QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja)

Maaliskuu 2017 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) Versio 1 72 Käytettäväksi Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM -instrumentin kanssa In vitro -diagnostiikkaan 616014 Self-screen B.V., Biothof 15-1, 1098 RX Amsterdam, ALANKOMAAT R3 1102323FI Sample to Insight

Sisältö Käyttötarkoitus... 4 Tiivistelmä ja kuvaus... 5 Menetelmän periaate... 5 Toimitetut materiaalit... 7 Sarjan sisältö... 7 Tarvittavat materiaalit jotka eivät kuulu toimitukseen... 7 Varoitukset ja huomautukset... 9 Turvallisuustiedot... 9 Yleiset varotoimet... 10 AssayManager-profiiliin liittyvät varotoimet... 11 Reagenssien säilytys ja käsittely... 11 Näytteen käsittely ja säilytys... 12 Näytteen valmistelu... 14 Protokolla: QIAsure Methylation -testin PCR-ajo Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM -laitteella.. 15 Tulosten tulkinta... 27 Ongelmien ratkaisu... 32 Rajoitukset... 35 2 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Suoritusarvot... 37 Havaitsemisraja (LOD)... 37 Lineaarisuus... 37 Tarkkuus... 37 Häiritsevät aineet... 38 Kliininen suorittaminen... 39 Robustisuus... 41 Kirjallisuusviitteet... 43 Symbolit... 43 Yhteystiedot... 44 Tilaustiedot... 45 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 3

Käyttötarkoitus QIAsure Methylation -testi on moninkertainen reaaliaikainen metylaatiospesifi PCR-testi geenien FAM19A4 ja hsa-mir124-2 promoottorien hypermetylaation tunnistamiseksi. QIAsure Methylation -testillä voi testata näytteitä, jotka sisältävät bisulfiittikonvertoitua DNA:ta, joka on peräisin irtosolunäytteistä. Näytteet voidaan ottaa seuraavilla tavoilla: Kohdunkaulan irtosolunäytteistä, jotka on otettu digene HC2 DNA Collection Device -laitteella (lääkärin ottama) Kohdunkaulan irtosolunäytteistä, jotka on otettu harjatyyppisellä näytteenottimella ja asetettu PreservCyt -liuokseen (lääkärin ottama) Emättimen irtosolunäytteistä, jotka on otettu harjatyyppisellä näytteenottimella (itse otetut) Käyttöindikaatiot: 1. Seurantatestinä naisille, jotka ovat saaneet positiivisen testituloksen ihmisen papilloomaviruksesta (HPV), jotta voidaan määrittää kolposkopialähetteen tai muiden seurantatoimenpiteiden tarve. 2. Seurantatestinä naisille, joiden Pap-testituloksissa on merkitykseltään epäselviä poikkeavia levyepiteelimuutoksia (ASC-US), jotta voidaan määrittää kolposkopialähetteen tai muiden seurantatoimenpiteiden tarve. Tämä tuote on tarkoitettu ammattilaisten, kuten laboratorioteknikoiden ja laboranttien käyttöön, jotka on koulutettu in vitro -diagnostiikkaan, molekyylibiologian tekniikoihin ja Rotor- Gene Q MDx 5plex HRM -järjestelmän käyttöön. 4 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Tiivistelmä ja kuvaus DNA:n metylaatio on biokemiallinen prosessi, joka on tärkeää kehittyneiden eliöiden normaalille kehitykselle (1). Metylaatiossa sytosiini-nukleotidin pyrimiidirenkaan 5. asemaan liittyy metyyliryhmä. DNA:n metylaation poikkeavuudet ovat merkittävä tekijä karsinogeneesissä. Useissa ihmisen syövissä ja syöpäsolulinjoissa, mukaan lukien kohdunkaulasyöpä ja kohdun limakalvon syövissä on todettu geenien FAM19A4 ja/tai hsa-mir124-2 promoottorien hypermetylaatiota (2 6). Isäntäsolun promoottorien metylaation analyysilla tunnistetaan spesifisti syöpiä ja ns. edistyneitä kohdunkaulan intraepiteliaalisia neoplasioita (CIN), joilla on syövän kaltainen metylaatioprofiili ja suuri riski muuttua syöväksi lyhyellä aikavälillä (3, 7, 8). QIAsure-testillä voidaan todeta promoottorien hypermetylaatio geeneissä FAM19A4 ja hsa-mir124-2, kun näyte on bisulfiittikonvertoitua DNA:ta, joka on peräisin kohdunkaulan tai emättimen irtosolunäytteistä. Sisäisenä näytteen laatukontrollina käytetään ACTB:tä. Menetelmän periaate QIAsure-metylaatiotesti on moninkertainen reaaliaikainen PCR-testi, joka monistaa kasvunrajoitegeenien FAM19A4 ja hsa-mir124-2 metyloituneita promoottorialueita, sekä metylaatioepäspesifiä fragmenttia referenssigeenistä. Sarja sisältää 2 putkea QIAsure Master Mix -pääseosta ja 2 putkea QIAsure Calibrator -kalibraattoria. Pääseos on tarkoitettu bisulfiittikonvertoidun DNA:n monistamiseen DNA:sta, joka on peräisin kliinisistä irtosolunäytteistä. Pääseos sisältää alukkeet ja koettimet kohdegeeneille ja referenssigeenille, joka toimii sisäisenä näytteen laatukontrollina. Kalibraattori on linearisoitu plasmidi, joka sisältää FAM19A4-, hsa-mir124-2- ja ACTB-amplikonien sekvenssejä. QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 5

Työnkulku Kliininen näyte Nukleiinihapon eristäminen DNA-materiaali Kaksijuosteisen DNA:n pitoisuuden määritys Bisulfiittikäsittely QIAsure-testaus Tulkinta Rotor-Gene AssayManager -ohjelmistolla QIAsure-testi tehdään Rotor-Gene Q MDx -instrumentilla, ja Rotor-Gene AssayManager -ohjelmisto analysoi ja tulkitsee testin tiedot automaattisesti. CT-arvo (syklin kynnysarvo) kertoo, kuinka monta PCR-sykliä tarvitaan fluoresoivan signaalin tunnistamiseksi taustasignaalista. Kynnysarvo on riippuvainen näytteessä olevien kohdemolekyylien määrästä. QIAsure-testi laskee CT-arvon FAM19A4- tai hsa-mir124-2-kohteiden CT-arvon ja referenssin (ACTB) CTarvon erotuksena. CT on suhteellinen kvantitatiivinen arvo FAM19A4- tai hsa-mir124-2- geenin promoottorin metylaatiotasosta. Normalisaatio tehdään vähentämällä kalibraattorinäytteen CT-arvo FAM19A4- tai hsa-mir124-2-kohteiden CT-arvosta, jolloin tuloksena saadaan CT-arvo (9). Kalibraattori on standardoitu matalan kopioluvun plasmidi- DNA-näyte, jonka kopioluku on tunnettu kaikkien kolmen kohteen osalta (FAM19A4, hsa-mir124-2 ja ACTB). 6 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Toimitetut materiaalit Sarjan sisältö QIAsure Methylation Test Luettelonumero Reaktioiden määrä 72 616014 72 QIAsure Master Mix -pääseos (2 putkea) Ruskean värinen 630 µl QIAsure Calibrator -kalibraattori (2 putkea) Läpinäkyvä 25 µl QIAsure Methylation Test Instructions for Use (englanninkielinen käsikirja) 1 Tarvittavat materiaalit jotka eivät kuulu toimitukseen Työskenneltäessä kemikaalien kanssa on aina käytettävä asianmukaista laboratoriotakkia, kertakäyttökäsineitä ja suojalaseja. Lisätietoja saa tuotekohtaisista käyttöturvallisuustiedotteista, jotka ovat saatavana tuotteen toimittajalta. Itse otettujen näytteiden käsittelyyn tarvittavat kulutustarvikkeet ja reagenssit Hologic PreservCyt Solution -liuos Kulutustarvikkeet ja reagenssit uutetun DNA:n bisulfiittikonversiota varten EZ DNA Methylation Kit -sarja (ZYMO Research, luettelonro. D5001 tai luettelonro. D5002) QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 7

