Patentti myönnetty' Patent medelat 10 V 191

3 UO M I-FI N LAN D 11 KUULUTUSJULKAISU UTLÄGGNINGSSKRIFT 4 3 6 2 5 Kv.11(11M.C1 C 12 k 5/00 UJXL 30 h 6 Patentti myönnetty' Patent medelat 10 V 191 Patenttihakemus Patentansökning 2788/67 Hakemispäivä Ansökningsdag 17 X 1967 Alkupäivä Giltighetsdag Tullut julkiseksi: Blivit offentlig 1 VII 1968 3atentti- ja rekisterihallitus 3 Pantu nähtäväksi Utlagd 1 II 1971 3atent- och registerstyrelsen Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet?1 X 1966 Englanti-England 47399/66 71) Recherche et Industrie Therapeutiques R.I.T., 13, rue du Tilleul, Genval, Belgia- Beleien 72) Keksijät-Uppfinnare: Constant Huygelen, Vossekoten, Huldenberg, Julien Peetermarw, 6, Avenue J. Herman, Rixensart, Belgia -Belgien Asiamies-Ombud: 0/Y Kolster A/B 5 4 )Menetelmä rokotteen valmistamiseksi vihurirokkoa vastaan - Förfarande för framställning av ett vaccin mot röda hund Tämä keksintö koskee menetelmää rokotteen valmistamiseksi vihurirokkoa vastaan, joka rokote sisältää aktiivisena aineosana heikennettyä elävää vihurirokko-virusta, joka on saatu viljelemällä vihurirokkoviruskantaa kanin munuaiskudosviljelyssä, jolloin rokote on valmistettu halutusta siirroksesta sinänsä tunnettuun tapaan. Valmistettaessa elävään virukseen perustuvaa rokotetta on heikennettävä mainittu virus riittävässä määrin, mutta siten, ettei antigeenisyys pienene. Valmis rokote ei saa käytössä aiheuttaa huomattavampia ei-toivottuja reaktioita. On yritetty valmistaa vihurirokkorokotetta siten, että elävän vihurirokkoviruksen kantaa heikennetään sarjasiirtämällä mainittua viruskantaa apinan munuaiskudosviljelyissä määrätyn lukumäärän kertoja. Menetelmää on selitetty julkaisussa Meyer H.M.Jr. Parkman P.D. ja Panos T.C., New Engl. J. Med. 275, 575-580 (1966). Siinä ilmoitetaan, että sarjasiirtämällä kantaa 77 kertaa sen tarttumiskyky heikkenee ilman että antigeenisyys oleellisesti huononee. Näin saatu heikennetty virus ei kuitenkaan sovellu erikoisen hyvin rokotteeksi, koska se aiheuttaa ei-toivottuja sivureaktioita (nivelsärkyä ja niveltulehdusta täysikasvuisissa). Varsinkin niveltulehdus on epämiellyttävä rokotuksen seuraus, vaikkakin se on lyhytaikainen. Ei ole voitu poistaa mainittuja haittavaikutuksia lisäämällä sarjasiirtojen

