Kvantitatiiviseen qrt-pcr:ään perustuva menetelmä enterovirusten tyypittämiseksi

Opinnäytetyö (AMK) Bio- ja elintarviketekniikan koulutusohjelma Biotekniikka 2011 Maija Liimatainen Kvantitatiiviseen qrt-pcr:ään perustuva menetelmä enterovirusten tyypittämiseksi

OPINNÄYTETYÖ (AMK) TIIVISTELMÄ TURUN AMMATTIKORKEAKOULU Bio- ja elintarviketekniikan koulutusohjelma Biotekniikka Kesäkuu 2011 Sivumäärä 47+ 5 liitettä Ohjaajat: Ilari Suominen (FT), Petri Susi (Dosentti, FT) ja Riikka Österback (FM) Maija Liimatainen Kvantitatiiviseen qrt-pcr:ään perustuva menetelmä enterovirusten tyypittämiseksi Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää herkkä menetelmä, jolla tuotetaan spesifinen DNA-pala suoraan virus-rna:sta käyttäen kvantitatiivista, reaaliaikaista käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktiota (qrt-pcr). Optimoinnissa keskityttiin enterovirusten VP1-alueen monistamiseen. Menetelmän optimointi tehtiin vaiheittain käyttäen ensin plasmidimuotoon kloonattuja virusgenomeja (PCR-vaihe) ja sitten virus-rna:ta, joka on eristetty tunnetuista virustyypeistä sekä ns. RNA-transkripteja, joiden kopioluku on tunnettu. Lopuksi tutkittiin kliinisiä virusnäytteitä, jotka edustavat todellista tunnistustilannetta, johon kehitettävää menetelmää aiotaan käyttää. Työssä testattiin erilaisia kaupallisia tuotteita, joita käytetään qrt-pcr:n eri vaiheissa. Tällaisia tuotteita ovat mm. kaupalliset käänteistranskriptioentsyymit (RT-vaihe), polymeraasiketjureaktiossa käytettävät entsyymit (PCR-vaihe) ja VP1-geenin eri kohtiin sitoutuvat alukkeet. Työssä tutkittiin myös PCR-syklin eri vaiheiden pituuksien ja lämpötilojen vaikutuksia PCR-tuotteen muodostumiseen. Ajo-olosuhteita vertailtiin toisiinsa ajojen Ct-arvoja ja PCRtuotteiden sulamiskäyriä tarkastelemalla. Kehitettävän VP1-menetelmän herkkyyttä verrattiin diagnostiikassa käytettävään, ns. ENRI RT-menetelmään. Tuotteen laatu tarkistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Työssä havaittiin merkittäviä eroja erilaisten kaupallisten tuotteiden välillä ja löydettiin VP1-geenin amplifiointiin sopivat olosuhteet. Kehitetyllä menetelmällä saavutettiin parhaimmillaan 100 kopion herkkyys PCR-vaiheessa, kun standardina käytetyllä ENRI RT-menetelmällä herkkyys oli 10 kopiota. Kvantitatiivinen RT-PCR -menetelmä testattiin kokonaisuudessaan eri virustyypeillä. Työssä analysoitiin 24 tunnettua virustyyppiä, joista neljälle ei saatu sulamislämpötilaa, mikä saattoi osin johtua myös koettimien epäsopivuudesta. Lopputuloksena työssä kehitettiin herkkä qrt-pcrmenetelmä VP1-geeniin tuottamiseksi ja kvantitoimiseksi, mikä mahdollistaa isojen näytemäärien nopean käsittelyn ja hallinnan esimerkiksi epidemioiden aikana. Jatkotutkimuksissa tulee testata ja määrittää menetelmän toimivuus tekemällä qrt-pcr-ajoja potilasnäytteistä. ASIASANAT: enterovirus, VP1, käänteistranskriptio, polymeraasiketjureaktio

BACHELOR S THESIS ABSTRACT TURKU UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES Bio technology and Food Technology Bio technology June 2011 Total number of pages 47 + 5 appendices Instructors: Ilari Suominen (PhD), Petri Susi (Dosentti, PhD) ja Riikka Österback (MSc) Maija Liimatainen Quantitative qrt-pcr method for typing enterovirus The goal of the thesis was to develop a sensitive method for enterovirus typing using a quantitative real-time polymerase chain reaction method. The qrt-pcr was targeted at the VP1 region of the enterovirus genome using both enteroviral cdna clones, RNA transcripts and viral RNA isolated from clinical specimens. Different commercially available reagents where tested during the study. These included reverse transcriptases (RT step), DNA polymerases (PCR step), and primer sets. The effect of temperature and time during PCR cycling was also analyzed. Individual runs were compared by Ct-values and melting curve analyses. The sensitivity of the method was compared with the ENRI RT method that is used in routine diagnostics. The quality of the PCR product was evaluated by agarose gel electrophoresis. There were significant differences in the performance of the commercial reagents with respect to the amplification of the VP1 gene. The sensitivity of the optimized PCR method reached 100 copies which is close to the sensitivity of the ENRI RT method (10 copies). The enterovirus qrt-pcr method was tested with 24 different enterovirus types of which only four remained unamplified. However, this may be due to primer incompatibility. In the future, the method may prove to be useful in the analysis of epidemiological sample sets as well as in rapid screening of positive samples during outbreaks. The performance of the developed assay will be further evaluated using clinical specimens. KEYWORDS: enterovirus, VP1, reverse transcription, polymerase chain reaction

SISÄLTÖ TIIVISTELMÄ ABSTRACT LYHENNELUETTELO 1 JOHDANTO 5 2 IHMISEN ENTEROVIRUKSET 6 2.1 Yleistä 6 2.2 Ihmisen enterovirusinfektiot 8 2.3 Diagnostiikka 10 3 MENETELMÄT 13 3.1 qrt-pcr 13 3.1.1Käänteiskopiointireaktio (RT-reaktio) 13 3.1.2Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qpcr) 14 3.2 Entsyymit 17 3.3 Alukkeet 19 3.4 Agaroosigeelielektroforeesi 23 3.5 Näytteet 25 4 TYÖN SUORITUS JA TULOKSET 26 4.1 qpcr:n optimointi 26 4.2 RT-reaktio 33 4.3 qrt-prc:n testaus tyyppikannoilla 38 5 TARKASTELU 43 6 PÄÄTELMÄT 44 LÄHTEET 46

LIITTEET Liite 1 Ihmisen enteroviruslajit ja niihin kuuluvat serotyypit Liite 2 qpcr-entsyymien työskentely: ohjeet ja ajo-olosuhteet Liite 3 Agaroosigeelielektroforeesi Liite 4 ENRI RT-PCR:n työohje Liite 5 RT-reaktion työohje KUVAT Kuva 1 Pikornaviruksen rakenneproteiinit (Bamford ym., 2010, 451) 7 Kuva 2 Pikornavirusten lisääntymiskierto (Hyypiä ym., 2010) 8 Kuva 3 Pikornavirusgenomin rakenne (Ylä-Pelto & Susi, 2010) 11 Kuva 4 ENRI RT-PCR:n kuva ajosta (Susi, 2011) 11 Kuva 5 Sulamislämpötilat (Susi, 2011) 12 Kuva 6 Käänteistranskriptio (kuva muokattu: Solunetti, 2006) 14 Kuva 7 Polymeraasiketjureaktion periaate (Suominen ym., 2010, 157) 15 Kuva 8 Reaaliaikaisen PCR:n monistuskäyrä (Suominen ym., 2010, 167) 16 Kuva 9 PCR-tuotteen sulamiskäyrä (Suominen ym., 2010, 169) 17 Kuva 10 Partial-alukkeiden sijoittuminen cdna synteesissä ja PCR:ssä (muokattu Nix ym., 2006) 20 Kuva 11 Simmonds-alukkeiden suunnat ja aloituskohdat 21 Kuva 12 Agaroosigeelielektroforeesi (Suominen ym., 2010, 127) 24 Kuva 13 Agaroosigeelielektroforeesi plasmidi-cav9, Partial vs. Simmonds 31 Kuva 14 Agaroosigeelielektroforeesi A-, C- ja D-lajin PCR-tuoteista 40 Kuva 15 Agaroosigeelielektroforeesi B-lajin PCR-tuoteista (AN89f-88r) 41 Kuva 16 Agaroosigeelielektroforeesi B-lajin PCR1-tuoteista (EvB OS+OAS) 42 Kuva 17 Agaroosigeelielektroforeesi B-lajin PCR2-tuoteista (EvB IS+IAS) 42 TAULUKOT Taulukko 1 PCR-optimoinnin entsyymiseokset 18 Taulukko 2 RT-optimoinnin entsyymit 19 Taulukko 3 Optimoinnissa käytetyt alukkeet 22 Taulukko 4 Entsyymiseoksien herkkyyden vertailu 27 Taulukko 5 GoTaq - ja KAPA -seoksien herkkyys muilla enterovirusplasmideilla 28 Taulukko 6 Simmonds A-lajin alukkeiden testaus GoTaq -seoksella 29 Taulukko 7 Simmonds B-lajin alukkeiden testaus KAPA -seoksella 30 Taulukko 8 AN89f-88r ja B-lajin OS+OAS -alukkeiden vertailu ENRI RT PCR:ään 32 Taulukko 9 RT-entsyymien vertailu 33 Taulukko 10 Alukkeiden vertailu 35 Taulukko 11 Transkriptit 36 Taulukko 12 Transkriptit 37 Taulukko 13 A-, C- ja D-lajeihin kuuluvien enterovirustyyppien qrt-pcr tulokset 38 Taulukko 14 B-lajin qrt-pcr:n tulokset 39

