VII KÄÄNTEISTRANSSKRIPTIO, RESTRIKTIO JA GEENITEKNOLOGIAN ALKU

Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAN LUENNOT VII 1 VII KÄÄNTEISTRANSSKRIPTIO, RESTRIKTIO JA GEENITEKNOLOGIAN ALKU A RNA virukset ja niiden lisääntymistavat,( retrovirukset) Tutkiessaan sarkooman syntymistä kanalla Peyton Rous huomasi 1911, että sairaus siirtyi solujen kautta, mutta myös soluvapaa uute synnytti sarkooman, siis sarkooma on ilmeisesti viruksen välittämä. Rousin löytöön ei uskottu ja Rous itsekin lopettitutkimuksen 10 v. myöhemmin. Jo vähän aiemmin V. Ellerman ja O. Bang (Kööpenhamina) olivat löytäneet RNA-viruksen, joka aiheutti leukemiaa kanassa, mutta se oli vaikea tutkia. Vasta 30 v. myöhemmin Ludvik Gross (Veterans Hosptl Bronx) huomasi, että sama Rousin sarkoomavirus aiheutti leukemian hiirissä, ja kiinnostus virukseen alkoi uudelleen. Havaittiin sen aiheuttavan tuumoreita ja leukemiaa monilla lajeilla. 1950-luvulla siirryttiin soluviljelmiin mm. Robert A. Manaker ja Vincent Groupé (Rutgers Univ.) ja Harry Rubin & Howard Temin (Cal Tech). Havaittiin, että Rousin sarkoomavirus ei tapa solua lisääntyessään siinä. 1960 Temin lisäsi sarkoomasoluihin aktinomysiini D:tä, joka esti kaiken transskription. RNA-virukset kuitenkin lisääntyivät RNA-->RNA replikaation avulla, paitsi Rousin sark. virus, jonka lis. pysähtyi transskription loppumisen myötä. Temin kehitti DNA-välivaihe- ja DNA-provirushypoteesit. Natl. Cancer Instituutissa (NCI) H.Temin ja John P. Bader kokeilivat DNA-synteesin estämistä kemikaalien avulla (amethopterin, Fluorodeoxyuridin, cytosine arabinoside) viruksen lisääntymiskierrossa. Nämä kokeet osoittivat, että Rousin sarkoomavirus tarvitsee tosiaan DNA-välivaiheen, jonka templaattina toimi Howard Temin virus RNA. David E. Böttiger ja Temin (NCI) ja toisaalla Piero Balduzzi ja Herbert R. Morgan (Univ. Rochester Medical School) onnistuivat erottamaan viruksen RNA-->DNA synteesin solun DNA-->DNAsynteesistä. Hybridisaatiokokein Marcel A. Baluda ja Debi P. Noyak (UCLA) osoittivat virus-dna:n ja virus RNA:n vastaavuuden. Peyton Rous sai Nobel-palkinnon 1966 85-vuotiaana 55 vuotta sarkoomavirus-löytönsä jälkeen. B Peyton Rous Käänteistransskriptio, ja syöpägeeni 1969 Satoshi Mitsutani & Temin havaitsivat RNA:ta mallina käyttävän DNA-polymeraasin, jonka he sitten eristivät ja kokeilivat sillä RNA-->DNA synteesiä virus-rna-templaattia käyttäen. Tulokset esiteltiin toukokuussa 1970 (10. Internatl. Cancer Congress, Houston, Texas), jolloin ilmeni myös, että David Baltimoren ryhmä MIT:ssä (=Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Mass., USA) oli tehnyt samanlaiset kokeet hiiren leukemia viruksella. Käänteistransskriptaasi (jonka ensimmäisinä olettivat Sylvia Lee Huang ja Liebe F. Cavalieri; Sloan Kettering Inst., NY) löydettiin sittemin monilta RNA-viruksilta. Varsinaisen onkogeenin, Rous sarkoomavirus-syöpägeenin =src-geenin löysi G. Steven Martin (UC, Berkeley) 1970, sen paikka määritettiin ( Peter H. Duesberg (UC, Berkeley ) sekä Charles Weissmann, Martin Billeter ja John M. Coffin, (Univ. of Zürich) käyttäen Peter K. Vogt in (Univ. of Southern Calif.,LA) deleetiokantaa, josta geeni puuttuu. Vastaavan src-proteiinin rakennetta on selvittänyt R.L. Erikson (Univ. Colorado, School of Med.), joka yhdessä Mark S. Collettin kanssa ja toisaalla Arthur Levinson, Harold E. Varmus ja J. Michael Bishop (UC, School of Medicine, San Francisco) David Baltimore

Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAN LUENNOT VII 2 osoittivat sen entsyymiksi (proteiinikinaasi). Robert J. Huebnerin ja George J. Todaron (NCI) onkogeeniteoriaa on sittemmin testattu (mm. 1972 Dominique Stehelin, Varmus ja Bishop, sekä Deborah H. Spector, Richard C. Parker ym.) viral oncogen = cellular oncogen; Hidesaburo Hanafusa ym. (Rockefeller Univ.); havaittiin, että puutteellinen v-src korjautuu solun c-src:stä rekombinaation avulla. Sittemmin on löydetty ja karakterisoitu suuri joukko retrovirusten onkogeenejä. Werner Arber C Restriktio Ensimmäiset vihjeet restriktiosta saatiin 1950-luvun alussa. Max Delbrück ja Salvador E. Luria huomasivat, että tietyt bakteriofagi-kannat eivät pysty infektoimaan kaikkia bakteerikantoja; ilmiö nimettiin: Host-controlled restriction-modification, julkaisuja mm. Luria & M.L. Human 1952, Anderson & Felix -52, Ralston & Krueger -52, Bertani & Weigle 1953). 1962 Werner Arber, Grete Kellengerger ja Daisy Dussoix (Univ. Geneve ja Universität Basel) huomasivat, että bakteeri kannoissa oli vierasta fagi-dna:ta pilkkovaa entsyymiä, vain pieni osa fagi-dna:sta välttyy pilkkomiselta modifioitumalla. Bakteerin oma DNA, ja siihen erikoistuneen oman fagin DNA eivät sisällä entsyymin tunnistuskohtia. 1968 Steward Linn ja Werner Arber tunnistivat ensimmäisen restriktioendonukleaasin (Eco I B:n). Matt Meselson ja Yuan (Harvard Univ.) löysivät toisen r- endonukleaasin (Eco I K:n), mutta nämä molemmat olivat tyyppiä I, eli ne tunnistivat tietyn kohdan, mutta katkaisivat juosteet eri kohdasta sattumanvaraisesti. 1968-69 Johns Hopkinsin yliopistossa, Baltimoressa (Md, USA) Hamilton O. Smith ja Kent W. Wilcox löysivät uuden r-endonukleaasin fagi P22 vastaan Haemophilus influenzae Rdbakteerikannassa. Wilcox joutui Vietnanmin sotaan ja Thomas J. Kelly Jr. tuli jatkamaan entsyymin eristämistä. Smith ja Kelly, Jr. osoittivat sen olevan tyyppiä II (H in d II), joka tunnistaa ja katkaisee samasta kohdasta. Kohta määritettiin se oli pieni palindromi. Myöhemmin on löydetty suuri joukko IItyypin r-endonukleaaseja. Israelissa sabattivuotta viettänyt Johns Hopkinsin tutkija Daniel Nathans sai kuulla uudesta entsyymistä ja päätti kokeilla sitä SV 40 virukseen, jota hän oli kartoittamassa. 1971 D. Nathans, K.J. Danna ja G.H. Sack, Jr. osoittivat, että II tyypin restriktioentsyymejä voi erinomaisesti käyttää genomikartoitukseen. Werner Arber, Hamilton O. Smith ja Daniel Nathans saivat Nobel-palkinnon 1978. Smith ja Nathans olivat ensimmäiset Nobelin saaneet Johns Hopkinsin omat tutkijat (aiemmat kuten T.H. Morgan olivat vain lyhyen aikaa opiskelleet tai väitelleet Johns Hopkinsissa). Phii X 174 viruksen 10 geenin paikantaminen osoitti, että viruksen DNA:ssa geenit voivat olla osittain päällekkäin vastakkaisissa juosteissa. Hamilton Smith ja David Nathans

Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAN LUENNOT VII 3 D Kloonaus ja sekventointi Paul Berg ym. (Stanford Univ.) onnistuivat ensimmäisenä liittämään lambda-fagin DNA:han SV 40 tuumorivirus-dna:ta. Koska syöpägeenien liittäminen E.colissa lisääntyvään fagiin näytti vaaralliselta National Academy of Sciences järjesti Asilomarissa (Monterey, Cal.) helmik. 