Prolyyli-4-hydroksylaasit

Kandidaatintutkielma Prolyyli-4-hydroksylaasit Aleksi Sutinen Oulun yliopisto Biokemian ja molekyylilääketieteen tiedekunta 2016

Sisällysluettelo Sisällys I KIRJALLISUUSTUTKIELMA 1. Johdanto... 3 1.1 Non-hemi rauta(ii)-2-oksoglutara(rankin & Giaccia 2016)atti deoxgenaasien katalysoima reaktio... 2 2. Hypoksia ja normoksia... 3 2.1 Hypoksian indusoima tekijä... 3 2.2 Hypoksian indusoiman tekijän rakenne... 5 3. HIF-transkriptiotekijän prolyyli-4-hydroksylaasi... 8 3.1 HIF-P4H ohjaa HIF1α:n proteasomeihin... 8 4. Kollageenit... 9 4.1 Kollageenit soluväliaineen osana... 9 4.2 Kollageenien rakenne... 10 5. Kollageeni prolyyli-4-hydroksylaasi... 10 5.1 C-P4H:n rakenne ja lokalisoituminen... 10 5.1.1 CAT-domeeni osana α-alayksikköä... 12 5.1.2 PSB-domeeni osana N-terminaalista domeenia... 13 5.1.3 β-alayksikkö-proteiini disulfidi isomeraasi... 13 5.2 Proliinin hydroksylaation vaikutukset tropokollageeniin... 14 6. Transmembraaninen prolyyli-4-hydroksylaasi... 15 6.1 P4H-TM:n rakenne ja lokalisoituminen... 15 6.2 P4H-TM:llä ei ole vielä spesifistä roolia... 16 7. Kirjallisuusluettelo... 17 Käytetyt lyhenteet HIF Hypoksia indusoima tekijä HIF-P4H HIF-prolyyli-4-hydroksylaasi HRE Hypoksiaan vastaava elementti EPO Erytropoietiini hormoni

VEGF Vaskulaarisen epiteelin kasvutekijä pvhl von Hippel Lindaun proteiini CH-domeenit Kalponiinin kaltaiset domeenit CBP camp:n säätelevään alueeseen liittyvän proteiinin sitoutumisproteiini p300 Adenoviruksen aikasen alueen A1 sitoutumisproteiini C-P4H kollageeni prolyyli-4-hydroksylaasi ARNT Aryyli-nukleaarinen translokaattori ODDD Hapesta riippuvainen hajottava domeeni N/CTAD N-ja C-terminaaliset transaktivaatio-domeenit TRP Tetratrikopeptidi toistuva proteiini FACIT fibrillien kanssa assosioivat ja häiritsevät SCR Nukleaarinen reseptori koaktivaattori II liite: TIEDETTÄ POPULARISOIVA ESITYS Otsikko: Toteutus: Prolyyli-4-hydroksylaasit osana HIF-signalointia ja kollageenien biosynteesiä Posteriesitys

1. Johdanto Solun tapahtumia ja reaktioreittejä säädellään tarkoin, jotta solu voi kudoksessa toteuttaa sille kudosspesifistä tehtävää. Solussa käynnistyy signalointitapahtumia, kun solu saa fysikaalisen tai kemiallisen ärsykkeen. Näiden tapahtumien keskiössä ovat entsyymit, joiden biokatalyyttinen kyky mahdollistaa signaalin muuntamisen solun vasteeksi. Vasteella tarkoitetaan muutosta solussa, jonka signaali saa aikaan. Vaste voi ilmetä geenin ekspression käynnistymisenä, solun fyysisenä liikkeenä, tai metabolisena kiihtymisenä. Metabolian kiihtyminen indusoi sellaisia synteesireittejä, jotka vaikuttavat solun kasvuun. Glykolyysi käynnistyy, kun glukoosin määrä plasmassa kasvaa. Jotkin signaalit voivat käynnistää solujen proliferaatiota tai hajoamista. Tässä tutkielmassa perehdytään prolyyli-4-hydroksylaaseihin, joilla on tärkeä rooli molekulaarisen hapen signaloinnissa ja tukikudoksen biosynteesissä. Prolyylihydroksylaasit kuuluvat non-hemi rauta(ii)-2-oksoglutaraattideoksygenaasien superperheeseen, jotka katalysoivat proliini aminohapon hydroksylaatiota. Seitsemänvaiheisen reaktiosarjan seurauksena proliinin pyrrolidiinirenkaan C 4 - hiileen substituoituu hydroksyyliryhmä, jolloin syntyy (2S,4R) hydroksiproliini. Reaktiossa on oltava läsnä orgaaninen koaktivaattori, molekulaarinen O2-happimolekyyli ja askorbaatti (Myllyharju & Koivunen 2013). Hydroksiproliini eristettiin ensimmäisen kerran Gelatiinin hydrolysaateista Emil Fischerin toimesta (Fischer 1902). Proliinitähteiden hydroksylaatio on tärkeä osa P4H kohdeproteiinien post-translationaalista muokkausta. P4H:t toimivat hypoksia-indusoiman tekijän (HIF) ja kollageenien biosynteesin säätelyssä. Eri P4H tyyppejä esiintyy myös muissa eläimissä, kasveissa ja joissakin viruksissa. Kollageenien biosynteesiin osallistuu kollageeni prolyyli-4-hydroksylaasi (C-P4H). Kollageenien perusyksikkönä esiintyy tyypillisesti kolme yhteen liittynyttä α-ketjua, jotka muodostavat helikaalisen rakenteen. C-P4H katalysoi näissä ketjuissa olevien proliini aminohappojen hydroksylaatiota. Hydroksiproliini stabiloi kollageenien rakennetta polaarisen hydroksyyliryhmän vaikutuksesta. Nykyisin tunnettuja ihmisen kollageeni prolyyli-4-hydroksylaasien isomuotoja on kolme, C-P4H (I, II, III). Kollageenien biosynteesin häiriöillä on usein välitön vaikutus luu-, nivel-, rusto- ja epiteelikudosten muutoksiin, mikä tekee C-P4H:n toiminnasta tärkeää (Gorres & Raines 2010). Fysiologista tilaa, jossa solussa ei ole riittävästi happea kutsutaan hypoksiaksi. Vaikeassa hypoksiassa solun alahainen hapen määrä voi johtaa nopeasti akuutteihin kudosvaurioihin. Olosuhteissa jossa hapen määrä on lievästi alentunut, voi pitkään jatkuvana haitata yksilön kehitystä. Tällainen olosuhde 1