Lyhenneluettelo: Aluke cdna Ct-arvo DNA HEV A-D Melt PCR-entsyymi qrt-pcr RNA RT-entsyymi ssrna -genomi Tyyppi Lyhyt DNA-pala, joka sitoutuu komplementaariseen kohtaan DNA:ssa (tai RNA:han RT-reaktiossa) DNA:RNA-hybridi (engl. complementary DNA) kynnysarvo; sykli, jossa PCR-tuotetta alkaa muodostua deoksiribonukleiinihappo enterovirusten lajit A-D sulamislämpötila PCR-tuotteelle PCR-reaktiossa käytettävä entsyymi kvantitatiivinen, reaaliaikainen käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio (engl. real-time quantitative reverse transcriptase - polymerase chain reaction) ribonukleiinihappo VP1-4 viruksen rakenneproteiineja RT-reaktiossa käytettävä entsyymi single-stranded RNA, yksijuosteinen RNA -genomi serotyyppi; lajin jälkeen seuraava pienempi yksikkö 3 -pää sekvenssin loppupää 5 -pää sekvenssin alkupää

5 1 Johdanto Opinnäytetyö tehtiin Turun yliopiston, Lääketieteellisen tiedekunnan Virusopin oppiaineessa. Opinnäytetyö on osa tutkimushanketta, jossa tutkitaan ihmisen pikornaviruksia, joihin myös enterovirukset kuuluvat. Työn tavoitteena oli optimoida enterovirusten qrt-pcr-menetelmä; virustyyppi voidaan tunnistaa eli tyypittää joko sekvensoimalla menetelmällä tuotettava PCR-tuote tai käyttämällä mikrosirumenetelmää PCR-tuotteen tunnistamiseen (Susi ym., 2009). Tyypityksessä virussekvenssiä (VP1-alue) verrattiin muihin pikornavirustyyppeihin bioinformatiikan keinoin. qrt-pcr:n optimoinnissa testattiin erilaisia kaupallisia valmiiksisekoitettuja reaktioseoksia sekä alukkeita, jotka sitoutuvat VP1-geenin eri kohtiin. PCRvaihetta testattiin myös muuntelemalla syklauksen eri vaiheiden lämpötiloja ja reaktioaikoja. Ajo-olosuhteita verrattiin toisiinsa Ct-arvojen ja PCR-tuotteiden sulamiskäyrien perusteella. Herkkyyttä verrattiin enterovirusdiagnostiikassa käytettävään, ns. ENRI RT-menetelmään. ENRI RT-menetelmässä alukkeet sitoutuvat virusgenomin 5 -pään konservoituneeseen alueeseen, jolloin saadaan tuotettua 120 emäsparin (bp) PCR-tuote. Menetelmällä saavutetaan 10 kopion herkkyys ja sillä saadaan erotettua entero- ja rinovirukset toisistaan, mutta tyypityskäyttöön sekvenssierot ovat riittämättömiä. qrt-pcr:n toimivuutta testattiin erilaisilla virusnäytteillä: virus-cdna-klooneilla (virusgenomi DNA-muodossa), puhdistetuista viruksista eristetyllä virus- RNA:lla, in vitro RNA-transkripteilla ja soluviljelmissä kasvatetuista, tyyppiviruksista eristetyillä RNA:illa. Lopputuotteiden laatu varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla.

6 2 Ihmisen enterovirukset 2.1 Yleistä Ihmisen enterovirukset (HEVs=human enteroviruses) kuuluvat Picornaviridaeheimoon ja Picornavirinae-alaheimoon (Pikornavirukset). Pikornaviruksiin kuuluu 12 virussukua: Enterovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Kobuvirus, Teschovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Tremovirus ja Avihepatovirus. Pikornaviruksia tunnetaan yli 300 tyyppiä ja uusia löydetään jatkuvasti. (Ylä-Pelto & Susi, 2010.) Enteroviruksiin kuuluu 10 lajia: Ihmisen enterovirus A (HEV A -laji), Ihmisen enterovirus B (HEV B -laji), Ihmisen enterovirus C (HEV C -laji), Ihmisen enterovirus D (HEV D -laji), Simian enterovirus A, Bovine enterovirus, Porcine enterovirus B, Ihmisen rhinovirus A, Ihmisen rhinovirus B ja Ihmisen rhinovirus C (Picornaviridae.com. 2011). Liitteessä 1 on esitetty ihmisen enteroviruslajit ja niihin kuuluvat serotyypit. Pikornavirukset ovat pieniä (läpimitaltaan 30 nm), vaipattomia RNA-viruksia, joiden ssrna-genomin pituus on noin 7 500 emäksen mittainen. Viruksen RNAgenomia ympäröi kuori, joka koostuu 60 samanlaisesta rakenneyksiköstä. Näissä on kussakin yksi kappale neljää erilaista rakenneproteiinia. Kuvassa 1 on kuvattu kuinka VP1, VP2 ja VP3 muodostavat kuoren ulkopinnan. VP4 sijaitsee kuoren sisäpinnalla. (Hyypiä ym., 2010.)

7 Kuva 1 Pikornaviruksen rakenneproteiinit (Bamford ym., 2010, 451) Pikornaviruksen RNA on positiivissäikeinen, joten sen RNA pystyy suoraan toimimaan lähetti-rna:na (m-rna) proteiinisynteesissä (Ahola ym., 2010, 463). Kuvassa 2 on kuvattu, kuinka virus tarttuu solun pinnalle ja lisääntyy solussa. Virus tarttuu solun pinnalla olevaan reseptoriin ja pääsee sen avulla solun sisälle. Lähetti-RNA:n koodittamana syntyy suuri polyproteiini. Viruksen proteiinit pilkkoutuvat viruksen omien proteaasi-entsyymien avulla. Enterovirusten 2A-proteaasi pysäyttää välillisesti isäntäsolun oman proteiinisynteesin. Virus myös häiritsee solun RNA-synteesiä ja muuta aineenvaihduntaa. Näin virus valjastaa nopeasti isäntäsolun makromolekyylisynteesin omaan käyttöönsä. (Hyypiä ym., 2010.) Virusgenomin monistamiseen osallistuu viruksen koodittama RNA:sta riippuvainen RNA-polymeraasi sekä muita viruksen ja solun proteiineja. Komplementaarista RNA:ta käyttäen RNA-polymeraasi tuottaa suuren joukon genomin kopioita. Osa genomin kopiosta käytetään lähetti-rna:na rakenneproteiinien tuotannossa ja lisääntymiskierrossa. Osa genomin kopioista pakkautuu genomiksi solulimassa kypsyviin tytärviruksiin. RNA-polymeraasi tekee toimiessaan virheitä, jonka takia tytärvirukset poikkeavat toisistaan noin

8 yhden nukleotidin verran. Tytärviruksista muodostuu virusparvi, josta valikoituu parhaiten lisääntyvät tai esimerkiksi hoidolle resistentit virukset. Valikoituneet tytärvirukset vapautuvat infektoimaan uusia soluja. (Hyypiä ym., 2010.) Kuva 2 Pikornavirusten lisääntymiskierto (Hyypiä ym., 2010) 2.2 Ihmisen enterovirusinfektiot Enterovirustartunta saadaan yleensä hengitysteiden limakalvon tai ruoansulatuskanavan kautta kontaminoituneesta ruoasta. Kontaminoituneen ravinnon mukana enterovirukset pääsevät suoliston limakalvoille, sillä ne kestävät hyvin mahalaukun matalaa ph-arvoa. Itämisaika tartunnasta oireiden alkamiseen vaihtelee yhdestä vuorokaudesta pariin viikkoon. Akuutin vaiheen jälkeen ja taudin oireista riippumatta viruksen lisääntyminen voi jatkua suoliston limakalvon alaisessa imukudoksessa ja virusta voi erittyä ulosteeseen useita viikkoja, jopa kuukausia. Enterovirusinfektio voi kroonistua henkilöillä, joilla on vasta-ainevälitteisen immuunipuolustuksen toimintavajaus. (Hyypiä ym., 2010.)

