NUORET TUTKIJAT 2014 Tommi Alanko Siina Alaranta Mari Alatalo Petri Antikainen Simon Christ Vesa Havurinne Jenna Jacobino Laura Kalliomäki Krista Korpi Csilla Kurdi Juha Kurkela Teemu Kustila Tiina Lehtiniemi Johanna Lilja Henri Malmi Niko Markkinen Tero Matikka Jesse Mattsson Sami Nylund Markus Palonen Mira Prinz Mihail Ruotsi Eetu Suominen Terhi Tallgren Pauli Tikka Jenna Tikkanen Natalia Tong Ochoa Pasi Tuomikoski Sanni Uotila Eerika Vuorinen Nuorten tutkijoiden työt ovat esillä myös tapahtuman verkkosivuilla: www.utu.fi/fi/yksikot/sci/yksikot/biokemia/opiskelu/nt
«1» RNA:n sokeriosien rakenteen vaikutus RNA-polymeraasin toimintaan Henri Malmi Ohjaajat: FT Anssi Malinen, dos. Georgiy Belogurov BIOKEMIA Transkriptiossa on kolme vaihetta: initiaatiossa RNA-polymeraasi (RNAP) sitoutuu DNA:han aloittaen transkription, elongaatiossa tuotetaan RNAtranskripti ja terminaatiossa transkriptio lopetetaan. Tutkimuksessa selvitettiin, voiko sokeriosien vaihtamisella, esimerkiksi DNA:han, vaikuttaa elongaatioon tai RNAP:n pilkkomisaktiivisuuteen spesifisellä rakenteesta kertovalla tavalla. Transkription elongaatiokompleksilla (TEC) tunnetaan kolme tilaa: Posttranslokaatiotilassa transkriptin 3 -pää on RNAP:n aktiivisen keskuksen ns. i- kohdassa ja nukleotidi emäspariutuu templaatti-dna:han viereiseen i+1- kohtaan. Nukleotidin liittänyt RNAP on pre-translokaatiotilassa ja uusi 3 -pää liikkuu translokaatiossa i-kohtaan. RNAP poistaa transkriptin virheitä katkomalla sitä i- ja i+1-kohtien välistä, mitä edistää Gre-faktorit. TEC voi peruutustilassa poistaa monta, yleensä kaksi, nukleotidia kerralla ja pretranslokaatiotilassa yhden. Tutkimuksen TEC:ssa transkriptin ja tdna:n komplementaarisuus oli nukleotidin liittämisessä 9bp ja pilkkomisessa 11bp, joista hybridiä oli 9bp. Nukleotidin liittämisen ja RNA:n pilkkomisen nopeudet mitattiin eripituisten RNA:iden osuuksista ja translokaatio fluoresenssileimalla. Käytetyissä transkripteissa oli osa RNA:sta korvattu DNA:lla, LNA:lla (Locked Nucleic Acid) tai 2 -O-metyyliryhmän sisältävillä nukleotideilla. GreA-faktorin edistämässä pilkkomisessa LNA:n tai 2 -O-Me-ryhmän sisältävät nukleotidit liikkuivat huonosti i-kohtaan. Rajoitetun liikkeen takia 3 - pään LNA pilkkoutui hyvin nopeasti, mutta kolme nukleotidia LNA:ta 3 -pään ribonukleotidin jälkeen esti pilkkomisen. Yksittäiset deoksiribonukleotidit heikensivät pilkkomista ympäriltään ja DNA-alue pysäytti pilkkomisen. RNAP:sta löytyi myös transkriptia oikeassa asennossa pitävä, nukleotidin liittämistä edistävä kohta. DNA-alueen vaikutusta tutkittiin transkripteilla, joissa RNA:n määrää kasvatettiin 3 -päästä alkaen. Nukleotidin liittäminen nopeutui asteittain, mutta normalisoitui vasta kahdeksannella ribonukleotidilla. Oletettavasti dsdna-alue on pidemmässä B-konformaatiossa ja työntää 3 - pään A- ja B-konformaation välimuodossa olevaa DNA-RNA-hybridiä hieman i+1-kohdan puolelle. Tulokset osoittavat deoksiribonukleotidien hidastavan transkriptiota vielä kaukana aktiivisesta keskuksesta. Täten RNAP:n sopimattomuus DNA-polymeraasiksi ei johdu vain NTP:n ja dntp:n eroista. Asiasanat: GreA, Escherichia coli, LNA, RNA-polymeraasi, translokaatio.
«2» FNR-like proteiinin tehtävät lituruohon kloroplastissa Markus Palonen Ohjaajat: FT Paula Mulo, FM Minna Koskela BIOKEMIA Kasvit kykenevät muuttamaan auringonvalon energian kemialliseksi energiaksi solujen käyttöön fotosynteesi- eli yhteyttämisreaktioiden avulla. Fotosynteesi tapahtuu kasvisolussa sijaitsevissa kloroplasteissa eli viherhiukkasissa. Viherhiukkasien sisällä olevalla tylakoidikalvostolla tapahtuvat fotosynteesin valoreaktiot. Fotosynteesin viimeisessä vaiheessa ferredoksiini:nadp(h) oksidoreduktaasi (FNR) siirtää valoreaktioissa vapautuneet elektronit ferredoksiinilta NADP + -molekyylille pelkistäen sen NADPH-molekyyliksi. Lituruohon kloroplastissa ilmentyvän toiminnaltaan tuntemattoman oksidoreduktaasin on huomattu muistuttavan FNR-proteiinia. FNR-like:ksi nimetyn proteiinin on ennustettu muistuttavan rakenteeltaan FNR:ää ja pystyvän FNR:n tavoin sitomaan sekä FAD- että NADP + -molekyylejä. Koska FNR-like proteiini muistuttaa FNR-proteiinia, joka on fotosynteesille välttämätön, tutkimuksen alkuvaiheessa keskityttiin selvittämään FNR-like proteiinin puuttumisen vaikutusta poistogeenisten fnr-like -mutanttikasvien fotosynteettiseen koneistoon. Tutkimuksessa käytettiin kahta erilaista mutanttia, joista FNR-like proteiinia koodaava tuman geeni oli inaktivoitu T- DNA insertion avulla sekä yhtä mutanttilinjaa, jossa FNR-liken tuotanto oli yliekspressoitu. Muutoksia mutanttikasvien kasvussa ja kehityksessä tarkasteltiin mittaamalla rosettien tuore- ja kuivapainot ja mittaamalla lehtien klorofyllipitoisuus. Muutoksia fotosynteesiin, Calvin-kiertoon ja muihin kloroplastissa tapahtuviin prosesseihin liittyvien proteiinien ilmentymisessä tutkittiin Western blot menetelmällä ja fotosynteettisten proteiinikompleksien muodostumista ja määriä tutkittiin lpbn (large pore Blue Native) geelillä. Tutkimuksessa havaittiin, että FNR-like geenin keskeyttäminen johtaa kasvin hitaampaan kasvuun ja klorofyllipitoisuuden pienenemiseen, kun taas yliekspressiossa ei nähty mainittavaa eroa. Fotosynteesin valoreaktioihin liittyvien proteiinikompleksien (valoreaktio I ja II, sytokromi b 6 f-kompleksi) määrä ja koostumus pysyivät samana kaikissa kasvilinjoissa, eikä muutoksia fotosynteesiin liittyvien proteiinien ilmentymisessä havaittu. Sen sijaan Calvinkiertoon osallistuvan Rubisco-aktivaasi-entsyymin kertyminen oli häiriintynyt yliekspressiokasveissa, minkä takia mutanttien kykyä sitoa hiilidioksidia tullaan jatkossa tutkimaan tarkemmin. Asiasanat: Arabidopsis thaliana, FNR-like, kloroplasti, fotosynteesi
