento, kun pipetti on täynnä. Vältä kärjen laskemista liuokseen, kun tyhjennät pipetin. Ensimmäisen pysähdyksen kohdalla pipetti tyhjenee lähes täysin. Painettaessa mäntä pohjaan kaikki neste poistuu. Männästä painetaan toistamiseen alle 20!l:n tilavuuksilla adheesionesteen vuoksi

3 eristä genominen DNA Valmista 3 ml H2O tai 0,9% NaCl-liuos limakalvon solujen keräämistä varten. Pureskele poskien sisäpintoja ja purskuta liuosta suussasi ja sylkäise se takaisin putkiloon. Saadaksesi homogeenisen liuoksen sekoita solususpensiota 30 sekuntia vortexilla. Siirrä 1 ml liuosta Epiputkeen DNA:n eristämistä varten. Sentrifugoi 30 sekuntia ja dekantoi supernatantti ja lisää 30!l dd H2O Lisää Chelex(R)- beadsit poistaaksesi DNAasia aktivoivat metalli-ionit. Lisää 100!l Chelex(R) ja suspensoi pelletti uudelleen vortexilla. Solut hajotetaan lämpöshokilla kuumentamalla 10 minuuttia 99 C vesihauteessa tai metalliblokissa.. Sediment Chelex beads by short spinning for 30 sec Never miss balancing the rotor by using exact counterweight Poista supernatantti huolellisesti. Älä kanna Chelex beadseja. DNA on supernatantissa. Syväjäädytyssäilytystä varten siirrä Epiputkeen, tai käytä heti esimerkiksi templaattina PCRreaktiossa. Ota 2,5!l DNA + 22,5!l PCR-Mix tai H2O, jos käytät Amersham PCR-Beads

4 Agaroosigeelin valaminen Puskuriliuos (50x) Agarose, vaaka, alumiinifolio, keitinlasi 10ml / 400ml, 250ml:n mittalasi, 1ml:n säädettävä pipetti Käytettäessä 50X liuosta 300 ml:n elektroforeesipuskurin valmistukseen, säädä pipetti 3 ml:aan ja Siirrä 6 ml pipetoimalla kaksi kertaa 250 ml:n mittalasiin Lisää dd H2O 150ml:aan asti, siirrä keitinlasiin (400ml) ja lisää vielä 150ml, jolloin lasissa yhteensä 300ml Käytä alumiinifoliota apuna agarin punnituksessa. Tehtäessä 1% geeliä käytä 400 mg agaria. Muuten ohjeen mukaan Älä koskaan laita ylimääräistä agaria takaisin purkkiin. Käytä Erlenmeyerpulloa (100 ml) säilöäksesi 40 ml elektroforeesipuskuria. Lisää agarjauhe puskuriin. Älä sekoita! Merkitse nesteen pinnan taso tai punnitse vaa alla. Peitä pullo ylössuin asetetulla lasilla vähentääksesi haihtumista. Kuumenna mikrossa 400 watin teholla 3 minuuttia. Jotta geelistä saa täysin läpinäkyvää toimenpide voidaan toistaa. Tarkista tilavuus tai paino ja korvaa haihtunut neste. Kun liuos on jäähtynyt 50 C:een geeli voidaan valaa.

5 Amersham beads PCR Polymerase-Chain-Reaction Menetelmä 1 Vaihtoehto 2 Erä 1A Erä 2A 0,2 ml putket kansikuumentavalla PCR-laitteella Käytetään Amersham-Beads puskuri/polymeraasilla 2,5!l templaattia 1!l aluke eteenpäin 1!l aluke taaksepäin 20!l dd H2O = 2x Erä 1A Pidä putkia jäissä, Kunnes PCR alkaa. Menetelmä 2 0,5 ml putket Ei-kansikuumentava PCR-laite Vaihtoehto B Klassinen menetelmä Kaikki reagenssit lisätään erikseen Erä1B 2,5!l templaattia 4!l dntp-mix 13!l dd H2O 1!l Taq-polymeraasia 1!l aluke eteenpäin 1!l aluke taaksepäin Erä 2B = 2x erä1b Pidä putkia jäissä, kunnes PCR alkaa vaihtoehtoinen: Lisää puskuriksi Kresolrot 6M Glc:ssa Ohjelmoi PCR-laite ohjeen mukaan. 95 C 60s aluksi Kierrokset 1-35 XX C 30s pariutuminen 72 C 90s polymerisaatio 95 C 30s denaturaatio XX C 30s pariutuminen 72 C 3m polymerisaatio 95 C 5m lopuksi 4 C säilytys XX= alukkeen mukaan