9 HEV A -lajin tyypillisin virusten aiheuttama tauti on enterorokko, jonka oireita ovat kuumeilu ja rakkulainen ihottuma käsissä, jaloissa, pakaroissa ja suun limakalvoilla. Enterorokkoa aiheuttaa yleensä virustyypit coxsackie A16 (CAV16) tai enterovirus 71 (EV71). Tautia esiintyy pieninä epidemioina syksyisin erityisesti lapsilla. Enterorokko luultavasti tartuttaa niin kauan kuin uusia rakkuloita syntyy. Rakkulat kuivuvat ja häviävät yleensä 5-7 vrk:n kuluessa. HEV A -lajin virukset aiheuttavat myös rakkulaista nielutulehdusta, johon liittyy kuumeilua. Coxsackie A7 -virustyyppi (CAV7) aiheuttaa aivokalvontulehdusta ja halvauksia. (Hyypiä ym., 2010.) HEV B -lajin virukset aiheuttavat aivokalvon ja aivojen tulehdusta, joiden epidemioihin on liittynyt myös halvauksia. HEV B -virukset aiheuttavat vakavia vastasyntyneiden yleisinfektioita, jotka voivat levitä synnytysosastoilla. Oireyhtymään liittyy usein keskushermostoinfektio ja sydäntulehdus, jolloin taudinkulku on kohtalokasta. HEV B -genomia on löydetty kroonista sydänlihastulehdusta sairastavien potilaiden sydänlihaksesta. Harvinainen kylkiluuvälilihasten tulehdus on HEV B -lajin virusten aiheuttama. HEV B lajin virukset aiheuttavat myös ihottumia ja hengitystieinfektioita. (Hyypiä ym., 2010.) HEV C -lajiin kuuluva polioviruksen infektio voi ilmetä halvauksina ja muina keskushermostokomplikaatioina. Maailman terveysjärjestön tavoitteena on hävittää tauti ja poliovirus kokonaan maapallolta rokotusohjelmien avulla. Muut HEV C-lajin virukset aiheuttavat oireeltaan lievää flunssaa, joka paranee parissa viikossa. Lapsilla kuitenkin lisätautina esiintyy välikorvatulehdusta, nenän sivuonteloiden tulehdusta, astman vaikeutumista ja keuhkokuumetta. (Hyypiä ym., 2010.) HEV D-lajin virukset (E68 ja E70) aiheuttavat ylähengitystieinfektioita, joiden jälkioireena voi esiintyä akuuttia sidekalvotulehdusta (Oberste ym., 2004). HEV D-lajin EV 94 enterovirusta esiintyy Egyptin jätevesissä ja sama virustyyppi on löydetty halvausoireislta kongolaiselta lapselta (Smura ym., 2007). Suomalaisnaisten seeruminäytteistä on löydetty vasta-aineita EV 94 enterovirukselle (Smura ym., 2007).

10 Nuoruustyypin diabetes on autoimmuunitauti, jossa asteittain tuhoutuu insuliinia tuottavat haiman beetasolut. Perinnöllisen taipumuksen lisäksi on löydetty viitteitä siitä, että erityisesti enterovirusinfektiot vauhdittavat taudin puhkeamista. Diabeetikkojen haimasta ja siellä spesifisesti insuliinia-tuottavia soluja sisältävistä Langerhansin saarekkeista on löydetty enterovirusgenomia. Jos tulevaisuudessa saadan varmistettua syy-seuraussuhde, voidaan diabetesta mahdollisesti ehkäistä enterovirusrokotteella. (Hyypiä ym., 2010.) 2.3 Diagnostiikka Enterovirusinfektioiden diagnostiikka on perinteisesti perustunut soluissa tapahtuvaan virus-viljelytekniikkaan, joka kestaa 1-4 viikkoa ja jonka tulos voidaan varmistaa neutralisaatiotestin avulla. Virusviljelyn hitauden takia virusviljelyn tulokset eivät ehdi vaikuttaa hoitopäätökseen. Tällä tavalla tunnistettavia viruksia kutsuttiin aiemmin serotyypeiksi, mutta nykyään (ja myös tässä työssä) käytetään tyyppi-nimitystä kaikista enteroviruksista. Tyyppi viittaa siis enterovirukseen, joka tunnistetaan sekvenssin perusteella. Suuri joukko enterovirusten tyyppikannoista kasvaa yleisesti käytössä olevassa soluviljelmässä, mutta jotkut kliiniset näytteet saattavat sisältää viruksia, joiden viljely on vaikeaa. Tästä johtuen on kehitetty RT-PCR -menetelmä, jossa näytteessä olevan viruksen RNA-genomi muutetaan cdna:ksi, josta monistetaan haluttu DNA-jakso PCR-menetelmällä. RT-PCR:n avulla voidaan todeta erittäin pieniä määriä virusgenomia, ja sillä voidaan tunnistaa myös sellaiset tyypit, jotka eivät lisäänny virusviljelyssä. (Hyypiä ym., 2010.) Diagnosointia nopeuttaakseen on kehitetty ENRI RT-PCR, jolla voidaan erottaa enterovirukset ja rhinovirukset toisistaan. ENRI RT-PCR on reaaliaikainen RT- PCR, jossa käytetään 5 -päähän sitoutuvia konservoituja alukkeita, joiden avulla voidaan tunnistaa kaikki tunnetut enterovirustyypit (Kuva 3). ENRI RT-PCR:ssä monistetaan 120 bp:n pituista pätkää ja virukset saadaan erotettua toisistaan PCR-tuotteen sulamislämpötilan avulla. ENRI RT-PCR:n herkkyys on 10 kopiota. (Peltola ym., 2008.)

11 Kuva 3 Pikornavirusgenomin rakenne (Ylä-Pelto & Susi, 2010) Viruksen rakennegeenit (VP 1-4) ovat genomin 5 -päässä ja ei-rakenteellisia proteiineja koodaavat geenit on genomin 3 -päässä. VP1-geeniä käytetään tyypityksessä. (Ylä-Pelto & Susi, 2010.) Reaaliaikaisessa RT-PCR:ssä (Kuva 4) ajon etenemistä voidaan seurata reaaliajassa näytöltä. Treshold tarkoittaa asetettua kynnysarvoa, jonka tulee olla kaikissa ENRI RT-ajoissa sama, jotta voidaan verrata PCR-tuotteen syntyä. Ct-arvo kertoo missä vaiheessa ajoa (missä syklissä) lopputuotetta alkaa syntyä. Kuva 4 ENRI RT-PCR:n kuva ajosta (Susi, 2011)

12 Kun tehdään RT-PCR:ää usean viruksen toteamiseksi samasta näytteestä, seoksessa käytetään useita alukepareja ja lopputuloksena syntyvät tuotteet voidaan luokitella niiden sulamislämpötilojen (Kuva 5) avulla. ENRI-RTmenetelmällä tuotetusta PCR-tuotteesta ei voida sekvensoinnin avulla määrittää virustyyppiä, koska sekvenssierot ovat riittämättömiä (Susi, 2011). Kuva 5 Sulamislämpötilat (Susi, 2011) Genomityypityksessä monistetaan virusgenomin VP1-aluetta (tai sen osaa) (Kuva 3), ja sekvensoinnin avulla siitä voidaan määrittää virustyyppi. VP1- alueen sekvenssillä tulee olla vähintään 75 % identtisyys ja yli 85 % amonihappoidenttisyys tunnettuun prototyyppiin, jotta voidaan sanoa, että kyseessä on sama virustyyppi (Oberste ym., 1999). VP1-alue on sopiva genomityypitykseen, koska VP1-alueella on sekvenssieroja virustyyppien välillä (Susi, 2011). Virustyypityksen avulla voidaan nopeasti selvittää epidemioiden lähde, osoittaa tautiassosiaatio ja antaa niiden avulla tietoa tulevaisuuden lääke- ja rokotuskehitykseen. Tämän opinnäytetyön tarkoituksena on kehittää kvantitatiivinen RT-PCRmenetelmä VP1-alueen monistamiseksi.

13 3 Menetelmät 3.1 qrt-pcr qrt-pcr tarkoittaa kvantitatiivista reaaliaikaista käänteistranskriptio polymeraasiketjureaktiota (engl. Real-Time quantitative reverse transcriptase - polymerase chain reaction). (Suominen ym., 2010, 153-170.) Siinä on kaksi vaihetta: RT- eli käänteistranskriptio- ja PCR- eli polymeraasiketjureaktio, jotka voidaan tehdä perättäisissä reaktiosarjoissa eli kaksi-vaiheisena tai ns. yksiputkimenetelmänä, missä RT- ja PCR-vaiheissa tarvittavat komponetit on laitettu samaan putkeen ja syklaus tehdään samassa ajossa ilman, että putkia poistetaan PCR-laitteesta. Kvantitatiivisella ajolla tarkoitetaan mahdollisuutta kvantitoida tuntemattoman lähtömateriaalin määrää käyttäen hyväksi standardeja, joilla on tunnettu pitoisuus. 3.1.1 Käänteiskopiointireaktio (RT-reaktio) RT-reaktiossa yksijuosteinen RNA muutetaan kaksijuosteiseksi cdna-rnahybridiksi (Solunetti, 2006). Hybridiä käytetään polymeraasiketjureaktiossa templaattina eli mallina (Solunetti 2006). RNA:n 3 -päähän liitetään spesifisesti sitoutuva aluke ja käänteiskopioijaentsyymin avulla syntetisoidaan yksijuosteinen RNA kaksijuosteiseksi cdna-rna-hybridiksi:ksi (engl. complementary DNA) (Suominen ym., 2010, 153-170) (kuva 6). Entero-RNA käyttäytyy kuten mrna (lähetti-rna) ja siksi cdna:ssa aluke sitoutuu nimenomaan RNA:n 3 -päähän (koska mrna vastaa koodaavaa DNA:ta). cdna toimii PCR:ssä templaattina ja RNA-juoste hajoaa PCR:n aikana.