1975 konferenssi rekombinantti-dna:n tutkimukseen liittyvistä vaaroista, ja NIH julkaisi viralliset ohjeet kokeista bakt. kannoista ja koeolosuhteista. Kloonausta varten on kehitelty patentoituja vektoreita kuten esim. puc 118 ja puc119 (plasmid University of California, kehittäneet J. Messing ja J. Vieira). Messing ym. käyttivät fagia M13, jonka DNA on yksi-juosteinen (kuten phiix174); 1-juosteinen vaihe voidaan sekventoida ja kaksijuosteinen replikaatiovaihe (RF) käytetään liitoksiin. Messing et al. insertoivat M13:een lacz bakteerigeenin, jossa on monia restriktioentsyymien tunnistuskohtia ja samalla kloonattavan DNA:n liitoskohtia. Myöhemmin on kehitelty vektoreita hiiva-, eläin-, ja kasvisoluille. DNA:n sekven-tointimenetelmät kehitettiin 1980- luvulla Frederick Sanger ja Alan Coulson (Cambridge,UK) kehittivät plus & minusmenetelmän, jota sittemmin on paranneltu (Sanger, Coulson ja S. Nicklen; dideoksi-2,3 -menetelmä) Walter Gilbert ja Allan Maxam (Harvard) kehittivät ns. kemiallisen menetelmän, jossa DNA katkaistaan tiettyjen emästen kohdalta. Sanger ja Gilbert saivat menetelmistään Nobel-palkinnon. E Geeniteknologia ja geenien siirto Stanley N. Cohen ja Herbert Boyer kehittelivät ensimmäiset patentoidut tekniikat lääke-ym.aineiden tuottamiseksi (Genentech, Cal.), Monsanto Co. on tuottanut mm. kasvien virusresistenssiä parantavia geeniteknologisia valmisteita jne. Onnistuneista geeninsiirroista mainittakoon esim. seuraavat: 1982 Richard D. Palmiter, Ralph L. Brinster ym. julkaisivat rotan kasvuhormonigeenin siirron hiireen ja 1986 D.W. Ow, Keith v. Wood, Marlene DeLuca, Jeffrey R. Dewet, Donald R. Helinski ja Stephen H. Howell julkaisivat tulikärpäsen lusiferaasigeenin siirron tupakkakasviin. F DNApolymeraasiketjureaktio Walter Gilbert ja Fred Sanger 1979 Cetus Corporation (Emeryville, California) palkkasi biokemisti Kary B. Mullis in (UC, San Franciscon Med. Schoolista) syntetoimaan oligonukleotideja. Huhtikuisena perjantai-iltana 1983 ajaessaan mökilleen rannikkovuoriston punapuualueelle San Franciscosta pohjoiseen Mullis mietti työnsä tekniikkaa. Laskeutuessaan autollaan Anderson Valley:iin (California 128 tiellä, joka erkanee Cloverdale:ssä US 101:stä) Mullis yhtäkkiä keksi PCR:n eli Stanley N. Cohen Paul Berg

Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAN LUENNOT VII 4 polymeraasiketjureaktion mahdollisuuden. Mullis valmisteli kuukausia ratkaisevia kokeita ja hioi tekniikan Fred A. Faloonan kanssa. Kokeissa PCR onnistui yhä suuremmilla näytteillä. Keväällä 1984 Mullis valmisteli PCR patenttia ja esitti menetelmän posterissa Cetus Scientific Annual Meetingissä, mutta kukaan ei ollut kiinnostunut posterista. Lopulta Mullis huomasi näyttelyvieraiden joukossa Joshua Lederbergin (, joka silloin oli Rockefeller yliopiston presidentti) ja sai houkutelluksi hänet posterin ääreen. J.L. katseli tarkkaan posterin ja kysyi toimiiko se? Lopullisen läpimurtonsa uusi tekniikka sai Cold Spring Harborin Symp. Quant. Biol.:ssa kesällä 1986, (vol. 51 osa 1, 263-273; Mullis, Faloona, Scharf, Saiki, Horn, ja Ehrlich.) Lukemattomila biokemisteillä olisi ollut mahdollisuus keksiä PCR, mutta kukaan ei tullut sitä ajatelleeksi. Nykyään PCR-julkaisuja on tuhansia. Kary B. Mullis sai keksinnöstään Nobel-palkinnon, ja toimii nykyään alan konsulttina. G Kromosomikävely, inversiohypyt ja geenikartat D. Jackson, R. Symons ja P. Berg 1972, P.E. Lobban ja A.D. Kaiser 1973, N.E. ja K. Murray 1974 ym. kloonausmenetelmien kehittäjät tekivät mahdolliseksi kromosomien kartoituksen DNAtasolla. Drosophilan DNA:n