2 lukumäärää tai käyttämällä erityyppisiä kudosviljelyitä kuten koiran munuaiskudosviljelmää tai hanhen alkion kudosviljelmää. Päinvastoin tuloksena oli yleensä viruksen liikaheikennys ennen haittavaikutuksien poistumista. Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on aikaansaada vihurirokkorokote, jonka antigeenisyys on korkea, mutta joka ei aiheuta niveltulehdusta lainkaan tai vain hyvin lievää niveltulehdusta. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että mainittua vihurirokkoviruskantaa heikennetään sarjasiirtämällä sitä ainakin 15 kertaa kanin primäärisissä munuaiskudosviljelyissä. On havaittu, että tällä tavoin viljelemällä vihurirokkovirusta kanin munuaiskudosviljelmässä saavutetaan parempi virulenssin heikkeneminen verrattuna aikaisemmin tähän tarkoitukseen käytettyjen kudosviljelmien käyttöön. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan modifioitu virus ja siten samalla rokote, jolla on korkea antigeenisyys, ja joka ei aiheuta huomattavampia ei-toivottuja reaktioita sillä rokotettuihin lapsiin. Ei-toivottujen reaktioiden esiintyminen, ja näistä erityisesti viruksen mandollinen leviäminen sillä rokotettujen ihmisten välityksellä, on yksi suurimmista ongelmista elävän vihurirokko-rokotteen kehittämisessä. On tunnettua, että sellaisten jälkitautien ohella kuin aivotulehdus ja trombosytopeeninen purpura, jotka ovat vakavia, mutta melko harvinaisia, ja niveltulehdus, joka on tavallisempi, mutta yleensä rajoittuu itsestään ja on lyhytaikainen, kohtalokkain tämän taudin jälkiseuraus on sen vaikutus epämuodostumien syntymiseen. Vihurirokko on todella vakava tauti naisilla heidän raskautensa 3:n ensimmäisen kuukauden aikana, koska se voi aiheuttaa synnynnäisiä epämuodostumia sikiössä, kuolleena syntymisiä ja keskenmenoja. Tässä mielessä on tärkeätä, että lapsi, joka on saanut elävää vihurirokko-rokotetta, ei muodosta mandollista vaaraa kenellekään raskaana olevalle naiselle, jonka kanssa hän voi joutua kosketuksiin. Tähän asti on ainoina mandollisina keinoina tällaista vihurirokon aiheuttamaa sikiön vaurioitumista vastaan ollut joko gammagiobuliinin anto suurina annoksina mandollisen tartunnan saaneelle raskaana olevalle naiselle, tai nuorten tyttöjen tartuttaminen vihurirokkoon, ennen kuin he saavuttavat lapsensaanti-iän. Gammaglobuliinin lääkkeeksi antoa ei kukaan asiantuntija voi pitää kovin tehokkaana käsittelynä, eikä taudin tartuttamista aikaisemmalla iällä voida, kuten hyvin käsitetään, pitää hyväksyttävänä ratkaisuna kysymykseen.

3 Nyt on yllättäen huomattu, että vihurirokko-viruksen sarjasiirrot primäärisissä kanin munuaiskudosviljelmissä (KM) eivät ainoas - taan aiheuta virulenssin heikentymistä, vaan tuovat myös esiin menetelmän, jolla voidaan valmistaa heikennettyä elävää vihurirokko-virusrokotetta, jolla ei ole mitään huomattavampia ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Sanonnalla "ei-toivottuja sivuvaikutuksia", jota yllä käytettiin, ei käsitetä ainoastaan sitä, että tämän keksinnön mukainen rokote saa aikaan immuniteetin ilman, että syntyy tavallisia vihurirokon aiheuttamia taudin oireita, vaan myöskin sitä, että kliinisissä kokeissa, joita tehtiin tämän keksinnön mukaisella rokotteella, ei havaittu mitään serologista tai virologista näyttöä tartunnasta, joka olisi tapahtunut rokotetun kanssa läheisessä kosketuksessa olleeseen. Niinpä tämän keksinnön tarkoituksena on tuoda esille menetelmä vihurirokko-viruksen virulenssin heikentämiseksi, ilman, että se menettää antigeenisyyttään, ja sanottu menetelmä käsittää vihurirokko-virus kannan sarjasiirron vähintään 15 kertaa primäärisessä kanin ~uaiskudosviljelmässä. Edelleen on esillä olevan keksinnön tarkoituksena saada aikaan (1) heikennettyjä eläviä vihurirokko-viruksia käyttäen mainittua heikentämismenetelmää ja (2) rokotetta, joka tehoaa vihurirokkoon, ja jonka tehoaineena on sanotulla heikentämismenetelmällä aikaansaatu heikennetty vihurirokkovirus. Tämän keksinnön mukaan vihurirokko-virus käy lävitse tarpeeksi monta sarjasiirtoa primäärisessä kanin munuaiskudosviljelmäss2, jotta heikentyminen saavutettaisiin. On todettu, että heikentyminen vaatii vähintään 15 sarjasiirtoa, ja edullisimmin noin 20:stä noin 60:een sarjasiirtoa, jotka siirrot suoritetaan lämpötiloissa, jotka eivät ylitä 36 C. Tämän keksinnön edullisessa sovellutuksessa kunkin siirron kestoaika on 3-6 päivää. Sopivasta siirrosta primäärisiin soluihin valmistetaan sitten rokote käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä. Vihurirokko-virus, jota tämän keksinnön sovellutuksessa käytetään, eristetään tyypillisestä sairastapauksesta käyttäen esimerkiksi kurkusta kaapimalla otettua näytettä, virtsanäytettä tai suunhuuhtelunäytettä. Näytteet joko jäädytetään välittömästi ja säilytetään -60 C:ssä käyttöön asti tai ympätään välittömästi sopivaan kudosviljelmään, esim. afrikkalaisen vihreän apinan munuaisen (VAM) solupohjaan (monolayer) tai mihin tahansa muuhun alalla tunnettuun tällaisessa viruksen eristämisessä käytettyyn kudosviljelysysteemiin. Vihurirokko-viruksen esiintyminen tarkistetaan ymppäämällä