14 Kuva 6 Käänteistranskriptio (kuva muokattu: Solunetti, 2006) 3.1.2 Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qpcr) qpcr:llä eli kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa polymeraasiketjureaktiossa RTreaktiossa tehdystä cdna:sta monistetaan DNA-jakso, PCR-alukkeita käyttäen. Näistä toinen voi olla RT-reaktiossa käytetty 3 -pään aluke tai siitä cdna:n alavirtaan sitoutuva aluke. PCR:ssä käytetään termostabiilia DNApolymeraasia, joka ei inaktivoidu korkeissa lämpötiloissa (< 100 o C), ja siten mahdollistaa perättäisten PCR-syklauksten tekemisen ilman, että putkeen tarvitsee lisätä uutta entsyymiä. DNA-polymeraasin lisäksi käytetään kahta erilaista tunnettua aluketta, jotka kiinnittyvät kaksinauhaisen DNA:n vastinnauhoihin monistettavan DNA-nauhan vastakkaisiin päihin. Alukkeiden väliin jäävää aluetta monistetaan PCR:llä. (Suominen ym., 2010, 153-154.) PCR:n syklit jakautuvat yleensä kolmeen vaiheeseen, joista ensimmäinen on denaturaatio, jossa lämpötila nostetaan +95 o C:seen, jonka vaikutuksesta templaattina käytetty cdna-rna-hybridin nauhat irtoavat toisistaan. Tämän jälkeen lämpötilaa lasketaan (+68 o C), jolloin alukkeet voivat kiinnittyä templaattiin niille komplementaarisiin kohtiin (=alukkeiden kiinnitys, annealing).

15 Lopuksi lämpötila nostetaan (+72 o C), jolloin DNA-polymeraasientsyymi alkaa liittää reaktioseoksessa olevia nukleotideja alukkeen 3 -päästä lähtien templaatin mallin mukaisesti (=pidennysreaktio). Yhden syklin tuloksena syntyy kahdesta DNA-nauhasta neljä DNA-nauhaa. Eli monistettava alue monistuu eksponentiaalisesti eli sykli sykliltä sen määrä kaksinkertaistuu. Kuvassa 7 on esitetty PCR:n vaiheet. (Suominen ym., 2010, 154-155.) Kuva 7 Polymeraasiketjureaktion periaate (Suominen ym., 2010, 157) Reaaliaikaisessa PCR:ssä syntyvän tuotteen määrää voidaan seurata tietokoneen näytöltä. Seuranta perustuu fluoresoivan merkkiaineen (SyBR-väri) käyttöön, jonka fluoresenssisignaali moninkertaistuu värin sitoutuessa

16 valmistuvaan kaksinauhaiseen PCR-tuotteeseen. (On myös muita tapoja havaita lopputuote, mutta tässä työssä käytettiin ainoastaan SyBR-väriä). Fluoresenssisignaali ilmoitetaan laitekohtaisena fluoresenssiyksikkönä (RFU, engl. relative fluorescence unit). Fluoresenssisignaalin määrä korreloi DNA:n määrää. (Suominen ym., 2010, 166-167.) Kuva 8 Reaaliaikaisen PCR:n monistuskäyrä (Suominen ym., 2010, 167) Ct-arvo eli kynnyssykli (treshold cycle) asetataan manuaalisesti haluttuun kohtaan (kuva 8). Kynnyssyklin signaali ylittää tietyn kynnysarvon. Tässä työssä kynnyssykli asetetaan aina samaan kohtaan (Norm. Fluoro. arvolle 10-2 ), jotta Ct-arvoja voidaan keskenään verrata toisiinsa. Mitä pienempi Ct-arvo, sitä aikaisemmin PCR-monistus on lähtenyt liikkeelle. Mitä alempi Ct-arvo on, sitä enemmän lähtömateriaalissa on tunnistettavaa tuotetta. Ct-arvo ja kopioluku suhteutuvat toisiinsa siten, että yksi kertaluokka eli 10-kertainen muutos herkkyydessä vastaa 3,3-yksikön muutosta Ct-arvossa. PCR-tuotteen oikeellisuus ja puhtaus todetaan sulamislämpötilakäyrän avulla. Lämmitettäessä kaksinauhaisen DNA:n nauhat erkanevat toisistaan sekvenssille ominaisessa lämpötilassa, Jolloin kaksinauhaiseen DNA:han

17 sitoutunut merkkiaine (SYBR green) vapautuu, muodostaen fluoresenssisignaalipiikin. (Suominen ym., 2010, 168-169.) Kuva 9 PCR-tuotteen sulamiskäyrä (Suominen ym., 2010, 169) Kuvassa 9 on kuvattu sinisellä viivalla spesifinen PCR-tuote ja mustalla viivalla alukedimeeri ja pieni tuotesaanto (Suominen ym., 2010, 169). Alukedimeeri tarkoittaa sitä, että alukkeet sitoutuvat toisiinsa, jolloin niitä ei ole saatavilla riittävästi spesifisen tuotteen valmistamiseksi ja näin ollen saanto heikkenee (Suominen ym., 2010, 160). 3.2 Entsyymit PCR:ssä käytetyt entsyymit ovat valmiita seoksia (engl. mastermix), jotka sisältävät kaiken muun paitsi alukkeet ja monistettavan templaatin. Valmistajat takaavat ja ilmoittavat entsyymien seoksien komponentit ja niiden määrät. Seokset sisältävät optimoidun PCR-puskurin, magnesiumkloridia, fluoresoivan merkkiaineen, dntp+ dutp ja PCR-entsyymin. Taulukossa 1 on esitetty työssä käytettyjen PCR-entsyymien tuotenumero, kaupalliset nimet, niissä käytetty polymeraasientsyymi ja valmistajan antama arvioitu kopiointipituus qpcr:ssä.

18 Taulukko 1 PCR-optimoinnin entsyymiseokset Tuotenumero qpcr-seoksen kauppanimi PCR-entsyymi Luvattu kopiointipituus DyNAmo SYBR Muunnettu Thermus F-430L Green 2-Step qrt-pcr brockianus (Tbr) DNA 50-250 bp Kit (Finnzymes) 1 polymeraasi (Hot Start) F-501S DyNAzyme II DNA Polymerase (Finnzymes) 2 Thermus brockianus (Tbr) DNA polymeraasi (Lämpöä kestävä) 500 bp (lambda DNA) ja 6 kb (M13 DNA) A6001 GoTaq qpcr Master Mix (Promega) 3 Täyspitkä Taq DNA polymeraasi (Hot Start) Ei mainintaa KK4600 KAPA SYBR FAST qpcr Kits (KapaBiosystmens) 4 Taq DNA polymeraasi Paras tehokkuus 86-249 bp L6544 LuminoCt SYBR Green qpcr ReadyMix (Sigma) 5 Taq DNA polymeraasi (JumpStart) < 200 bp #K0241 Maxima SYBR Green/Fluorescein qpcr Master Mix (2X) (Fermantas) 6 Kemiallisesti muunnettu Taq DNA polymeraasi (Hot Start) 70-150 bp 1 DyNAmo SYBR Green 2-Step qrt-pcr Kit. 2010 2 DyNAzyme II DNA Polymerase. 2010 3 GoTaq qpcr Master Mix. 2010 4 KAPA SYBR FAST qpcr Kits. 2010 5 LuminoCt SYBR Green qpcr ReadyMix. 2010 6 Maxima SYBR Green/Fluorescein qpcr Master Mix (2X). 2009

19 Käänteistranskriptiossa käytettiin kolmea kaupallista RT-entsyymiä. Tyypillisessä reaktioseoksessa on reaktiopuskuri, RNaasi-inhibiittori, dntpseos, alukkeet ja entsyymi. Taulukossa 2 on esitetty käänteistransikriptiossa käytetyt entsyymit: tuotenumero, kaupallinen nimi, ja RT-entsyymi. Valmistajien kuvauksissa ei kerrota lähdettä ImProm II -entsyymille. Taulukko 2 RT-optimoinnin entsyymit Tuotenumero RT-seoksen kauppanimi RT-entsyymi A3800 Improm II Reverse Transcription System (Promega) 1 ei ilmoitettu #EP0351 M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas) 2 Moloney Murine Leukemia - viruksesta eristetty kääntesitranskriptaasi 18080-093 SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) 3 Muunneltu Moloney Murine Leukemia -viruksesta eristetty käänteistranskriptaasi 1 Improm II Reverse Transcription System. 2010 2 M-MuLV Reverse Transcriptase. 2010 3 SuperScript III Reverse Transcriptase. 2010 3.3 Alukkeet Tässä työssä tutkitaan ja verrataan VP1 osasekvenssialukkeita (Partial) ja koko vp1 sekvenssin alukkeita (Simmonds) toisiinsa. Kyseiset alukkeet on aiemmin kuvailtu (Nix ym. 2006 ja McWilliam Leitch 2009) ja ne tuottavat osan enterovirus-vp1-geenistä. Partial-alukkeet monistavat tuotetta, joka sijaitsee Simmonds-alukkeiden sisällä. Partial-alukkeisiin kuuluvat AN32r, AN33r, AN34r, AN35r (RT-reaktio) ja AN89f ja AN88r alukkeet (PCR-reaktio) (taulukko 3).