6 DNA - Katkaisu Pipetti (20:200), kärki (keltainen) Eppendorf-putkia teline jäärasia ajastin Merkitse putket kaksoiskäsittelylle: E1, E2, E12, C, H20, Puskuri tai kertakäsittely: H2O, B(uskuri), E(ntsyymi) Ja negatiivinen C(ontrolli) Valmista H20 Eppendorf-putkessa katkaisureaktiota varten. Entsyymit jäissä valmiina toimintaan! Laita reaktioputket telineeseen, tarkkaile näytteitä, älä sekoita niitä! Säädä pipetti oikeaan tilavuuteen ja käytä sopivaa kärkeä (värikoodi). Tarkista pipetointilista ennen pipetointia. Käytä aina uutta kärkeä! Noudata Kuinka pipetoin onnistuneesti -ohjetta. Koske Epi-putkia vain kannen reunoista, jottei sisältö lämpene. ÄLÄ TEE kuten kuvassa! Pipetointi kanteen on hyväksytty toimenpide. Kerää pipetoidut nesteet Sentrifugoimalla lyhyesti. ÄLÄ UNOHDA tasapainottaa fuugia. Säädä inkubaattori 37 C ennen toimenpidettä. Inkuboi 30 min ja säilytä jäissä tai jäädytä -20 C pitempiaikaista säilytystä varten.

7 Agaroosigeelielektroforeesi Poista geelitarjotin ja laita se takaisin siten, että kampa on mustalla merkittyä negatiivista elektrodia kohden. Lisää elektroforeesipuskuria kammioon. Yleensä n. 260 ml riittää. Tarkista puskurin taso. Sen pitäisi olla n. 5 mm geelin pinnan yläpuolella. Kampa poistetaan varovaisesti vasta puskurin lisäämisen jälkeen. Käytä keltaisella merkittyä pipettiä (20 200) ja säädä se 30!l:aan näytteitä varten ja ohjeen mukaan markkerille. Pipetoi ohjeiden mukaan. Käytä aina uutta kärkeä jokaiselle näytteelle. Vältä reunakaistoja aina kun se on mahdollista. Aloita markkerilla toiselta kaistalta. Käytä keskikaistaa täydellä geelillä. Nyt lisää näytteet markkerin yläpuolisiin kaivoihin. Huom! Älä puhkaise kaivon pohjaa. Laita kammion kansi tiukasti kiinni ja pistä johdot kiinni voimalähteeseen. Huolehdi, että oikean väriset johdot menevät oikeaan paikkaan. Säädä jännitteeksi 120V. Käynnistä elektroforeesi virtakytkimestä. Katso, että kammiosta nousee kuplia ja että värit liikkuvat oikeaan suuntaan. Riippuen käytetystä värjäysmenetelmästä, näet erivärisiä nauhoja. Elektroforeesi kestää yleensä n. 30 min.

Samankaltaiset tiedostot

LABORATORIOTYÖ: AGAROOSIGEELIELEKTROFOREESI

LABORATORIOTYÖ: AGAROOSIGEELIELEKTROFOREESI Agaroosigeelielektroforeesi (AGE) on yksinkertainen ja tehokas menetelmä erikokoisten DNAjaksojen erottamiseen, tunnistamiseen ja puhdistamiseen. Eri valmistajien