«3» Sisäilman toksisuuden arvioinnissa käytettävän E.coli-lux - menetelmän kehittäminen Eetu Suominen Ohjaajat: FM Janne Atosuo, dos. Esa-Matti Lilius BIOKEMIA Kosteus- ja homevaurioista aiheutuvat taloudelliset ja terveydelliset haitat ovat merkittäviä niin Suomessa kuin muuallakin maailmassa. Tämän erikoistyön tarkoituksena oli testata ja kehittää rekombinanttien Escherichia coli bakteerien käyttöön perustuvaa, ja mahdollisesti kenttäkäyttöön soveltuvaa sisäilman toksisuusanalyysiä. E.coli-lux - bakteereihin on siirretty Photorhabdus luminescensin bakteerilusiferaasigeeni konstitutiivisen promoottorin alle. Bakteerilusiferaasin katalysoimassa reaktiossa syntyy bioluminesenssisignaalia, jonka suuruus on suoraan verrannollinen elossa olevien solujen määrään. Erikoistyön hypoteesina oli, että kosteus- ja homevaurioista kärsivien rakennusten sisäilman pöly on homeista tai muista lähteistä peräisin olevien yhdisteiden johdosta toksisempaa kuin vauriottomien rakennusten pöly. E.colilux soluja altistettiin pyyhintäpölynäytteistä tehdyille rinnakkaisille vesi- ja dimetyylisuloksidi (DMSO) - uutoksille pitoisuuksissa 2500 µg/ml 4 µg/ml, minkä jälkeen näytteistä mitattiin luminometrisesti bioluminesenssisignaalin mahdollista alenemista. Tästä alenemasta laskettiin kullekin näytteelle mahdolliset EC 50 -arvot kahden tunnin kohdalta. Kyseisiä arvoja verrattiin keskenään, samoin vertailtiin rinnakkaisten vesi- ja DMSO-uutosten antamia tuloksia. Tuloksista määritettiin raja-arvot, jotka erottavat bakteerisoluille toksisen ja ei toksisen uutoksen toisistaan. Tutkimuksessa havaittiin, että pölyuutosten pitoisuudet 250-50 µg/ml riittävät käytetyssä solupitoisuudessa erottamaan toksiset näytteet ei toksisista. Tutkittujen, 200 näytteen perusteella, toksisuuden raja-arvoksi asetettiin EC 50 = 100 µg/ml. Vesi- ja DMSO-uutosten tulokset korreloivat keskenään 84 % tarkkuudella, mikä tarkoittaa, että jatkossa jompikumpi uutoksista on mahdollista jättää tutkimuksesta pois. Näytteenottomenetelmää on tarkoitus kehittää niin, että jatkossa käytettäisiin suoraan hengitysilmasta suodattamalla saatuja pölynäytteitä. Toksisuusmittausten tuloksia tullaan myös vertaamaan näytteenottopaikoista saatuihin terveyskyselyihin. Asiasanat: kosteusvauriot, bioluminesenssi, E.coli-lux, EC 50
«4» The interaction of FYCO1 with TIP49a and TIP49b in male germ cells Tiina Lehtiniemi Supervisors: M.Sc. Matteo Da Ros, assistant professor Noora Kotaja BIOCHEMISTRY Male germ cells have an exceptionally diverse transcriptome. During the time of highest transcriptional activity in haploid round spermatids, a cytoplasmic ribonucleoprotein structure called the Chromatoid Body (CB) appears. The CB forms a dynamically moving structure that closely interacts with membraneous structures and participates in the regulation of RNAs in haploid male germ cells. Our group has previously set up a novel isolation method which enabled the identification of the CB proteins by mass spectrometric analysis. FYCO1, known to have a role in autophagocytosis and microtubule related vesicle transport in cultured cells, was identified as a novel CB component. TIP49a and TIP49b in turn were identified as main interaction partners of non-cbassociated FYCO1. They belong to the family of (AAA+) proteins with diverse cellular functions, including the regulation of RNA quality control pathway. The aim of this study was to characterize the interaction between FYCO1 and TIP49a/TIP49b complex. First, immunofluorescence experiments were conducted in order to determine the localization of both FYCO1 and TIP49a/TIP49b in HeLa cells. Both proteins localized predominantly in the cytoplasm. Furthermore, overexpressed FYCO1 localized in vesicular structures, but was not able to recruit endogenous or overexpressed TIP49a/TIP49b to these structures. This may indicate that their interaction is very transient and/or occurs at specific subcellular sites. Second, coimmunoprecipitation assay was set up to study if FYCO1 and TIP49 proteins form stable complexes in Hela cells. Preliminary results argue against the direct interaction between these proteins and suggest that FYCO1-TIP49 complex formation requires some male germ cell-specific factors. Future experiments include the validation of FYCO1-TIP49 interactions in spermatocytes and round spermatids isolated by centrifugal elutriation and shrna construct design to knockdown FYCO1 in cultured cells. Altogether, these studies will help us to understand the novel connection between the ribonucleoprotein granule-mediated RNA regulation and vesicular transport system in male germ cells. As the CB function is required for normal sperm production, the results will provide novel important insights into the factors involved in the maintenance of male fertility. Keywords: Spermatogenesis, Chromatoid Body, FYCO1, TIP49a, TIP49b
Se alkuperäinen tyrniöljy kasviskapselissa Kun silmiä tai suuta kuivaa Tuote ylläpitää limakalvojen ja ihon terveyttä Tuotteen moninaisia terveysvaikutuksia on tutkittu laajasti Turun yliopiston biokemian ja elintarvikekemian laitoksella. www.omega7.fi Omega7 on saatavana myös nestemäisenä pullossa sekä hoitavana ihovoiteena. Flavo C Tyrnin flavonolit ja C-vitamiini Kun flunssa tai stressi iskee Tuote ylläpitää vastustuskykyä ja auttaa jaksamaan 2 tablettia vastaa 100 grammaa tuoretta tyrniä www.aromtech.com
«5» The role of Shank family proteins in integrin activation Johanna Lilja Supervisors: professor Johanna Ivaska, adjunct professor Jeroen Pouwels BIOCHEMISTRY Integrins are cell adhesion receptors important in cell-matrix interactions. Regulation of integrin activation is essential for cell adhesion, motility and tissue homeostasis. Shank family proteins (Shank1, Shank2 and Shank3) are multidomain scaffolding proteins best known to organize protein complexes at the postsynaptic density. The aim of our project was to study the role of Shank family proteins in integrin activation and improve our knowledge about the interaction between proteins Shank and Sharpin. Using an RNAi kinase screen Sharpin was identified as an important inhibitor of β1-integrin activity in prostate cancer cells. Shank family proteins were found in the same screen but the role of Shank proteins in integrin activation is unknown. Moreover, it has been shown that Sharpin binds to the ankyrin repeats of Shank. Integrin activation involves conformational changes that result in an increase affinity for ligand. We used the fluorescence-activated cell sorting (FACS) to measure β1 integrin activation state. Active integrin FACS was performed both with labeled fibronectin and active β1 conformation sensitive antibodies. The expression levels of Shank and Sharpin in different cell lines were studied by using quantitative reverse transcription PCR (qrt-pcr) and western blot. Confocal microscopy was used to visualize the localization of Sharpin and Shank. The interaction of these proteins was also observed by immunoprecipitation. We showed that overexpression of Shank3 and Sharpin individually or in compination decreased beta1 integrin activity in chinese hamster ovary cells (CHO). We also observed that Shank3 and Sharpin co-localize to the nucleus and lamellipodium of CHO cells. Thus, our findings suggest that the Shank family proteins might have an important role in β1 integrin activation together with Sharpin. We are also studing the integrin activation in Shank-silenced prostate cancer cells. For reliable conclusion this requires further research. Keywords: integrin activation, Shank, Sharpin