20 Kuvassa 10 on havainnollistettu alukkeiden sijoittuminen VP1-alueeseen sekä niiden kopiointisuunta. (Nix ym., 2006.) Kuva 10 Partial-alukkeiden sijoittuminen cdna synteesissä ja PCR:ssä (muokattu Nix ym., 2006) Simmondsin alukkeisiin kuuluvat enterovirus A- ja B-lajin (EvA/ EvB) OS (engl. outer sense), OAS (engl. outer antisense), IS (engl. inner sense) ja IAS (engl. inner antisense) alukkeet (taulukko 3, kuva 11). Alkuperäinen menetelmä on siis kaksivaiheinen eli ns. seminested PCR-menetelmä. OS- ja OAS-alukkeilla saadaan 841 kb (EvA) tai 1181 kb (EvB) pituiset sekvenssit (PCR1). IS- ja IASalukkeilla saadaan 684 kb (EvA) tai 1085 kb (EvB) pituiset sekvenssit (PCR2 eli nested-pcr:ä). Eli Simmonds-alukkeilla on tarkoituksena tehdä kaksi PCRajoa. Tällä tavoin saadaan herkkyyttä parannettua. (Mc William ym., 2008.)

21 2441 kb 3331 kb 5 VP1 3 EvA OS, kb 2268 OAS, 3109 IS, 2332 IAS, 3016 EvB OS, 2324 IS, 2392 OAS, 3505 IAS, 3477 Kuva 11 Simmonds-alukkeiden suunnat ja aloituskohdat Partial- ja Simmonds-alukkeiden lisäksi testataan Random Hexamer Primeraluketta käänteistranskriptiossa ja verrataan siitä johtuvaa herkkyyttä em. alukkeisiin. Random Hexamer Primer on kuuden emäksen aluke, jossa esiintyy G, A, T ja C nukleiinihappoja. Nukleiinihapot voivat olla missä vain järjestyksessä. Tämä tarkoittaa sitä, että aluke voi kiinnittyä kohdesekvenssin eri kohtiin. Molemmilla RT-PCR-menetelmillä on väitetty kyettävän tunnistamaan kaikki tunnetut enterovirustyypit. Työ ei siis ota kantaa alukeparien käytettävyyteen tunnistettaessa uusia enterovirustyyppejä vaan lähtöoletuksena on, että kumpi tahansa menetelmä on toimiva laaja-alaiseen enterovirustyypitykseen.

22 Taulukko 3 Optimoinnissa käytetyt alukkeet Eränumero RT-alukkeen kauppanimi Sekvenssi 5-3 Sijainti HA01922952 EvA OS CCN TGG ATH AGY AAC CAN CAY T a 2268 HA01922953 EvA OAS GGR TAN CCR TCR TAR AAC CAY TG a 3109 HA01922954 EvA IS TNA SNA TYT GGT AYC ARA CAN AYT a 2332 HA01922955 EvA IAS GAN GGR TTN GTN GKN GTY TGC CA a 3016 HA01922956 EvB OS GGY TAY ATN CAN TGY TGG TAY CAR AC a 2324 HA01922957 EvB OAS GGT GCT CAC TAG GAG GTC YCT RTT RTA RTC a 3505 HA01922958 EvB IS CTT GTG CTT TGT GTC GGC RTG YAA YGA YTT YTC WG a 2392 HA01922959 EvB IAS TCY TCC CAC ACR CAV TTY TGC CAR TC a 3477 HA01922960 AN32r GTYTGCCA a 3009-3002 HA01922961 AN33r GAYTGCCA a 3009-3002 HA01922962 AN34r CCRTCRTA a 3111-3104 HA01922963 AN35r RCTYTGCCA a 3009-3002 HA01922964 AN89f CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG a 2602-2627 b HA01922965 AN88r TACTGGACCACCTGGNGGNAYRWACAT a 2977-2951 b #S0142 Random Hexamer Primer d(nnnnnn) c a Sigma. 2010. (R=A+G, Y=C+T, M=A+C, K=G+T, S=G+C, W=A+T, H=A+T+C, B=G+T+C, D=G+A+T, N=A+C+G+T, V=G+A+C) b Sijainti määritetty PV1 Mahoney genomilla (GenBank tuotenumero J02281) c Fermentas. 2010. (N= G, A, T tai C)

23 3.4 Agaroosigeelielektroforeesi Agaroosigeelielektroforeesilla analysoidaan nukleiinihappoja (PCR:n tuotteita), joiden koko on noin 0,1 50 kb. Agaroosi on merilevästä eristetty polysakkaridi, joka kiehautettaessa liukenee geelipuskuriin. Jäähtyessään se muodostaa hyytelömäisen geelin. Nukleiinihappojen kulkeutuminen geelillä perustuu siihen, että ne ovat fosfaattiryhmiensä ansiosta happamia ja näin ollen negatiivisesti varautuneita. Kun PCR-tuotteen DNA joutuu sähkökenttään, se kulkeutuu kohti positiivista napaa. Agaroosigeelin verkkorakenne hidastaa suurempikokoisten fragmenttien kulkua ja pienempikokoiset fragmentit liikkuvat pidemmälle, jolloin saadaan erotettua erikokoiset fragmentit toisistaan omiksi vyöhykkeiksi. Vyöhykkeet kulkeutuvat niiden pituudelle ominaisella nopeudella. (Suominen ym., 2010, 122-123.) Jotta vyöhykkeet saadaan näkyviin, ennen agaroosigeelin jähmettymistä siihen tulee lisätä etidiumbromidia (EtBr), joka tunkeutuu nukleiinihappojen emästen väliin. Kun DNA-etidiumkompleksia valaistaan ultraviolettivalolla, emäkset absorboivat UV-säteitä ja luovuttavat saamansa energian etidiumille, joka fluoresoi oranssinpunaisena värinä. (Suominen ym., 2010, 123.) Geeli valmistetaan tarjottimelle, johon on liitetty näytekampa. Geelin jähmettyä näytekampa poistetaan, jolloin geeliin jää näytteille kolot. Valmistettu geeli upotetaan tarjottimessa ajoaltaaseen, jossa on ajopuskuria niin paljon, että geeli ja sen näytekolot peittyvät. Ajoaltaan päissä on elektrodit, joiden avulla sähkövirta saadaan kulkemaan ajopuskurin avulla geelin läpi. Ajopuskuri on samaa kuin geelipuskuri. (Suominen ym., 2010, 124.) Näytteiden on oltava raskaampaa kuin ajopuskuri, sillä muuten ne eivät uppoa tasaisesti näytekoloihin vaan sekoittuisivat ajopuskuriin. Näytteisiin lisätään näytepuskuria. Näytepuskuri lisää PCR-tuotteen tiheyttä ja värjää sen näkyväksi, joillon se on helpompi pipetoida näytekoloon. (Suominen ym., 2010, 124.) Jotta näytteiden fragmenttien koko saataisiin selville, on käytettävä kokostandardia. Kokostandardi on pilkottu tunnetun kokoisiksi fragmenteiksi.

24 Ajon aikana fragmentit kulkevat niille ominaisen matkan ja standardikartan avulla voidaan määrittää vyöhykkeiden koot (kb). (Suominen ym., 2010, 125.) Ajo käynnistetään asettamalla turvakansi kiinni ja kytkemällä virtalähde päälle. Virran tulee kulkea siten, että DNA kulkee kohti +-napaa. Jännite on 20-200 V ja ajoaika 1-2 h. Ajon jälkeen geeli kuvataan UV-valon avulla ja tuloksia analysoidaan tietokoneohjelmalla tai manuaalisesti. (Suominen ym., 2010, 125.) Kuva 12 Agaroosigeelielektroforeesi (Suominen ym., 2010, 127) Kuvassa 12 on kuvattu esimerkki geeliajosta. Oikeassa ja vasemassa reunassa on sama tunnettu kokostandardi ja keskellä neljä eri näytettä. Kokostandardien avulla näytteiden fragmenttivyöhykkeiden koko voidaan määrittää. (Suominen ym., 2010, 127.) Menetelmällä tarkistettiin qrt-pcr-tulokset. Tuotteen tunnistus perustuu värin intensiteettiin. RT-PCR:ssä ns. väärät positiiviset voivat saada sopivan Ct-

25 arvon, joten agaroosigeelielektroforeesin avulla saadan varmistus tuotteen olemassa oloon. 3.5 Näytteet Testattavat näytteet ovat plasmidivektorit, puhdistetut virus-rna:t, RNAtranskriptit ja virustyyppikannat. Plasmidit ovat laboratoriokokoelmasta, virus- RNA:t on eristetty virustyyppikannoista, jotka ovat pääosin peräisin ATCC:ltä (American Type Culture Collection) tai muilta tutkijoilta. Potilasnäytteet on diagnosoitu ENRI RT-menetelmällä ja tunnistettu sekvensoimalla. Tutkitut plasmidivektorit ovat pcav16 (HEV A-laji), pcav9 (HEV B-laji), pev11 (HEV D-laji) ja pcav21 (HEV C-laji). Plasmidivektoreissa enteroviruksen genomi on kloonattu DNA-muotoon tavalliseen plasmidivektoriin. Tutkitut virus-rna:t ovat CAV9, CBV4, ECHO11 ja ECHO30 (kaikki kuuluvat HEV B-lajiin). Niiden kopiolukua ei tunneta. Transkriptit ovat CAV16 (HEV A-laji), E7 (HEV B-laji), E30 (HEV B-laji), CAV21 (HEV C-laji) ja EV70 (HEV D-laji). Transkriptit on tuotettu plasmidivektoreista, joissa RNA-viruksien virusgenomi on kloonattu DNA-muodossa T7-promootterin taakse ja josta on tuotettu virus-rna T7-RNA-polymeraasilla in vitro transkriptioreaktiossa. Transkriptien kopioluku on tarkasti tunnettu. Tutkitut tyyppikannat ovat: - HEV A-laji: CAV2, CAV3, CAV6, CAV7, CAV10, CAV16 ja E71 - HEV B-laji: CAV9, CBV1, CBV4, ECHO1, ECHO7, ECHO9, ECHO11, ECHO17, ECHO18, ECHO30, ECHO31 ja ECHO6 - HEV C-laji: CAV1, CAV13, CAV15 ja CAV21 - HEV D-laji: E70