Rotor-Gene Q MDx -instrumentin tarvitsemat kulutustarvikkeet Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (liuskaputkia ja korkkeja, 0,1 ml; luettelonro. 981103) Puhdistettua vettä (esim. molekyylibiologialaatu, tislattu tai deionisoitu) Laitteisto Säädettäviä pipettejä*, PCR-käyttöön tarkoitettuja (1 10 µl; 10 100 µl) Kertakäyttökäsineitä Pöytämallinen sentrifugi*, jonka nopeus on > 10 000 rpm Vortex-sekoitin* Qubit (Thermo Fisher Scientific, luettelonro. Q33216), NanoDrop 3300 Fluorospectrometer -fluorospektrometri (Thermo Fisher Scientific, luettelonro. ND-3300), tai vastaava* Laitteisto reaaliaikaista PCR:ää varten Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System -järjestelmä (luettelonro. 9002033) tai Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM -instrumentti (luettelonro. 9002032) Rotor-Gene AssayManager Core Application -ohjelmistoversio 1.0.x (jossa x on suurempi tai yhtä suuri kuin 4) Rotor-Gene AssayManager Epsilon Plug-in -lisäosa asennettuna, versio 1.0.x (jossa x on suurempi tai yhtä suuri kuin 1) QIAsure Assay Profile -testiprofiili (tiedostosta AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap) (jossa Y on yhtä suuri tai suurempi kuin 1) käytettäväksi bisulfiittikonvertoituun DNA:han, joka on saatu lääkärin ottamista kohdunkaulan irtosolunäytteistä * Varmista, että välineet on tarkastettu ja kalibroitu valmistajan ohjeiden mukaan. Testissä voidaan käyttää Rotor-Gene Q 5plex HRM -instrumenttia, jonka valmistuspäivä on tammikuussa 2010 tai myöhemmin. Valmistuspäivä on nähtävissä laitteen taustapuolella olevasta sarjanumerosta. Sarjanumero on muodossa kkvvnnn, jossa kk on valmistuskuukausi, vv on valmistusvuoden kaksi viimeistä numeroa ja nnn on laitteen tunnistenumero. 8 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

QIAsure self-collected brush specimen Assay Profile -testiprofiili (tiedostosta AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap) (jossa Y on yhtä suuri tai suurempi kuin 0) käytettäväksi bisulfiittikonvertoituun DNA:han, joka on saatu irtosolunäytteistä, jotka on itse otettu emättimestä harjatyyppisellä näytteenottimella Varoitukset ja huomautukset Vain in vitro -diagnostiikkaan. Turvallisuustiedot Työskenneltäessä kemikaalien kanssa on aina käytettävä asianmukaista laboratoriotakkia, kertakäyttökäsineitä ja suojalaseja. Lisätietoa saa tuotekohtaisista käyttöturvatiedotteista. Ne ovat saatavilla kätevässä ja kompaktissa PDF-muodossa osoitteessa www.qiagen.com/safety, jossa voidaan tarkastella ja tulostaa kaikkien QIAGEN -sarjan ja sarjakomponentin käyttöturvallisuustiedotteita. QIAsure Master Mix -pääseos: Varoitus! Epäillään vaikuttavan hedelmällisyyttä heikentävästi tai vahingoittavan syntymätöntä lasta. Käytä suojakäsineitä/suojavaatetusta/silmäsuojainta/kasvosuojainta. Altistumistapauksessa tai epävarmoissa tilanteissa: kysy neuvoa lääkäriltä tai hakeudu lääkärin hoitoon. Säilytä lukitussa tilassa. Hävitä sisältö tai säiliö toimittamalla se hyväksyttyyn jätelaitokseen. QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 9

Yleiset varotoimet PCR-testien käyttäminen vaatii hyvien laboratoriokäytäntöjen noudattamista, mukaan lukien molekyylibiologiaan käytettävien laitteiden ylläpito sovellettavien säädösten ja standardien mukaisesti. Huomioi aina alla mainitut varotoimet: Käytä puuterittomia kertakäyttöisiä suojakäsineitä, laboratoriotakkia ja silmiensuojaimia, kun käsittelet näytteitä. Estä näytteen ja sarjan kontaminoituminen mikrobeilla ja nukleaasilla (DNAaasilla). DNAaasi voi hajottaa malli-dna:n. Varo DNA:n tai PCR-tuotteen kulkeutumiskontaminaatiota, joka voi aiheuttaa väärän positiivisen signaalin. Käytä aina DNAaasittomia kertakäyttöisiä, aerosolin syntymisen estäviä pipettikärkiä. QIAsure-testin reagenssien laimennos on optimaalinen. Älä laimenna reagensseja enempää, koska seurauksena saattaa olla suorituskyvyn heikkeneminen. Kaikki QIAsure -sarjan mukana toimitetut reagenssit on tarkoitettu käytettäväksi ainoastaan muiden samaan sarjaan sisältyvien reagenssien kanssa. Älä korvaa mitään sarjan reagenssia toisella samanlaisella reagenssilla, joka on peräisin toisesta QIAsuresarjasta, vaikka sarjojen eränumero olisi sama. Tällainen korvaus voi vaikuttaa sarjan suorituskykyyn. Katso muut varoitukset, varotoimet ja menettelyt Rotor-Gene Q MDx -instrumentin käyttöoppaasta. Inkubaatioajan ja -lämpötilan muuttaminen voi tuottaa virheellisiä tai ristiriitaisia tietoja. Älä käytä sarjan komponentteja, joiden vanhentumispäivä on mennyt, tai joita on säilytetty virheellisesti. Altista komponentteja valolle mahdollisimman vähän: valo saattaa muuttaa reaktioseosten koostumusta. 10 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Noudata äärimmäistä varovaisuutta, jotta seokset eivät sekoittuisi PCR-reagensseissa olevien synteettisten materiaalien kanssa. Hävitä näyte ja testijäte paikallisten turvallisuuskäytäntöjen mukaisesti. AssayManager-profiiliin liittyvät varotoimet Eri näytetyypeille tarvitaan eri AssayManager-profiilit. Varmista, että käytettävä profiili vastaa testattavan näytteen tyyppiä alla olevalla tavalla: QIAsure cervical scrapes Assay Profile -testiprofiilia (tiedostosta AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap) on käytettävä bisulfiittikonvertoituun DNA:han, joka on saatu lääkärin ottamista kohdunkaulan irtosolunäytteistä QIAsure self-collected brush specimen Assay Profile -testiprofiilia (tiedostosta AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap) on käytettävä bisulfiittikonvertoituun DNA:han, joka on itse otettu emättimestä harjatyyppisellä näytteenottimella Reagenssien säilytys ja käsittely Lähetysolosuhteet QIAsure Methylation -testi lähetetään kuivajäähän pakattuna. Jos jokin QIAsure Methylation -testin komponentti ei ole vastaanottohetkellä jäässä tai jos ulkopakkaus on avattu kuljetuksen aikana tai jos toimituspakkaus ei sisällä lähetysluetteloa, käsikirjoja tai reagensseja, ota yhteyttä johonkin QIAGENin tekniseen palveluyksikköön tai paikalliseen jälleenmyyjään (katso lisätietoja takakannesta tai osoitteesta www.qiagen.com). QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 11