«6» Characterization of novel proteases in Staphylococcus pseudintermedius Mihail Ruotsi Supervisor: Ph.D. Benedykt Wladyka BIOCHEMISTRY Staphylococcus genus bacterial species are silent inhabitants of human and other warm-blooded animals on the epithelium. When given a chance, opportunistic pathogen species have ability to overcome hosts defence mechanisms and colonise the body. S. pseudintermedius is a close relative of S. aureus and it has been linked to be originated from canine species pathogen. Lately, it has been recognised that it also carries the capability to develop antibiotic resistance, and more so, there have been cases of cross-species infection of S.pseudintermedius. The genus Staphylococcus secretes wide variety of distinct exoenzymes which correlates with high pathogen virulence. One of S. aureus exoenzymes group is under the Spl (serine protease-like) operon. Spl proteases have been researched over the past years and have been recognised as a strong contributor for SSSS (Staphylococcal scalded skin syndrome), it is also called Ritter s disease. Through bioinformatical gene mining we have found similar operon in S. pseudintemedius with 10 theoretical structural genes. The aim was to clone operon s structural genes. Moreover, to produce, purify and specify the activity of the Spl-proteases. In the project we designed primers and cloned the genes into intermediate vector ptz. After determining that the cloning of the genes from S. pseudintermedius was successful with sequencing, we further cloned the genes into production vector pgex. We tested the induction and production of the proteins. We optimised the production for maximising the solubility and the yield of the protein for purification. We purified the protein with a GST- and a Ni-NTA column in natural and denatured conditions. Protease activity and specificity of the cleavage was tested by zymography method. Because of the high amount of insoluble protein we performed a refolding buffer assay. We were able to clone 9 of the genes in pgex. For confirmation we performed PCR with specific primers. Induction in BL21 with IPTG was proven to work with SDS-PAGE. Most proteins were produced in insoluble form, but we were able to purify small amounts of the most auspicious protein and do a zymography for the activity. The results were inconclusive. Refolding buffer assay showed some promising results for purification of the protein in denatured conditions. Keywords: Staphylococcus pseudintermedius, Spl-protease, SSSS
«7» Phaeodactylum tricornutum piilevän fotoinhibitio Vesa Havurinne Ohjaaja: Dos. Esa Tyystjärvi MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA JA BIOENERGETIIKKA Valon ajamassa elektroninsiirrossa syntyy paljon haitallisia sivutuotteita, kuten esimerkiksi singlettihappea, jotka vahingoittavat fotosynteesikoneistoa sen toimiessa. Valon aiheuttamasta vahingosta seuraavaa yhteyttämiskyvyn heikkenemistä kutsutaan fotoinhibitioksi, ja yksikään fotosynteettinen eliö ei ole välttynyt sen vaikutukselta. Piilevät ovat yksi menestyneimmistä yksisoluisista leväryhmistä, ja jopa 25 % maapallon primaarituotannosta on piilevien fotosynteesiä. Tutkituin piilevälajeista on Phaeodactylum tricornutum, joka on kuitenkin vielä biofysikaalisesti nuori tutkimuskohde. Kyseisen levän valonkeruukompleksien sisältämä harvinainen klorofylli c tekee siitä fotosynteesitutkimuksen kannalta hyvin mielenkiintoisen. Erikoistyön tarkoituksena oli määrittää fotoinhibition aktiospektri P. tricornutum piilevässä in vitro sekä ultraviolettisäteilyn että näkyvän valon alueella altistamalla leväkasvatus yhteensä 17 eri aallonpituuskäsittelylle (fotosynteettisen fotonivuon tiheys 100-300 µmol m -2 s -1 ). Kasvatuksiin lisättiin linkomysiiniä ennen valokäsittelyjä kloroplastien proteiinisynteesin inhiboimiseksi. Käsittelyjä jatkettiin kunnes Clark-tyypin O 2 -elektrodilla mitattu hapentuotto oli inhiboitunut vähintään 25 % diklooribentsokinonin toimiessa elektronin vastaanottajana. Pulssiamplitudimodulaatiofluorometrilla mitattua vaihtelevan fluoresenssin ja maksimifluoresenssin suhdetta käytettiin tulosten vahvistamiseksi. Fotoinhibition reaktionopeusvakiot määritettiin sovittamalla mittaustulokset ensimmäisen kertaluvun reaktioyhtälöön. Tuloksistani käy ilmi, että vaikka P. tricornutum levällä onkin erikoinen pigmenttikoostumus, on sen fotoinhibition aktiospektri melko samanlainen kuin korkeammilla kasveilla. Ultraviolettisäteily on selvästi vahingollisempaa kuin näkyvä valo, mikä osoittaa happea vapauttavan kompleksin mangaaniionien toimivan fotoinhibition valoreseptoreina myös piilevällä. Näkyvällä alueella fotoinhibition aktiospektri seuraa levästä eristettyjen pigmenttien absorptiospektriä osoittaen selkeitä piikkejä 480 ja 680 nm:n kohdalla (klorofyllit a ja c). Havaittu kohouma 520 nm:n kohdalla on vielä selittämättä. Tutkimuksessani aion tulevaisuudessa selvittää singlettihapen tuoton ja fotoinhibition yhteyden samoilla aallonpituuksilla P. tricornutum piilevässä fotoinhibition vielä ratkaisemattomien syntymekanismien selventämiseksi. Asiasanat: fotosynteesi, fotoinhibitio, Phaeodactylum tricornutum, näkyvä valo, ultraviolettisäteily
«8» RNA-polymeraasin -alayksikön rooli syanobakteerin Synechocystis sp. PCC 6803 sopeutumisessa eri hiilidioksidipitoisuuksiin Juha Kurkela Ohjaaja: FT Taina Tyystjärvi MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA JA BIOENERGETIIKKA Synechocystis sp. PCC6803 on syanobakteerien malliorganismi. Sen RNApolymeraasin ytimen muodostavat -, - ja -alayksiköt, kaksi -alayksikköä, sekä -alayksikkö. Pieni -alayksikkö ei ole välttämätön, sillä mutanttikannan ( rpoz) solut, joilta on inaktivoitu -alayksikköä tuottava rpoz-geeni, kasvavat hyvin. Mutanttikannan geenien ilmenemisessä on kuitenkin paljon muutoksia villityyppiin verrattuna. Monien hiilenkuljetukseen ja sidontaan osallistuvien geenien ilmeneminen oli vähäisempää rpoz:lla kuin villityypillä, mikä johti 20 % laskuun fotosynteesitehokkuudessa, vaikka valoreaktioiden toiminta pysyi muuttumattomana. Työssäni testasin, korvaako CO 2 :n lisäys rpoz-kannan hiilimetabolian puutteet. Tutkimuksessa havaittiin, että 3 %:n CO 2 :n lisäys kasvatuskaapin ilmaan nopeutti viilityypin kasvua, mutta rpoz-kannan kasvu ei kiihtynyt. Kaiken lisäksi mutanttikannan solut kuolivat kolmen päivän kasvatuksen jälkeen. Vuorokauden korkeassa CO 2 :ssa kasvaneista soluista mitattiin fotosynteettistä tehokkuutta happielektrodilla, fotosynteettisen koneiston proteiinien ilmenemistä Western blot-menetelmällä, valoreaktioiden toimintaa 77K fluoresenssin avulla ja pigmenttien suhteet laskettiin absorptiospektreistä. Testasimme myös miten ph:n muutos vaikuttaa rpoz:n kasvuun, koska ajattelimme, että CO 2 -lisäys muuttaisi kasvatusliuoksen ph:ta. Fotosynteettisen koneiston proteiinit ilmenivät rpoz:lla vähemmän kuin villityypillä ja fotosynteesitehokkuus oli laskenut 50 %:iin villityypin arvosta. 