Mikä on virus? Jean-Yves Sgro Virukset poikkeavat kaikista muista organismeista - täysin oma elinmuoto Virusten rakenne ja lisääntyminen Maria Söderlund-Venermo, FT, dos. Haartman-instituutti, Virologian osasto Helsingin yliopisto Pakollisia solunsisäisiä loisia, joissa on minimimäärä geenejä joita ympäröi infektiokyvyn antava suojakerros. Virus ei voi lisääntyä ilman eläviä soluja. Isäntäsolunsa ulkopuolella virukset ovat metabolisesti inaktiivisia kappaleita. Viruspartikkelin on sekä selviydyttävä solunulkoisista olosuhteista, että kyettävä purkautumaan sopivassa isäntäsolussa. Tunkeuduttuaan soluun virukset käyttävät tämän metabolista ja synteettistä laitteistoa omiin tarkoitusperiinsä yleensä solun hyvinvoinnin kustannuksella. Viruksia löytyy eläin-, kasvi-, bakteeri-, arkki-, levä- ja sienisoluissa Viruksia on >10 miljoonaa partikkelia/ml vettä Virus koostuu proteiinista ja nukleiinihaposta, eräillä myös lipidiä VIRUKSEN KOKO Viruspartikkelin koko on vain 15-300 nm [1000nm = 1 µm; 1000µm = 1 mm] - viruksia ei siis voi nähdä, tarvitaan elektronimikroskooppi LWOFFIN KRITEERIT Ominaisuus Bakteerit Riketsiat Virukset Geenit Viroidit valomikroskooppi elektronimikroskooppi röntgen NMR Erotuskyky: silmä 0,1 mm = 100 µm valomikroskooppi 0,2 µm EM 0,2-2 nm Albumiini Polio Influenssa Isorokko Stafylokokki Ihmissolu koko genomi (MW) 5nm - 28nm 2,6 x 106 100nm 4 x 106 250nm 160 x 106 1000nm 3000 x 106 15 000nm 10 000 000 x 106 Koko (> 500nm) Lisääntyy: jakautumalla replikoimalla Ribosomeja Oma energiatuotanto Oma proteiinisynteesi Perimä: DNA RNA DNA tai RNA Infektiokyky (Antibioottiherkkyys) 1898 1902 1908 1911 1916 1923 1930-1940- 1949 1950-1952 1964 1977 1983 1983 1986 Variolaatio isorokkorokotteena Isorokkovirusrokote (vaccination) Rabies kaneihin TMV on pienempi kuin muut taudinaihettajat Virus = taudinaiheuttaja, virulentti + ± + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Bakteerit lisääntyvät jakautumalla, keinotekoisilla kasvatusalustoilla. Virukset lisääntyvät vain elävän solun sisällä: solu toimii tehtaana ja tuottaa viruksen osia - vasta tämän jälkeen viruksen rakenneosat yhdistyvät viruksiksi. Viruspartikkeli ei kasva eikä liiku. Virus muteeraa, kehittyy (evoluutio), lisääntyy > elävä organismi VIROLOGIAN HISTORIA 1000-luku -> 1796 Edward Jenner 1881 Louis Pasteur 1892 Dimitri Iwanowsky 1898 Martinus Beijerinck Iso ja pieni virus Mimivirus: 1,2 Mega bp Anellovirus: TTV: 3,8 Kilo bp Virus keksittiin : Tupakan mosaiikkivirus (TMV) on pienempi kuin muut taudinaiheuttajat. Ei voida filtroida pois. Uudentyyppinen taudinaiheuttaja => tarttuva elollinen aine Contagium virum/vivum fluidum eli tarttuva myrkyllinen/elollinen neste Loeffler ja Frosch Suu ja sorkkatauti siirtyy kuten TMV ja lisääntyy joka siirroksessa Walter Reed Keltakuume tarttuu hyttysten välityksellä, viremia Landsteiner, Popper Lapsihalvauksen aiheuttaja on virus Peyton Rous Ensimmäinen kasvainvirus