vallitsee esim. sikiökauden aikana jossa hapen saanti on rajoittunutta äidin istukan kautta. Elimistössä hypoksiavaste käynnistää hypoksia indusoima tekijän (HIF) aktivoitumisen. HIF:it ovat joukko transkriptiotekijöitä, jotka säätelevät noin sataa kohdegeeniä. Näillä geeneillä on kiihdyttävä vaikutus solun metaboliaan ja kasvuun. Näitä transkriptiotekijöitä tunnetaan kolmea eri isomuotoa, HIF (1,2,3). HIF transkriptiotekijöiden liiallinen aktiivisuus johtaa kudosten rajoittamattomaan kasvuun, joka voi edesauttaa syöpäsolujen muodostumista (Semenza 2012). Hypoksialla ja HIF-ohjautuvien geenien yliekspressioilla on yhteys vaikeiden tuumorien kehittymiseen ja etäpesäkkeiden muodostumiseen (Rankin & Giaccia 2016). Normoksia on fysiologinen tila, jossa happea on solussa riittävästi. Tällöin solu pyrkii rajoittamaan HIF-ohjautuvien geenien yliekspressioita. HIF-signaalin vaikutusta säätelee solussa HIF-prolyyli-4-hydroksylaasit. Ne hydroksyloivat HIF:n kahdessa transaktivaatiodomeenissa olevia proliinitähteitä, jolloin HIF:n sitoutuminen kohdegeenin säätelyalueelle estyy. 1.1 Non-hemi rauta(ii)-2-oksoglutara(rankin & Giaccia 2016)atti deoxgenaasien katalysoima reaktio Prolyyli-4-hydroksylaasien katalysoima reaktio tapahtuu non-hemi-rauta(ii)-dioksigenaasien reaktiomekanismin mukaisesti. Seitsemänvaiheinen reaktiosarja (kuva.1) on monimutkainen ja se voidaan jakaa kahteen osaan. Ensin muodostuu reaktiivinen rauta(iv)-superoksidi, jota seuraa substraatin hydroksylaatio ja koentsyymin dekarboksylaatio (Costas et al. 2004). Reaktiomekanismin yksityiskohtaisen mekanismin esittivät ensimmäisen kerran Hanauske-Abel ja Günzler vuonna (1982). Reaktiota katalysoivan entsyymin katalyyttiset aminohapot ovat aspartaatti tai glutamaatti, sekä kaksi proliinia. Nämä kolme aminohappoa muodostavat kolmikon samalle puolelle metallikompleksia. Toisen puolen muodostavat koaktivaattori ja molekulaarinen happi. Ensimmäisessä vaiheessa muodostuu reaktiivinen ferryylikompleksi, jonka keskusatomina on rauta(iv)-kationi. Reaktion alkaessa keskusatomin hapetusluku on vielä kaksi. 2-oksoglutaraatti (ts. α-ketoglutaraatti) toimii reaktion koentsyyminä. Se muodostaa ligandin rauta(ii)-kationiin C 1 -hiilen karboksylaattiryhmän hapella ja C 2 -hiilen karbonyyliryhmän hapella. Askorbaatti pelkistää Fe(III):sta Fe(II):ksi. Tämä on reaktion kannalta oleellista, koska rauta(iii):n redox-potentiaali ei ole reaktion kannalta riittävä (de Jong et al. 1982). Happimolekyylin sitouduttua aktiiviseen kohtaan, sen toiselle happiatomille syntyy negatiivinen varaus, jolla se hyökkää 2-oksoglutaraatin karboksyyliryhmän hiileen. Tällöin muodostuu Fe(IV)- 2

peroksihemiketaali-kompleksi, jossa keskusatomi rauta on sitoutunut viiteen substituenttiin. 2- oksoglutaraatin karboksyyliryhmä dekarboksyloituu muodostaen hiilidioksidia. Kompleksissa olevan ketoryhmän happiatomin affiniteetin ansiosta proliinin pyrrolidiinirengas radikalisoituu. Tällöin pyrrolidiinirenkaan C 4 -hiilestä irtoaa ensin protoni, joka korvautuu ketoryhmän happiatomilla. Pyrrolidiinirenkaan C 4 -hiileen substitioutuu hydroksyyliryhmä ja koaktivaattori dekarboksyloituu sukkinaattina (Gorres et al. 2008, Hoffart et al. 2006, Krebs et al. 2007) Kuva.1 Non-hemi-Fe(II)-2-oksoglutaraatti dioksigenaasien katalyysin reaktiomekanismi. Rauta kelatoituu kahden histidiinin ja yhden aspartaatin kanssa samalle puolelle. Toinen puoli ligandista muodostuu 2-oksoglutaraatin karbonyyliryhmän ja karboksylaatin happiatomeista. Substraatin lähestyessä katalyyttistä aluetta molekulaarinen happi liittyy kompleksiin ja hyökkää 2-oksoglutaraatin karbonyylihiileen, jolloin tapahtuu dekarboksylaatio ja syntyy hiilidioksidia. Muodostuu reaktiivinen ferryyli-fe(iv)-metallikompleksi, jonka seurauksena muodostuu prolyyliradikaali. Tämän jälkeen happi liittyy pyrrolidiinirenkaaseen ja sukkinaatti dekarboksyloituu. Lopputuotteena syntyy hydroksiproliini, sukkinaatti ja vesimolekyyli. (Kuva lähteestä: (Tarhonskaya et al. 2014). Kuvan käyttöön on anottu lupa kustantajalta. Teksti lähteistä: Costas et al. 2004, Hoffart et al. 2006, McDonough et al. 2006, Gorres et al. 2008) 2. Hypoksia ja normoksia 2.1 Hypoksian indusoima tekijä EPO-hormonin säätelyyn liittyviä havaintoja voidaan pitää ratkaisevana hypoksia-indusoiman tekijän löytymisen kannalta. EPO-geenin löytyminen ja sen jatkotutkimukset johtivat ensimmäiseen hapen avulla ohjautuvan transkriptiosäätelyalueen HRE:n (Hypoxia responsive element) löytymiseen (Beck et al. 1991, Lin et al. 1985). HRE-alueeseen liittyvien transkriptiotekijöiden selvittäminen johti HIF:n löytymiseen. Nykyisin tunnetaan kolmea eri HIF-isomuotoa, joista HIF1α karakterisoitiin 3