4 viljelmiin esimerkiksi enterovirusta kuten Echovirus 11 tai Coxsackievirus A 9 9:tenä tai 10:tenä päivänä vihurirokko-virus-ymppäyksen jälkeen. Käyttäen erityistä antiseerumia, jota oli valmistettu kaneissa tunnettua VV kantaa vastaan, on mandollista identifioida vihurirokkovirus spesifisellä neutralisointikokeella sopivissa soluissa kuten VAM-soluissa. Mandollisten vieraiden apinavirusten poissaolo tarkistetaan VAM-soluilla neutraloinnin jälkeen spesifisellä VV antiseerumilla, joka on valmistettu toisessa solusysteemissä. Primääriset kanin munuaissolu-viljelmät sarjasiirtoja varten valmistetaan edullisimmin sellaisten eläinten munuaisista, jotka ovat alle 3 viikon ikäisiä. Edullinen elatusaine primääriselle KM viljelmille on Hanks'in tasapainoitettu suola-elatusaine, jossa on inaktivoitua vasikan seerumia, laktalbumiini-hydrolysaattia ja tryptoosifosfaatti-lientä, kuitenkin voidaan käyttää myös muita alan ammattiihmiselle tunnettuja elatusaineita. Kasvatuslämpötilan on oltava korkeintaan 36 C. Sarjasiirrot suoritetaan ymppäämällä KM solukerrokset määräosalla edellisen siirron viljelyliuosta, ja virusten talteenotto tapahtuu edullisimmin 3. ja 6. päivän välillä ymppäyksestä. Talteenotetun viruksen titraus voidaan suorittaa käyttäen interferenssimenetelmää VAM viljelmäputkissa, käyttäen esim. echovirusta 11 tai coxsackievirusta A 9, kuten edellä on osoitettu viruksen eristämisen yhteydessä. Määrätyssä sarjasiirtojen vaiheessa, ei ennen 15 ja edullisimmin noin 20:nnen ja noin 60:nnen siirron välillä, poistetaan ympättyjeri viljelmien viljelyliuos kuudentena päivänä ymppäyksen jälkeen, ja solukerrokset pestään puskuroidulla suolaliuoksella, esim. Eaglen tai Hanks'in liuoksella, ja niitä haudotaan edelleen elatusaineessa, esim. Hanks'in elatusaineessa, johon on lisätty kaseiinihydrolysaattia. 3:n päivän hautomisen jälkeen otetaan viljelyliuos talteen ja kirkastetaan joko suodattamalla tai sentrifugoimalla. Vaihtoehtoisesti voidaan viruksen talteenotto tehdä jäähdytyksen ja sulamisen jälkeen ravistamalla viljelmää elatusaineessa sekä senjälkeen sentrifugoimalla tai suodattamalla. Saatu VV, johon on saatettu lisätä stabilointilisäainetta, voidaan varastoida jäätyneenä, esim. noin -60 C:ssä tai kuivajäädytettynä. Saatua rokotetta annostetaan subkutaanisti tai intramuskulaaristi, jos tarpeen rekonstituoituna. Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä. Esimerkki 1 3 viikon ikäinen kaninkasvattamon kani tutkitaan, jotta todettaisiin, ettei siinä ole patologisia muutoksia, ja tapetaan. Molemmat

