MALDI-TOF MS menetelmä Uuden laitteen myötä tarkka bakteeridiagnoosi nopeasti Erikoistutkija Tarttuvien tautien erikoiseläinlääkäri Eläintautibakteriologian tutkimusyksikkö Helsingin laboratoriojaosto Evira
Esityksen sisältö MALDI-TOF MS -laitteen toimintaperiaate ja käyttö Laitteen toimintaperiaate Bakteerin tunnistus käytännössä Menetelmän edut Menetelmän rajoitukset ja kriittiset tekijät Eviran kokemuksia menetelmän käytöstä kalatautibakteereiden tunnistuksessa Hyvin tunnistuvat kalabakteerit Huonommin tunnistuvat kalabakteerit
MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry l. Matriisiavusteinen laserdesorptio/ionisaatio-lentoaika massaspektrometria
Laitteen toimintaperiaate Mittaa bakteerin hyvin konservoitunutta ja runsasta pääasiassa ribosomaalista proteiinia (proteomia) Analysoi minkä painoisia (=massa) proteiinimolekyylejä ja kuinka paljon niitä bakteerissa on (=intensiteetti) massavälillä 2000-20000 Da (~m/z)
Laitteen toimintaperiaate 1. Laite laskee eripainoisten proteiinimolekyylien määristä > massaspektrin ( sormenjälki ) 2. Laite vertaa saatua kannan massaspektriä laitteen kirjastossa (tietokannassa) oleviin bakteerikantojen spektreihin 3. Laite listaa 10 parasta tunnistusosumaa tulosarvoilla l. scoreilla 0 3.0
Tulosarvojen (0 3.0) luotettavuus Tulosarvo 2.300-3.000: hyvin todennäköinen lajitunnistus Tulosarvo 2.000-2.299: varma sukutunnistus, todennäköinen lajitunnistus Tulosarvo 1.700-1.999: todennäköinen sukutunnistus Tulosarvo 0-1.699: epäluotettava tunnistus (not reliable id) No peaks 0 (ei spektriä, näytteessä vika, yl. liian paksu levitys näytepaikkaan tai joku muu virhe)
Bakteerikannan tunnistus käytännössä Näytteen käsittely: 1. Bakteerimassaa pesäkkeestä sellaisenaan levitetään näytelevylle ja päälle lisätään matriisia (apuainetta) Matriisi: kyllästetty alfa-syano-4-hydroksikanelihappo Tai (harvemmin): 2. Pikauutto: näytelevylle levitetyn bakteerimassan päälle pipetoidaan 70% muurahaishappoa ja päälle lisätään matriisia 3. Uutto: bakteerimassasta erotetaan proteiini uuttamalla, uutetta pipetoidaan näytelevylle ja päälle lisätään matriisia
Tunnistus suoraan bakteeripesäkkeestä Hammastikulla otetaan bakteerimassaa pesäkkeestä (+ tätä ennen viljellään puhdasviljelmä samasta pesäkkeestä)
Näyte levitetään näytelevylle Näyte levitetään teräksisen 96-paikkaisen näytelevyn 2 näytepaikkaan (spottiin)
Matriisin lisäys Näytteen päälle lisätään 1 ul matriisia
Näytelevy viedään laitteen sisään
http://www.mayomedicallaboratories.com/images/articles/communique/2013/01-maldi-tof-massspectrometry/maldi-tof.jpg :
Ajon kulku Ajo seurattavissa näytöllä on-line: laite laskee näytteen molekyylien lentoajoista ja määristä summaspektrin ja hakee ja listaa osumat
Massaspektri (x = massa, y= intensiteetti)
Neljän eri bakteerilajin spektrit suurennos massavälillä 7400 8100 Da (m/z)
Yhden näytteen tulos (Hafnia alvei)
