Uutta mikrobien tutkimusmenetelmistä Johtava asiantuntija, FT, Dos. Anne yvärinen 28.5.2012 Uutta analytiikasta ja tutkimusmenetelmistä / Anne yvärinen 1
Mikrobien erityispiirteitä Mikrobeja on kaikkialla ja paljon erilaisia Solut, itiöt, niiden osaset ja rakennekomponentit allergeenit Metaboliatuotteet (VC, toksiinit) Eläviä, muuntuvia, mutta kuolleillakin merkitystä Mikrobien kasvuun, kasvualustasta vapautumiseen ja esiintyvyyteen vaikuttaa useat tekijät Pitoisuuksien vaihtelu suurta Vaikutusmekanismit ja oireita/sairauksia aiheuttavat tai suojaavat mikrobitekijät edelleen epäselviä Yksilöiden vasteet erilaisia Sisäilman mikrobipitoisuuksille ei ole terveysperusteisia ohjearvoja! 28.5.2012 2
Tarvitaanko mikrobitutkimuksia? Voidaanko ongelma ratkaista jo olemassa olevan tiedon ja kokemuksen perusteella? Jos mikrobivaurio tai lähde selvä, voimavarat kannattaa suunnata korjaamiseen Mikrobitutkimukset eivät yksin riitä Näytteenottostrategia ja - suunnitelma 28.5.2012 3
Mikrobikasvusta vapautuvien epäpuhtauksien käyttäminen asumisterveystutkimuksissa? mikrobi-itiöitä ja soluja, rihmaston, solujen ja itiöiden osasia viljely käytössä, qpcr tulossa Lajistotieto viljely indikaattorit, DNA-pohjaiset menetelmät tuovat uutta tietoa Allergeenejä tutkimuskäytössä, työläs mikrobien rakennekomponentteja tutkimuskäytössä, mutta ei tulkintaohjeita olemassa endotoksiini, 1,3-ß-glukaani, ergosteroli, muramiinihappo mikrobien haihtuvia aineenvaihduntatuotteita (MVC) (homeen haju) tutkimuskäytössä, ei erottele mikrobivauriokohteita mikrobitoksiineja tutkimuskäytössä, ei vielä mahdollista arvioida soveltuvuutta käytäntöön Toksisuustestaus validointitutkimus menossa Kosteuden vaikutuksesta myös materiaalien kemiallisen hajoamisen tuotteita esim. ftalaatit tutkimuskäytössä 28.5.2012 4
qpcr mikrobien mittaamisessa qpcr tuottaa mikrobin tai mikrobiryhmän (mille menetelmä on kehitetty) pitoisuuden näytteessä voidaan suunnitella vain lajeille, joiden DNA- sekvenssi on tunnettu Esimerkiksi 10 eri mikrobin detektointi = 10 qpcr-reaktiota Nopea, suuret näytemäärät mahdollisia Vaatii paljon työtä alussa (alukesuunnittelu ja validaatio) qpcr reaktio voi inhibitoitua negatiivikontrolli background-signaalin määrittämiseen ja kontaminaation kontrollointiin Positiivinen sisäinen kontrolli korjaamaan yleistä PCR-inhibiitiota Kvantifiointi ei aina täsmällistä, erityisesti jos assayt ovat ryhmäspesifisiä (assay ei toimi yhtä hyvin kaikille kohdemikrobeille) 5
qpcr elinympäristönäytteissä Mikrobien DNA:ta elinympäristössä paljon, esim. huonepölyssä useita satoja sieni- ja bakteerilajeja qpcr-menetelmällä määritetyt pitoisuudet n. 10-100 suuremmat kuin vastaavat viljelyllä määritetyt pitoisuudet qpcr:llä havaitaan mikrobeja useammassa näytteessä, koska havaitsee pienetkin pitoisuudet Toisaalta tulos voi olla negatiivinen qpcr-menetelmällä, vaikka positiivinen viljelymenetelmällä 28.5.2012 6
concentration (cells/g) P. brevicompactum (QPCR) vs. kosteusvauriosumma p=0.003 1000000 100000 10000 0 1 2 3 Lignell ym. 2008 28.5.2012 7