26 Tyyppikannat ovat laboratoriokokoelmista (alunperin ATCC:ltä) ja tunnistettu neutralisoimalla. Potilasnäytteiden viruksen määrää on lisätty soluviljelmissä ja niistä on eristetty viruksien RNA. 4 Työn suoritus ja tulokset 4.1 qpcr:n optimointi Työssä optimoidaan kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio vertailemalla kuuden (6) kaupallisen valmiiksi sekoitettujen (engl. mastermix) entsyymiseoksien toimivuutta ja herkkyyttä ja käyttäen kahdessa aiemmassa työssä kehitettyjä alukekokonaisuuksia. Näiden erona on se, että ns. Partial VP1-menetelmässä tuotetaan 340 bp lopputuotetta, kun taas Simmondsin alukkeiden tuote on 1000 bp. Koska qrt-pcr-seokset on pääosin kehitetty lyhyiden PCR-tuotteiden monistamiseen, tutkimuksen mielenkiinto oli todentaa, kuinka em. käytössäolevat tyypitysmenetelmät soveltuvat kvantitointiin. Käytetyt entsyymit on esitetty taulukossa 1. Herkkyyttä mitataan templaattina käytetyn HEV B-lajin plasmidi-cav9 -enteroviruksen laimennoksilla 10 7-10 -1. Laimennos 10 7 tarkoittaa, että plasmidi-cav9 -enterovirusta on 10 000 000 plasmidikopiota/µl. Pienimmässä laimennoksessa eli 10-1 on 0,1 kopiota/µl. Käytännössä plasmidikopio vastaa viruskopion määrää ja siten menetelmällä voidaan osoittaa, kuinka monta virusgenomia käytettävät alukkeet ja reaktioseokset kykenevät tunnistamaan kvantitatiivisessa ajossa. qpcr-ajossa käytettiin Partial VP1-alukkeita AN89f-88r, jotka kopioivat 349 bp pituista DNA-aluetta. Entsyymejä testattiin yksitellen niiden ohjeissa mainittujen ajo-olosuhteiden mukaan. Liitteessä 2 on kerrottu jokaisen qpcr-entsyymin työskentely ohjeet ja ajo-olosuhteet sekä toimivimmat ajo-olosuhteet. Tämän jälkeen testattiin entsyymien toimivuutta matalammassa annealinglämpötilassa. Annealing-lämpötilan alentamisen johdosta qpcr:n Ct- ja sulamislämpötilakäyrän arvot paranivat huomattavasti. Sulamislämpötilakäyrä

27 kertoo tuotteen syntymisestä; korkea käyrä kertoo suuresta tuotesaannosta ja matala käyrä kertoo pienestä lopputuotteen määrästä. Taulukossa 4 on esitetty entsyymiseokset ja niiden antamat parhaimmat Ct- ja sulamislämpökäyrän arvot eri plasmidi-cav9 laimennoksille. Taulukosta havaitaan, että GoTaq ja KAPA ovat parhaimmat, sillä niiden Ct-arvot ovat kaikista pienimmät. Tämä tarkoittaa sitä, että PCR-tuotetta alkaa syntyä kaikista aikaisimmin. Näiden entsyymien herkkyys on siten paras. Molemmilla entsyymeillä päästään 10 2 laimennokseen eli 100 kopiota/µl. DyNAmo :lla ja Maxima :lla päästään 10 4 eli 10 000 kopiota/µl herkkyyteen. DyNAzyme :lla päästään 10 5 eli 100 000 kopiota/µl herkkyyteen ja LuminoCt :lla vain 10 6 eli 1 000 000 kopiota/µl herkkyyteen. Taulukko 4 Entsyymiseoksien herkkyyden vertailu Seos * DyNAmo DyNAzyme GoTaq KAPA LuminoCt Maxima pcav9 Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt 10 7 21,08 83,5 20,16 83,3 16,45 85,5 10,69 84,7 24,76 85,8 25,68 83,0 10 6 24,94 83,5 23,33 83,0 21,27 85,7 14,69 84,8 28,74 86,0 28,55 82,8 10 5 29,63 83,5 26,54 82,8 25,99 86,0 18,55 84,8 32,12-33,55 83,0 10 4 33,65 83,7 26,99-30,10 86,0 22,20 84,8 34,09-38,26 83,3 10 3 36,53-27,19-33,48 86,5 25,92 85,0 33,33 - - - 10 2 37,78-27,08-35,60 86,3 28,50 85,2 35,77 - - - 10 1 38,02-27,07-40,04-30,19-34,11 - - - 10 0 37,81-27,88-40,00-30,25-34,38 - - - 10-1 37,32-26,90-41,08-30,85-33,96 - - - * DyNAzyme :lla ja Maxima :lla annealing-lämpötila on + 55 C. Muilla seoksilla annealing-lämpötila on + 50 C.

28 pcav9:llä tehdyn analyysin perusteella jatkoanalyyseissä päätettiin käyttää kahta parhaiten toiminutta qrt-pcr-seosta eli testattiin GoTaq :n ja KAPA :n herkkyyttä muilla enterovirusplasmideilla käyttämällä samoja AN89f-88r alukkeita kuin entsyymiseoksien vertailussa. Taulukossa 5 on kuvattu seoksien herkkyys plasmidi-cav16 (HEV A-laji), -EV11 (HEV B-laji), ja -CAV21 (HEV C- laji). GoTaq - ja KAPA -seoksilla on sama herkkyys eri HEV-lajeilla. KAPA seoksella on kuitenkin selkeästi alemmat Ct-arvot eli sillä saadaan tuotetta syntymään hieman aikaisemmin kuin GoTaq -seoksella. Taulukko 5 GoTaq - ja KAPA -seoksien herkkyys muilla enterovirusplasmideilla Seos GoTaq KAPA GoTaq KAPA GoTaq KAPA pcav16 pev11 pcav21 Kopionumero Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt 10 7 27,47 85,3 21,39 84,0 12,80 86,0 8,5 84,7 18,56 84,3 13,72 83,8 10 6 30,61 85,5 24,95 84,0 16,52 86,2 11,52 84,8 22,10 84,5 17,11 83,8 10 5 33,38 86,0 28,17 84,2 20,43 86,2 14,73 84,8 27,02 84,7 20,59 83,8 10 4 41,42-30,87-25,07 86,3 18,64 84,7 31,23 84,8 24,38 83,5 10 3 37,93-31,84-29,04 86,5 22,39 85,0 34,04 85,2 28,22 84,0 10 2 Negt. - 31,87-31,50 86,5 25,55 85,0 39,03-30,95-10 1 39,12-32,44-37,29-30,26 85,2 38,14-32,17-10 0 40,90-31,68-37,06-31,60-40,05-31,70-10 -1 Negt. - 32,77-39,82-32,64-39,34-32,22 -

29 Tämän jälkeen testattiin Simmonds:n A- ja B-lajin alukkeiden toimivuus vastaavalla tavalla. HEV-A -laji testattiin plasmidi-cav16:sta ja GoTaq - seoksella. HEV-B -laji testattiin plasmidi-cav9 ja KAPA -seoksella. Taulukossa 6 on esitetty HEV-A -lajin alukeparit ja niistä tehdyn qpcr:n tulokset. Taulukosta huomataan, että alukepari OS+OAS toimii parhaiten, sillä herkkyys yltää 10 3 kopioon/µl. Taulukko 6 Simmonds A-lajin alukkeiden testaus GoTaq -seoksella Alukeparit OS+OAS IS+IAS OS+IAS IS+OAS pcav16 Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt 10 7 17,32 86,5 23,78 86,5 14,47 85,7 23,39 87,3 10 6 23,84 86,2 27,03 86,5 20,21 85,5 29,27 87,5 10 5 29,29 86,2 25,01-22,52 85,7 32,99-10 4 31,51 86,2 26,12-21,38 86,0 36,43-10 3 34,20 86,5 23,21-22,02-35,33-10 2 - - 11,00-21,86-42,23-10 1 44,42-19,93-22,74-25,94-10 0 - - 9,02-22,33-37,91-10 -1 - - 25,59-21,97-33,51 - Taulukossa 7 on esitetty HEV-B -lajin alukeparit ja niistä tehdyn qpcr:n tulokset. Taulukosta huomataan, että kaikki muut paitsi alukepari IS+OAS yltävät herkkyyteen 10 3 kopiota/µl. Paras alukepari on kuitenkin OS+IAS, sillä niillä päästään parhaimpiin Ct-arvoihin.