sarkoomasta, RSV Twort, d Herelle Bakteerivirukset (faagit) Theiler ja Smith Hiiri-ja kananmunaeristykset Wendell Stanley Kiteytti TMV:n mallivirus Ernst Ruska et al. Elektronimikroskopia John Enders Soluviljelmät; polion kasvatus Salk / Sabin Poliorokotteet Hershey & Chase Bakteriofagin genomi on yksinään infektiivinen Epstein & Barr Ensimmäinen osoitus ihmisen virussyövästä: EBV, Burkittin lymfooma Viimeinen isorokkotapaus. WHO:n ohjelma johti taudin häviämiseen Montagnier, Barré-Sinoussi: AIDS:n aiheuttajavirus (HIV) eristettiin Karry Mullis PCR eli geenimonistus Ensimmäinen yhdistelmä-dna-rokote (Hepaatiitti B) otettiin käyttöön Bendinelli et al Clin Microbiol Rev 14; 2001 Circo: 20nm Raoult et al Science 306; 2004 Mimi: 400nm 1
VIRUSTEN KOOSTUMUS NUKLEIINIHAPPO 1-30 (50)% - DNA tai RNA - 1- tai 2-säikeinen - lineaarinen tai sirkulaarinen - yhtenäinen tai segmentoitu - koko ~ 10 3 10 5 (- 10 6 ) bp (rajoittunut geneettinen kapasiteetti) PROTEIINI 60-80% - genomia suojaava kuori - yleensä vain muutama lajike - immunologinen spesifiteetti - reseptoritunnistus - entsyymitoiminta (polymeraasi) - solunsisäinen kuljetus - virusgenomin koodaamia VIRUSTEN RAKENNE (MORFOLOGIA) EM (1950): Pintarakenne ei ole tasainen vaan koostuu alakomponenteista Röntgendiffraktio (1972): Viruspartikkeli ei ole amorfinen - koostuu toistuvista säännöllisistä alayksiköistä - helppo kiteyttää, symmetrisiä - tutkitaan jo alle 2 Å tarkkuudella Kryo-EM + tietokoneella tehty 3D-kuvarekonstruktio Näyte jäädytetään nopeasti, jotta rakennetta vahingoittavia jääkiteitä ei muodostuisi. Mikroskopointi -160 C. Virusten muodot: sauva, pallo, ikosahedri, luoti, mato... LIPIDIT 0-20% - vaipassa - isäntäsolusta peräisin - koostumus vastaa maturaatiopaikkaa - voi vaihdella isäntäsolusta riippuen HIILIHYDRAATIT - vaipan glykoproteiineissa ja -lipideissä - isäntäsolun entsyymit vaastaavat synteesistä VIRUSTERMINOLOGIA Kapsidi (Kapsid, Capsid) Rakenneyksikkö Kapsomeeri (Kapsomer) Nukleiinihappo (DNA tai RNA) Nukleokapsidi (tai RNP) Lipidi (Lipid) Glykoproteiini, uloke spike Vaippa (Hölje, Envelope) Matrix-proteiini Virioni (Virion) HELIKAALINEN VIRUSSYMMETRIA Proteiiniyksiköt järjestyvät vierekkäin nukleiinihapporihman ympärille muodostaen spiraalimaisen rakenteen, jossa kukin rakenneyksikkö on naapuriinsa nähden samassa asemassa = nukleokapsidi. Malliviruksena toimii Tupakan mosaiikkivirus TMV: Genomi koodaa vain yhtä proteiinia, mutta valtavia määriä tätä Koko kapsidin pituus on riippuvainen RNA-rihman pituudesta Viruksen ulkomuoto voi silti olla joko pyöreä tai pitkulainen TMV Replikaatio: genomin monistus Transkriptio: lähetti-rna:n tuotanto Translaatio: proteiinisynteesi Paramyxovirus Cytomegalovirus Paramyxovirus Rabies Helikaalinen symmetria VIRUSSYMMETRIA IKOSAHEDRAALINEN (POLYHEDRAALINEN) Filo: Ebola Ortomyxo: Influenssa A Arenavirus Genomi on vapaana kuoren sisällä, eli ei tiukasti proteiinin