77K fluoresenssispektrissä havaitsimme valoreaktio I:n piikin siirtymisen, mikä voisi viitata valoreaktio I:n vaurioitumiseen. rpoz-kannan korkea karotenoidipitoisuus suojaa soluja hapettavalta stressiltä normaaliolosuhteissa, jolloin 3 %:ssa CO 2 :ssa havaittu karotenoidien väheneminen altisti solut hapettavalle stressille. Fykobiliinin määrä lisääntyi enemmän ja nopeammin viilityypillä kuin rpoz:lla, mikä viittaa siihen, että villityyppi reagoi tehokkaammin ylimääräisen CO 2 saantiin. Mutanttikanta kasvoi paremmin ph:ssa 8,3 kuin ph:ssa 7,5, mutta se ei kasvanut yhtä hyvin kuin villityyppi kummassakaan ph:ssa. Yllätykseksemme ylimääräinen CO 2 ei korvannut hiilimetabolian puutteita vaan olikin soluille letaali. Asiasanat: Synechocystis, RNA-polymeraasi, hiilensidonta
«9» Nopean RNA-testin kehitys norovirukselle Siina Alaranta Ohjaaja: FT Ari Lehmusvuori MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Nopealla diagnostiikalla on merkittävä rooli sairaanhoidossa, sillä se mahdollistaa nopean diagnoosin ja hoidon aloittamisen. Tästä on erityisesti hyötyä tapauksissa, joissa pyritään esimerkiksi estämään epidemian leviämistä. Yksi yleisimmistä vatsatautiepidemioiden aiheuttajista on norovirus (NoV). Viruksella on stabiili ikosahedraalinen viruskapsidi, joka suojaa 7,5 kb:n kokoista, yksinauhaista RNA-juostetta. Isoterminen NASBAmonistustekniikka (engl. Nucleic acid sequence based amplification) kykenee monistamaan suoraan RNA-templaatista monivaiheisen monistusmekanismin kautta. Käytännössä tekniikka on kuitenkin yksinkertaisempi verrattuna perinteiseen polymeraasiketjureaktioon (PCR), sillä monistus tapahtuu yhdessä lämpötilassa ilman erillistä lämpösyklauslaitetta. Työssä kehitetään NoV-testi, joka perustuu NASBA-monistustekniikkaan ja kelaattikomplementaatioon. Lantanidikelaattikomplementaatio mahdollistaa luotettavan reaaliaikaisen detektoinnin, sillä signaalitasot nousevat vain monistustuotteen ollessa läsnä. Norovirustestin kehitys aloitettiin suunnittelemalla alukkeet ja koettimet sekä NoV:lle että sisäiselle monistuskontrollille. Kontrolliksi suunniteltiin synteettinen RNA-templaatti, jonka sekvenssiä ei löydy luonnosta. Monivaiheinen NASBA-monistustekniikka sisältää käänteiskopiointi- ja RNAsynteesivaiheen. Määritys on myös riippuvainen RNaasiH-entsyymin toiminnasta. NASBA-tekniikan monivaiheisuudesta johtuen alukkeiden ja koettimien toimintaa tutkittiin aluksi reaaliaikaisessa käänteiskopiointi- PCR:ssä. Käänteiskopiointi-PCR:ssä havaittiin, että kontrollina käytetty synteettinen templaatti monistui tehokkaasti ja komplementaatiokoettimet detektoivat monistustuotteen. NoV-näytteiden monistuminen oli hyvin heikkoa. Näytteiden monistumista testattiin myös NASBA-tekniikalla ja havaittiin, että tulokset olivat PCR:n kanssa yhtenevät. Syitä tähän ovat esimerkiksi RNA-templaatin sekundäärirakenteet, jotka häiritsevät NASBA-tekniikassa käytetyn T7 RNApolymeraasin toimintaa. Seuraavaksi työssä on tarkoitus monistaa kontrollia NASBA-tekniikalla ja havainnoida signaalikehitystä reaaliajassa. Asiasanat: Norovirus (NoV), NASBA, lantanidikelaattikomplementaatio, reaaliaikainen käänteiskopiointi-pcr, T7 RNA-polymeraasi
«10» Upkonvertoivat nanopartikkelit lateraalivirtausmäärityksissä Laura Kalliomäki Ohjaajat: FM Etvi Juntunen, FM Riikka Arppe ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Lateraalivirtausmääritykset ovat yksinkertaisia ja helppokäyttöisiä, joten niitä voidaan käyttää olosuhteissa, joissa ei ole laboratoriolaitteistoa tai koulutettua laboratoriohenkilökuntaa. Yleensä lateraalivirtausmäärityksissä testituloksen havainnointi perustuu leimamolekyylien signaalitason kvalitatiiviseen mittaamiseen määrityslastulta. Herkemmän määrityksen kehittämiseksi tarvitaan leimamolekyylejä, joiden signaalitaso voidaan mitata lastulta kvantitatiivisesti. Upkonvertoivat nanopartikkelit (engl. upconverting nanoparticles, UCNP) ovat lantanideja sisältäviä fosforeita, joiden signaali voidaan mitata kvantitatiivisesti. Koska niiden viritysaallonpituus on korkeampi kuin emissioaallonpituus, niitä käyttämällä vältetään myös korkeilla aallonpituuksilla esiintyvästä autofluoresenssista johtuva taustasignaali. Työssä kehitettiin UCNP-leimoja lateraalivirtausmäärityksiin. UCNP:t pinnoitettiin kahdella menetelmällä. Erikokoisten UCNP-leimojen liikkuvuutta määrityslastulla verrattiin toisiinsa ja leimojen liikkuvuutta pyrittiin parantamaan muuttamalla määrityspuskurin komponentteja. UCNP-leimojen analyyttinen herkkyys määritettiin seerumi- ja plasmanäytteissä. Mallianalyytteina määrityksissä käytettiin vapaata eturauhasspesifistä antigeenia (engl. free prostate-specific antigen, fpsa) ja sydänperäistä troponiini-i:tä (engl. cardiac troponin I, ctni). Leimojen signaalitasot mitattiin kannettavalla fluorometrilla. Suurimmista, halkaisijaltaan 45 88 nm UCNP:ista vedettömällä pinnoitusmenetelmällä valmistettujen leimojen epäspesifinen sitoutuminen määrityslastulle oli vähäisintä, eli niiden havaittiin liikkuvan määrityslastulla parhaiten. Määrityspuskurin komponentteja muuttamalla leimojen liikkuvuutta ei pystytty parantamaan. Parhaiten liikkuvia UCNP-leimoja käyttämällä analyyttiset herkkyydet olivat fpsa-määrityksessä seeruminäytteessä 5,8 ng/ml ja plasmanäytteessä 1,3 ng/ml sekä ctni-määrityksessä vastaavasti 0,4 ng/ml ja 0,4 ng/ml. Tulosten perusteella UCNP-leimojen todettiin soveltuvan kvantitatiivisiin lateraalivirtausmäärityksiin. Asiasanat: lateraalivirtausmääritys, leimamolekyyli, upkonvertoivat nanopartikkelit, liikkuvuus