5 munuaiset poistetaan aseptisesti ja leikellään pieniksi palasiksi, jotka saatetaan kosketuksiin puskuroidun suolaliuoksen kanssa, joka sisältää trypsiiniä (2.5 gin, ja seosta sekoitetaan jatkuvasti 10 minuutin ajan 37 0C:ssä. Neste kaadetaan tämän jälkeen pois ja tilalle pannaan yhtä suuri määrä tuoretta trypsiiniliuosta. Trypsinointia jatketaan, kunnes kudos on hävinnyt, ja suspendoituneita soluja sisältävä neste otetaan erilleen pari kertaa trypsinoinnin aikana ja sentrifugoidaan. Saatu solulaskeuma suspendoidaan uudelleen Hanks'in liuokseen ja sentrifugoidaan jälleen. Tämä viimeinen työvaihe toistetaan kandesti, ja lopullinen solulaskeuma suspendoidaan kasvuväliaineeseen, joka sisältää Hanks'in tasapainoitettua suolaliuosta, jossa on 10 % inaktivoitua vasikan seerumia, 0.5 % laktalbumiinihydrolysaattia ja 0.1 % tryptoosifosfaatti-lientä, sellaisessa määrin, että saadaan väkevyys noin 10 5 solua per ml. Saadusta solususpensiosta otetaan määräsuuruisia näytteitä, jotka sisältävät kukin 10 5 solua, nämä kaadetaan 10 kasvuputkeen (12 mm läpimitta), ja niitä haudotaan vinossa asennossa 37 C:ssa 4 päivää. Tämän kasvatusajan kuluttua on muodostunut täydellinen solupohja. Kasvuaine korvataan sitten yhtä suurella tilavuudella tuoretta kasvuainetta juuri ennen virus-ymppäystä. Samaa kasvuainetta käytetään ennen virus-ymppäystä ja sen jälkeen, ja jokainen primäärinen KM soluviljelmä, joka tässä esimerkissä esiintyy valmistetaan yllä kuvatulla tekniikalla. Määräsuuruisia näytteitä (0.1 ml) vihurirokko-viruskannasta, joka on eristetty primäärisestä VAM viljelmästä, ja on käynyt lävitse 3 siirtoa tässä systeemissä, ympätään sen luonteen lähemmäksi tutkimiseksi primäärisiin KM-viljelysputkiin, joita haudotaan vinoasennossa 34 0 C:ssä. Kuudentena päivänä ymppäyksestä otetaan erilleen erottunut neste, ja saatu virus identifioidaan ja titrataan edellä kuvatulla interferenssimenetelmällä. Tiiteri VAM-soluissa tämän ensimmäisen siirron jälkeen KM-soluihin on 10 2.83 InD 50 per ml. Näytteitä yhdistetyistä ensimmäisen

siirron pintanesteistä ympätään toisiin primäärisiin KM-viljelmäputkiin, joita haudataan 34 C:ssa. Kuudentena päivänä ymppäyksestä otetaan pintaneste talteen. Virus titrataan kuten ensimmäisen siirron lopussa. Tämä toimenpide toistetaan aina 20. siirtoon asti, ja jokaisen yksittäisen siirron hautoma aika on 3-5 päivää. Yhdeksännestä siirrosta eteenpäin havaitaan primäärisissä KM soluissa sytopaattista vaikutusta. 21. siirtoa varten KM-soluihin valmistetaan primäärisiä KM soluviljelmiä 500 ml:n Roux pulloihin käyttäen edellä kuvattua valmistusmenetelmää. Kolmen päivän haudonnan jälkeen 36 C:ssä, saadaan täydellinen solukerros. Pintaneste poistetaan ja sen sijalle pannaan yhtä suuri tilavuusmäärä samaa elatusainetta, tähän ympätään 20. siirron virusta. Kun on jälleen haudottu 6 päivää 34 C:ssä, poistetaan pintaneste ja sen tilalle pannaan yhtä suuri tilavuusmäärä elatusainetta, joka koostuu Hanks'in liuoksesta, johon on lisätty 0.3 % kaseiinihydrolysaattia. Haudotaan jälleen 3 päivää 34 C:ssä, minkä jälkeen pintaneste otetaan talteen ja kirkastetaan sentrifugoimalla. Tästä otetaan näytteitä titraukseen, identifiointiin ja turvallisuuskokeisiin. Virusta säilytetään 60 C:ssä. Viruksen tiftteri on 10 5 InD50 per ml, kuten on saatu kokeessa primäärisillä VAM soluilla interferenssimenetelmällä.