30 Taulukko 7 Simmonds B-lajin alukkeiden testaus KAPA -seoksella Alukeparit OS+OAS IS+IAS OS+IAS IS+OAS pcav9 Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt 10 7 11,03 86,3 7,25 86,7 6,73 86,5 7,86 86,5 10 6 16,03 86,5 11,80 86,7 11,76 86,7 13,96 86,3 10 5 22,60 86,3 16,66 86,8 16,78 86,5 21,49 86,2 10 4 29,09 86,0 21,70 86,7 21,23 86,5 26,85 86,0 10 3 32,84 86,3 26,72 86,7 24,68 86,5 31,08-10 2 36,81-28,81-28,63 - - - 10 1 - - 29,96-30,12 - - - 10 0 - - 19,90-29,97 - - - 10-1 - - 34,16-30,12 - - - Agaroosigeelielektroforeesilla todetaan, että PCR-tuote on todellinen ja oikeankokoinen. Liitteessä 3 on agaroosigeelielektroforeesin valmistus ja ajoohjeet. Kuvassa 13 plasmidi-cav9 on vasemmalta lukien puc19 kokomarkkeri, AN89f-88r -alukkeilla tehdyt PCR-ajon tuotteet laimennoksesta 10 7 laimennokseen 10-1 ja PCR-ajon negatiivinen kontrolli sekä B-lajin alukkeilla OS+OAS tehdyt PCR-ajon tuotteet laimennoksesta 10 7 laimennokseen 10-1 ja ajon negatiivinen kontrolli. Agaroosigeelielektroforeesi todentaa sen, että AN89f-88r -alukkeilla saavutetaan 10 1 herkkyys. PCR-tuote laimennoksella 10 1 näkyy erittäin heikosti, joten tuotetta on olemassa, mutta todella vähän. OS+OAS -alukkeilla saavutetaan 10 3 herkkyys.

31 Kuva 13 Agaroosigeelielektroforeesi plasmidi-cav9, Partial vs. Simmonds Tyypitys-PCR-ajoja verrataan ENRI RT-PCR:ään käyttäen plasmidi-cav9:llä tehtyjä PCR-ajoja (AN89f-88r - ja B-lajin OS+OAS -alukeparia). Liitteessä 4 on esitetty ENRI RT-PCR:n työohje. Taulukossa 8 on esitetty näiden kolmen ajon PCR-tulokset. Siitä nähdään, että ENRI-RT-PCR:n herkkyys on 1 kopio/µl eli se havaitsee yhden (1) plasmidi-cav9:n/µl. Taulukosta havaitaan myös se, että AN89f-88r alukepari on herkin käytetyistä alukepareista.

32 Taulukko 8 AN89f-88r ja B-lajin OS+OAS -alukkeiden vertailu ENRI RT PCR:ään Alukepari AN89f-88r KAPA OS+OAS KAPA ENRI RT pcav9 Ct Melt Ct Melt Ct Melt 10 7 10,69 84,7 11,03 86,3 7,03 85,8 10 6 14,69 84,8 16,03 86,5 10,30 85,9 10 5 18,55 84,8 22,60 86,3 13,52 85,8 10 4 22,20 84,8 29,09 86,0 16,79 85,8 10 3 25,92 85,0 32,84 86,3 20,28 86,7 10 2 28,50 85,2 36,81-23,56 85,9 10 1 30,19 - - - 26,53 85,8 10 0 30,25 - - - 30,12 85,8 10-1 30,85 - - - - - Yhteenvetona PCR-optimointiajojen perusteella KAPA -seoksella ja AN89f-88r -alukkeilla saadaan paras herkkyys. Toiseksi paras entsyymiseos on GoTaq - seos. Työn seuraavassa vaiheessa käytettiin KAPA - ja GoTaq - seoksia saatavuuden mukaan ja osittain myös rinnakkaisissa ajoissa.

33 4.2 RT-reaktio Käänteistranskriptioreaktion optimoinnissa verrataan kolmea kaupallista RTentsyymiä sekä erilaisia alukkeita. Luvussa 3.2 on esitetty käytetyt entsyymit (taulukko 2) ja luvussa 3.3 on esitetty käytetyt alukkeet (taulukko 3). Taulukossa 9 on esitetty CAV9- ja Echo1-RNA:sta tuotettujen RCP-tuotteiden Ct-arvot käyttäen kolmea RT-entsyymiä. cdna on tuotettu joko AN32-35- tai AN88ralukkeilla. Enterovirustyyppien laimennoksien tarkkoja kopiointilukuja ei ole tiedossa. Liitteessä 5 on kuvattu RT-reaktion työohjeet. Taulukko 9 RT-entsyymien vertailu Entsyymi Improm II Reverse Transcription System M-MuLV Reverse Transcriptase SuperScript III Reverse Transcriptase Aluke AN32-35 AN88r AN32-35 AN88r AN32-35 AN88r Laimennos Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt CAV9 10-2 16,86 84,7 12,03 84,7 18,37 84,7 9,06-18,86 84,5 18,63 84,5 CAV9 10-3 21,80 85,0 18,42 84,7 23,66 84,8 5,70-23,23 84,7 17,71 84,5 CAV9 10-4 26,25 85,0 16,17-26,21 84,7 9,56-26,11 84,8 22,63 - ECHO11 10-2 15,28 85,0 13,50 84,7 15,29 85,0 8,97 84,5 14,53 84,8 12,90 84,7 ECHO11 10-3 19,81 85,0 15,62 85,0 19,88 84,8 10,54 84,5 19,15 84,7 15,49 84,8 ECHO11 10-4 24,11 85,2 17,41 84,8 24,7 84,8 9,94-24,2 85,0 15,11 84,8 Taulukosta 9 havaitaan, että M-MuLV Reverse Transcriptase -entsyymi on heikoin, sillä sen avulla ei saada ollenkaan tuloksia AN88r-alukkeella ja CAV9:llä. M-MuLV Reverse Transcriptase -entsyymillä ja AN88r-alukkeella ei saada CAV9:lle sulamislämpötiloja ja ECHO11:sta ei saada sulamislämpötilaa viimeiselle laimennokselle. ECHO11:sta herkkyys ei yllä Improm II Reverse Transcription System - ja SuperScript III Reverse Transcriptase -entsyymien

34 tasolle. Improm II Reverse Transcription System -entsyymi on paras, koska sillä päästään alhaisimpiin Ct-arvoihin kuin SuperScript III -entsyymillä. Tämän jälkeen jatkettiin RT-alukkeiden testausta siten, että RT-reaktio tehtiin CAV9, ECHO11, CBV4 ja ECHO30 -virustyypeille Hexamer Primer -, EvB OAS - tai EvB IAS -alukkeilla. cdna-tuotteiden toimivuutta testattiin ajamalla PCRajo KAPA -seoksella ja eri alukepareilla. Alukepareina olivat AN89f-88r, EvB IS+EvB IAS sekä EvB OS+EvB OAS. Parhaimmat tulokset saatiin alukeparilla AN89f-88r. Taulukossa 10 on esitetty cdna-tuotteiden PCR-ajojen tulokset, kun PCR-ajossa on käytetty KAPA -seosta ja AN89f-88r -alukeparia. (Testauksissa on käytetty useammin SuperScript III -entsyymiä, koska ImProm II -entsyymiä ei ole saatavilla toimitusvaikeuksien takia.)

35 Taulukko 10 Alukkeiden vertailu Entsyymi Improm II Reverse Transcription System SuperScript III Reverse Transcriptase Aluke Random Hexamer Primer EvB OAS EvB IAS Laimennos Ct Melt Ct Melt Ct Melt CAV9 10-2 22,22 84,8 9,48 84,5 10,19 84,5 CAV9 10-3 27,31 84,8 7,68 84,5 11,14 - CAV9 10-4 30,88 85,2 10,70-5,24 - ECHO11 10-2 18,83 84,8 5,87 84,8 10,70 84,7 ECHO11 10-3 23,82 85,0 6,05 85,0 11,97 84,5 ECHO11 10-4 28,93 85,2 9,92 85,2 10,99 - CBV4 10-2 20,01 84,0 11,71 84,0 11,85 83,5 CBV4 10-3 24,80 84,0 8,10 83,7 12,03 - CBV4 10-4 29,76 84,2 6,18-4,92 - ECHO30 10-2 16,18 84,0 15,35 84,0 13,79 84,0 ECHO30 10-3 21,73 84,0 7,28 84,0 12,24 83,5 ECHO30 10-4 25,86 84,2 17,72 84,2 11,92 - Taulukosta 9 ja 10 havaitaan, että Improm II -entsyymillä ja AN32-35 - alukkeella sekä Random Hexamer Primer -alukkeella saadaan kaikista parhaimmat herkkyydet. Näiden tietojen pohjalta verrataan AN32-35 alukeita Random Hexamer Primer -alukkeeseen kolmessa eri PCR-ajossa: KAPA seos + AN89f-88r -alukepari, KAPA -seos + EvB OS+OAS -alukepari ja ENRI RT-PCR. Taulukossa 11 ja 12 on esitetty ajojen tulokset.