Säilytysolosuhteet QIAsure Methylation -testi on sijoitettava heti vastaanottamisen jälkeen -30...-15 C:n lämpötilassa olevaan pakastimeen, jonka lämpötila pysyy vakaana. Lisäksi testi on suojattava valolta. Stabiilisuus Kun QIAsure Methylation -testiä säilytetään edellä kuvatuissa säilytysolosuhteissa, testi on stabiili laatikon etiketissä mainittuun vanhentumispäivämäärään saakka. Avatut reagenssit voidaan säilyttää alkuperäispakkauksissaan -30...-15 C:ssa. Toistuvaa sulatusta ja pakastusta on vältettävä. Pakastamis- ja sulattamisjaksoja saa olla enintään kolme. Sekoita kääntämällä putki ylösalaisin 10 kertaa ja sentrifugoi kaikki putket ennen niiden avaamista. Kunkin reagenssin vanhentumispäivämäärät on ilmoitettu komponentin etiketissä. Asianmukaisissa säilytysolosuhteissa tuotteen suorituskyky pysyy yllä yhtä pitkään kuin tuote pysyy stabiilina, kunhan käytetään samoja komponenttieriä Näytteen käsittely ja säilytys Kaikkia näytteitä on käsiteltävä mahdollisesti infektoituneena materiaalina. 12 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Kohdunkaulanäytteet QIAsure-sarja on tarkoitettu käytettäväksi bisulfiittikonvertoituihin genomisiin DNA-näytteisiin, jotka on saatu kohdunkaulan irtosolunäytteistä. Validoidut kohdunkaulan raaputusnäytteiden alustat ovat PreservCyt -ottoalusta ja digene Specimen Transport Medium (STM) -kuljetusalusta. Kliinisten näytteiden optimaalinen säilytyslämpötila on 2 8 C laboratorioon saapumishetkellä. Näissä säilytysolosuhteissa PreservCyt-ottoalustassa olevat näytteet pysyvät stabiilina 3 kuukautta ennen DNA:n uuttoa. Huomautus: STM-kuljetusalustalla olevat kohdunkaulan irtosolunäytteet voidaan lähettää 2 30 C:n lämpötilassa yön yli testauslaboratorioon ja jäädyttää -20 C:seen vastaanotettaessa. Emättimestä harjatyyppisellä näytteenottimella itse otetut näytteet QIAsure Methylation -testi on tarkoitettu käytettäväksi bisulfiittikonvertoituihin genomisiin DNAnäytteisiin, jotka on uutettu näytteistä, jotka on otettu emättimestä harjatyyppisellä näytteenottimella itse. Emättimestä harjatyyppisellä näytteenottimella itse otetut näytteet voidaan lähettää kuivana tai suolaliuoksessa (0,9 % p/til. NaCl), ja laboratorioon saapuessa ne voidaan säilöä PreservCyt-ottoalustaan. PreservCyt-ottoalustassa olevia näytteitä saa säilyttää 2 8 C:ssa tai huoneenlämmössä enintään 3 kuukautta. Genomiset DNA-näytteet Kun genominen DNA on uutettu, DNA-näytteitä voidaan säilyttää ja lähettää -30...-15 C:ssa 12 kuukauden ajan. QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 13

Näytteen valmistelu QIAsure Methylation -testi on validoitu käytettäväksi bisulfiittikonvertoituun genomiseen DNA:han, joka on peräisin kohdunkaulan irtosolunäytteistä ja käsitelty ZYMO Researchin EZ DNA Methylation -sarjalla. DNA:n uuttaminen Vakiotyyppiset DNA-uuttosarjat (kuten kolonnityyppiset ja magneettihelmiin perustuvat sarjat) ovat yhteensopivia QIAsure Methylation -testin kanssa. DNA:n kvalifiointi ja kvantifiointi Mittaa DNA:n pitoisuus ennen DNA:n bisulfiittikonvertointia. DNA:n pitoisuuden mittaamiseen sopivia järjestelmiä ovat Qubit Fluorometer, NanoDrop 3300 Fluorospectrometer (kumpikin Thermo Fisher Scientific -yhtiön valmistamia) tai vastaavat järjestelmät. Bisulfiittikonversio toimii parhaiten, kun DNA-syötteen määrä on 100 ng 2 µg. Suositeltava määrä bisulfiittikonversiota varten on 200 ng. Jos DNA-pitoisuus on liian alhainen bisulfiittikonversiota varten, toista DNA:n uutto käyttäen suurempaa kliinisen näytteen syöttötilavuutta tai eluoi DNA pienempään eluutiotilavuuteen. Näytteestä uutetun DNA:n bisulfiittikonversio ZYMO research -yhtiön valmistama EZ DNA Methylation -sarja on yhteensopiva QIAsure Methylation -testin kanssa. Huomautus: EZ DNA Methylation -sarjan käyttöohjeiden mukaan näyte-dna:n enimmäissyöttö saa olla enintään 2 µg, jotta konversiotehokkuus olisi riittävän suuri (> 98 %). Reagenssien kontaminaation välttämiseksi bisulfiittikonversioreaktio on tehtävä alueella, joka on erillään QIAsure Master Mix -pääseoksen säilytys- ja annostelualueesta. 14 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

QIAsure-reaktiossa bisulfiittikonvertoidun DNA- syötteen määrä on 2,5 μl. Jos näytteen sisäinen laatukontrolli on negatiivinen (esim. ACTB CT-arvot ovat > 26,4), näytteen DNA:n bisulfiittikonversion tuloksena saadun materiaalin laatu ja/tai määrä ei riitä, ja sitä pidetään virheellisenä. Toista bisulfiittikonversioreaktio suuremmalla näyte-dnasyötteellä ja toista DNA:n eristys suuremmalla syötteellä kohdunkaulanäytettä, jotta ACTB CTarvo asettuisi hyväksyttävälle tasolle. Bisulfiittikonvertoitua DNA:ta voidaan säilyttää enintään 24 tunnin ajan 2 8 C:ssa, enintään 5 päivän ajan -25...-15 C:ssa ja enintään 3 kuukautta alle -70 C:ssa. Bisulfiittikonvertoidun DNA:n toistuvaa pakastamista ja sulatusta on aina vältettävä. Laadun säilyttämiseksi pakastussulatussyklejä saa olla enintään kolme. Protokolla: QIAsure Methylation -testin PCR-ajo Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM -laitteella* Tärkeitä huomioita ennen kuin aloitat Tutustu huolellisesti Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM -laitteen käyttöön ennen protokollan suorittamista. Katso laitteen (luettelonro. 9002033 tai 9002032) käyttöopasta. Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmistolla PCR-tulokset voidaan tulkita automaattisesti. QIAsure-sarja on ajettava Rotor-Gene Q MDx -laitteella käyttäen Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmistoa. Tutustu Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmistoon (luettelonro. 9022739) ja Epsilon Plug-In -lisäosaan. Lue kummankin käyttöoppaat. *Testissä voidaan käyttää Rotor-Gene Q 5plex HRM -instrumenttia, jonka valmistuspäivä on tammikuussa 2010 tai myöhemmin. Valmistuspäivä on nähtävissä laitteen taustapuolella olevasta sarjanumerosta. Sarjanumero on muodossa kkvvnnn, jossa kk on valmistuskuukausi, vv on valmistusvuoden kaksi viimeistä numeroa ja nnn on laitteen tunnistenumero. QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 15