«11» Nanokokoisten upkonvertoivien partikkeleiden käyttö leimana reaaliaikaisessa PCR:ssä Tero Matikka Ohjaajat: FM Riikka Arppe, FT Ari Lehmusvuori, prof. Tero Soukka MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Upkonversio on ainutlaatuinen ilmiö, jossa kahden tai useamman alempienergisen fotonin energia pinoutuu korkeampienergiseksi emissioksi. Työssä käytetyt epäorgaaniset upkonvertoivat nanopartikkelit (UCNP) sisältävät ytterbiumia, joka absorboi infrapuna-aallonpituudella ja siirtää energian partikkelissa olevalle erbiumille, joka emittoi näkyvällä aallonpituusalueella 550 nm:ssa. Käyttämällä UCNP:ta leimoina reaaliaikaisessa polymeraasiketjureaktiossa (PCR) päästään eroon näytteiden ja muovimateriaalien aiheuttamasta autofluoresenssista, minkä vuoksi määrityksen herkkyyttä on mahdollista parantaa. Yhteensä kolme erilaista upkonversioenergiansiirtoon (UC-RET) perustuvaa koetinmenetelmää suunniteltiin ja testattiin. Kohdesekvenssinä käytettiin synteettistä Chlamydia trachomatis -bakteerin DNA:ta. Akseptorina käytettiin 550 nm:ssa virittyvää Alexa Fluor AF546 -fluoroforia (AF546), jonka emission sammuttamiseen käytettiin Dark Quencher BHQ-2:sta. Koetinmenetelmistä yksi oli TaqMan-tyyppinen, jossa akseptori ja sammuttaja erotettiin toisistaan monistuksen aikana polymeraasin eksonukleaasiaktiivisuudella. Jäljelle jäänyt AF546:n sisältämä oligonukleotidihäntä sitoutui UCNP:n pinnalla olevaan vastinoligoon, jolloin UC-RET:n oli mahdollista tapahtua. Kilpailevissa koetinmenetelmissä oligokonjukoitu UCNP kilpaili PCR-tuotteen kanssa akseptorilla tai sammuttajalla leimatusta koettimesta. Akseptorin sisältävä koetin sitoutuneena UCNP:n pintaan mahdollisti UC-RET:n. Sammuttajan sisältämä koetin sammutti UCNP:n pintaan konjukoidun akseptorin UC-RET - emission. TaqMan-tyyppisen koetinmenetelmän todettiin toimivan parhainten UCNPleimojen kanssa. PCR:n lämpötilavaihteluiden vaikutuksesta partikkelit saostuivat, minkä takia sekä reaktio-olosuhteet että UCNP:den pintakemia vaativat vielä lisätutkimusta. Asiasanat: upkonversioresonanssienergiansiirto, upkonvertoiva nanopartikkeli, polymeraasiketjureaktio, TaqMan, koetin
www.orion.fi
«12» Uusien eturauhassyöpämerkkiaineiden tasojen tutkiminen eturauhaskudoksessa reaaliaikaisella käänteiskopiointi-pcr:llä Terhi Tallgrèn Ohjaajat: FM Saeid Alinezhad, FM Riina-Minna Väänänen ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Eturauhassyöpä on yleisin miesten syöpä teollistuneissa länsimaissa. Eturauhassyövän diagnosointiin tarvitaan uusia merkkiaineita, joita kirjallisuuden ja alustavien tilastollisten tutkimusten mukaan geenit PLA2G7 (engl. platelet-activating factor acetylhydrolase) ja RHOU (engl. Rho-related GTP-binding protein RhoU) voisivat olla. Erikoistyössä tutkittiin RNA-tasolla PLA2G7- ja RHOU-geenien soveltuvuutta eturauhassyöpädiagnostiikkaan. Työssä kehitettiin PLA2G7- ja RHOU-lähetti-RNA:lle aikaerotteiseen fluorometriaan perustuvat reaaliaikaiset kvantitatiiviset käänteiskopiointi-pcrmääritykset, jotka ovat sisäisesti standardoituja. Optimoidulla määrityksellä mitattiin PLA2G7-lähetti-RNA:n pitoisuudet 75 eturauhassyöpäkudosnäytteestä ja 149 hyvänlaatuisesta eturauhaskudosnäytteestä. Hyvänlaatuisista näytteistä 104 oli eturauhassyöpäpotilailta, 19 kliinisesti eturauhassyöpää sairastamattomilta virtsarakkosyöpäpotilailta ja 26 eturauhasen liikakasvua potevilta potilailta. PLA2G7:n havaittiin yli-ilmentyvän sekä eturauhassyöpäpotilaiden syöpä- että hyvänlaatuisessa kudoksessa. Molempien näyteryhmien PLA2G7-lähetti- RNA:n tasojen mediaani oli 42 kertaa korkeampi kuin kliinistä eturauhassyöpää sisältämättömien eturauhasten kudoksissa. Erot olivat tilastollisesti merkitseviä (p<0,001). Erikoistyössä kehitetyt määritykset mittaavat PLA2G7- ja RHOU-lähetti- RNA:n pitoisuudet herkästi ja spesifisesti. PLA2G7 on yli-ilmentynyt tilastollisesti merkitsevästi eturauhassyöpäkudoksessa, jolloin sitä voidaan mahdollisesti käyttää eturauhassyöpädiagnostiikassa. PLA2G7-määrityksellä ei pystytä kuitenkaan erottamaan hyvänlaatuista ja syöpäistä kudosnäytettä samasta eturauhasesta, mikä voi johtua siitä, että PLA2G7 yli-ilmenee syöpää sisältävässä eturauhasessa myös kasvainalueen ulkopuolella. Väittämä vaatii kuitenkin lisätutkimuksia. RHOU-lähetti-RNA pitoisuudet tullaan myös mittaamaan samoista kudosnäytteistä. Asiasanat: eturauhassyöpädiagnostiikka, käänteiskopiointi-pcr, PLA2G7, RHOU
«13» Developing a quantitative reverse transcription PCR assay for DLX1 and functional validation for eight genes as novel biomarkers for prostate cancer diagnosis Jesse Mattsson Supervisors: M.Sc. Saeid Alinezhad, Ph.D. Malin Åkerfelt, Ph.D. Matthias Nees and prof. Kim Pettersson MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS Prostate cancer (PrCa) is the most common cancer among men. The main problem in PrCa diagnosis is the lack of specific and sensitive biomarkers. The aim of this thesis was to perform the functional validation for eight biomarker candidates and developing a quantitative, internally standardized, reverse transcription PCR assay for one of the eight genes (Distal-Less Homeo Box 1, DLX1). A previous bioinformatics analysis of a large-scale transcriptomics data set resulted in eight biomarker candidates for PrCa diagnosis for further studies. A qrt-pcr-assay was developed and optimized to measure the transcript level of DLX1 in 182 radical prostatectomy samples (106 histologically benign prostate tissues (RP/B) and 76 from cancerous lesions (RP/PrCa)), 21 benign tissue samples from cystoprostatectomies (CP) and 25 benign prostatic hyperplasia (BPH) samples. For functional studies, the sirna-mediated knockdown effect of each gene was evaluated by their impact on g.e. morphology and proliferation of cancer cells on both 2D and 3D cell culture models. Also functionalized nanoparticles were tested for delivery of sirna into spheroids. The median mrna expression level of DLX1 was 17-folds higher in RP/PrCa samples than RP/B samples. Comparison of the expression level of DLX1 in RP/PrCa samples with RP/B, CP and BPH samples revealed statistically significant differences (P 0.001). Our results showed that DLX1 was overexpressed in PrCa. It seems that DLX1 could be a potential biomarker for diagnosis of PrCa, but further functional and clinical studies are needed. The functional studies experiments are ongoing and forthcoming results need to be analysed later. Keywords: Prostate cancer, DLX1, qrt-pcr, Biomarker, functional studies
Doing things first in the world Antigen detection tests made by the R&D team