Tämän virusaineksen vaarattomuus, s.o. sen bakteeri- steriliteetti ja mandollisten epäpuhtauksien läsnäolo tutkitaan ymppäämällä sitä kaneihin, hamstereihin, marsuihin, hiiriin ja apinoihin. Lisäksi suoritetaan turvallisuuskokeita erilaisissa kudosviljelmissä. Alustava tehon tutkiminen suoritetaan ymppäämällä kaneihin ja apinoihin 10 3.5 InD50. Seerumin neutralointi-(sn) kokeet tehdään VAM soluissa. Tulokset nähdään seuraavista taulukoista I ja II. Taulukko I Vasta-aineen muodostuminen apinoille, joihin on ympätty intramuskulaaristi 10 3.5 InD 50 Apina Ennen ymppäystä SN kokeen tulokset kun käytetään30 InD 50 n otettu seerum- VAM soluissa näyte 14X 25' 32 451r 225 <1/4 EM 1/8 1/16 1/16 509 <1/4 EM 1/4 1/16 1/32 611 <1/4 c1/4 1/8 EM 1/32 831 qic1/4 1/4 1/32 EM 1/32 619 <1/4 1/4 1/8 EM 1/16 857 <1/4 1/4 1/8 EM 1/16 1064 <1/4 EM 1/32 EM 1/64 953 <1/4 EM 1/16 EM 1/32 1053 ir.1/4 EM 1/4 EM 1/8 EM = ei määritetty X päivää ymppäyksen jälkeen

Taulukko II Vasta aineen muodostuminen kaneilla, joihin on ympätty subkutaanisti 10 3.5 InD 50 Kani Ennen ymppäystä otettu seerum näyte SN kokeen tulokset kun käytetään 30Infil 0 VAM suluissa 24 päivän kuluttua ymppäyksestä. 1-1/4 71/8 2 <,1/4 ;1/8 3 <1/4 1/16 4.=.1/4 1/8 5 <1/4 <fl./8..., 6 <1/4 1/16 7 <1/4 1/16 8 <1/4 1/8 Virusvalmiste jaetaan lasipulloihin, 1 ml nestettä kuhuddi. Pullot sisältöineen kylmäkuivataan ja suljetaan. Rekonstituoituina lisäämällä niihin 1 ml tislattua vettä, rokotteita annetaan subkutaanisti tartunnalle alttiille henkilöille annosten ollessa noin 125 InD 50. Tulokset serologisen vaikutuksen kokeilusta, joka suoritettiin 25 seronegatiivista lasta käsittävällä ryhmällä (15 sai rokotetta ja 10 lähiyhteydessä elävää olivat kontrolleina) nähdään taulukossa III 15:sta rokotetusta lapsesta 13:11a nousi vasta aineiden määrä 1/32:een tai yli (2 koehenkilöä, ND-taulukossa III, eivät olleet tavattavissa kokeen ottohetkellä). Kenelläkään ei ollut tartuntaoireita. Kaikki 10 lähiyhteydessä elävää pysyivät serologisesti negatiivisina.

Taulukko III Serologinen vaikutus ilmoitettuna vasta aineiden seroneutralointitiiterinä. Henkilö Ikä (vuosia) Ennen rokotusta otettu näyte Tila 56 päivää rokotuksen jälkeen S.M. 2 1/2 i:4 V 32 V.S. 2 <4 V it.32 M.J. 2 <4 V -,m32 N.R. 2 <4 V 32 H.A. 1 <4 V.g 32 DB.G 2 <4 C <:. 4 VN.L 2 <4 C.c.4 R.F. 2 <4 V C 32 B.D. 2 <4 C <.4 J.A. 1 1/2 <4 C 4 V.M. 1 <4 V.4-.32 E.P. 1 <.4 V 4L32 L.T. 1 <4 C <... 4 C.C. 1 <4 V.4:32 A.M. 1 <4 V.5.32 R.O. 1 <4 C de.:. 4 L.A. 2 <4 V ND D.A. 2 <4 C.4=-4 G.O. 2 1/2.0 C -c: 4 M.A. 2 1/2 <4 V ND J.A. 1 <4 C <. 4 P.A. 2 1/2 <4 V <32 D.B. 3 1/2 <4 V 32 GB.K 5 <4 V 8 GB.F 4 '.1 C..gz4 V = rokotettu C = yhteydessä ollut ND = ei ollut tavattavissa kokeen ottohetkellä