kartoitus alkoi Stanfordissa ( P.C. Wensink, D.J. Finnegan, J.E. Donelson ja David S. Hogness 1974). Kromosomikävely rosy - Ace-geenien alueella (3R, 87DE) valmistui 9 v. myöhemmin ja käsitti 315000 emäsparia (Pierre Spierer, Ann Spierer, Welcome Bender, D. Hogness 1983, L.M.C. Hall, P. J. Mason & P. Spierer 1983). Se sisälsi myös inversiohypyn bithorax-kompleksin alueelle (3R;89DE), jota sittemmin on paljon tutkittu: mm. Bender, W., Akam, M., Karch, F., Beachy, P.A., Pfeifer, M., Spierer, P., Lewis, E.B. & Hogness, D.1983). Kolmas, jo alkuvaiheesta asti tehokkaasti tutkittu alue on ollut Antp (Antennapedia) (3R;84AB) ; USA:ssa (R.A. Lewis, B. T. Wakimoto, Thomas C. Kaufman, R.E. Denell; Scott, Matthew P., Weiner, A.J., Hazelrigg,T.I.ym. Walter J. Gehring Univ. of Indiana, Bloomington) ja Euroopassa: mm. Garber, R.L., Kuroiwa, A., Gehring, Walter J., Levine M., Hafen, E., McGinnis ym. (Biozentrum, Basel). Monista kehitysgeeneistä on löydetty Homeo-sekvenssi. Heidelbergissä Drosophilan alkion varhaisinta kehitystä ohjaavien geenien toimintaa tutkineet Christiane Nüsslein-Volhard (nyk. Tübingenissä) ja Eric F. Wieschaus (nyk. Princetonissa,USA:ssa) sekä mm. bithoraxkompleksin tutkija Cal Techin Morgan-professori Edward B. Lewis saivat tutkimuksistaan Nobelpalkinnon 1995. Satakunta Drosophilan geeniä oli jo sekventoitu 1990-luvun alussa ja paljon useampia kartoitettu restriktioentsyymien avulla, Valtaosa Drosohilan genomista oli kloonattu. Koko genomin sekventointi valmistui 2000-luvun alussa. Nykyään myös ihmisen ja n. sadan muun eliölajin koko genomin DNA:n emäsjärjestys on saatu selville. Geeni tutkijoita Cold Spring Harborin Symposiassa: alla Suzanne Bourgeois, Benno Müller-Hill, Walter Gilbert ja Mark Ptashne Tom Maniatis

Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAN LUENNOT VII 5 A. Efstradiatis ja Peter Wensink H Yleistä henkilö- ja tapahtumahistoriaa 1910 Peyton Rous osoitti soluvapaan sarkoomauutteen aiheuttavan sarkooman 1961 B.D.Hall & S. Spiegelman osoittivat DNA- RNAhybridin mahdolliseksi 1962 Watson, Crick, ja Wilkins saivat Nobelpalkinnon DNA:n rakenteesta ja M.F. Perutz & J.C. Kendrew hemoglobiinin ja myoglobiinin rakenteesta Werner Arber, D. Dussoix ja G. Kellenberger löysivät restriktioentsyymin 1965 R. W. Holley ym. selvittivät hiivan alaniini-s- RNA:n koko sekvenssin S. Brenner, A.O.W. Stretton & S. Kaplan saivat selville lopetuskodonit UAG ja UAA; Jacob, Monod & Lwoff saivat Nobel-palkinnon 1966 B. Weiss ja C.C. Richardson eristivät DNAligaasin Peyton Rous sai Nobel-palkinnon onkogeeni virustutkimuksistaan 1968 Hamilton O. Smith, K.W. Wilcox ja T.J. Kelly, Jr. eristivät ensimmäisen paikkaspesifisen restriktioentsyymin. Holley, Khorana ja Nirenberg saivat Nobelpalkinnon 1969 R.I. Huebner ja G.I. Todaro esittivät onkogeeni teorian Delbrück, Luria ja Hershey saivat Nobelpalkinnon 1970 Khorana ym. syntetoivat alaniini-siirtäjä- RNA:n geenin David Baltimore ja Howard M. Temin ilmoittivat käänteistransskriptaasista 1971 K. Danna ja Daniel Nathans tekivät retriktiokartan SV 40 :n DNA:sta 1972 Silkkiproteiinin messenger eristettin Bombyx mori:sta (Y. Suzuki & D.D. Brown) ja sitä tuottava fibroiinigeeni karakterisoitiin (Y.S., L.P. Gage ja D.D.Brown) R. Silber, V.G. Malathi ja J. Hurwitz löysivät RNA-ligaasin D.A. Jackson, R.H. Symons ja Paul Berg liittivät SV40 viruksen DNA:ta E. colin lambda-fagin DNA:han kloonausta