ympäröimänä kuten helikaalisella viruksella. Rakenteen perustana on tasokide, jossa on 20 kolmionmuotoista tasoa. Tasokide voidaan jakaa tasasivuiseksi kolmioverkoksi, jossa kutakin kolmiota vastaa kolme rakenneyksikköä (20 x 3), rakenneyksiköitä tarvitaan 60. Alkeiskolmioista muodostuneen ikosahedrin 12:a kärjen ympärille muodostuu viiden yksikön rengas. Pienin ikosahedri on T=1 (alkeiskolmioluku x 60 yksikköä) 3,4,7,9,12 - jos suurempi kuin T=3 puhutaan kvasiekvivalenssista 5-3-2-symmetria: Paramyxo Coronavirus Rhabdo: Vesicular Stomatitis (VSV) 2
Ikosahedraalinen symmetria Papillomavirus, T=7 Herpesvirus, T=16 VIRUSSYMMETRIA Enterovirus, T=1 The Eden Project with geodesic domes near St Austell, England. Climatron at the Missouri Botanical Garden, St. Louis, 1960 Fuller s geodesic system consists of dividing a sphere into equal triangles; Geodesic Dome Parvovirus, T=1 Adenovirus, T=25 Rotavirus, T=13 VIRUSTEN LUOKITTELU VIRUSSYMMETRIA Otetaan huomioon kemialliset, fysikaaliset ja biologiset ominaisuudet: VIRIONI: virionin koko, muoto, vaippa, kapsidin symmetria GENOMI: DNA/RNA, yksi/kaksisäikeisyys, lineaarinen/sirkulaarinen, +/- polariteetti (ambisens), segmentoituneisuus ja niiden lukumäärä, koko, +/- 5 terminaalinen caprakenne, sekvenssi, jne. PROTEIINIT: lajikkeiden lukumäärä, koko, toiminnat, aminohappojärjestys REPLIKAATIO: strategia, transkriptiotapa, translaatiotapa, maturaatiopaikka, vaikutus soluun FYSIKAALISET: ph-sieto, kationiriippuvuus, lämpö-, liuotin-, detergentti- ja säteilyherkkyys BIOLOGISET: serologinen sukulaisuus, isäntä- ja kudosvalikko, taudinaiheuttamiskyky KOMPLEKSINEN Pox-virukset (isorokkovirus) eivät ole helikaalisia eivätkä ikosahedraalisia, vaan hyvin monimutkaisia isoja partikkeleita (250 nm) - tiiliskiven muotoisia - ei noudattele symmetrioita On myös muunmallisia viruksia, kuten sitruunan, pisaran ja viinipullonmuotoisia... RNA Molluscum contagiosum poxvirus Fusellovirus Acidianus bottle-shaped virus (Ampullavirus) Ikosahedraalinen Helikaalinen RNA-VIRUKSET Esimerkkejä: Rota IBDV Noro Sapo polio rino HAV entero dengue rubella kumlinge sindbis keltakuume HCV HIV HTLV SARS Ebola Marburg rabies VSV Hantaan Influenssa Puumala Inkoo Uukuniemi DNA Ikosahedraalinen Helikaalinen Tuntematon DNA-VIRUKSET RS Lassa sikotauti tuhkarokko parainfluenssa HMPV hendra Esimerkkejä: B19 papillooma (oma heimo) Boca polyooma (oma heimo) Parv4 SV40 AAV BK, JC, MVM KI, WU, MCV, TSV CPV HBV HSV LCV CMV rana EBV HHV-6, 7, 8 AcMNPV isorokko vaccinia molluscum contagiosum 3