ensimmäisenä (Wang et al. 1995). HIF:t voivat indusoida angiogeneesin kannalta tärkeiden prekursorien kuten EPO-hormonin ja VEGF-hormonin ekspression käynnistymisen (Kuva.2). Muita kasvua stimuloivia tekijöitä ovat mm. IGF- ja TGF-hormonien tuotannon lisääminen. Solun metaboliaan HIF:t voivat vaikuttaa lisäämällä mm. GLUT1-transportterien määrää. Hapen kuljetusta verisuonissa voidaan tehostaa, kun HIF:t indusoivat vasomotorisia kohdegeenien kuten inos:n tuottoa. Hapen merkitys solun homeostaasiin on ollut tiedossa pitkään, mutta sen mekanismeja ollaan alettu ymmärtämään molekulaarisella tasolla vasta viime vuosien aikana (Rankin & Giaccia 2008, Myllyharju & Koivunen 2013). Kaksi muuta HIF-isomuotoa ovat HIF2α ja HIF3α (Gu et al. 1998, Wenger & Gassman 1997) Kaikki HIF:t muodostavat αβ-heterodimeerejä, joissa β-alayksikkö on kaikissa isomuodoissa identtinen. Kuva.2 HIF-signaloinnin pääperiaatteet. Happi toimii signaalivälitteisessä solun säätelyssä Hypoksian indusoiman tekijän avulla. Hypoksiassa sytoplasmassa olevan HIF1α:n määrää säätelevä HIF-P4H inhiboituu. Tämä johtaa HIF1α:n kulkeutumisen tumaan, jossa se dimerisoituu HRE-säätelyalueeseen HIF1β:n ja p300/cbp:n kanssa. Nämä transkriptiotekijät indusoivat noin sadan eri geenin transkriptiota, jotka vaikuttavat kudosten metaboliaan kiihdyttävästi. Normoksisessa tilassa happi aktivoi yhdessä Fe 2+ :n 2-oksoglutaraatin ja askorbaatin kanssa HIF-P4H-entsyymin joka hydroksyloi HIF1α:n kahta proliini aminohappoa. Hydroksylaation seurauksena pvhl-kompleksi ohjaa HIF1α:n proteosomaaliseen hajotukseen. (Kuva lähteestä(maes et al. 2012). Kuvaan on saatu lupa kustantajalta. Teksti lähteestä: (Semenza 2001) 4

Laajan kohdgeenijoukon ansiosta hypoksia kytkeytyneellä säätelymekanismilla on suuri merkitys solun homeostaasiin, solunjakautumiseen ja apoptoosiin (Semenza 2001). Laajan geenijoukon vuoksi HIF signalointi voi johtaa usein onkologisten prosessien käynnistymiseen, joiden tutkiminen on avannut mahdollisuuksia tiettyjen syöpien kliinisten hoitomenetelmien kehittämiseen (Kung et al. 2000). 2.2 Hypoksian indusoiman tekijän rakenne Hypoksiassa solu käynnistää sensorijärjestelmän, jonka keskeisessä roolissa on HIF1α- ja HIF1βtranskriptiotekijöiden aktivoituminen, jota kontrolloidaan 2-oxoglutaraatti riippuvaisten dioxygenaasientsyymien hydroksylaatio reaktion avulla (Bishop & Ratcliffe 2014). Pääasiallisesti α- alayksikön stabiliteetti on olennainen osa reaktioreitin säätelytapahtumaa. HIF:it kuuluvat PASproteiinien superperheeseen, joissa esiintyy tavallinen loop-helix-loop PAS laskostyyppi (Wang et al. 1995). DNA:han sitoutuva osa on happisensorina toimiva α-alayksikkö ja geenin säätelyalueeseen kiinnittyvä β-alayksikkö. Dimerisoituminen kohdentuu HIF1α:n N-terminaaliseen osaan (aminohapot 1-390). DNA:han sitoutuva osa on myös kyseisessä sekvenssissä (Jiang et al. 1996). HIF1:n aktivoituminen saa aikaan satojen hypoksia-kytkettyjen geenien ekspression, joka ohjaa mm. glykolyysiä, angiogeneesiä, erytropoietiisiä ja vaskulariteettiä. PAS-proteiinit koostuvat kolmesta alayksiköstä, PER- (period circadian protein), AHR- (aryl-hydrocarbon receptor) / ARNT (arylhydrocarbon nuclear translocator) ja SIM (single-minded protein) proteiineista. HIF1α:ssa esiintyvä β-domeenilla on ARNT aktiivisuus (Hoffman et al. 1991). Hypoksisessa tilassa HIF1α stabiloituu ja muodostaa heterodimeerin β-alayksikön kanssa, joka toimii tässä tilanteessa ARNT:n kaltaisesti (aryl-hydrocarbon nuclear translocator) (Hoffman et al. 1991, Wang et al. 1995). HIF1 aktivaatio vaatii lisäksi useiden avustavien transkriptiofaktoreiden liittymistä HRE-säätelyalueelle, joita ovat p300, CBP, tai SRC (Kallio et al. 1998, Kung et al. 2000). Näillä proteiineilla on histoni trans-asetyyli-transferaasi aktiivisuutta. HIF1-dimeerin ja avustavien transkriptiotekijöiden interaktiot tapahtuvat HIF-dimeerin C- terminaalisen transaktivaatio domeenin (CTAD), N-terminaalisen transaktivaatio domeenin (NTAD) ja p300/cbp proteiineissa esiintyvien CH1, CH2 ja CH3 domeenien välillä. Transaktivaatiodomeenit sijaitsevat vierekkäin HIF1α:n rakenteessa järjestyksessä, jossa N-terminaalinen transaktivaatio-domeeni tulee ennen C-terminaalista. Niitä yhdistää N-terminaalisesta ulottuva looprakenne. Muut CTAD:n rakenteelliset osat ovat kaksi helixiä ja niiden väliin muodostuva looprakenne. CH-domeenit sisältävät kysteiini/histidiini motiivin joiden avulla p300/cbp liittyy HIF- 5