10 Esimerkki 2 Käytetään samaa menettelytapaa kuin esimerkissä 1, erona on siirtojen jatkaminen aina 30. siirtoon KM soluvil - jelmissä. Tästä valmistetaan rokote, jonka vaarattomuus tutkitaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Valmisteen teho tutkitaan eläinkokeissa (apinat). Tulokset nähdään taulukossa IV. Taulukko IV Vasta aineen muodostuminen apinoilla, joihin on ympätty intramuskulaaristi 10 2.5 InD50. Apina Ennen ymppäystä otettu SN kokeen tulokset kun käytetään n seerumnäyte 10 InD50 VAM soluissa 25A' 39x 1098 <-1/4 1/8 EM 1091..1/4 1/8 EM 919 <1/4 1/8 1/8 943.c1/4 1/16 1/16 päivää ymppäyksen jälkeen. Esimerkki 3 Käyttäen lähtbaineena virusainesta esimerkin 1 21:sestä siirrosta 34 C:ssä, suoritetaan vielä 9 sarjasiirtoa primäärisiin KM soluviljelmiin 28 C:ssä, viimeinen rokotteen valmistusvaihe mukaan laskettuna. Saadulla rokotteella tutkitaan sen vaarattomuus, ja sitä ympätään apinoihin ja kaneihin tehon tutkimiseksi. Tulokset nähdään seuraavissa taulukoissa V ja VI.

11 Taulukko V Vasta aineen muodostuminen apinoilla, joihin on ympätty intramuskulaaristi 10 2.0 InD 50. Apina Ennen ymppäystä otettu SN kokeen tulokset kun käytetään n seerumnäyte 10 InD50 VAM soluissa 25X 39 3( 1003 <1/4 1/8 1/16 977 <1/4 1/8 1/8 X päivää ymppäyksen jälkeen. Taulukko VI Vasta aineen muodostuminen kaneissa, joihin on intra muskulaaristi ympätty 10 2. InD 50. Kani Ennen ymppäystä otettu SN kokeen tulokset kun käytetään n seerumnäyte 10 InD50 VAM soluissa 26 )( 29 <1/4 1/8 30 <1/4 1/4 31 <1/4 1/16 32 <1/4 1/8 33 <1/4 1/4 X päivää ymppäyksen jälkeen. Esimerkki 4 Menettelytapa on sama kuin esimerkissä 1, sarjasiirtoja jatketaan kuitenkin aina 51:seen siirtoon asti primäärisissä KM soluviljelmissä, ja viimeinen elatusaine sisältää Hanks'in 'Juosta, jossa on lisänä 0.3% kaseiinihydrolysaattia,

12 ja joka sisältää 50 mcg kloramfenikolia Hanka'in liuoksen ml:aa kohti. Kun on haudottu 9 päivää 34 C:ssä, otetaan viljelyliuos talteen, kirkastetaan sentrifugoimalla, ja siihen sekoitetaan yhtä suuri tilavuusmäärä stabilointiliuosta, joka sisältää 30g kaliumpr,lutamaattia, 200g sakkaroosia ja 50 mg kloramfenikolia litrassa tislattua vettä. Seos jaetaan lasipulloihin, joissa on 1 ml vettä. Pullot sisältöineen kylmäkuivataan ja suljetaan. Rekonstituoituina lisäämällä 1 ml tislattua vettä, ja rokotetta annetaan subkutaanisti 65:11e seronegatiiviselle koehenkilölle, jolloin kerta-annosten titraustulos on noin 10 2.6 InD 50 VAM suluissa tai 10 3.7 PFU (Plaque forming units = täpliä muodostava yksikkö) KM 13 soluissa. 30 lapsen seronegatiivista ryhmää pidettiin läheisessä kosketuksessa rokotettujen kanssa 6 viikon ajan. Serologisessa tutkimuksessa, joka suoritettiin 65 rokotetun henkilön ryhmällä, osoittautui, että rokote vaikutti kaikkiin muihin paitsi yhteen, ja yleinen vasta-aine-tiitteri oli 1/128, kuten HAI (hemagglutinmtb inhibitio) kokeesta ilmeni. Kenessäkään ei näkynyt kliinisiä tartunnan merkkejä. Kaikki 30 kosketuksissa ollutta pysyivät serologisesti negatiivisina. Esimerkki 5 Menettelytapa on sama kuin esimerkissä 1, sarjasiirtoja jatketaan kuitenkin aina 61:seen siirtoon asti primääreissä KM soluviljelmissä, ja viimeinen elatusaine sisältää