BAKTERIOFAGIT Virophage" = viruksen faagi Bakteerien syöjät, eli bakteerivirukset, eli bakteriofagit, eli fagit tai faagit (phage) Todennäköisesti kaikilla bakteereilla omat faaginsa, joiden isäntäspesifisyys johtuu solun ulkopinnan reseptoreista. Eri morfologiatyyppejä (A-F) Jättiviruksilla on omat faaginsa, jotka tekevät ne sairaiksi Faagin nimi on Sputnik ~50 nm ikosahdraalinen kapsidi ~18 kbp dsdna rengasmainen genomi sisältää 21 geeniä, jotka homologisia eri eliödomenien kanssa (eukaryootit, arkit ja bakteerit) T4 faagi Tectiviridae faagi T4 faagi Different morphological aspects of mamavirus and Sputnik. La Scola et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07218 Enterobacteria virus P2 F (M13) faagi 1. ADSORPTIO VIRUKSEN MONISTUMINEN SOLUSSA 1. ADSORPTIO (KIINNITTYMINEN) - virus tarttuu solun reseptoreihin 2. PENETRAATIO - virus läpäisee solukalvon Infektoivia yksiköitä per solu Infektiivisiä virus- partikkeleita solussa Ekstrasellulaarisia viruspartikkeleita 3. KUORIUTUMINEN (uncoat) - genomin vapautuminen kapsidista 4. PROTEIINI JA NUKLEIINIHAPPOSYNTEESI - solu tuottaa viraalisia proteiineja - viruksen genomi monistuu (replikoituu) 5. 6. 1, 2 3, 4 Satunnainen yhteentörmäys, fysikaalinen ilmiö, ei vaadi energiaa > korkea virionikonsentraatio, josta kuitenkin vain harva kiinnittyy soluun Virus tunnistaa jonkin reseptorin (vastaanottajamolekyylin) solun pinnalla ja tarttuu siihen > usein hyvin spesifi tarttuminen Virus infektoi vain muutaman solun Virus voi päästä myös sellaisiin soluihin, joissa se ei kykene lisääntymään > voi tappaa solun 6Aika 5 Eklipsi VIRUKSEN KOKOAMINEN/ ASSEMBLY (KYPSYMINEN) - proteiiniyksiköt muodostavat kapsidin, jonka sisälle joutuu nukleiinihappo Beanpod mottle virus (kasvi) VAPAUTUMINEN Chlorellavirus (levä) - valmiit virukset lähtevät isäntäsolusta joko eksosytoosilla tai kuroutumalla, tai rikkomalla solukalvon SOLUKALVO JA RESEPTORIT 2. PENETRAATIO Monta eri menetelmää miten virus tunkeutuu solukalvon läpi a) Virus luovuttaa vain nukleiinihapponsa /nukleokapsidinsa suoraan plasmamembraanin läpi sytoplasmaan (esim T4 bakteriofaagi) b) Virusvaipan ja solukalvon yhteensulaminen, eli fuusio (esim. HIV) c) Reseptori-välitteinen endosytoosi, eli virus kulkeutuu soluun solurakkulassa - fuusio endosomin kalvon kanssa (influenssa) - endosomin lyysi (adeno) Koiran parvoviruksen transferriinireseptori (C.R. Parrish 2001) Esimerkkejä solureseptorista: Integriinit, hepariinisulfaatti, sialihappo, CD21, CD4, globosidi, ICAM-1, laminiini-reseptori, EGF-reseptori... Monet virukset tarvitsevat ko-reseptorin päästäkseen solun sisään Reseptoreilla usein tärkeä merkitys solu- ja kudoshakuisuudelle HI-viruksen kiinnittyminen ja sisääntulo PBCV-1 viruksen DNA:n syöttö Chlorellalevään 4
VIRUKSEN KULKEUTUMINEN SOLUSSA Sytoplasma eli solulima on virukselle iso viskoosinen meri jonka läpi täytyy päästä tumaan. Virusten endosytoottiset kuljetusreitit Virukselle 1 cm matka kestäisi vedessä solulimassa Poliovirus kapsidi 16 nm 45 vrk 61 vuotta Adenovirus kapsidi 45 nm 122 vrk 166 vuotta HSV kapsidi 63 nm 169 vrk 231 vuotta From Sodeik, 2000. Trends Microbiol 8: 465 Monet virukset (rabies, influenssa, herpes, adeno, parvo) käyttävät hyväkseen solun tukirakenteita, eli mikrotubuluksia, sekä solun tumakuljetusproteiineja, dyneiinia ja