dimeerin C-terminaaliseen transaktivaatio-domeeniin. CTAD:n ja CH1:n kompleksi on orientoitunut kolmion muotoon katalyyttisessä keskuksessa. (McDonough et al. 2006) CH1 ei kuitenkaan muodosta sidosta CTAD:n rikkisillan avulla vaan sidos muodostuu lähinnä hydrofobisten aminohappojen vuorovaikutusten avulla. Lisäksi on havaittu, että kysteinit kelatoivat Zn 2+ -kationin inhibitorisesti hydrofobisen taskun sisään, joka välttämätöntä kompleksin muodostukseen. p300/cbp ja HIF-dimeerin sitoutuminen CTAD sijoittuu aminohappojen 786 826 välille (Freedman et al. 2002). Normoksiassa HIF1:n dimerisoituminen estyy hapen feedback-inhibition seurauksena. Tällöin HIF1α ei pysy stabiilina, eikä se voi siten muodostaa kompleksia HIF1β:n (ARNT) kanssa. Epästabiili HIF1α jää sytoplasmaan, jossa se hydroksyloidaan HIF-P4H:n katalysoimassa reaktiossa (Semenza 2001). pvhl (Von Hippel-Lindau protein) on Von Hippel-Lindaun kasvunrajoittajageenin tuote. Se ei yleensä esiinny solussa monomeerinä, vaan kompleksissa elongiini C:n ja elongiini B:n kanssa (Kibel et al. 1995). Tällä kompleksilla on E3-ubikitiini-ligaasi aktiivisuutta. pvhl on αβ-heterodimeerinen proteiini. Sen α-domeeni rakentuu kolmesta pienestä α-kierteestä ja β-domeeni useammasta β- laskoksesta. Domeeneja yhdistää kaksi silmukkaa. Elongiini C on suurimmaksi osaksi kohdakkain pvhl:n α-domeenin kanssa (Stebbins et al. 1999). HIF1α:ssa oleva ODDD (Oxygen dependent degradation domain) säätelymotiivi liittyy pvhl:n β-domeeniin (Ohh et al. 2000). Katalyyttiset proliinit, joihin hydroksylaatio kohdistuu ovat Pro 402 ja Pro 564 (Epstein et al. 2001). Proliinien läheisyydessä olevat aminohapot ovat erilaiset kollageenien X-Y-Gly-jaksoihin nähden. HIF- P4H:den hydroksylaatio kohdistuu Leu-X-X-Leu-Ala-Pro-X-motiiveihin (Huang et al. 2002). Reaktion mekanismi noudattaa aikaisemmin esiteltyä 2-oksoglutaraattidehydrogenaasien tyypillistä reaktiota, jossa on oltava kofaktorina rautaa(fe 2+ ) ja askorbaattia. Lisäksi raudan sitomiseen tarvitaan 2-oksoglutaraattia ja happea (Jaakkola et al. 2001). HIFα:n isomuodot ekspressoituvat eri kudoksissa ja niiden geenit ovat konservoituneita siten, että ne muokataan vaihtoehtoisen silmukoinnin avulla (Epstein et al. 2001). HIF1α ja HIF2α ovat EPASproteiineja (Endothelial PAS) (Tian et al. 1997) ja HIF3α ovat IPAS (Inhibitory PAS) (Makino et al. 2001)- tai NEPAS-proteiineja (Neonatal and embryonic PAS) (Yamashita et al. 2008) Näiden eri PAS proteiinien ekspression esiintyvyydet eri kudoksissa eroavat hiukan, mutta pääasiallisesti HIF:ien ekspressio on suurinta aivokuoren-, haiman-, istukan- ja luuytimen soluissa (Shan et al. 2012). 6