Eri näytetyypeille tarvitaan eri Rotor-Gene AssayManager v1.0 -testiprofiilit. Varmista, että käytettävä profiili vastaa testattavan näytteen tyyppiä alla olevalla tavalla: QIAsure cervical scrapes Assay Profile -testiprofiilia (tiedostosta AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap) on käytettävä bisulfiittikonvertoituun DNA:han, joka on saatu lääkärin ottamista kohdunkaulan irtosolunäytteistä QIAsure self-collected brush specimen Assay Profile -testiprofiilia (tiedostosta AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap) on käytettävä bisulfiittikonvertoituun DNA:han, joka on itse otettu emättimestä harjatyyppisellä näytteenottimella Huomautus: testillä voi testata vain yhden näytetyypin kerrallaan. Yksilölliset testiprofiilit on optimoitu kullekin näytetyypille, joten on erittäin tärkeää valita oikea testiprofiili, jotta kyseisestä näytetyypistä saatavat tulokset olisivat mahdollisimman hyviä. Ennen aloittamista suoritettava valmistelut Rotor-Gene Q MDx -laitteeseen liitetyssä tietokoneessa on oltava asennettuna Rotor-Gene AssayManager -ohjelmiston versio v1.0.x (jossa x on suurempi tai yhtä suuri kuin 4). Lisätietoja Rotor-Gene AssayManager v1.0 Core Application -ydinohjelmistosta on julkaisussa Rotor-Gene AssayManager v1.0 Core Application User Manual (Rotor-Gene AssayManager -ydinohjelmiston version 1.0 käyttöopas). QIAsure Methylation -testi edellyttää tiettyä lisäosaa, jonka nimi on Epsilon Plug-in (versio 1.0.1 tai uudempi). Tämän lisäosan voi ladata QIAGENin sivustosta: http://www.qiagen.com/shop/automated-solutions/detection-and-analysis/rotor-geneassaymanager#resources. Tämä lisäosa on asennettava tietokoneeseen, johon on jo asennettu Rotor-Gene AssayManager -ohjelmiston versio 1.0.x (jossa x on suurempi tai yhtä suuri kuin 4). QIAsure Methylation -testi vaatii testikohtaisen profiilin, jota käytetään Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmiston kanssa. Testiprofiili sisältää kaikki parametrit, joita tarvitaan testin sykleihin ja analyysiin. QIAsure-testiprofiileja on kaksi: 1. QIAsure cervical scrapes -testiprofiilia (tiedostossa AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap) käytetään lääkärin ottamiin kohdunkaulan irtosolunäytteisiin 16 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

2. QIAsure self-collected brush specimens -testiprofiilia (tiedostossa AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap) käytetään näytteisiin, jotka on itse otettu emättimestä harjatyyppisellä näytteenottimella. Profiilit voidaan ladata QIAsure Methylation -testin verkkosivulta: http://www.qiagen.com/shop/assay-technologies/ Complete-Assay-Kits/ hpv-testing/qiasure-methylation-test-kit-eu/. Testiprofiili on tuotava Rotor-Gene AssayManager -ohjelmistoon. Huomautus: QIAsure-sarja voidaan ajaa vain, jos Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmaan on ohjelmoitu tietyt kokoonpanoasetukset. Järjestelmänlaajuisen prosessiturvallisuuden vuoksi seuraavat pakolliset asetusmääritykset on asetettava suljetun tilan mukaisiksi: Material number required (Materiaalinumero on pakollinen) Valid expiry date required (Kelvollinen vanhenemispäivä on pakollinen) Lot number required (Eränumero on pakollinen) Epsilon Plug-in -lisäosan asennus ja testiprofiilin tuominen Epsilon Plug-in -lisäosan ja testiprofiilin asennus ja tuonti on kerrottu julkaisuissa Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Rotor-Gene AssayManager -ydinohjelmiston käyttöopas) ja Epsilon Plug-In User Manual (Epsilon Plug-in -lisäosan käyttöoppaassa). Lataa sekä Epsilon Plug-in -lisäosa että QIAsure-testiprofiilin viimeisin versio QIAGENin sivustosta. Aloita asennus kaksoisnapsauttamalla EpsilonPlugin.Installation.msi-tiedostoa. Noudata näkyviin tulevia asennusohjeita. Yksityiskohtaisia tietoja on julkaisun AssayManager Core Application User Manual (AssayManager -ydinohjelmiston käyttöopas) osassa Installing Plug-ins (Lisäosien asentaminen). Huomautus: Järjestelmänlaajuisen prosessiturvallisuuden vuoksi valitse Settings (Asetukset) -välilehti ja valitse seuraavat valintaruudut Material number required (Materiaalinumero on pakollinen), Valid expiry date required (Kelvollinen vanhenemispäivä on pakollinen) ja Lot number required (Eränumero on pakollinen) QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 17

suljettua tilaa varten. Nämä valintaruudut ovat Work list (Työluettelo) -osiossa. Jos valintaruudut eivät ole jo valittuina, valitse ne napsauttamalla. Kun lisäosa on asennettu onnistuneesti, Rotor Gene AssayManager -ohjelmiston pääkäyttäjäoikeuksilla varustetun henkilön on tuotava AP_QIAsure_V1_0_Y.iaptestiprofiili seuraavasti. 1. Avaa Rotor-Gene AssayManager -ohjelmisto napsauttamalla kuvaketta. Rotor-Gene AssayManager -ikkuna avautuu (katso Kuva 1). Kuva 1. Rotor-Gene AssayManager -sisäänkirjautumisikkuna. 18 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

2. Kirjaudu Rotor-Gene AssayManager -ohjelmaan käyttäjätunnuksellasi ja salasanallasi. Älä muuta Closed (Suljettu) -tilaa. Valitse OK. Näkyviin tulee Rotor-Gene Assay Manager -näyttö (katso oheista kuvaa). 7 1 3 4 5 6 2 1 Set-up (Asetukset) -välilehti. Tässä välilehdessä voit hallita ja käyttää työluetteloita. 2 Käytössä olevien työluetteloiden tarkastuksessa näytetään vain uudet työluettelot. 3 Approval (Hyväksyntä) -välilehti. Tässä välilehdessä voit hakea aiempia testejä (ajoja). 4 Archive (Arkisto) -välilehti. Tässä välilehdessä voit hakea aiempia testejä (ajoja), jotka on jo hyväksytty. 3. Valitse Configuration (Kokoonpano) -ympäristö. 4. Valitse Assay Profiles (Testiprofiilit) -välilehti. 5. Napsauta Import (Tuo). 5 Service (Huolto) -välilehti. Näyttää jokaisesta ohjelman luomasta tiedostosta auditointilokin. 6 Configuration (Asetukset) -välilehti. Mahdollistaa kaikkien ohjelmistoparametrien määrityksen. 7 Rotor-Gene Q MDx -kuvakkeet. Ei yhteyttä Yhteys muodostettu QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 19

6. Valitse ikkunassa testiprofiili AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap, jos näyte on kohdunkaulan irtosolunäyte, ja/tai testiprofiili AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap tuotavaksi ja valitse Open (Avaa). 7. Kun testiprofiili on tuotu onnistuneesti, sitä voidaan käyttää Setup (Asetukset) -ympäristössä. Huomautus: Testiprofiilin samaa versiota ei voi tuoda kahdesti. Näytteen käsittely Rotor-Gene Q MDx -laitteella, jossa on 72-putkinen roottori Yhdessä ajossa (testissä) voidaan testata enintään 70 bisulfiittikonvertoitua DNA-näytettä kalibraattorinäytteen ja ei mallia -kontrollinäytteen lisäksi. Taulukko 1 on esimerkki latauslohkon tai roottorin asettelusta QIAsure Methylation -testin ajoa varten. Numerot ilmaisevat sijainnit latauslohkossa sekä roottorin loppuasennon. 20 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Taulukko 1. Levyn ja roottorin asettelu QIAsure-sarjan ajoa varten Rotor-Gene Q MDx -instrumentilla Liuska Putken sijainti Näytteen nimi Liuska Putken sijainti Näytteen nimi Liuska Putken sijainti Näytteen nimi 1 1 Kalibraattori 7 25 Näyte 23 13 49 Näyte 47 2 NTC 26 Näyte 24 50 Näyte 48 3 Näyte 1 27 Näyte 25 51 Näyte 49 4 Näyte 2 28 Näyte 26 52 Näyte 50 2 5 Näyte 3 8 29 Näyte 27 14 53 Näyte 51 6 Näyte 4 30 Näyte 28 54 Näyte 52 7 Näyte 5 31 Näyte 29 55 Näyte 53 8 Näyte 6 32 Näyte 30 56 Näyte 54 3 9 Näyte 7 9 33 Näyte 31 15 57 Näyte 55 10 Näyte 8 34 Näyte 32 58 Näyte 56 11 Näyte 9 35 Näyte 33 59 Näyte 57 12 Näyte 10 36 Näyte 34 60 Näyte 58 4 13 Näyte 11 10 37 Näyte 35 16 61 Näyte 59 14 Näyte 12 38 Näyte 36 62 Näyte 60 15 Näyte 13 39 Näyte 37 63 Näyte 61 16 Näyte 14 40 Näyte 38 64 Näyte 62 5 17 Näyte 15 11 41 Näyte 39 17 65 Näyte 63 18 Näyte 16 42 Näyte 40 66 Näyte 64 19 Näyte 17 43 Näyte 41 67 Näyte 65 20 Näyte 18 44 Näyte 42 68 Näyte 66 6 21 Näyte 19 12 45 Näyte 43 18 69 Näyte 67 22 Näyte 20 46 Näyte 44 70 Näyte 68 23 Näyte 21 47 Näyte 45 71 Näyte 69 24 Näyte 22 48 Näyte 46 72 Näyte 70 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 21