kinesiinia Nucleus MTs Maija Vihinen-Ranta, Jyväskylä Marsh, Helenius: Virus entry Cell 2006 VIRUKSEN KULKEUTUMINEN SOLUSSA Viruksen tumakuljetus ja DNA-genomin vapautuminen 1) Vapautuneen genomin (+ proteiineja) tumakuljetus - genomi vapautuu sytoplasmassa: HIV, influenssa tumakalvolla: herpesvirus, adenovirus, hepatiitti B virus 2) Kokonainen viruspartikkeli kuljetetaan tumaan - genomi vapautuu tumassa - esim. geminivirukset, parvovirukset (?) 3) Virus tumaan mitoosin aikana (tumakalvo häviää) - simian retrovirus 1 Tuma- huokonen Tuma 3-4 EKLIPSI (NUKLEIINIHAPON JA PROTEIININ SYNTEESI) Aika, jolloin emme näe viruksia solun sisällä sillä virus on hajonnut. Virus on hyvin kehittynyt parasiitti: solun oma proteiinituotanto loppuu melkein kokonaan ja solu rupeaa tuottamaan ainesosia virukselle. Eräät DNA-virukset käyttävät solun polymeraasia replikaatioon eli genominsa monistukseen, mutta useimmilla on oma entsyymi. RNAviruksilla oma. DNA-virukset monistuvat tumassa ja RNA-virukset sytoplasmassa. Virus EI monistu integroitumalla solun kromosomiin. Genomin vapautuminen kuorestaan uncoating VIRUSTEN REPLIKAATIOSTRATEGIA +ssrna -ssdna (retrovirus) Kantaa käänteis-transkriptaasia mukanaan - tai + ssdna ±dsdna (parvo, anello, circo) (papillooma, polyooma, adeno, herpes, hepadna, irido, pox) DNA-virus DNA-virukset DNA > aikainen mrna > aikainen proteiini (entsyymejä) DNA replikoituu myöhäisiä mrna:ta > myöh. proteiineja (rakenneprot.) +ssrna (picorna, flavi, toga, calici, corona) Koodaa RNA/RNA-polymeraasia -ssrna +RNA -ssrna ±dsrna (reo) Kantaa RNA/RNA-polymeraasia mukanaan (rabdo, paramyxo, ortomyxo, arena, filo, bunya, borna) Kantaa RNA/RNA-polymeraasia mukanaan DNA-virukset menevät tumaan - pienillä viruksilla solun polymeraasi ja isoilla viruksilla oma esim. HSV:n transkriptio, translaatio ja replikaatio > 5
RNA-virukset Yleensä suhteellisen pieni genomi, ehkä koska solussa ei juuri ole RNAvirheiden korjausta Tarvitsevat oman RNA-RNA-polymeraasin, jota ei ole sytoplasmassa Mitään proteiineja ei voida tehdä ilman mrna:ta, siksi RNA-genomin laatu virionissa vaikuttaa viruksen monistumiseen: +ssrna: Picornavirukset Replikaatio: +ssrna > -ssrna > +ssrna => replikaatio enkapsidaatio translaatio Translaatio: +ssrna -ssrna dsrna RNA > DNA + tai - ssrna:n kohtalo voi olla: - replikaatio, täyspitkien templaattien synteesi - enkapsidaatio - translaatio tai templaatti mrna-synteesille proteiineja VIRUKSEN VAIPPAPROTEIINIEN KYPSYMINEN 5-6. KYPSYMINEN JA VAPAUTUMINEN Nukleiinihappo ja proteiinit yhdistyvät uusiksi viruspartikkeleiksi Vaippaproteiinien eritysreitti: Viruspartikkelin kokoaminen on ohjelmoituneena sen rakenneproteiinien aajärjestykseen = self assembly Vaippaproteiinit glykosyloidaan ja kuljetetaan solukalvolle Vaipalliset virukset saavat ympärilleen lipideistä koostuvan vaipan joko solukalvosta tai solunsisäisistä kalvoista (tuma, ER tai golgi) 1. ER: - proteiinien tuotto - laskostuminen - rikkisidosten muodost. - glykosylaation aloitus Vapautumisreitit: c) a) b) 2. Golgi: d) - glykosylaatio saatetaan päätökseen - kuljetusvesikkelit siirtävät proteiinit solukalvolle BAKTERIOFAGIEN ULOSPÄÄSY Vaipattomien bakteriofagien solulyysi burst Isäntäsolu hajoaa = solu lyysaa ja virionit vapautuvat ympäristöön. Solu kuolee. Vaipalliset virukset kuroutuvat ( budding ) ulos solusta. Viruspartikkeli hakeutuu niihin alueisiin membraanipinnalla, joissa löytyy valmiiksi ulokkeita Virus tulee ulos samoin kuin sisään, eli solurakkula-kuljetussysteemillä, eksosytoosilla Virus saa aikaiseksi solun apoptoosin ja siirtyy kuolleen solun mukana uusiin soluihin esim makrofaagien fagosytoosilla TARTTUMINEN Isäntäsolun toiminta TUNKEUTUMINEN VAPAUTUMINEN Transkriptio Translaatio Replikaatio VIRUKSEN LISÄÄNTYMINEN KOKOAMINEN (kypsyminen) VAPAUTUMINEN 6
VIROLOGINEN TUTKIMUS TÄNÄÄN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Pystymme ylläpitämään eläviä soluja kudoksen ulkopuolella (lisääntyvät keinotekoisella alustalla). Virukset kasvavat näissä soluviljelmissä hyvin. Huom Kaikki virukset eivät kasva soluviljelmissä. LÄHTEET Elektronimikroskoopilla ja röntgendiffraktiolla voidaan tutkia virusten rakennetta Spesifisiä vasta-aineita käytetään serotyypitykseen, diagnosointiin ja viruspartikkeleiden löytämiseen kudoksissa ja soluviljelmissä Rekombinantit antigeenit ja virukset ovat käytössä tutkimuksessa, diagnostiikassa ja rokotteissa PCR auttaa meitä löytämään viruksia yhä vähempiä määriä eri kudoksissa > diagnostiikka ja antiviraalisen hoidon seuranta > genotyyppaus > molekulaari-epidemiologiset ja evoluutiotutkimukset Antiviraalisia aineita (lääkkeitä) käytetään hoidossa. Pystymme tekemään infektiivisiä virusplasmidi-klooneja, joita voi käyttää tutkiessamme solunsisäisiä tapahtumia (replikaatio, transkriptio), tropismia, patogeneettisia mekanismeja sekä evoluutiota. Virustutkimus hyödyntää molekyyli- ja solubiologian tutkimusta 8. Viruksia käytetään geeniterapian työkaluina vektoreina. 9. Pystymme hävittämään tiettyjä viruksia maan päältä (isorokko, polio...) 10. Emme pysty kontrolloimaan kaikkia viruksia. Emme pysty estämään uusien vaarallisten virusten ilmestymistä (emerging diseases). Emme edes vielä tunne kaikkia viruksia... 11. Bioterrori uhkaa: isorokkovirus tai rekombinanttiviruksia Virus Ultrastructure by Linda Stannard [http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/linda.html] All the virology on the web by David Sander [http://www.tulane.edu/~dmsander/] ICTV [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ictvdb/index.htm] Molecular genetics by Ulrich Melcher OSU [http://opbs.okstate.edu/~melcher/] Maija Vihinen-Ranta, Jyväskylän yliopisto Fundamental Virology, Fields and Knipe, Raven Press Principles of Virology, Flint et al, ASM Press Jatkokursseja: Molecular Virology Molecular epidemiology of virus infections Clinical virology 7