«14» Mapping of AMACR and TMPRSS2-ERG fusion gene expression in human prostate Natalia Tong Ochoa Supervisors: M.Sc. Riina-Minna Väänänen, prof. Kim Pettersson BIOMEDICAL IMAGING Expression of suggested prostate cancer marker genes AMACR (α-methylacylcoenzyme A racemase) and fusion gene TMPRSS2-ERG (transmembrane protease serine 2 - ETV related gene) has previously been detected in histologically benign tissue of cancerous prostates. This may be due to field cancerization phenomenon which suggests that molecular aberrations can precede histological changes. The aim of this study was to analyze the correlation of protein and gene expression levels of AMACR and TMPRSS2- ERG with tumor areas in prostate tissue. A thin cross-section was collected from three prostates with localized prostate cancer and divided into 5x5 mm tissue pieces, recording their locations. The sample panel consisted of 48, 62 and 44 samples for prostate 1 (pro1), 2 (pro2) and 3 (pro3), respectively. The mrna levels of AMACR and two TMPRSS2- ERG isoforms were measured with quantitative reverse-transcription PCR assays. Protein expression was determined by immunohistochemistry on tissue sections obtained from each side of the cross-section intended for mrna measurements. AMACR mrna was expressed in all samples. Higher expression was seen in 2/5 tumor areas of pro1, in 4/4 PIN lesions in pro2 and in one sample located in a benign area of pro3. There was no expression of TMPRSS2-ERG III mrna in pro1, but in pro2, expression was observed adjacent to 2/4 PIN lesions and in pro3, it was detected in 1/3 tumor areas and in benign areas near it. TMPRSS2- ERG VI mrna expression was found only in pro3 adjacent to 1/3 tumor areas and in 1/3 PIN lesions. Immunohistochemistry data is currently under processing. The findings of high expression of AMACR mrna in benign areas adjacent to tumors and PIN lesions, and low levels in tumor areas suggest cancer field effect. Moreover, the expression of TMPRSS2-ERG isoforms observed not only in tumors or PIN lesions but also in benign areas supports the field cancerization hypothesis in which a larger area of the gland than just the tumor site is affected. Keywords: Prostate cancer, field cancerization, AMACR, TMPRSS2-ERG fusion gene
«15» Luminescent chemical sensors based on upconversion particles Simon Christ Supervisor: Ph.D. Michael Schäferling MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS Upconversion nanoparticles (UCNP) are versatile nanoprobes for assays, sensing and imaging applications in biological and biomedical fields. Rare earth metal doped nanocrystals show photo-upconversion by the absorption of two or more photons and emission at shorter wavelength. Thus excitation of these nanoprobes using near-infrared light results in a multicolor emission in the visible range, making them suitable for complex samples such as biological tissue and whole cells. Furthermore, UCNP s can be sensitized to certain ions, ph or oxygen pressure. This may be achieved by conjugation of sensitive luminescent dyes to the surface of the particles. If the emission of the UCNP s overlaps with the absorption of the dye and if the distance between particles and dye is appropriate, Förster resonance energy transfer (FRET) can occur. The FRET results in a quenched UCNP emission and an additional signal dependent upon the emission of the dye. This signal can either be measured directly and used for quantification or lifetime determination can give more precise information on the microenvironment of the particles. The fluorescence lifetime can be measured by using the fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) technique. The aim of our research is to develop upconversion nanoprobes for ph and ion sensing. This is realized by the conjugation of ph or calcium sensitive luminescent dyes to silica coated nanoparticles. In the process the coating is modified to prevent coagulation and enhance stability. Spectral properties are determined and adjusted carefully to meet the criteria for internal referencing. Cellular uptake is tested to enable use of the sensor in living cells. A particular interest is paid to quenching of luminescence intensity and lifetime under measuring conditions. A custom-made FLIM instrument is optimized in parallel to provide a cheap and reliable platform for measurements utilizing our upconversion nanoprobes. Since the project has just started there are no final results to be presented at this stage and we hereby give an outlook on upcoming work. Keywords: luminescence, upconversion nanoparticles, FLIM, resonance energy transfer
«16» Generation of terminal peptide tag specific binders by using phage display and synthetic antibody libraries Csilla Kurdi Supervisors: Ph.D. Urpo Lamminmäki, M.Sc. Hanna Sanmark MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS Phage display is a widely used technique to find binders from large heterologous peptide or protein populations such as synthetic antibody libraries. In this technique, the foreign (poly)peptides are expressed and displayed on the surface of bacteriophages as fused to a phage coat protein. The displayed peptide or protein with the desired binding properties can be propagated and isolated in a process called (bio)panning. The goal of this project was to develop a synthetic antibody binder recognizing the C-terminal peptide epitope generated by an enzymatic cleavage reaction. Such a binder could be used to develop an immunoassay based method to detect blood coagulation reactions. For peptide C-terminus specific antibody generation, a synthetic single-chain (scfv) antibody phage library was panned against the immobilized target peptide. The gathered phages were propagated after each panning round in E.Coli. After the second and third panning rounds, the scfv genes were cloned into bacterial expression vectors to allow the production of scfv fragments as a soluble fusion protein with bacterial alkaline phosphatase (scfv-ap) or betalactamase (scfv-bla). Bacterial clones were picked and the fusion proteins were produced on microtiter wells. The specific binders were identified by ELISA screening, where the binding of fusion protein to the biotinylated antigen immobilized on streptavidin wells was detected by the enzymatic activity of AP or BLA. After panning clear enrichment was observed and several clones specific to the target peptide were found in screening. The binding specificity of the clones will be verified with a second ELISA and sequencing will be applied to indentify the unique binders. The selected clones will be expressed in bottle scale cultures and purified as scfv-ap fusion proteins with IMAC affinity chromatography to be further studied for the blood coagulation assay development. Keywords: phage display, synthetic antibody libraries, bacteriophage