Hanks'in liuosta, jossa on lisänä 0.3% kaseiinihydrolysaattia, ja joka sisältää 50 meg kloramfenikolia Hanks'in liuoksen ml:aa kohti. Kun on haudottu 9 päivää 34 C:ssä, otetaan viljelyliuos talteen, kirkastetaan sentrifugoimalla, ja siihen sekoitetaan yhtä suuri tilavuusmäärä stabilointiliuosta, joka sisältää 30g kaliumglutamaattia, 200g sakkaroosia ja 50 mg kloramfenikolia litrassa tislattua vettä. Seos jaetaan lasipulloihin, joissa on 1 ml vettä. Pullot sisältöineen kylmäkuivataan ja suljetaan. Rekonstituoituina lisäämällä 1 ml tislattua vettä, rokotetta annetaan subkutaanisti seronegatiivisille koehenkilöille, jolloin yksilöllisten annosten titraustulos on noin 10 2.83 InD 50 VAM soluissa tai 10 3.9 PFU KM 13 soluissa. Serologisessa tutkimuksessa, joka suoritettiin 7 seronegatiivisen koehenkilön ryhmällä, osoittautui, että rokote vaikutti kaikkiin yleisen tiitterin ollessa 1/64, kuten HAI kokeesta ilmeni. Kenessäkään ei näkynyt kliinisen tartunnan merkkejä.

14 Patenttivaatimukset: 1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi vihurirokkoa vastaan, joka rokote sisältää aktiivisena aineosana heikennettyä elävää vihurirokko-virusta, joka on saatu viljelemällä vihurirokkoviruskantaa kanin munuaiskudosviljelyssä, jolloin rokote on valmistettu halutusta siirroksesta sinänsä tunnettuun tapaan, tunnettu siitä, että mainittua vihurirokkoviruskantaa heikennetään sarjasiirtämällä sitä ainakin 15 kertaa kanin primäärisissä munuaiskudosviljelyissä. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sarjasiirtojen lukumäärä kanin primäärisissä munuaiskudosviljelyissä on 20-60. 3. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä, t u n - nettu siitä, että mainitut sarjasiirrot suoritetaan lämpötilassa korkeintaan 36 C. 4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, tunnett u siitä, että kunkin sarjasiirron kestoaika on korkeintaan 5 päivää.

1 5 Patentkrav: 4 36 25 1. Förfarande för framställning av ett vaccin mot röda hund, vilket vaceåi innehåller säsom aktiv beständedel försvagat, levande röda hundsvirus, som har erhållits genom att odla en etam av röda hundsvirus i en kaninnjurvävnadakultur, varvid vaccinet har framställts ur den önskade passagen pä i och för sig känt sätt, k ä n n e t e c k n a t därav, att den nämnda stammen av röda hundsvirus försvagas genom åtminstone 15 seriepassager i primära kaninnjurvävnadskulturer. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att antalet seriepassager i de primära kaninnjurvävnadskulturerna är 20-60. 3. Förfarande enligt patentkraven 1 och 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att passagerna utföras vid en temperatur av högst 36 C. 4. Förfarande enligt patentkraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t därav, att varaktigheten hos var och en av seriepassagerna är högst 5 dagar. Viitejulkaisuja-Anförda publikationer Patenttijulkaisuja:-Patentskrifter: USA 2915436 (167-78) Muita julkaisuja:-andra publikationer: New Eng. J. Med. 275(1966) 569-580