Putket on asetettava roottoriin Taulukossa 1 kuvatulla tavalla. Testiprofiilissa määritetty automaattinen analyysi perustuu tähän järjestykseen. Jos järjestys on erilainen, tuloksista tulee poikkeavia. Huomautus: Täytä kaikki käyttämättömät paikat tyhjillä putkilla. PCR-ajo Rotor-Gene Q MDx -laitteella, jossa on 72-putkinen roottori 1. Luo käsiteltävästä näytteestä työluettelo seuraavasti: Käynnistä Rotor-Gene Q MDx -instrumentti. Avaa Rotor-Gene AssayManager -ohjelmisto ja kirjaudu käyttäjänä Operator (Käyttäjä) -roolissa suljetussa tilassa. Valitse työluettelon hallinnassa New work list (Uusi työluettelo) -vaihtoehtoa ( Setup (Asetukset) -ympäristö). Valitse QIAsure-testiprofiili (QIAsure assay profile) käytettävissä olevien testiprofiilien luettelosta. Huomautus: AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap-testiprofiilia on käytettävä kohdunkaulan irtosolunäytteille; AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap-testiprofiilia on käytettävä näytteille, jotka on itse otettu emättimestä harjatyyppisellä näytteenottimella. Huomautus: Testillä voi testata vain yhden näytetyypin kerrallaan. Napsauta Move (Siirrä), jolloin valittu testiprofiili siirtyy Selected assay profiles (Valitut testiprofiilit) -luetteloon. Testiprofiilin pitäisi nyt näkyä Selected assay profiles (Valitut testiprofiilit) -luettelossa. Kirjoita näytteiden lukumäärä vastaavaan kenttään. Kirjoita seuraavat QIAsure-sarjan tiedot, jotka on painettu laatikon kanteen. Materiaalinumero: 1102417 Kelvolliset vanhenemispäivät esitetään muodossa VVVV-KK-PP Eränumero 22 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Valitse Samples (Näytteet) -vaihe. AssayManager-näyttöön tulee näkyviin luettelo näytteiden tiedoista. Luettelo edustaa roottorin odotettua asettelua. Kirjoita tähän luetteloon näytteen tunnistenumero(t) sekä mahdolliset muut valinnaiset näytetiedot kommenttina jokaisen näytteen kohdalle. Valitse Properties (Ominaisuudet) -vaihe ja kirjoita työluettelon nimi (Kuva 2). Kuva 2. Ominaisuudet. Vahvista valintaruutu is applicable (on käytettävissä) ja valitse Apply (Käytä). Tallenna työluettelo. Työluettelon voi tulostaa, mistä voi olla apua PCR-ajon valmistelussa ja asetusten tekemisessä. Jos haluat tulostaa työluettelon, valitse Print work list (Tulosta työluettelo). Näytteen tiedot sisällytetään tämän työluettelon osaksi. Huomautus: Työluettelon voi luoda, kun ajo on määritetty instrumenttiin. Työluettelon voi myös tallentaa, ennen kuin näytteet lisätään instrumenttiin. 2. Määritä QIAsure-ajo. PCR-reaktion kontaminoitumisriskin vähentämiseksi on erittäin suositeltavaa käyttää PCR-kaappia, jossa on UV-säteilytysmahdollisuus. QIAsure Master Mix -seoksen annostelu on tehtävä erillään alueelta, jolla DNA:n bisulfiittikonversioreaktio tapahtuu. QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 23

Puhdista työpöydän alue, pipetit ja putkiteline ennen DNA:ta hajottavan liuoksen käyttämistä malli- tai nukleaasikontaminaation estämiseksi. Huomautus: Vaihda kärki jokaisen putken välillä ei-spesifin mallikontaminaation tai reaktioseoskontaminaation ja siitä seuraavien väärien positiivisten tulosten estämiseksi. Sulata QIAsure Master Mix -pääseos ja QIAsure Calibrator -kalibraattori kokonaan ja suojaa QIAsure Master Mix valolta aina kun mahdollista. Huomautus: Sulatusvaihe saa kestää enintään 30 minuuttia, jotta materiaali ei hajoaisi. Sekoita varovasti kääntämällä putki ylösalaisin 10 kertaa ja sentrifugoi lyhyesti ennen käyttöä. Annostele 17,5 µl käyttövalmista QIAsure Master Mix -pääseosta kyseisiin liuskaputkiin. Reaktion asetukset voidaan tehdä huoneenlämpötilassa. Palauta QIAsure Master Mix -pääseos pakastimeen, jotta materiaalissa ei tapahtuisi hajoamista. Kuljeta putket eri alueelle testin kontrollien ja bisulfiittikonvertoitujen näytteiden annostelua varten. Lisää 2,5 µl vettä asemaan 2, no template control (NTC) (ei mallia -kontrolli) (katso edellä olevaa Taulukkoa 1). Sekoita varovasti pipetoimalla ylös ja alas. Lisää 2,5 µl QIAsure Calibrator -kalibraattoria asemaan 1 (katso edellä olevaa Taulukkoa 1). Sekoita varovasti pipetoimalla ylös ja alas. Sulje putki korkilla. Lisää vastaavaan putkeen 2,5 µl bisulfiittikonvertoitua DNA:ta. Sekoita varovasti pipetoimalla ylös ja alas. Aina kun olet täyttänyt 4 putkea, sulje ne korkilla. Huomautus: Näytteiden pipetoinnin jälkeen PCR-putkia voi säilyttää 30 minuutin ajan 2 8 C:ssa pimeässä ennen testin ajoa. Palauta QIAsure Calibrator -pääseos pakastimeen, jotta materiaalissa ei tapahtuisi hajoamista. Huomautus: Vaihda kärki jokaisen putken välillä ei-spesifin mallikontaminaation tai reaktioseoskontaminaation ja siitä seuraavien väärien positiivisten tulosten estämiseksi. 24 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