«17» Kreatiinikinaasiin perustuvan seulontamenetelmän kehittäminen Duchennen lihasdystrofialle Mari Alatalo Ohjaajat: DI Juho Terrijärvi, FT Jonne Vaarno ja FT Teemu Korpimäki BIOTEKNIIKKA DI Duchennen lihasdystrofia (DMD) on nopeasti etenevä perinnöllinen lihasrappeumatauti. Tautia sairastavat joutuvat usein pyörätuoliin noin kymmenen vuotiaana ja kuolevat alle 30 vuoden iässä. Taudin aiheuttaa mutaatio dystrofiinia koodaavassa geenissä X-kromosomissa, joka periytyy resessiivisesti. Yksi 3500:sta elävänä syntyneestä pojasta sairastaa DMD:tä ja heistä joka kolmannella geenivirhe on syntynyt sponttaanista mutaatiosta. Lääkekehitys DMD:hen on pitkällä, mistä johtuen on syntynyt kiinnostusta vastasyntyneiden seulontaan. Vastasyntyneillä DMD:tä sairastavilla lapsilla on havaittu olevan normaalia korkeampi kreatiinikinaasiaktiivisuus veressä. Normaali kreatiinikinaasiaktiivisuus vastasyntyneen veressä on noin 250 U/l ja sairailla kreatiinikinaasiaktiivisuudet ovat yli 2000 U/l. Diplomityön aiheena oli kehittää kreatiinikinaasiin perustuva seulontamenetelmä, joka olisi suoritettavissa kuivatuista veritäplistä PerkinElmerin automaattisella määritysalustalla GSP :llä. Seulontamenetelmän kehitystä varten tutkittiin kahta erityyppistä entsyymiketjutukseen perustuvaa tekniikkaa, joissa molemmissa muodotuva signaali on verrannollinen kreatiinikinaasin muodostaman ATP:n määrään. Kreatiinikinaasi-lusiferaasireaktiossa määritys perustui lusiferaasin tuottaman valon detektointiin. Kreatiinikinaasi-heksokinaasi-glukoosi-6- fosfaattidehydrogenaasi reaktiossa (CK-HK-G6PD) mitattiin kolmannen entsyymireaktion lopputuotteen, pelkistetyn nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin (NADPH), fluoresenssi aallonpituudella 460 nm. Standardikäyrän perusteella CK-HK-G6PD määrityksen toiminta-alue kattaa sekä terveiden että sairaiden kreatiinikinaasiaktiivisuudet. Lusiferaasimäärityksellä suurin määritettävä pitoisuus on saatu vain 1400 U/l:aan, mikä ei riitä sairaiden yksilöiden kreatiinikinaasiaktiivisuuksien määrittämiseen. Ongelmaa pyritään korjaamaan hidastamalla kreatiinikinaasin toimintaa vähentämällä sen substraattien määrää. Molemmat määritykset vaativat vielä optimointia, koska niissä on ongelmana korkea tausta ja matala signaalitaso. Määritysten toimivuus täytyy myös testata vielä oikeilla näytteillä. Asiasanat: kreatiinikinaasi, Duchennen lihasdystrofia, entsyymiketjureaktio, DMD
«18» Upkonvertoivien nanopartikkelileimojen havainnointi ja käyttö homogeenisessa ei-kilpailevassa immunomäärityksessä Krista Korpi Ohjaajat: DI Juho Terrijärvi ja FT Johanna Vuojola BIOTEKNIIKKA DI Ylös-konvertoivat nanopartikkelileimat (engl. upconverting nanoparticles, UCNP) ovat lantanidi-ioneja sisältäviä nanokiteisiä partikkeleita, jotka virittyvät infrapunavalolla ja emittoivat sitä korkeampi energistä näkyvää valoa. Mittauksien tausta jää alhaiseksi käytettäessä UCNP-partikkeleita määrityssovelluksissa, koska UCNP emissiopiikit ovat kapeat ja viritys- ja emissiospektrien välinen anti-stokesin siirtymä, mihin mikään biologinen materiaali ei pysty, on suuri. Lisäksi UCNP-leimojen etu on se, etteivät partikkelien viritysspektri, toinen emissiopiikeistä ja veren absorbtiospektrit ole päällekkäin, joten UCNP:tä voidaan käyttää homogeenisissa määrityksissä kokoverinäytteillä upkonvertoivaa resonassienergian siirtoa hyödyntäen (engl. up-conversion resonance energy transfer, UC-RET). UC-RET:ssä donorina toimiva UCNP virittää akseptorina toimivan pienvärin, jos niiden välinen etäisyys on keskimäärin alle 10 nm. UCNP-teknologia ei ole vielä levinnyt laajalle eikä UCNP luminesenssin mittaamiseen soveltuvaa infrapunaviritykseen kykenevää laitetta ole listatuotteena kaupallisesti saatavilla. Tämän työn tarkoituksena oli kvalifioida ja käyttöön ottaa UCNP luminesenssin mittaamisen soveltuva muokattu fluorometri (laser-modifioitu Plate Chameleon, Hidex Oy) sekä evaluoida asiakastoimeksiantona mahdollisuus toteuttaa asiakkaan immunomääritys homogeenisena ei-kilpailevana UC-RET immunomäärityksenä. Evaluointia varten UCNP-partikkeleiden pintaan kiinnitettiin tutkittavan analyytin tunnistavia sitojavasta-aineita. Akseptorina toimi streptadavidiiniin konjugoitu fykoerytriini, joka sitoutui analyyttiin biotinyloidun vasta-aineen välityksellä. UC-RET:n onnistumiseksi immunokompleksiin osallistuvien vasta-aineiden epitoopit oli valittu siten, että akseptori tulisi lähelle UCNP:n pintaa. Asiakasevaluoinnissa valmistettujen komponenttien toimivuus varmistettiin heterogeenisella immunomäärityksellä ennen homogeeniseen ei-kilpailevaan määritykseen siirtymistä. Määritys toimi, mutta asetetusta analyytin erotuskykytavoitteesta jäätiin. Optimointia ei voitu jatkaa enempää, koska aikaja reagenssiresurssit lopuivat kesken. Levylukijan kvalifiointi ja käyttöönotto ovat vielä kesken. Asiasanat: UCNP, homogeeninen ei-kilpaileva immunomääritys, kvalifiointi
«19» The effect of mirnas to the regulation of triple negative breast cancer cells Pauli Tikka Supervisors: M.Sc. (Tech.) Juho Terrijärvi, prof. Rainer König BIOTECHNOLOGY (DI) The structural specialities of triple negative breast cancer cell reflect its regulatory complexity. There are no estrogen, progesterone, or HER2 receptors expressed on the surface of this cell type. The regulatory mechanism of this cell was studied by the expression signals of the genes and mirnas. The expression signals were obtained from TCGA (The Cancer Genome Atlas). Statistical and mathematical methods were used to infer the connections behind the genes and mirnas in the breast cancer cells. Some of the genes and mirnas behave differently in cancer. This phenomenon was investigated with Fisher exact test (i.e. enrichment test) which revealed 21 mirnas connected to the triple negative breast cancer cell. Sixteen of these mirnas were downregulated from which hsa-mir-301b was the most downregulated one. The rest of the mirnas were upregulated (e.g. hsa-mir-216a-5p). The target genes of these mirnas were regulated in the opposite direction compared to these mirnas. The target genes were found with target gene program that uses information from different databanks. The clustering of mirnas was studied with the methods of Ward and Hamming distance. The aberrant genes related to these cancer mirna, such as NFIB (Nuclear Factor I/B) and QKI (Quaking Homolog, KH Domain) were found out to group under similar clusters. The connection of genes and mirnas were modelled by Mixed Integer Programming (MIP). Three groups of genes were examined: the target genes of enriched mirnas, the genes from essential metabolic pathways, and target genes of differentially expressed mirnas. The MIP model estimated the best correlation (85%) to real signals with CELF2 (CUGBP, Elav-Like Family Member 2) and its mirnas including some of the enriched mirnas. CELF2 protein is important gene because it inhibits apoptosis in of cells. The effect of using only a restricted amount of mirnas in the model was also tested. The restricted model and enrichment test showed that the upregulation of CELF2 in breast cancer is due to hsa-mir-29b-3p. Keywords: Triple negative breast cancer cell, the regulation mechanisms of mirnas, Fisher s exact test, mixed integer programming.