Erityisesti sikiön kehityksen aikana sikiön solukko on altistuneena hypoksialle, josta johtuen varsinkin HIF1α ja HIF2α ekspressiot ovat suuria istukan solukossa. HIF3α on allosteerinen HIF2α:n ja HIF1α:n säätelijä. Se muodostaa myös heterodimeerin ARNT-yksikön kanssa ja liittyy HREsäätelyalueeseen, mutta sen affiniteetti on huomattavasti heikompi kuin HIF1α:n tai HIF2α:n Heikompi sitoutuminen säätelytekijään on selitettävissä sillä, että HIF3α: geenissä on C- terminaalisen trans-aktivaatiodomeenin sijasta, vain N-terminaalinen trans-aktivaatio domeeni. Se siis kilpailee ARNT kompleksinmuodostuksesta HIF1α: ja HIF2α:n kanssa. Tämän säätelymekanismin häiriöillä on havaittu olevan yhteyttä neonataalien elinvaurioihin tai kasvun häiriöihin (Compernolle et al. 2002). Toinen HIF3α variantti NEPAS toimii erityisesti vastasyntyneen keuhkojen epiteelisoluissa, toimien HIF1α:n ja HIF2α:n negatiivisena säätelytekijänä. Havainnot HIF3α:n ekspression indusoitumisesta vastasyntyneillä, voidaan selittää vastasyntyneen luontaisen kardiorespitoriaalisen hengityksen käynnistymisellä. Sikiökauden aikana äidin istukan kautta saatu hapen määrä on usein rajoittunutta sikiön kehitykselle, jolloin HIF1α ja HIF2α ovat aktiivisia. Tämä on välttämätöntä mm. sikiön vaskulariteetin ja angiogeneesin kannalta (Iyer et al. 1998, Ryan et al. 1998). Synnytyksen jälkeen hapen määrä kasvaa dramaattisesti, jolloin HIF-ohjatuvien geenien indusointi ei ole enää tarpeellista. HIF1α:n ODDD:ssä sijaitsevien proliinitähteiden lisäksi samankaltainen hydroksylointi voi tapahtua toiseen konservoituneeseen aminohappoon CTAD:ssa, joka on Asparagiini. Tämän posttranslationaalisen modifikaation tarkoitusperä on sama kuin proliinien hydroksylaatiolla. Näin ollen se toimii HIF1α säätelyssä negatiivisesti. Yleisesti asparagiini-hydrokslylaasia kutsutaan FIH:ksi (Factor inhibiting HIF). p300/cbp-kompleksi, liittyy CTAD:iin, mikäli Asp 803 :ta ei ole hydroksyloitu. Entsyymi, joka katalysoi tämän reaktion on aspartyyli-β-hydroxylaasi, joka kuuluu myös non-hemi rauta(ii)-2-oxoglutaraatti riippuvaisiin dioksygenaaseihin (Wang et al. 1991). Tämä mahdollistaa CTAD:n aktivoitumisen ja HIF1αβ-dimeerin muodostumisen. HIF-indusoitu geeniekspressio voidaan kiteyttää kahteen vaiheeseen. Jotta mekanismi voi käynnistyä, kaksi seikkaa on tapahduttava: HIF1α:n Pro 402 ja Pro 564 hydroksylaation inhibointi ja Asp 803 hydroksylaation inhibointi. Nämä seikat mahdollistavat sen, että pvhl-kompleksi ei voi sitoutua HIF1α:n proliineihin, jolloin p300/cbp pääsee liittymään CTAD:iin (Lando et al. 2002). 7

3. HIF-transkriptiotekijän prolyyli-4-hydroksylaasi 3.1 HIF-P4H ohjaa HIF1α:n proteasomeihin Normoksisessa tilassa HIF1α:a hajotetaan tehokkaasti proteasomeissa ubikitiniini-kytketyllä systeemillä, joka estää HIF1α:n pääsyn tumaan (Huang et al. 1998). Ennen kuin tiedettiin mekanismista, jolla voitiin selittää HIF1α:n hajottamista proteasomeissa, tiedettiin että metallikationit kuten Co 2+, Ni 2+, Mn 2+ ja rautaa kelatoivat yhdisteet, kuten EDTA kykenivät aktivoimaan HIF1α:a liittymällä CTAD:n ja inhiboimaan HIF-P4H:ta (Ivan et al. 2002). (Myllyharju & Koivunen 2013)(Myllyharju & Koivunen 2013)(Rankin & Giaccia 2008)Proteiinien hapettumista koskeva reaktiomekanismi, jossa metallikationit toimivat katalyyttinä tunnettiin (Hanauske-Abel & Günzler 1982, Levine et al. 1981, Levine 1983).Metallikationien inhiboiva vaikutus antoi viitteitä sille, että HIF1α:n säätelyyn osallistuu sellainen entsyymi, jonka katalyysissä HIF1α modifioidaan oksidatiivisesti. Entsyymikatalyysin, jossa ODDD-domeenin P 402 ja P 564 hydroksyloidaan, oletettiin olevan riippuvainen hapesta ja raudasta. Tämä pystyttiin osoittamaan kokeellisesti (Ivan et al. 2001). HIF-P4H:t ovat Fe +2-2-oxoglutaraatti riippuvaisia dioksygenaaseja. Sen katalyysi perustuu samaan mekanismiin kuin C-P4H:n α2β2 tetrameerin (Kivirikko & Pihlaniemi 1998) protokollageenin hydroksylointi, mutta substraattia ympäröivien aminohappojen orientaatio proliinien ympärillä on erilainen. Lisäksi C-P4H:n katalyysi tapahtuu ER:ssa ja HIF-P4H:n sytosolissa, eikä sen toiminta esty hypoksisessa tilassa (Takahashi et al. 2000). C-P4H ei kuitenkaan voi hydrolysoida HIF1α:n proliineja. Kaikki P4H:n aminohapot, jotka sitovat Fe 2+ -ionia ovat konservoituneita. Tämän perusteella pystyttiin osoittamaan kokeellisesti HIF-P4H:n aktiivisuuden moninkertaistuvan askorbaatin ja FeSO 4+ :n vaikutuksesta (Bruick & McKnight. 2001). Samalla myös pystyttiin osoittamaan, että CoCl2 inhiboi hydroksylaatiota, sillä se kilpailee Fe 2+ :n sitoutumisesta HIF-P4H:n katalyyttiseen motiiviin. Homologien perusteella ja käyttämällä bioinformatiivisia menetelmiä C.eleganssin ja D.melanogasterin geenisekvensseistä, Egl9 geenistä löydettiin ihmisen HIF-P4H:ta. Nykyään tunnetaan kolmea HIF-P4H:n isomuotoa. Ne esiintyvät kirjallisuudesta riippuen eri nimillä, joita ovat HIF-P4H:den (1,2,3) lisäksi, mm. PHD:t (1,2,3) ja EGLN:t (1,2,3) (Bruick & McKnight. 2001, Epstein et al. 2001, Ivan et al. 2002). HIF-P4H:n ja C-P4H:n katalyyttisen domeenin laskostyyppi on samankaltainen. Se koostuu kahdeksasta β-laskoksesta, jotka asettuvat päällekkäin (double stranded β-helix, jelly-roll-fold). 8