3. Valmistele Rotor-Gene Q MDx ja aloita ajo (testi seuraavasti): Aseta 72-kuoppainen roottori roottoripitimeen. Aseta liuskaputket roottoriin oikeisiin sijainteihinsa; aloita sijainnista 1 Taulukon 1 (sivu 21) esittämällä tavalla. Aseta kaikkiin käyttämättömiin sijainteihin tyhjä, korkilla suljettu putki. Huomautus: Varmista, että ensimmäinen putki on asetettu sijaintiin 1, ja että liuskaputket on asetettu oikeisiin suuntiin ja sijainteihin Taulukon 1 (sivu 21) esittämällä tavalla. Kiinnitä lukitusrengas. Lataa roottori ja lukitusrengas Rotor-Gene Q MDx -instrumenttiin ja sulje instrumentin kansi. Valitse Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmistossa joko vastaava työluettelo työluetteloiden hallinnasta ja napsauta Apply (Käytä), tai jos työluettelo on edelleen avoinna, valitse Apply (Käytä). Huomautus: Jos ajon työluetteloa ei ole luotu, kirjaudu Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmistoon ja tee kohdassa 1 kuvatut toimet ennen jatkoa. Kirjoita ajon (testin) nimi. Valitse käytettävä sykli Cycler Selection (Syklerin valinta) -kohdasta. Tarkista, että lukitusrengas on kiinnitetty oikein ja vahvista näytössä, että lukitusrengas on kiinnitetty. Napsauta Start experiment (Aloita testi). 4. The QIAsure Methylation -testin ajo alkaa. 5. Kun ajo on päättynyt, valitse Finish run (Lopeta ajo). 6. Vapauta ja hyväksy ajo. Approver (Hyväksyjä) -roolilla kirjautuneiden käyttäjien on valittava Release and go to approval (Vapauta ja siirry hyväksyntään) -vaihtoehto. Operator (Operaattori) -roolilla kirjautuneiden käyttäjien on valittava Release (Vapauta) -vaihtoehto. QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 25

7. Vapauta tulokset. Release and go to approval (Vapauta ja siirry hyväksyntään) -vaihtoehdon valinta näyttää testin tulokset. Jos käyttäjäroolissa oleva käyttäjä napsauttaa Release (Vapauta) -vaihtoehtoa, jonkin toisen käyttäjän on kirjauduttava sisään Approver (Hyväksyjä) -roolissa ja valittava Approval (Hyväksyntä) -ympäristö. Suodata hyväksyttävä testi valitsemalla suodatusvaihtoehdot ja napsauttamalla Apply (Käytä). Tarkista tulokset ja hyväksy kunkin testinäytteen tulokset. Siirry Results (Tulokset) -taulukossa näytteeseen, jonka haluat hyväksyä. Jokaisessa hyväksyntää odottavassa näytetuloksessa on kolme valintanappia rivin lopussa. Valitse näytteen tuloksen osalta accept (hyväksy) tai reject (hylkää). Huomautus: Jos Rotor-Gene AssayManager -ohjelmisto on asettanut tulokseksi INVALID (VIRHEELLINEN), tulosta ei voi muuttaa enää kelvolliseksi, vaikka tuloksen hylkäisikin. Valinnainen vaihe: Kirjoita kommentti Sample comment (Kommentti näytteestä) -sarakkeeseen. Valitse Release/Report data (Vapauta/raportoi tiedot) Valitse OK. Järjestelmä luo raportin Adobe Portable Document (.pdf) -muodossa ja tallentaa sen automaattisesti ennalta määritettyyn kansioon. Tämä polku on oletuksena seuraava: QIAGEN > Rotor-Gene AssayManager > Export > Reports Huomautus: Tätä polkua ja kansiota voi muuttaa Configuration (Kokoonpano) -ympäristössä. Siirry Archive (Arkisto) välilehteen viemään raakadatan sisältävä.rex-tiedosto. Hae testi käyttämällä suodatusvaihtoehtoja ja napsauttamalla show assays (näytä testit). Valitse sitten Export.rex file (Vie.rex-tiedosto) ja tallenna se valitsemalla OK. Ohjelmisto tallentaa.rex-tiedoston automaattisesti seuraavaan ennalta määritettyyn kansioon: QIAGEN > Rotor-Gene AssayManager > Export > Experiments 26 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Huomautus: Tämän polun ja kansion voi muuttaa välilehdessä Specify the.rex file export destination (Määritä.rex-tiedoston viennin määränpää). Huomautus: Vianetsintää varten tarvitaan ajosta peräisin oleva tukipaketti. Tukipaketteja voidaan tuottaa Approval (Hyväksyntä)- tai Archive (Arkisto) -ympäristössä. Katso julkaisun Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Rotor-Gene AssayManager -ydinohjelmiston käyttöopas) kohdasta Troubleshooting (Vianetsintä) otsikko Creating a support package (Tukipaketin luominen). Julkaisu on osoitteessa https://www.qiagen.com/shop/automated-solutions/detection-and-analysis/rotor-geneassaymanager#resources. Apua voi olla myös auditointilokista ±1 päivän ajalta ennen tapahtumaa. Auditointilokin voi noutaa Service (Huolto) -ympäristöstä (julkaisu Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Rotor-Gene AssayManager -ydinohjelmiston käyttöopas)). 8. Poista Rotor-Gene Q MDx -instrumenttiin ladatut materiaalit ja hävitä liuskaputket paikallisten turvallisuussäädösten mukaan. Tulosten tulkinta Analyysi on täysin automatisoitu. Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmisto analysoi ensin monistumiskäyriä ja voi merkitä epäyhteensopivat käyrät virheellisiksi niiden muodon ja kohina-amplitudin mukaan. Tällaiset käyrät on merkitty erityisellä merkinnällä (katso taulukko 2). Sen jälkeen Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmisto analysoi ajon kontrollit. Kalibraattori NTC Huomautus: Ajon lopuksi luodussa raportissa näkyvät ajon kontrolleissa saadut tulokset. Virheellisten tietojen edessä näkyy virheellisyyttä ilmaiseva merkintä. QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 27

Jos kaikki ajon kontrollit ovat yhteneväiset, Rotor-Gene AssayManager -ohjelmisto analysoi tuntemattomat näytteet. Taulukossa 2 on lueteltu virheellisyyttä ilmaisevat näytteiden merkinnät, joilla Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmisto voi merkitä yksittäiset putket. Taulukossa on myös merkintöjen selitykset. 28 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Taulukko 2. Virheellisyyttä ilmaisevat näytteiden merkinnät ja niiden kuvaukset QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 29

Merkintä Merkitys Kuvaus ABOVE_ACCEPTED_RANGE Virheellinen Kohdearvo on korkeampi, kuin määritetty arvoalue. Tämä voi olla CT, päätepisteen fluoresenssi, pitoisuus tai laskettu arvo, esimerkiksi keskimääräinen CT tai CT. ASSAY_INVALID Virheellinen Testi on virheellinen, koska ainakin yksi ulkoinen kontrolli on virheellinen. BELOW_ACCEPTED_RANGE Virheellinen Kohdearvo on matalampi, kuin määritetty arvoalue. Tämä voi olla CT, päätepisteen fluoresenssi, pitoisuus tai laskettu arvo, esimerkiksi keskimääräinen CT tai CT. CONSECUTIVE_FAULT Virheellinen Tämän kohteen laskennassa käytetty kohde on virheellinen. CURVE_SHAPE_ANOMALY Virheellinen Raakadatan monistumiskäyrän muoto poikkeaa tämän testin tyypillisestä käyttäytymistavasta. Virheellisten tulosten tai tulosten virheellisen tulkinnan todennäköisyys on suuri. FLAT_BUMP Virheellinen Raakadatan monistumiskäyrän muoto on litteä töyssy, mikä poikkeaa tämän testin tyypillisestä käyttäytymistavasta. Virheellisten tulosten tai tulosten virheellisen tulkinnan todennäköisyys on suuri (esimerkiksi CT-arvon määritys on virheellinen). IN_ACCEPTED_RANGE Kelvollinen NTC-kontrollin signaalin CT-arvot ovat suurempia kuin 36 kohde-actb:n osalta. INVALID_CALCULATION Virheellinen Tämän kohteen laskenta epäonnistui. MULTIPLE_THRESHOLD_CROSSING Virheellinen Monistumiskäyrä ylittää kynnysarvon useammin kuin kerran. CT-arvoa ei voi määrittää ristiriidattomasti. NO_BASELINE Virheellinen Ensimmäisen perustason alkuarvoa ei ole löytynyt. NO_CT_DETECTED Muuttuja Tälle kohteelle ei ole havaittu CT-arvoa. NO_VALUE Virheellinen Kohteella ei ole arvoa, vaikka sillä edellytetään olevan arvo. Tämän arvon ei tarvitse olla tietyllä alueella. Tämä voi olla CT, päätepisteen fluoresenssi, pitoisuus tai laskettu arvo (esimerkiksi keskimääräinen CT tai CT). NORM_FACTOR_ALTERATION Varoitus Poikkeama normalisoinnin aikana. Monistumiskäyrä näytetään oletusnormalisoinnin kanssa; tulosten oikeellisuus on tarkistettava manuaalisesti. OTHER_TARGET_INVALID Virheellinen Jokin toinen saman näytteen kohde on virheellinen. SATURATION Virheellinen Fluoresenssin raakadata saturoituu voimakkaasti ennen monistumiskäyrän taipumispistettä. SATURATION_IN_PLATEAU Varoitus Fluoresenssin raakadata saturoituu monistumiskäyrän tasannevaiheessa. 30 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

