Genetiikan perusteiden harjoitustyöt Molekyylien kloonaus ja siihen liittyvät taidot ja temput, osa 1 Restriktioentsyymit, elektroforeesi Moniste sivulta 24-: Geenien kloonaus CELL 491- Isolating, cloning, and sequencing DNA www.bio.davidson.edu/courses/genomics/methodslist.html#meth2 http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html
DNA:n eristäminen on usein esiintyvä työvaihe erilaisissa tehtävissä. Menetelmiä on monia. Kurssityö: Drosophilan genomisen DNA:n eristys fenolikloroformimenetelmällä ilman fenolia resepti sivulla 26
Muita DNA:n eristysmenetelmiä Fenoli-kloroformimenetelmä tuottaa paljon laadukasta totaalidna:ta esimerkiksi kaloista Chelex hartsipallomenetelmä, hyvin tykätty Toisinaan jätetään DNA eristämättä ja siihen kohdistuvat toimet tehdään moskassa tai in situ, paikallaan. Niinpä esimerkiksi oikein pienten eläinten PCR tehdään moskineen, ja PCR voidaan tehdä myös esimerkiksi objektilasille liiskatussa, hieman hajotetussa kudoksessa/solussa.
Eikö se PCR kävisi hyvin pienestä kudosraapaisusta ilman puhdistusta, niinkuin me teemme Gyrodactylusten kanssa? Meillä ohjelma on seuraava: Digestio 10µl tilavuudessa 200µl putkessa: Dynazyme 10x PCR-Buffer 1µl Tween 20 (10%) 0,5µl Igepal (10%) 0,5µl Proteinaasi K (6mg/ml) 0,1µl Steriili vesi 7,9µl Gyromato 1 kpl kokonaisena tai vain etupää Madon spinnaus pohjalle. Hajotusohjelma PCR-laitteessa: 65 C 25 min 94 C 10 min Tästä otetaan 2 mikrolitraa PCR:ää varten.
Polymeraasiketjureaktio eli PCR monistaa sen mitä me haluamme 5 3 3 5 Nobel 1993: Kary S. Mullis CELL 509
Tästä eteenpäin määrämittaisten molekyylien osuus kasvaa eksponentiaalisesti, nyt niitä on 8 (vasta puolet, mutta aluksi ei ollut yhtään. Kolmen lisäsyklin jälkeen määrämittaisia on 240/ 256, ja kolmenkymmenen syklin jälkeen yhä enemmän) CELL 509
Prosessin vaiheet Denaturointi (melting) korkeassa lämpötilassa erottaa kaksoisjuosteen puoliskot toisistaan Annealing Primerit takertuvat spesifisiin kohtiin 30-45 sekunnissa. Lämpötila? Lasketaan se vaikka firman laskimella: http://www.finnzymes.fi/java/tm_determination.htm Elongation Polymeraasi toimii ja tekee primerista lähtien kopion Final elongation: Parsitaan kesken jääneet juosteet
PCR madon KK#9 kloonausta varten Steriili vesi 11,4 µl PCR-ohjelma Phusion 5x HF-PCR-puskuri (Finnzymes) 4,0 µl 98 C 20 s dntp (10 mm) 0,4 µl 98 C 10 s aluke ITS1clo (10 µm) 1,0 µl 30x 57 C 20 s aluke ITS2Rclo (10 µm) 1,0 µl 72 C 35 s Phusion DNA polymeraasi (2 U/µl) (Finnzymes) 0,2 µl 72 C 5 min hajotettu mato KK#9 2,0 µl 4 C 4 C lopetus Tässä on Esa Aallon gradun PCR-resepti Gyrodactylus-matoa varten. Madot olivat heterotsygootteja, ja PCR tuotti runsaasti paternaalisen ja maternaalisen alleelin rekombinantteja myös silloin, kun alleelit oli kloonattu ja sekoitettu. PCR-rekombinaation poistamiseksi EA teki hyvin paljon työtä, mutta se ei näyttänyt olevan mahdollista. Kirjallisuudessa on paljon esimerkkejä siitä, että tätä artefaktia on pidetty biologisena prosessina, joka tapahtuu heterotsygooteissa (concerted evolution, gene conversion). Sellainen prosessi on olemassa, mutta sen demonstraatio ei taida olla helppoa, jos signaali ei erotu artefaktista.