Menetelmän edut Nopeus ja suuri kapasiteetti Tunnistus onnistuu yleensä suoraan yhdestä primaari l. ensiviljelmän bakteeripesäkkeestä eikä muita tunnistustestejä tarvita Yhden kannan näytelevylle laitto, kirjaus laitteen ohjelmaan ja ajo (yleensä kaksi näytepaikkaa/kanta) kestää muutamia minuutteja Kapasiteetti jopa n. 500 kantaa/työpäivä Yksinkertainen suorittaa Yl. riittää suora bakteerimassan levitys hammastikulla näytelevylle Pikauutto näytelevyllä helppo ja nopea, uutto n. 15 min
Menetelmän edut Kirjastoa voi itse täydentää (Brukerin laite) Edullisuus Yhden näytteen (2 näytepaikkaa) ajon kuluttamat tarvikkeet ja reagessit 80 snt, uutto n. 15 snt / näyte Laite n 180 000 + huoltosopimus Vähentää jatkoviljelmiä, niistä tehtäviä muita tunnistustestejä, elatusaineita ja työtä Huolto Melko toimintavarma Muutama huolto-säätötoimenpide mahdollista tehdä itse Etähuolto toiminut hyvin
Rajoitukset ja kriittiset tekijät Tunnistaa vain kirjastossa olevia bakteerikantoja Laitevalmistajan kirjastossa nyt n. 2200 eri lajia, 5627 eri kantaa (päivityksiä tulee ajoittain) Jos kirjastossa on vain yksi ko. lajin kanta edustettuna > tunnistusvarmuus heikompi kuin jos kirjastossa on useita eri kantoja ko. lajia (kantavaihtelu lajin sisällä) Tunnistusvarmuus yleensä paranee, kun viety itse eristetty paikallinen kanta kirjastoon Kirjastoon saa viedä vain luotettavasti varmennettuja kantoja (ATCC, DSM, NCTC, sekvensoidut, PCRtunnistetut ) 18.6.2014 TUVI kokous
Rajoitukset ja kriittiset tekijät Tiettyjen bakteerisukujen lajien spektrit hyvin lähellä toisiaan > lajitunnistus epävarma, menevät sekaisin Alalajien erottaminen ei yleensä onnistu > tarvitaan muita lisätestejä erottamiseen On hyvä edelleen tuntea eri bakteerisukujen ja lajien pesäkkeiden ulkonäköä, jotta voi kriittisesti arvioida hyvänkin osuman ja tulosarvon luotettavuutta Jotkut toistensa lähellä olevat suvut ja lajit voivat tunnistua ristiin ja joskus harvoin saadaan myös täysin virheellisiä hyviä tuloksia 18.6.2014 TUVI kokous
Rajoitukset ja kriittiset tekijät Näytteen pitää olla ehdottomasti puhdas ja (yleensä) tuore bakteerimassa - kanta tai miel. 1 pesäke Sopivanpaksuisen bakteerimassan levitys näytelevylle kriittinen tekijä! erilaiset pesäkekonsistenssit kädenjälki vaikuttaa
MALDI-TOF MS -kokemuksia kalabakteereiden tunnistuksessa
Laite ollut käytössä Evirassa tammikuusta 2014 alkaen (Bruker Biotyper MALDI-TOF MS laite) Tutkittu mm. Eviran kantakokoelmaan pakastettuja bakteerikantoja, ml. kalabakteerikantoja (tyyppikantoja ja omia eristyksiä) sekä 2014 alusta alkaen on-line näytteeksi tulleista eläimistä ml. kaloista eristettyjä bakteerikantoja Laitteen omassa kirjastossa on valmiiksi monia kaloille tauteja aiheuttavia bakteerilajeja: Yersinia ruckeri, Hafnia alvei, Vibrio anguillarum, monia muita vibriolajeja, ASS, Carnobacterium maltaromaticum (ent. piscicola), Iodobacterium fluviatilis, Edwardsiella tarda, Aeromonas hydrophila, A, caviae, A. sobria, Shewanella, Plesiomonas ym.