«20» Uuden europium(iii)kelaatin karakterisointi ja soveltuvuus aikaerotteisiin fluoroimmunomäärityksiin Jenna Jacobino Ohjaajat: FM Tanja Savukoski ja prof. Kim Pettersson BIOTEKNIIKKA DI Europium(III)kelaatteja käytetään leimoina aikaerotteiseen fluoresenssiin perustuvissa mittauksissa, koska niiden pitkä fluoresenssin elinikä mahdollistaa lyhytikäisestä taustafluoresenssista vapaan mittaamisen. Perinteisten kelaattien virittämiseen tarvitaan kalliita ja kookkaita, korkeaenergistä ultraviolettivaloa (UV, <350 nm) tuottavia ksenonvälähdyslamppuja tai typpilasereita. Hohtodiodit (LED) olisivat edullisuutensa ja pienen kokonsa vuoksi houkuttelevampi vaihtoehto käytettäväksi viritysvalonlähteenä, erityisesti vieritestaussovelluksissa, mutta niillä ei toistaiseksi voida tuottaa tehokkaasti korkeaenergistä UV-valoa. Tästä johtuen LED:ien käyttö vaatii kelaattien virittämisen lähellä näkyvän valon aallonpituutta ( 365 nm). Olemassa olevien europium(iii)kelaattien virittyminen tällä aallonpituudella on kuitenkin tehotonta ja siksi uusien kelaattien kehittämiseen ja karakterisointiin on tarvetta. Diplomi-insinöörityössä tutkittiin uuden europium(iii)kelaatin fluoresenssiominaisuuksia 340 nm:n ja 365 nm:n virityksellä sekä sen soveltuvuutta aikaerotteisiin fluoroimmunomäärityksiin. Verrokkina käytettiin perinteistä 9-hampaista europium(iii)kelaattia ja mallianalyyttinä sydäninfarktin merkkiainetta, troponiini I:tä (ctni). Kaksi ctni-spesifistä detektiovasta-ainetta leimattiin 9-hampaisella ja uudella kelaatilla. Kelaattien viritys- ja emissiospektrit sekä fluoresenssin eliniät määritettiin spektrofluorometrillä. Lopuksi leimattuja vasta-aineita testattiin kaksipuoleisessa immunomäärityksessä (viritys 340 nm, emissio 615 nm). Viritysspektrin huippu sijaitsi uudella kelaatilla 325 350 nm:n ja 9-hampaisella kelaatilla 315 335 nm:n välillä. Mittauksiin käytettävien emissiopiikkien muodossa ei ollut kelaattien välillä eroa. Uuden kelaatin emission intensiteettimaksimi oli 2 3 -kertainen 340 nm:n ja jopa kymmenkertainen 365 nm:n virityksellä 9-hampaiseen verrattuna. Uuden kelaatin fluoresenssin elinikä oli pidempi kuin verrokilla (1180 vs. 1059 µs). Lisäksi uusi kelaatti toimi immunomäärityksessä leimana ja sen tuottamat fluoresenssisignaalit olivat 2 5 -kertaisia 9-hampaiseen verrattuna. Koska uusi kelaatti virittyi tehokkaasti 365 nm:ssä, mahdollistaa se LED:ien käytön viritysvalonlähteenä. Asiasanat: aikaerotteinen fluoresenssi, europium(iii)kelaatti, hohtodiodiviritys
«21» Antigeeniosoitustestin kehittäminen Epstein-Barr-virukselle Petri Antikainen Ohjaaja: FT Janne Koskinen BIOTEKNIIKKA DI Esptein-Barr-viruksen (EBV) aiheuttaman infektion on sairastanut jopa 95 % maailman aikuisväestöstä. Herpesviruksena, EBV jää aktiivisen infektion jälkeen latenttina kantajaansa ja saattaa terveilläkin henkilöillä erittyä ajoittain nieluun. Yleisin EBV:n aiheuttama tauti on mononukleoosi, eli pusutauti, jonka oireita ovat korkea kuume, imusolmukkeiden tulehtuminen, kipeä kurkku ja nielutulehdus. Oireiden samankaltaisuus muiden virusten ja bakteerien aiheuttamien nielutulehdusten kanssa vaikeuttaa oikean diagnoosin tekemistä. Taudinaiheuttajaspesifinen diagnoosi on nielutulehduksessa edellytys oikealle lääkitykselle ja hoidolle, koska antibioottihoito ei tehoa viruksiin. Diplomityön tavoitteena oli kehittää antigeeniosoitustesti EBV:lle hengitystieinfektioiden maripoc -pikatestijärjestelmään. Työssä kehitettiin immunometrinen antigeeniosoitustesti EBV:lle ArcDia TM TPX -mittatekniikkaan. Testin analyyttinen herkkyys on 3 pm, joka on verrattavissa muiden maripoc -testien herkkyyksiin. maripoc pharyn - testissä käytettävä uuttokäsittely Streptokokki A -bakteerin hajottamiseksi laski EBV-testin signaaleja keskimäärin 50 %. Latenttiuden aikaisen EBV:n erittymisen tutkimiseksi terveiltä henkilöiltä kerätyistä näytteistä yksikään ei ollut positiivinen EBV-testissä. Kehitetty EBV:n antigeeniosoitustesti on ensimmäinen testi maailmassa, jolla EBV:ta voidaan osoittaa nopeasti näytteestä. Testi on herkkä, mutta sen toiminta tulee tutkia vielä mononukleoosipotilaiden näytteillä. Uuttokäsittelyn aiheuttamasta signaalien laskusta huolimatta EBV pystytään osoittamaan potilasnäytteistä, jos EBV:n pitoisuus on korkea. Terveiden henkilöiden näytteistä ei löytynyt EBV:ta, mikä vahvisti kirjallisuuden perusteella tehtyä oletusta, että terveillä henkilöillä ei erity EBV:ta merkittävissä määrin. Akuutti EBV-infektio pystytään todennäköisesti erottamaan latentista infektiosta EBV:n pitoisuuden perusteella, vaikka latenttiudessa erittyisikin EBV:ta. Testin ristireaktiot erityisesti muiden herpesvirusten kanssa tulee vielä tutkia ja lisäksi pitää selvittää tulisiko EBV osoittaa nielusta vai nenänielusta. Asiasanat: Epstein-Barr-virus, mononukleoosi, pusutauti, nielutulehdus, antigeeniosoitustesti