DNA-fragmenttien eristys ja visualisointi agaroosigeelielektroforeesilla Kurssityö: sivu 27
Agaroosigeelielektroforeesilla erotellaan erikokoisten DNAmolekyylien joukot ja poimitaan mieluisat UV-valossa talteen
Etidiumbromidilla (, CELL 494) dopattu DNA näkyy geelillä UV-valossa
Tässä erotellaan muutamia lohikalojen loislajeja toisistaan suit sait
MCB 214 CELL 502
Taq -polymeraasi jättää PCR-tuotteen päähän aina yhden A:n ylimääräistä (overhang) Liitos = TA cloning concept TOPO tulee topoisomeraasi ykkösestä (MCB 468). Se liittää T-A parit yhteen mielellään Invitrogen 1999 p. 6
Bakteerien transformaatio Kurssityö sivu 29- Transformaatio tarkoittaa sitä, että bakteerien (solujen) ominaisuuksia muutetaan siirtämällä DNA:ta. Molekyylikloonauksessa halutaan vain siirtää joku DNApätkä monistettavaksi bakteereihin; bakteerin ominaisuuksista sinänsä ei nyt välitetä (Transduktio on virusvälitteistä) Kurssityössä siirretään plasmideja soluihin. Plasmideissa voisi olla siirrettäviä geenejä!
Bakteerien transformaatio sivu 29 1) Kasvatetaan E. colia, heikennetään soluseiniä kalsiumkloridilla = kompetentit solut, voi myös ostaa kaupasta 2) Heitetään plasmidit sekaan 3) Annetaan kasvaa, maljataan 4) Etsitään muuntuneita solukolonioita: eläviä = ampisilliiniresistenssi siirtynyt, ei sinisiä = vektorin reportteri lauennut 5) Positiivinen bakteerikolonia eristetään, varmistetaan sen sisältö (uusi PCR) ja kasvatetaan vaikka viideksi litraksi.
Historia: bakteerien transformaatio oli yksi niistä havainnoista, jotka johtivat DNA:n roolin demonstrointiin
DNA Kemiallinen luonnehtinta: Kossel (1910), Todd (1957) Transformaatio: Griffith 1928, Avery, McLeod, McCarty 1944 Transduktio: Hershey & Chase (1969) Rakenne: Watson, Crick, Franklin, Wilkins 1953 (1962)
Transformaatio Griffith 1928 Kaksi bakteerikantaa (Streptococcus pneumoniae): Smooth virulentti Rough benigni Keitetty S voi muuttaa elävän R:n virulentiksi
MCB 210 CELL 502
MCB 210 CELL 502
MCB 210 CELL 502
Siniset pesäkkeet ovat pysyneet elossa, mistä päätellen ne on transformoitu, mutta sininen lacz -reportterin tuote paljastaa, ettei vektorissa ole insertiota Siis: Valkeat pesäkkeet ovat niitä toivottuja
Hieno nykyaikainen kloonausvektori, kaksi mallia saatavana Invitrogen 1999 p. 6
2 vaihtoehtoista antibioottiresistenssigeeniä Invitrogen 1999 p. 6
Promoottorit, jos halutaan käyttää ekspressiovektorina lacz -reportteri: jos se toimii, ei tässä välissä ole mitään Invitrogen 1999 p. 6
Invitrogen 1999 p. 6
Transformaatiokoe kontrolli proteiinit tuhottu (proteinaasi) DNA tuhottu (DNAasi) RNA tuhottu (RNAasi)
Avery, McLeod, McCarty 1944
DNA:n pilkkominen (digestio) restriktioendonukleaaseilla Rekombinatti-DNA -tekniikoiden perusjuttuja Kurssityö: äsken eristetyn plasmidi-dna:n pilkkominen Entsyymikitin ohjeiden mukaan! Ei ole vaikeaa! Katsotaan, mitä kirjassa asiasta kerrotaan. MCB 211-213 CELL 493
Restriktioendonukleaasin toiminta, esimerkkinä EcoRI Bakteerisoluissa on endonukleaasin lisäksi samaa sekvenssiä valvova metylaasi, joka metyloi restriktiopaikat, jottei E. coli pilko omaa DNA:taan pikku pätkiksi MCB 212
Restriktioentsyymejä on biotekniikkafirmojen esitteissä sivukaupalla. Esitteet ovatkin paras käsikirja reseptien etsimiseen.
2 vaihtoehtoista polylinkkerisekvenssiä Invitrogen 1999 p. 6
Invitrogen 1999 p. 192
Restriktioentsyymejä on biotekniikkafirmojen esitteissä sivukaupalla. Esitteet ovatkin paras käsikirja reseptien etsimiseen.
Ligaatio Pilkkomisen vastakohta on liittäminen eli ligaatio Restriktioentsyymit tuottavat usein sticky ends, jotka ovat mukavasti komplementaarisia, koska restriktiokohta oli palindromi Kun vektori ja kohdedna pilkotaan samalla restriktioentsyymillä, ovat kaikki katkoskohdat periaatteessa yhteensopivia CELL 501
MCB 213
Rough (ei patogeeninen) Smooth (tappaa hiiren)
MCB 214 CELL 502
MCB 209
Siniset pesäkkeet ovat pysyneet elossa, mistä päätellen ne on transformoitu, mutta sininen lacz -reportterin tuote paljastaa, ettei vektorissa ole insertiota Siis: Valkeat pesäkkeet ovat niitä toivottuja