36 Taulukko 11 Transkriptit RT-aluke AN32-35 Random Hexamer Primer PCR- alukepari AN89f-88r EvB OS+OAS ENRI 5 AN89f-88r EvB OS+OAS ENRI RT Laimennos Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt CAV16 10 4 33,12-32,92-23,84 84,8 32,02-36,06-22,96 85,0 CAV16 10 3 31,15-31,84-27,24 84,7 31,79-37,18-27,07 84,8 CAV16 10 2 33,10-31,74-33,21 84,8 31,96 - - - 29,94 85,0 CAV16 10 1 34,41-30,10 - - - 32,36 - - - 31,48 84,8 CAV16 10 0 33,49-32,00 - - - 31,91 - - - - - ECHO7 10 4 21,26 83,5 34,09-23,85 82,8 22,77 83,5 32,58 86,0 21,34 82,8 ECHO7 10 3 24,89 83,7 33,89-27,01 82,5 26,38 84,0 34,89-24,81 82,7 ECHO7 10 2 29,68 84,2 29,44-30,76 82,7 30,73 84,2 35,99-28,56 82,8 ECHO7 10 1 31,66-31,00 - - - 32,38-37,08-31,39 82,8 ECHO7 10 0 33,78-31,93 - - - 31,27-34,58 - - - ECHO30 10 4 24,06 84,7 32,20-23,36 85,0 24,68 84,8 34,21-22,32 84,8 ECHO30 10 3 27,79 84,8 32,96-26,61 85,0 28,16 85,0 38,40-25,28 84,7 ECHO30 10 2 33,18-32,58-30,21 84,8 31,34 - - - 29,39 84,7 ECHO30 10 1 32,65-32,36 - - - 32,47-35,20-33,09 84,5 ECHO30 10 0 34,49-31,16 - - - 31,76-36,52 - - -

37 Taulukko 12 Transkriptit RT-aluke AN32-35 Random Hexamer Primer PCR- alukepari AN89f-88r EvB OS+OAS ENRI RT AN89f-88r EvB OS+OAS ENRI RT Laimennos Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt Ct Melt CAV21 10 4 31,09-32,85-25,30 83,2 30,24 84,2 34,57-25,07 83,2 CAV21 10 3 32,99-31,57-29,20 83,2 31,07-36,54-28,23 83,0 CAV21 10 2 31,41-34,25-33,20 83,2 32,64 - - - 30,76 83,2 CAV21 10 1 32,02-33,89 - - - 32,17 - - - - - CAV21 10 0 31,51-12,43 - - - 32,44 - - - - - EV70 10 4 33,55-29,45-23,06 83,3 31,70-36,18-21,93 83,5 EV70 10 3 34,16-33,84-26,94 83,3 32,01 - - - 26,02 83,3 EV70 10 2 33,93-33,04-30,15 83,0 31,73-37,71-30,55 83,0 EV70 10 1 33,18-32,31 - - - 31,88-37,51-32,35 83,0 EV70 10 0 34,66 - - - - - 32,38 - - - - - Taulukkoihin 11 ja 12 on tummennettu ne kohdat, jotka vaikuttavat siihen, että Random Hexamer Primer on alukkeena parempi kuin AN32-35 aluke. Ainoastaan CAV21 AN32-35 alukkeella päästään samaan herkkyyteen ENRI RT-PCR:ssä kuin Random Hexamer Primer -alukkeella. Muilla enterovirustyypeillä Random Hexamer Primer:n herkkyys on aina yhtä parempi kuin AN32-35 -alukkeilla. On huomioitava, että EvB OS+OAS -alukkeet ei tietenkään toimi A, C ja D -lajin tyypeillä. RT-optimoinnissa paras RT-entsyymi on Improm II -entsyymi ja paras aluke cdna:n muodostamiseen on Random Hexamer -aluke.

38 4.3 qrt-prc:n testaus tyyppikannoilla Tyyppikannat testataan optimoidulla qrt-pcr:llä. RT-reaktiossa käytetään Improm II -entsyymiä ja Random Hexamer -aluketta. qpcr suoritetaan GoTaq -seoksella ja AN89f-88r -alukkeilla. B-lajin virukset testataan myös EvB alukkeilla (PCR1 OS+OAS ja PCR2 IS+IAS). Taulukossa 13 on esitetty A-, C- ja D-lajiin kuuluvien näytteiden qrt-pcr:n tulokset ja taulukossa 14 on taulukoitu B-lajin AN89f-88r -, OS+OAS - ja IS+IAS -alukkeilla saadut tulokset. Taulukko 13 A-, C- ja D-lajeihin kuuluvien enterovirustyyppien qrt-pcr tulokset Laji Virustyyppi Ct Melt A-laji CAV2 17,30 84,2 A-laji CAV3 22,51 86,0 A-laji CAV6 18,53 86,5 A-laji CAV7 20,22 - A-laji CAV10 17,73 85,5 A-laji CAV16 21,66 85,2 A-laji E71 16,63 - C-laji CAV1 17,35 82,7 C-laji CAV13 22,69 84,5 C-laji CAV15 12,21 85,2 C-laji CAV21 18,00 - D-laji E70 20,47 83,8

39 Taulukko 14 B-lajin qrt-pcr:n tulokset Virustyyppi AN89f-88r PCR1: OS+OAS PCR2: IS+IAS Ct Melt Ct Melt Ct Melt CAV9 14,18 87,2 20,52 86,3 8,17 84,8 CBV1A 18,24 85,5 22,43-2,83 83,0 CBV4 18,81 85,0 31,09 84,3 12,31 81,7 ECHO1 15,36 84,0 26,31 84,7 2,28 83,0 ECHO7 12,53 84,3 30,56 85,5 2,42 83,5 ECHO9 14,33 87 24,69 85,5 1,59 81,8 ECHO9 19,99 86,7 31,08 85,5 2,93 82,7 ECHO11 10,53 86,2 21,77 85,5 2,26 83,8 ECHO11 11,46 86,2 22,18 85,3 2,26 83,3 ECHO17 17,27 84,5 28,99-2,86 85,7 ECHO18 15,86 83,5 31,87-15,15 80 ECHO30 7,37 85,3 21,06 83 12,42 80,7 ECHO30 7,47 85,3 20,72 82,8 2,27 81,3 ECHO31 22,86-30,26 81,5 13,37 80,5 ECHO6 12,07 85,3 29,37 85 2,34 86,2 Taulukoista 13 ja 14 havaitaan, että AN89f-88r -alukkeilla tehdyistä qpcrajoista neljälle (4) tyyppikannan virusnäytteistä ei saatu sulamislämpötilaa. PCR2-tuotteiden Ct-arvot ovat alhaisia, koska PCR1-ajon aikana kehittyy lisää SyBR-väriä, joka puolestaan PCR1-ajon tuotteiden välityksellä siirtyy PCR2- ajon putkiin. Eli PCR2-ajossa on enemmän SyBR-väriä, joka antaa alhaisempia Ct-arvoja.

40 PCR-tuotteiden laatu tarkistettiin vielä agaroosigeelielektroforeesilla. Kuvassa 14 on esitetty A-, C- ja D-lajin PCR-tuotteista tehty geeliajo. Kuvasta havaitaan, että CAV7:lla, E71:lla ja CAV21:lla ei ole PCR-tuotetta. Muista tyyppikannoista saadaan PCR-tuotetta, mutta niiden laatu ja määrä vaihtelee. Esimerkiksi CAV2 ja CAV15 saanto on suuri, sillä niiden fragmenttivyöhykkeet ovat suurimmat. Kuva 14 Agaroosigeelielektroforeesi A-, C- ja D-lajin PCR-tuoteista Kuvassa 15 on kuvattu B-lajin PCR-tuotteet. Kuvasta havaitaan, että ECHO31 monistaminen ei onnistunut. ECHO9, ECHO 11 ja ECHO11 fragmenttivyöhykkeissä ovat röpelöisiä. Tämä oletettavasti johtuu siitä, että näytekolot hieman vaurioittuivat, kun kampa otettiin irti geelistä.

41 Kuva 15 Agaroosigeelielektroforeesi B-lajin PCR-tuoteista (AN89f-88r) Kuvissa 16 ja 17 on esitetty B-lajin PCR-tuotteiden agaroosigeelielektroforeesiajot, kun PCR1-ajossa on käytetty EvB:n OS+OAS - alukkeita ja PCR2-ajossa EvB:n IS+IAS -alukkeita. Agaroosielektroforeesiajojen perusteella B-lajin viruksista ei saada ollenkaan PCR-tuotetta alukkeilla OS+OAS (PCR1) ja IS+IAS (PCR2), vaikka sulamislämpötila antaa PCR2 kaikille viruksille arvot. Tämä ero saattaa johtua siitä, että PCR-tuotetta on todella vähän, jolloin käytetty detektointi ei ole ollut riittävän herkkä tai on muodostunut epäspesifistä tuotetta. Lisäksi Ct-arvot PCR2-ajossa viittavat siihen että PCR1- tuotteen mukana siirtynyt Syber green antaa flueresoivaa taustaa. Tästä johtuen voidaan sanoa että qpcr PCR1:senä ei sovellu nestedmuotoiseen PCR:ään.

42 Kuva 16 Agaroosigeelielektroforeesi B-lajin PCR1-tuoteista (EvB OS+OAS) Kuva 17 Agaroosigeelielektroforeesi B-lajin PCR2-tuoteista (EvB IS+IAS)