SPIKE Varoitus Monistumiskäyrässä havaittiin fluoresenssin raakadatassa piikki, mutta se on CT-määritysalueen ulkopuolelle. SPIKE_CLOSE_TO_CT Virheellinen Monistumiskäyrässä havaittiin piikki lähellä CT-arvoa. STEEP_BASELINE Virheellinen Monistumiskäyrässä havaittiin fluoresenssin raakadatassa jyrkästi nouseva perustaso. STRONG_BASELINE_DIP Virheellinen Monistumiskäyrässä havaittiin fluoresenssin raakadatassa voimakas pudotus perustasossa. STRONG_NOISE Virheellinen Monistumiskäyrän kasvuvaiheen ulkopuolella havaittiin voimakasta kohinaa. STRONG_NOISE_IN_GROWTH_PHASE Virheellinen Monistumiskäyrän kasvuvaiheessa (eksponentiaalisessa vaiheessa) havaittiin voimakasta kohinaa. UNCERTAIN Muuttuja AUDAS (Automatic Data Scan) -tulokset ovat ristiriidassa ydinanalyysin tulosten kanssa. Automaattinen ja yksiselitteinen tietojen kelpoisuuden arviointi ei ole mahdollista. UNEXPECTED_CT_DETECTED Muuttuja Havaittiin CT-arvo kohteelle, jonka ei pitäisi monistua. UNEXPECTED_VALUE Virheellinen Kohteella on arvo, mutta arvo ei ole odotettu. Tämä voi olla CT, päätepisteen fluoresenssi, pitoisuus tai laskettu arvo, esimerkiksi keskimääräinen CT tai CT. UPSTREAM Muuttuja Ylävirran prosessi (esim. QIAsymphony) asetti näytteen tilaksi Invalid (Virheellinen) tai Unclear (Epäselvä). Huomautus: Rotor-Gene AssayManager -ohjelmiston toimintatapa epäselviksi merkittyjen näytteiden osalta määritetään AssayManager-ohjelmiston Configuration (Asetukset) -ympäristössä. Ylävirrasta tulevat Invalid (Virheellinen) -merkinnät johtavat aina siihen, että Rotor-Gene AssayManager -ohjelmisto merkitsee kyseisen näytteen virheelliseksi. WAVY_BASE_FLUORESCENCE Virheellinen Monistumiskäyrässä havaittiin fluoresenssin raakadatassa aaltoileva perustaso. Jos kaikki ajon kontrollit ovat kelvollisia, Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmisto analysoi tuntemattomat näytteet. Näytteessä on oltava pieni määrä bisulfiittikonvertoitua DNA:ta, jotta tulokset voitaisiin tulkita. Tämä ilmenee ylläpitogeeni ACTB:n CT-arvosta, jonka on oltava 26,4, jotta Rotor-Gene AssayManager -ohjelmisto validoisi näytteen. Sen jälkeen ohjelmisto laskee FAM19A4- ja hsa-mir124-2-geenien CT-arvot ja antaa tuloksen. Jos jokin CT-arvo on raja-arvon alapuolella, järjestelmä pisteyttää kohteen merkinnällä Hypermethylation positive (Hypermetylaatiopositiivinen). QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 31

Huomautus: Osittainen tai alhainen metylaatiotaso on luonnollinen ilmiö, jolla toisin kuin hypermetylaatiolla ei ole suoraa yhteyttä syövän kehittymiseen. Näytettä pidetään hypermetylaatiopositiivisena, jos ainakin yksi kohde pisteytetäään hypermetylaatiopositiiviseksi. Ongelmien ratkaisu Tämä ongelmien ratkaisuopas voi auttaa mahdollisissa esiin tulevissa ongelmissa. Lisätietoja on saatavissa myös teknisen tuen sivustoltamme usein kysyttyjen kysymysten osiosta: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. QIAGENin teknisen palvelun asiantuntijat vastaavat aina mielellään kysymyksiisi koskivatpa ne sitten tämän käsikirjan tietoja tai tässä käsikirjassa esiteltyjä protokollia tai näytteisiin ja testeihin liittyviä tekniikoita. (Katso yhteystiedot tämän käsikirjan takakannesta tai osoitteesta www.qiagen.com). Lisätietoja Rotor-Gene AssayManager -ohjelmiston vianmäärityksestä on julkaisussa Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Rotor-Gene AssayManager -ydinohjelmiston käyttöopas). Kommentteja ja ehdotuksia Yleinen käsittely Näytteen DNA-pitoisuus on liian alhainen bisulfiittikonversiota varten Tarkista DNA-uute Toista DNA:n uuttaminen konsentroituneemmalla kliinisellä näytteellä Näyte pisteytetään virheelliseksi: ACTB ei monistu tai sen monistuminen on liian alhainen a) Pipetointivirhe tai reagensseja on unohdettu lisätä Tarkista pipetointimenettely ja reaktion asetukset. Suorita PCR-ajo uudelleen. 32 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Kommentteja ja ehdotuksia b) Tarkista DNA-konsentraatti Lisää bisulfaattikonversion DNA-syötteen määrä suurimmaksi mahdolliseksi. Bisulfiittikonversioreaktio toimii parhaiten, kun DNA-syötteen määrä on 100 ng 2 µg c) Tarkista bisulfiittikonvertoitu eluaatti Toista bisulfiittikonversio, tarvittaessa voit käyttää suurempaa DNA-syötettä. Näyte pisteytetään virheelliseksi: kohteet FAM19A4 ja/tai hsa-mir124-2 ovat virheellisiä Sekoitus ei riitä Sekoita näytettä ja reaktioseosta pipetoimalla (noin 10 kertaa/putki). Toista näyte. Positiivinen kontrolli pisteytetään virheelliseksi: ainakin yhden kohteen monistuminen on liian alhainen tai puuttuu a) Pipetointivirhe tai reagensseja on unohdettu lisätä Tarkista pipetointimenettely ja reaktion asetukset. Suorita PCR-ajo uudelleen. b) Osittainen hajoaminen Säilytä sarjan sisältöä -15...-30 C:ssa. Vältä toistuvaa pakastamista ja sulatusta. Pakastus-sulatussyklejä saa olla enintään kolme. c) PCR-reagenssit ovat osittain hajonneet d) Liuskaputkien vaihtuminen keskenään Säilytä sarjan sisältö -15...-30 C:ssa ja suojaa reaktioseokset valolta. Vältä toistuvaa pakastamista ja sulatusta. Tarkista pipetointimenettely ja reaktion asetukset. e) Vanhentumispäivämäärä Tarkista käytetyn sarjan vanhentumispäivämäärä. f) Aikaviive näytteiden pipetoinnin ja ajon alkamisen välillä Kun näytteet on annosteltu PCR-reaktioita varten, PCR-reaktioseoksia voi säilyttää pimeässä 2 8 C:n lämpötilassa enintään 30 minuutin ajan ennen ajon käynnistämistä laitteessa. QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 33