varten. J. Hedgpeth, H. M. Goodman ja H.W. Boyer löysivät restriktiospesifisen sekvenssin lambda-fagin DNA:sta 1973 Ensimmäinen proteiinia koodaava geeni sekventoitiin (MS2-fagin kuoriprot.) W. Friers, W.M. Jou, G. Haegerman ja M. Ysebaert. Stanley N. Cohen, A.C.Y. Chang, Herbert W. Boyer ja R. B. Helling konstruoivat ensimmäisen toimivan DNA:n siirtoplasmidin (hybridiplasmidin) 1974 K.M. Murray ja N.E. Murray manipuloivat restriktiotunnistuskohtia lambdafagin DNA:ssa vieraan DNA:n liittämistä varten: ensimmäinen yleiskloonausväline saatiin aikaan. 1975 Maailman molekyylibiologit kokoontuivat Asilomarissa, Kaliforniassa rekombinantti-dna - kokeita koskevien ohjeiden laatimiseksi NIH Recombinant DNA Committee julkaisi ohjeet riskien poistamiseksi ja minimoimiseksi rekombinantti-dna-kokeissa. M. Grunstein ja D. Hogness kehittivät hybridisaatiomenetelmän kloonatun DNA:n tunnistamiseksi ja eristämiseksi, E.M. Southern kuvasi uuden menetelmän DNA-fragmenttien siirtämiseksi agaroosigeelistä nitroselluloosafiltteriin, josta hybridit saatiin esille radioaktiivisen RNA:n avulla. W. D. Benton ja R.W. Davis esittivät toisen menetelmän tiettyjen DNA-jaksojen tunnistamiseksi, Fred Sanger ja A.R. Coulson kehittivät ensimmäisen nopean menetelmän

Veikko Sorsa: PERINNÖLLISYYSTIETEEN HISTORIAN LUENNOT VII 6 DNA:n sekventoimiseksi; ( toisen sekventointimenetelmän keksivät 1977 Allan M. Maxam ja Walter Gilbert.) Rouxin sarkooma-viruksen onkogeeninen sekvenssi paikannetaan (L.H.Vang, P.H. Duesberg, K. Beemon ja P.K. Vogt) R. Dulbecco, H. Temin ja D. Baltimore saivat Nobel-palkinnon onkogeenisten virusten tutkimisesta. 1976 NIH julkaisi uudet ohjeet rekombinantti-dnakokeita varten Ensimmäinen genetic engineering yhtiö GENENTECH perustettiin Kaniinin hemoglobiinin alfa- ja beetta-ketjujen messenger-rna:ta vastaavat DNA:t syntetoitiin in vitro (A. Efstradiatis, F.C. Kafatos, A. Maxam ja T. Maniatis.) 1977 Fred Sangerin johtama 8 tutkijan ryhmä selvitti nukleotidijärjestyksen phix174 fagin koko genomista W. Gilbert indusoi bakteerisolun tuottamaan ei-bakt.proteiineja David S. Hogness, D.M. Glover ja R.L. White löysivät introneita 28S rrnageeneistä, aiemmin löydettyjen proteiinigeeniintronien; kaniinin beettaglobiini-geenin (A. Jeffreys ja R.A. Flavell) ja kanan ovalbumiinigeenin (R. Breathnach, J.L.Mandel ja Pierre Chambon;Strasbourg) lisäksi. 1978 Tom Maniatis, A.Efstradiatis ja kuusi muuta tutkijaa kehittivät geenien eristämis- ja tunnistamismenetelmän geenikirjastojen luomiseksi. V.B. Reddy ja 8 muuta tutkijaa julkaisivat täydellisen sekvessin SV40 viruksesta ja vertailivat geenien ja mrna:iden sekä proteiinien sekvenssit Werner Arber, Hamilton O. Smith ja Daniel Nathans saivat Nobel-palkinnon. 1979 Restriktioendonukleaasikartoitusta sovellettiin mitokondrio-dna:n vertailuun luonnonpopulaatioissa (J.C. Avise, R.A. Lansman ja R.O.Shade). NIH vähensi rajoituksia rek.-dnatutkimuksessa sallien mm. virus DNAtutkimuksen. E.F. Fritsch, R.M. Lawn ja Tom Maniatis selvittivät ihmisen globiinigeenien rakenteen. 1980 Geneettisesti manipuloitujen mikroorganismien patentointi sallittiin (United States Supreme Court). J.W. Gordon, G.A. Scangos,D.J. Plotkin,J.A. Barbosa ja F.H. Ruddle saivat aikaan transgeenisen hiiren. Paul Berg, Walter Gilbert ja Fred Sanger saivat kemian Nobel-palkinnon. 1979-86 Kary B. Mullis ym. kehittelivät PCR menetelmää DNA:n monistamiseksi.