qpcr-tuloksia käytetyistä, vaurioitumattomista materiaaleista 100 000 (solua / g) 10 000 PenAspPae Tviri Apull 1 000 Clado 100 10 1 28.5.2012 8
Percentiles (%) qpcr-menetelmän validointi terveysvalvonnan tarpeisiin Ilmanäytteet Penicillium/Aspergillus/P. variotii 100000 p=0.015 undamaged damaged outdoor 100 10000 p=0.005 p=0.002 p<0.001 80 1000 60 cells/m 3 100 10 40 undamaged damaged outdoor 1 20 0.1 Winter Spring Summer Autumn All 0 1 10 100 1000 10000 100000 cells/m 3
DNA-sekvensointiin perustuvat metodit Kohdegeenisekvenssin todellinen nukleotidisekvenssi määritetään (esim. näytteen kaikki eri sekvenssit eri mikrobeista määritetään) Saatu data tulee puhdistaa (poistetaan mm. epämääräiset huonolaatuiset sekvenssit) Saatuun sekvenssidataan liitetään tieto tunnetuista sekvensseistä database-vertailulla ( esim. Blast-työkalulla) Vaatii paljon lisäanalyysejä, valtavasti työtä!! Uusia, todella tehokkaita menetelmiä Vain tutkimukseen!!! 10
Sienien diversiteetti huonepölyssä Kloonikirjastot: 1339 sekvenssiä 394 TU:a Yleisimpiä: hiivat, Cladosporium, Aureobasidium Viljely: 72 pesäkettä 23 lajia Yleisimpiä: hiivat, steriilit, Cladosporium Pitkäranta et al. 2008, AEM
Mycometer Mittaa entsyymin β-n-acetyylihexosaminidaasin määrää Löytyy kaikista homeista Kuvaa sienten biomassaa Vähenee kasvuston iän myötä, mutta voi olla läsnä myös kuolleissa soluissa Myyjä lupaa: nopea, kenttäkäyttöinen, jopa 20 näytettä tunnissa omekasvuston toteaminen, korjausten onnistumisen toteaminen
Mycometer - pintanäytteet A Mycometerlukema 25 omeiden määrä ei yli normaalin taustapitoisuuden B C 25< mycometerlukema 450 Mycometerlukema>450 omeiden määrä yli normaali taustapitoisuuden. Voi tyypillisesti johtua korkeista itiöpitoisuuksista pölyssä tai joissain tapauksissa viitata vanhaan kuivuneeseen kasvustoon omeiden määrä yli normaalin taustapitoisuuden johtuen homekasvustosta
Mykotoksiinit sienien sekundaarimetaboliitit Mycos (Greek) = sieni Toxicum (Latin) = toksinen Tällä hetkellä >300 erilaista mykotoksiinia identifioitu MUTTA Arvioitu, että jopa noin 20.000 erilaista mykotoksiinia luonnossa (arvio sienilajeista: 100.000 arvio sienien sekundaarimetaboliiteista: 200.000)
Mykotoksiinit sienien sekundaarimetaboliitit C 3 C 3 3 C Mikrobit voivat tuottaa, jos ovat metabolisesti C 3 aktiivisia 3 C C 3 C 2 I Ac Ac 3 C C 3 C 2 C 3 Eivät ole rakennekomponentteja, toimivat kasvu- ja kehitysprosesseissa Kaksi biologista pääfunktiota: Luontaiset funktiot, jotka liittyvät kasvuun, C lisääntymiseen, erilaistumiseen... Toimia ulkoisia uhkia vastaan; organismien välinen kilpailullinen interaktio C 3 C C Me C 3 C Me C C 3 C C 3 C 2 I Ac N 2
Mykotoksiinit sienien sekundaarimetaboliitit, jotka voivat aiheuttaa terveysriskejä C 3 C 3 Alhainen molekyylipaino, pysyviä, eihaihtuvia 3 C C 3 3 C C 3 C 2 I Ac Ac 3 C C 3 C 2 C 3 Vaihtelevia kemiallisia rakenteita Vaihtelevia biologisista aktiivisuutta ja vaikutuksia: maksatoksisia, munuaistoksisia, neurotoksisia, solutoksisia, karsinogeenisia, immunosuppressiivisia, tulehdusvaikutuksia, 3 C C C 3 3 C C C C 3 C 2 I Ac Me Me C N 2 Suurin osa tiedosta perustuu ravinnon kautta tapahtuvaan altistumiseen C C