Katalyysin kannalta tärkeät aspartaatti ja histidiinit tulevat toisen β-laskoksen jälkeen. Kaikkia β- laskoksia stabiloi kolme ympäröivää α-kierrettä. Entsyymi esiintyy solussa monomeerinä. Sen katalyyttisen yksikön rakenenteessa rauta(ii)-kationi on kompleksoitunut oktaedriesesti His 313 :n, Asp 315 :n ja His 374 :n, 2-oksoglutaraatin ja happimolekyylin kanssa (McDonough et al. 2006). 4. Kollageenit 4.1 Kollageenit soluväliaineen osana Solu tarvitsee monimutkaisten säätelyreittien lisäksi muodon ja liikkeen. Kudoksen täytyy kasvaa ja toisaalta antaa tilaa ja joustaa. soluväliaine rakentuu epiteeli-, tai non-epiteelikudoksesta ja se rajoittuu laminaan. Laminaa ylläpitää sen kanssa vuorovaikuttavat solut. Kaikilla eliöillä on tarve uusiutua, siten soluväliaineen rakenneproteiineissa esiintyy eläinkunnassa paljon homologisia rakenteita. Sen pääkomponentteja ovat joukko suurikokoisia proteiineja, jotka voidaan jakaa neljään luokkaan, tyypin IV kollageenit, laminiinit, perlekaanit ja nidokiinit. Näistä kollageenit esiintyvät runsaimpina kaikissa eliöissä. Ihmisen koko proteiinimassasta 30% on kollageenia. Kollageenien biosynteesi tapahtuu pääosin fibroplasteissa. Kaikkiaan kollageeneja tunnetaan 27 erilaista tyyppiä, joista tyypin I kollageeni on kaikista yleisin selkärankaisilla tavattu kollageeni. Tyypin I kollageeni muodostuu kahdesta α-ketjusta, jotka kummatkin koostuvat n. 1000:sta aminohaposta ja ovat 30-300 nm pitkiä. Kollageenit syntetisoidaan monomeerisena prokollageeneina, jotka rakentuvat fibrillisäikeiksi. Posttranslationaalisen muokkaamisen jälkeen kollageenia kutsutaan tropokollageeniksi. Polaarisuuden tuoman lujuuden ansiosta kollageeni on luu-, nivel- ja sidekudoksen pääkomponentti. Tyypin IV kollageenit esiintyvät laminan peruselementtinä. Muita kollageenityyppejä, joita esiintyy eri kudostyypeistä riippuen ovat: säikeitä muodostavat-(fibrillaariset), FACIT-(fibril associated collagens with interrupted triple helix), heksagonaaliset-, ankkuroivat-, transmembraaniset kollageenit ja multipleksiinit. Lisäksi on olemassa joukko kollageeneja, joiden toimintaa ei toistaiseksi tunneta vielä hyvin (Shaw & Olsen 1991). Polaarisuuden tuoman lujuuden ansiosta kollageeni on luu-, nivel ja sidekudoksen pääkomponentti. Noin 80-90%:a ihmiskehon kollageeneista on fibrillaarisia (tyypit I, II ja III). Fibrillaaristen kollageenien kanssa interaktoivat FACIT-kollageenit liittävät näitä soluväliaineen muihin komponentteihin ja epiteelikudoksiin. Transmembraanisten kollageenien tehtävänä on muodostaa liitoksia (neksus) solujen välille. Ne nopeuttavat solujen välistä viestintää, joista desmosomit ovat yleisin esimerkki. Kollageeneilla voi olla myös lymfaattisia ja proteoglykaanisia ominaisuuksia (Shaw & Olsen 1991). 9

4.2 Kollageenien rakenne Kollageenit ovat trimeereistä koostuvia polymeerejä, jotka jakaantuvat α-ketjuiksi. Kudostyypistä riippuen α-ketjut voivat olla homotrimeerejä tai heterotrimeerejä. Ketjut kiertyvät toistensa kanssa kolminkertaiseksi kierteeksi muodostaen fibrillaarisia tai verkkomaisia tertiääri-rakenteita. Prokollageenien hydroksylaatio lisää ketjujen polaarisuutta, jonka ansiosta tropokollageeni saavuttaa sille ominaisen lujuuden. kollageenit ovat luu-, nivel ja sidekudoksen pääkomponentteja (Heino & Vuento 2009). Kollageenin primäärinen helix-rakenne perustuu X-Y-Gly-jaksoihin (Bowes & Kenten 1948). Toistuvan yksikön ainoana vaatimuksena joka kolmannen aminohapon tulee olla glysiini. Kaksi muuta aminohappoa voivat olla mitä tahansa aminohappoja, mutta usein niitten paikalla ovat proliini ja hydroksiproliini. Glysiini on tärkeä osa kollageenin rakennetta, koska sen pieni koko ja vähäinen steerinen este sallivat α-ketjujen tiiviin pakkautumisen. Kaksi muuta aminohappoa ovat polaarisia glysiiniin nähden, joiden rooli on stabiloida α-ketjua. Post-translationaalisen modifikaation seurauksena proliinista muodostuu hydroksiproliini, kun proliinin pyrrolidiinirenkaaseen liittyy hydroksyyliryhmä. Happi vetää negatiivisen osittaisvarauksen avulla elektroneja kohti akselin keskiosaa, stabiloiden α-ketjun rakennetta. Ketjut liittyvät toisiinsa vetysidoksin (Lodish et al. 2007). Kollageenityyppien erot voidaan jakaa kolmeen eri karakteristiseen tekijään. Suurin ero kollageeneillä on niiden kolmoiskierteisten α-kierteiden määrässä ja pituudessa. Yksittäinen kollageeniyksikkö ei ole koko matkaltaan kolmoiskierteinen. Välissä voi olla sivuavia, tai niiden väliin sijoittuvia segmenttejä, jotka eivät ole kierteisiä. Kiertymättömien ketjujen ansioista kollageenit saavat elastisen ominaisuuden. Kolmas ero kollageenien välillä riippuu kovalenttisesta luonteesta ketjujen välillä. Proliinin hydroksylaation lisäksi α-ketjua voidaan glykosyloida, hapettaa, tai ketjut voivat mennä ristiin toisten ketjujen kanssa. Ketjuun voi liittyä myös globulaarisia yksiköitä. Kollageenit ovat rakenteeltaan hyvin primitiivisiä, mutta suuria proteiineja. Niillä on erittäin tärkeä rooli soluväliaineen toiminnassa ja niiden virheellisellä laskostumisella on usein aina yhteys tuki-ja liikuntaelimistön sairauksiin. (Lodish et al. 2007). 5. Kollageeni prolyyli-4-hydroksylaasi 5.1 C-P4H:n rakenne ja lokalisoituminen Toinen tärkeä prolyyli-4-hydroxylaaseihin kuuluva entsyymi HIF-P4H:n ohella on kollageenin X-Y- Gly-jaksojen proliineja ja muita kollageenin tyyppisiä peptidejä hydroksyloiva kollageeni-prolyyli- 10