Laitteen omasta kirjastosta puuttuu kaloille tauteja aiheuttavia tärkeitä bakteerilajeja: Renibacterium salmoninarum, Flavobacterium psychrophilum, F. columnare ja Pseudomonas anguilliseptica > Olemme lisänneet kirjastoon itse em.: - Renibacterium salmoninarum - Flavobacterium psycrophilum - Flavobacterium columnare - Pseudomonas anguilliseptica (sekvensoitu itse eristetty kanta)
Kalabakteereiden spektrejä Renibacterium salmoninarum, Yersinia ruckeri, Flavobacterium psychrophilum, Pseudomonas anguilliseptica, Edwardsiella tarda
Kalabakteerit ovat yl. hidaskasvuisia kasvua kasvualustalle ilmaantuu 2-7 päivässä, renibakteerin kasvu jopa 6(-12) viikkoa >Perinteisiä biokemiallisia tunnistustestejä käytettäessä tarvittavan puhtaan ja riittävän bakteerimassan kasvatus jatkoviljelmässä vie aikaa > bakteriologinen tutkimustulos valmistuu n. 1-2 vk:ssa (flavot ja varsinkin renibakteeri pidempään) > Maldi-tof -tunnistus nopeuttaa huomattavasti tutkimusta, kun voidaan useimmiten tehdä jo ensiviljelmän yksittäisestä pesäkkeestä
Maldi-tofilla hyvin tunnistuvia kalabakteerilajeja Renibacterium salmoninarum tunnistuu erittäin hyvin ( score 2,25) ilman uuttoa primaariviljelmästä, heti kun kasvua (10 pv us. vk), mutta myös jopa 3-4 viikon ikäisestä kasvusta Flavobacterium psychrophilum tunnistuu hyvin ( 2.0) suoraan 3-7 pv ikäisen primaariviljemän pesäkkeestä kannattaisi viedä kirjastoon paikallinen kanta > tunnistusvarmuus/tulosarvo paranisi Flavobacterium columnare? Tunnistuu todennäköisesti hyvin (SVA) vähän testattu Evirassa Agariin tarttuva hankala pesäke, vaikea saada sopivaa tasaista massaa näytelevylle edes uuttamalla
Hyvin tunnistuvia kalabakteerilajeja Yersinia ruckeri (enterobakteeri) Tunnistuu erittäin hyvin suoraan ( 2,3) (1-)2 pv ikäisen primaari(ensi)viljelmän pesäkkeestä Ei erota biotyyppejä 1 ja 2 > lisäksi liikkuvuus, SW-malja (Tween 80 hydrolyysi) > biotyyppi (+ 2 pv) - Hafnia alvei (enterobakteeri) Tunnistuu erittäin hyvin suoraan pesäkkeestä ( 2,3) (1-)2 pv ikäisen primaariviljelmästä (Y. ruckerin diffinä tärkeä erottaa) Edwardsiella tarda (enterobakteeri) Tunnistuu erittäin hyvin ( 2.3) suoraan (1-)2 pv ikäisen primaariviljelmän pesäkkeestä
Hyvin tunnistuvia kalabakteerilajeja Vibrio anguillarum Tunnistuu hyvin ( 2,3) suoraan (1-)2 pv ikäisen primaariviljelmän pesäkkeestä. Pieni varaus vielä muiden vibrioiden suhteen (sekoittuvatko lajit), vähän ehditty vertailla Evirassa. (Kaikki tutkitut V.a tulleet V.a toistaiseksi) Pseudomonas anguilliseptica tunnistuu erittäin hyvin suoraan ( 2,3), 3-7 päivän ikäisen primaariviljelmän pesäkkeestä suht. hidaskasvuinen ja biokemiallisesti reagoi huonosti > vaikea tunnistaa biokem. testeillä
Ongelmalliset Aeromonas salmonicida ssp salmonicida ASS ASA (epätyypillinen AS) puuttuu kirjastosta A. salmonicidat sekoittuvat keskenään ja ainakin Aeromonas bestiarumin kanssa (spektrit hyvin lähellä toisiaan) Aeromonas hydrophila, sobria, caviae Sekoittuvat ja joskus jopa A. salmonicidan kanssa (kanta antanut joskus hyvän tulosarvon A. salmonicida!) Pesäkkeet kuitenkin tunnistettavan erilaisia! > Aeromonakset tunnistuvat hyvin sukutasolle, ehkä lajitasolle osittain. Ei alalajitasolle.
Kalabakteerit, joita testattu vähän Muut vibriot kuin anguillarum? vähän testattu Evirassa Iodobacterium sp. (lahnoilla ym.) laitteen kirjastossa yksi kanta: I. fluviatilis? Vähän kantoja testattu: Eviran eristykset I. fluviatilis > 1.7 (=sukutasolle) Carnobacterium maltaromaticum (ent. piscicola) Laitteen kirjastossa yksi kanta? Kokeiltu vähän Evirassa (vähän kantoja kokoelmassa), saattaa mennä sekaisin Lactobacillus-suvun lajien kanssa
>> Kannoille, jotka eivät tunnistu luotettavasti, on tehtävä edelleen perinteisiä biokemiallisia ja molekyylibiologisia tunnistustestejä (PCR).
YHTEENVETO MALDI-TOF MS on mullistavan nopea, helppo, halpa ja luotettava useimpien (kala)bakteerilajien tunnistusmenetelmä (kunhan muistaa menetelmän rajoitukset!)
KIITOS!