Bakteerien sekundaarimetaboliitit Bakteerit tuottavat valtavan määrän bioaktiivisia sekundaarimetaboliittejä (1999: ~15.000 kuvattu; 500 uutta /vuosi) Useat farmakologisesti aktiivisia ja käytetään farmaseuttisissa tuotteissa antibiootit (> 6000; mm. tetrasykliinit,..) Kasvainlääkkeet (mm. aktinomysiini,..) Immunosuppressiiviset lääkkeet (eg. polyketidit,..) Ensyymi-inhibitorit Antiparasiittiset tuotteet
Miksi tutkimme mikrobitoksiineja? Suuri joukko erittäin bioaktiivisista sekundaarimetaboliitteistä on sienien ja bakteerien tuottamia Potentiaalisesti toksiineja tuottavia sieniä ja bakteereja kasvaa useilla rakennusmateriaaleilla Mikrobitoksiineja havaitaan rakennusmateriaaleissa, ilmassa ja pölyssä Mikrobitoksiineja ilmaan itiöiden, solujen ja niiden osasten mukana altistuminen on mahdollista! Vain vähän tutkittua tietoa, vain muutamista toksiineista Ei systemaattisia tutkimuksia toksiinien yhteydestä terveyteen ealth effects of air pollutants AP lectures 2012; Indoor microbial toxins 18
42-58% näytteistä positiivisia metaboliittien esiintymisprevalenssi n. <10% (paitsi emodiinillä, enniatiineillä) pieniä eroja metaboliittien profiileisissa ja esiintymisessä Suomen, Espanjan ja Alankomaiden välillä Indeksikouluissa enemmän metaboliitteja, mutta yksittäisten yhdisteiden välillä vain muutamia eroja Joitakin sisäilmaan liittyviä toksiineja esiintyi vain indeksikouluissa tausta toksiinit liittyvät ulkolähteisiin? Peitzsch et al. 2012 (hyväksytty)
Mikrobimetaboliittien esiintyminen vaurioituneiden kotien rakennusmateriaali- ja pölynäytteissä Sampling Microbial toxins in building materials and dust samples of the same home location Building materials Dust bag dust Floor dust Airborne settled dust Alternariol, Alternariolm., bacterial toxin, Beauvericin, bacterial Beauvericin, ome 2 Apicidin, Emodin, Emodin, Enniatin toxin, Emodin, bacterial toxin, Enniatin A, Enniatin B, B Enniatin B, Equisetin Enniatin B Festuclavin, Mycophen. acid ome 3 ome 6 ome 9 Beauvericin, bacterial toxin, Emodin, Enniatin A, Mycophen. acid, chratoxin A, Viridicatin, Valinomycin Beauvericin, bacterial toxin, Emodin, Enniatin B, Mycophen. acid, chratoxin A, Sterigmatocystin Altenuene, Alternariol, Alternariolm., Beauvericin, Chaetoglob., Emodin, Enniatin A1, Equisetin, ydr. Fumonisin B1, Kojic acid, Macrosporin, Physcion, Sterigmatocystin Beauvericin, bacterial toxin, Emodin, Enniatin B, Equisetin, Physcion bacterial toxin, Emodin, Enniatin B Beauvericin, Emodin, Enniatin A1, Equisetin, Enniatin B, Physcion bacterial toxin, Emodin, Enniatin B Beauvericin, bacterial toxin, Emodin, Enniatin B Altenuene, Alternariolm., Chaetoglob., Emodin, Enniatin A1, Equisetin, Enniatin B, Sterigmatocystin bacterial toxin, Emodin, Enniatin B Beauvericin, bacterial toxin, Enniatin B n.a.