4-hydroksylaasi (C-P4H) (Kivirikko 1989). Sen katalyysin suorittava α-alayksikkö kuuluu myös nonhemi rauta(ii)-2-oksoglutaraatti dioksygenaaseihin. Sen konformaatiota ylläpitää tioreduktaaseihin kuuluva proteiini disulfidi isomeraasi, joka muodostaa β-alayksikön. Näin ollen kaikki selkärankaisten C-P4H:t ovat α2β2 heterotetrameereja. Ihmisen C-P4H α(i)-alayksikkö koostuu 517:ta aminohaposta ja 17 aminohapon pituisesta signaalijaksosta, kun taas α(ii)-alayksikkö koostuu 514:ta aminohaposta ja 21:n aminohapon pituisesta signaalijaksosta (Annunen et al. 1997, Helaakoski et al. 1989). C-P4H:n toiminnallisuudessa ei ole yhteyttä HIF-ohjautuvien geenien säätelyyn ja sen geenin identtisyys HIF-P4H:den kanssa on vähäinen. Täysin eri tehtävästä huolimatta entsyymeillä on konservoituneita aminohappoja ja samankaltainen katalyyttinen mekanismi. Niiden substraatit ovat erilaisia, joten niiden katalyyttisen domeenin aminohappojen orientaatio on erilainen. Toisin kuin HIF-P4H:t, C-P4H:t lokalisoituvat ER:n luumeniin. C-P4H osallistuu prokollageenin posttranslationaalisessa muokkaukseen (Kivirikko & Prockop 1967). Nämä seikat ovat auttaneet paljon HIFα (1,2,3):n ja HIF-P4H(1,2,3):n tutkimuksissa. Ihmisen C-P4H:n ohella entsyymiä on löydetty ja tutkittu, myös muista selkärankaisista, kuten C.eleganssista ja D.melanogasterista. Eläimien lisäksi C-P4H:ta on löydetty kasveista mm. Arabidopsis thalianasta (Hieta & Myllyharju 2002) ja Chlamydomonas reinhardtiista (Koski et al. 2009). Joittenkin viruksien, kuten Paramecium bursaria Chlorella Virus-1:n katalyyttinen mekanismin osoittava kiderakenne on pystytty ratkaisemaan kristallografian avulla. Kiderakenteen perusteella ollaan voitu todentaa aikaisemmin oletettu P4H:n reaktiomekanismi (Eriksson et al. 1989, Longbotham et al. 2015). Ihmisen C-P4H:n kiderakenteen ratkaisun tueksi on julkaistu kiderakenteita muista organismeista kuten Basicillus anthraxisesta C-P4H homodimeeri, jolla on 30%:n homologisuus ihmisen C- P4Hα(I):en nähden (Culpepper et al. 2010). Uusin esitetty olemassa oleva C-P4H rakenne on niin ikään Bascillus anthraxisesta (Schnicker & Dey 2016). Prokollageenien hydroksylaatio on välttämätöntä tropokollageenin biosynteesille. Kaikkien selkärankaisten C-P4H:t ovat α2β2 tetrameereja. Erillinen katalyyttinen domeeni on sitoutunut α- alayksikköön ja substraattia sitova domeeni α- ja β-alayksikön väliin. Kahta αβ heterodimeeriä yhdistää loop-alue (Kivirikko & Myllyharju. 1998). Tetrameerirakenteessa esiintyy viisi konservoitunutta kysteiiniä. Yleensä proteiinissa esiintyvät rikkisillat voivat olla merkittäviä proteiinin aktiivisuudelle ja konformaatiolle. C-P4H:n disulfidisidokset sijoittuvat α-alayksiköön. Disulfidisidokset muodostuvat toisen ja kolmannen, sekä neljännen ja viidennen kysteiinin välille. Tetrameerissa esiintyy kaksi potentiaalista N-glykolysoitua 11