Kommentteja ja ehdotuksia Ei mallia -kontrolli (NTC) on virheellinen a) Pipetointivirhe Tarkista pipetointimenettely ja reaktion asetukset. Suorita PCR-ajo uudelleen. b) Ristikontaminaatio Vaihda kaikki kriittisen tärkeät reagenssit. Käsittele näytteitä, sarjan osia ja kulutusosia yleisesti hyväksyttyjen menettelytapojen mukaisesti, jotta kulkeutumiskontaminaatiota ei tapahtuisi. c) Reagenssin kontaminaatio Vaihda kaikki kriittisen tärkeät reagenssit. Käsittele näytteitä, sarjan osia ja kulutusosia yleisesti hyväksyttyjen menettelytapojen mukaisesti, jotta kulkeutumiskontaminaatiota ei tapahtuisi. d) Liuskaputkien vaihtuminen keskenään e) Aikaviive näytteiden pipetoinnin ja ajon alkamisen välillä Tarkista pipetointimenettely ja reaktion asetukset. Kun näytteet on annosteltu PCR-reaktioita varten, PCR-reaktioseoksia voi säilyttää pimeässä 2 8 C:n lämpötilassa enintään 30 minuutin ajan ennen ajon käynnistämistä laitteessa. f) Koettimen hajoaminen Säilytä reaktioseokset valolta suojattuna. Tarkista, onko fluoresenssikäyrässä vääriä positiivisia signaaleja. Näytteen signaaleita puuttuu tai ne ovat matalia, mutta kontrolliajo on ok a) Inhiboivia vaikutuksia Kun teet bisulfiittikonversiota, tarkista aina sentrifugoinnin jälkeen, ettei suodattimessa ole puskuriliuoksen jäämiä. Toista bisulfiittikonversio. b) Pipetointivirhe Tarkista pipetointimenettely ja reaktion asetukset. Suorita PCR-ajo uudelleen. Jos ongelma jatkuu, ota yhteys QIAGENin tekniseen palveluun. 34 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Rajoitukset QIAsure Methylation -testin reagensseja voi käyttää vain in vitro -diagnostiikkaan. PCR-testien käyttäminen vaatii hyvien laboratoriokäytäntöjen noudattamista, mukaan lukien molekyylibiologiaan käytettävien laitteiden ylläpito sovellettavien säädösten ja standardien mukaisesti. Tämän sarjan mukana toimitetut reagenssit ja ohjeet on validoitu suorituskyvyltään optimaalisiksi. QIAsure Methylation -testin käyttäjän on oltava laboratorioalan ammattilainen, jolla on koulutus Rotor-Gene Q MDx -laitteiden ja Rotor-Gene AssayManager v1.0 -ohjelmiston käyttöön. Tuotetta saavat käyttää vain henkilöt, jotka on nimenomaisesti koulutettu reaaliaikaisten PCRmenetelmien ja in vitro -diagnostiikan käyttöön. Saatu diagnostinen tulos on tulkittava yhdessä muiden kliinisten löydösten tai laboratoriolöydösten kanssa. Optimaalisten PCR-tulosten saavuttamiseksi käyttöoppaan (käsikirjan) on ohjeita on noudatettava erittäin tarkasti. Ota huomioon vanhenemispäivämäärät, jotka on painettu pakkaukseen ja kaikkien komponenttien etiketteihin. Älä käytä vanhentuneita komponentteja. Näytteet, joissa DNA:n laatu tai määrä on matala (esimerkiksi ACTB:n CT-arvot ovat juuri ja juuri hyväksyntärajoissa; CT-arvot 25 26,4), saattavat tulla pisteytetyksi väärinä negatiivisina. On suositeltavaa toistaa testi kunkin näytteen osalta yksittäisenä. Negatiivinen tulos toistetussa QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 35

testissä tarkoittaa, että näyte on hypermetylaationegatiivinen. Positiivinen tulos tarkoittaa, että näyte on hypermetylaatiopositiivinen. Kaikki QIAsure Methylation -testin mukana toimitetut reagenssit on tarkoitettu käytettäväksi ainoastaan muiden samaan sarjaan sisältyvien reagenssien kanssa. Muussa tapauksessa suorituskyky saattaa heikentyä. QIAsure Methylation -testi on validoitu HPV-positiivisten naisten osalta. QIAsure Methylation -testi on validoitu kohdunkaulan irtosolunäytteille, jotka on kerätty ja säilötty PreservCyt- tai STM-ottoalustaan sekä näytteille, jotka on otettu emättimestä itse harjatyyppisellä näytteenottimella ja säilötty suolaliuokseen (0,9 % p/til. NaCl). QIAsure Methylation -testiä ei ole validoitu käytettäväksi kohdunkaulan irtosolunäytteisiin, jotka on kerätty ja säilötty formaldehydiä sisältävään näytteenottoalustaan, kuten BD Surepath tai vastaava. Formaldehydi aiheuttaa DNA:n ristiinlinkittymistä, mikä voi häiritä QIAsure Methylation -testin suorituskykyä. Vain Rotor-Gene Q MDx -laite on validoitu käytettäväksi QIAsure Methylation -PCR-testin kanssa. Tämän tuotteen off label -käyttö ja/tai komponenttien muokkaaminen mitätöi Self-screen B.V. -yhtiön vastuun. Käyttäjän vastuulla on validoida järjestelmän suorituskyky kaikissa niissä laboratoriossa käytetyissä menetelmissä, joita Self-screen -yhtiön tekemät suorituskykytutkimukset eivät kata. 36 QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017

Suoritusarvot Havaitsemisraja (LOD) QIAsure Methylation -testin analyyttiseksi herkkyydeksi määritettiin 95 %:n havaitsemisraja (95 % LOD) käyttämällä sarjalaimennussarjaa plasmidista, joka sisälsi kaikki kolme amplikonisekvenssiä (eli ACTB, FAM19A4 ja hsa-mir124-2; välillä 750 000 0,25 kopiota/pcrajo). Kohteiden 95 %:n havaitsemisraja arvioitiin alhaisimpana plasmidin laimennuksena, joka tuotti vähintään 35 positiivista tulosta (CT < 40) 36:sta. Neljä eri käyttäjää teki yhteensä 12 testiä (1 ajo/käyttäjä/päivä) käyttämällä kolmea eri erää ja kolmea eri RGQ-järjestelmää. Jokaisessa kokeessa testattiin 11 plasmidilaimennosta kolme kertaa. 95 %:n havaitsemisraja oli kaikissa kolmessa eri kohteessa 7,5 kopiota/pcr-ajo. Lineaarisuus QIAsure-testin lineaarisuus määritettiin niiden 12 testin tiedoista, joilla 95 %:n havaitsemisraja määritettiin. Testin kahdessa kohteessa, FAM19A4 ja hsa-mir124-2, sekä referenssi ACTB:ssä tapahtuu lineaarista monistumista välillä 750 000 7,5 kopiota/pcr-ajo. Tarkkuus QIAsure Methylation -testin tarkkuus määritettiin testin sisäisenä variaationa (saman pitoisuuden omaavien näytteiden testitulosten vaihtelevuutena yhden testin sisällä) ja testin kokonaisvarianssina (useiden testitulosten vaihtelevuutena eri operaattorien, instrumenttien, erien ja laboratorioiden välillä). Testaus tehtiin bisulfiittikonvertoidulla DNA:lla, joka oli saatu suuririskisestä HPV-positiivisesta kohdunkaulanäytteestä, joka testautui hypermetylaatiopositiiviseksi ja tuotti signaalin FAM19A4- että hsa-mir124-2-kohteen osalta, mikä vastasi noin 3 kertaa havaitsemisrajan pitoisuutta. Testauksen teki neljä käyttäjää kahdennettuna 8 ajossa (yksi ajo/käyttäjä/päivä) käyttäen kahta eri erää ja kolmea eri RGQ-laitetta QIAsure Methylation -testi, käyttöohje (käsikirja) 03/2017 37