Mikrobimetaboliittien esiintyminen vaurioituneiden kotien rakennusmateriaali- ja pölynäytteissä Prevalence (%) of microbial metabolites in samples of building materials Mineral Paper Gypsum fibres* based based N = 10 N = 6 N = 5 Wood based N = 14 ther N = 7 Prevalence (%) of microbial metabolites in dust samples Dust bag Floor Settled dust dust airborne N = 7 N = 13 dust N = 7 verall prevalence (%) N = 69 Fungal metabolites Emodin 71.4 20.0 33.3 60.0 71.4 100.0 92.3 28.6 62.3 Enniatin B 28.6 16.7 80.0 42.9 100.0 100.0 100.0 56.5 Beauvericin 7.1 10.0 16.7 80.0 14.3 71.4 61.5 71.4 37.7 Equisetin 21.4 70.0 16.7 42.9 57.1 38.5 14.3 34.8 Physcion 14.3 60.0 60.0 28.6 42.9 15.4 14.3 27.5 Sterigmatocystin 50.0 10.0 16.7 80.0 14.3 14.3 7.7 23.2 Meleagrin 35.7 50.0 100.0 14.3 20.3 Chaetoglobosin A 28.6 10.0 50.0 40.0 15.4 17.4 Enniatin A1 30.0 14.3 28.6 30.8 14.3 15.9 Stachybotrylactam 7.1 33.3 100.0 14.3 13.0 Bacterial metabolites Chloramphenicol 7.1 20.0 33.3 14.3 71.4 69.2 85.7 37.7 Valinomycin 42.9 33.3 60.0 14.3 17.4 Täubel et al. 2011
ng/g dust Korjausten vaikutus mikrobimetaboliittien esiintymiseen pölyssä Metabolite content of vacuumed floor dust before and after renovation - home 8 10000 1000 100 10 1 Before After 0,1 AME Altenuene Chaetoglobosin A Emodin Enn B Enn A1 Equisetin Sterigmatocystine
ng/g dust Korjausten vaikutus mikrobimetaboliittien esiintymiseen pölyssä Metabolite content of vacuumed floor dust before and after renovation - example home 23 1000 100 10 1 Before After 0,1 Beauvericin Andrastin A Physcion Enn B1 Enn B Enn A1 Emodin Chlamydosporal Sterigmatocystine
Toksisuusmittaukset Näytteen yleistä toksisuutta voidaan testata esim. soluviljelmässä Vastaus ei kerro, mikä näytteen osa aiheuttaa toksisuuden Toksisuutta testeissä voivat aiheuttaa toksiinien lisäksi esim. ulkoilman saasteet, pakokaasut, palamistuotteet, monet talouskemikaalit jne. Menetelmät vasta tutkimus- ja testausvaiheessa TXTEST-projekti: TL, TTL, elsingin yliopisto Jos toksisuus liittyy homevaurioon, johtopäätös korjaustarpeesta sama kuin ilman mittausta 28.5.2012 24
TXTEST- tutkimusryhmä TL Professori Maija-Riitta irvonen ankkeen koordinointi Toksikologiset kokeet solulinjoilla TL Johtava asiantuntija Anne yvärinen Kenttätutkimus TTL Tutkimusprofessori arri Alenius Toksikologiset kokeet ihmisperäisillä soluilla ELSINGIN YLIPIST Tutkimusjohtaja Mirja Salkinoja-Salonen Toksikologiset kokeet sian siittiöillä TURUN YLIPIST Lehtori Esa-Matti Lilius Toksikologiset kokeet E. colilla RAITTAJAT Ympäristöministeriö, kosteus- ja hometalkoot Sosiaali- ja terveysministeriö 28.5.2012 TXTEST
Yläpölyt: toksisten näytteiden osuus % 45 40 35 30 25 20 21 42 37 35 toksiset poikkeavan toksiset Salin ym. 2012, Sisäilmastoseminaari, Taulukko 3 15 15 10 5 8 9 0 0 Vähiten oireilevat koulut Muut koulut Eniten oireilevat koulut Kaikki koulut Aerosolikasvustot: toksisten näytteiden osuus % 45 43 40 35 37 35 30 25 20 20 23 24 20 toksiset poikkeavan toksise 15 10 11 5 0 Vähiten oireilevat koulut Muut koulut Eniten oireilevat koulut Kaikki koulut
Uusia menetelmät asumisterveysoppaaseen? Rakennusmateriaalien suoraviljely Loppusuoralla qpcr ilmanäytteiden ja rakennusmateriaalien tutkimiseen Työn alla Toksisuuden tutkimusmenelmä Laskeutuneen pölyn viljely Tulevaisuudessa? Mycometer Mikrobitoksiinit Vertailuaineistojen kerääminen ja menetelmien validointi valtava työ