motiivia, jotka sijaitsevat α-domeenissa. Toistaiseksi niiden vaikutusta proteiinin liukoisuuteen tai katalyyttiseen aktiivisuuteen ei ole havaittu (Hanauske-Abel & Günzler 1982, John & Bulleid 1996, Lamberg et al. 1995, Levine et al. 1981).Kokopitkää ihmisen C-P4H kristallografiallista rakennetta ei ole vielä ratkaistu. Katalyyttisen α-domeenin, β-domeenin eli PDI:n, peptidi-substraattia sitovan domeenin rakenteita on selvitetty ihmisen C-P4H:sta (Anantharajan et al. 2013, Pekkala et al. 2004). 5.1.1 CAT-domeeni osana α-alayksikköä C-P4N:n katalyyttinen domeiini C-terminaalisessa osassa koostuu kolmesta konservoituneesta aminohaposta: Histidiinistä, aspartaatista ja toisesta histidiinistä, joka ulottuu hieman kauemmaksi edellisistä. His-X-Asp-motiivi kelatoi Fe 2+ -kationin. 2-oksoglutaraatti sitoutuu katalyyttisen domeeniin kahdella tavalla. 2-oksoglutaraatti muodostaa ionisidoksen 5-karboksylaattiryhmän Lys 493 :n välillä. Toinen karboksyylipää 2-oksoglutaraatista liittyy yhdeksi Fe 2+ -ionin ligandihampaaksi karbonyylihapen avulla (Majamaa et al. 1984, Majamaa et al. 1986). Neljännen ligandinhampaan Fe 2+ :n kanssa muodostaa molekulaarinen happi. Kompleksin läheisyydessä hieman taaempana on ylimääräinen histidiini, joka ei osallistu katalyysin. Se voi vaikuttaa 2-oksoglutaraatin C 1 -hiilen ja Fe 2+ :n ligandin muodostuksessa ja siten vaikuttaa 2- oksoglutaraatin dekarboksylaatioon. Ihmisen C-P4H:ssa nämä aminohapot ovat His 412, Asp 414 ja His 483. Katalyysiin osallistumaton histidiini on His 501. Myös C-P4H:n katalyyttisessä domeenissa esiintyy kaksoisjuosteinen jelly-roll-laskostyyppi, joka koostuu kahdeksasta anta-paralleelistä β- laskoksesta. Huolimatta useiden eri homologien ratkaisuista kiderakenteista, ihmisen C-P4H:n määrittäminen on usein epäonnistunut kiteytymisongelmien takia (Majamaa et al. 1984, Majamaa et al. 1986, Myllyharju & Kivirikko 1997). C-P4H:n aktiivisuuden mittaus voidaan suorittaa radioaktiivisen 2-oksoglutaraatin avulla, jossa on C 14 -radionuklidi. Reaktiossa voidaan käyttää myös synteettisiä PPG-substraatteja. Aktiivisuus määritetään radionuklidin tuottaman signaalin perusteella. Radionuklidin käyttäminen on menetelmänä vanha (Peterkofsky & Udenfriend 1965), (Hutton et al. 1966)Sen tueksi on kehitelty useita uudempia menetelmiä, joissa radionuklidin käyttöä ei tarvita (Gorres & Raines 2009). 12

5.1.2 PSB-domeeni osana N-terminaalista domeenia C-terminaalisen domeenin ohella toinen α-alayksikköön kuuluva N-terminaalinen domeeni käsittää sen alueen α-alayksiköstä, johon substraatti sitoutuu. Tämä osa ihmisen C-P4Hα(I):n kiderakenteesta (aminohapot 1-244, joista substraattia sitova osa 144-244) on ratkaistu (Anantharajan et al. 2013). Siihen kuuluu α2-alayksikköön liittyvä neljästä α-kierteestä rakentuva coiled-coil-laskos, joka on yleisesti oligomeroituvissa proteiineissa esiintyvä laskostyyppi. Substraattina toimivan prokollageeni sitoutuu N-terminaalissa olevaan erilliseen substraattia sitovaan domeeniin (Peptide Substrate Binding domain). PSB:n ja neljän α-kierteen muodostaman coiled-coil laskosta yhdistää löyhä silmukka. PSB:ssä on kaksi TPR-motiivia (Tetratricopeptide repeating domain), jotka toimivat erityisesti proteiini-proteiini/peptidi interaktioissa. C-P4H:n PSB-domeenissa TRP-motiiveja on kaksi, TRP-1 ja TRP-22. Viides α-kierre PSB:ssä on solvatoiva kierre. Toista ja kolmatta kierrettä yhdistää silmukka. Yhdessä TRP-domeenissa on kaksi anti-paralleelia α-kierrettä, joissa kussakin on lähekkäin pieniä, sekä isokokoisia ja hydrofobisia aminohappoja. Esimerkiksi C-P4Hα(I):n TRP-1:n on muotoa Cys 150 -Leu 153 -Gly 154 -Ala 157 -Thr 166 -Met 170 -Ala 173 -Asp 178 (Pekkala et al. 2004). Substraatin liittymisen kannalta tärkeitä tekijöitä PBS:n rakenteessa ovat proteiinin pinnalla olevat tyrosiinitähteet, joita on kahdeksan. Ne sijoittuvat PSB:n koveralle puolelle paitsi Tyr 199 ja Tyr 158, jotka osoittavat poispäin aromaattisesta urasta ja samalla oletetusta peptidisubstraatin sitoutumiskohdasta. Aromaattisen uran tähteistä Tyr 193, Tyr 196 ja Tyr 233 ovat kriittisiä peptidisubstraatin sitoutumisen kannalta. Nämä aminohapot sijoittuvat PSB:n kolmanteen α- kierteeseen. PSB:n aromaattisen uran orientaatio on hiukan erilainen C-P4H:n eri isomuotojen (I,II,III) välillä, joka selittää niiden erilaisen sitoutumisen potentteihin inhibiittoreihin. Lisäksi synteettisten Pro-Pro-Gly-peptidisubstraattien sitoutumisessa on eroja eri isomuotojen välillä (Pekkala et al. 2004). 5.1.3 β-alayksikkö-proteiini disulfidi isomeraasi Proteiini disulfidi isomeraasi on tioredoksioksidaasi, joka on saperoniproteiini. Se lokalisoituu ER:n luumeniin, jossa se katalysoi eri proteiinien disulfidisidosten muodostusta, niiden pelkistymistä tai isomerisaatiota (Freedman 1989). Ihmisellä PDI:tä ja C-P4H:ta koodaavat sama geeni. β-alayksikön tunnistaminen PDI:ksi tapahtui havaitsemalla huomattavan suuri identtisyys β-alayksikön ja rotan PDI:tä koodaavalla geenillä (Edman et al. 1985, Pihlajaniemi et al. 1987). 13

Ihmisen PDI koostuu 491:stä aminohaposta, jossa on 17:a aminohapon signaalisekvenssi. Sillä on kaksi aktiivista motiivia, jotka sijoittuvat a- ja a -domeeneihin. a- ja b-domeenit sisältävät tioredoksiini laskoksen. Lisäksi b - ja a -domeenien välillä on lyhyt silmukka, mutta sillä ei ole katalyysin kannalta olennaista roolia. C-P4H:n α-alayksikkö liittyy oletettavasti PDI:n a- b - ja a domeeneihin kolmesta eri kohtaa toisistaan etäällä olevien aminohappojen kanssa, jotka ovat His 412, His 483 ja His 501 (Lamberg et al. 1995). Muita tyypillisiä sitoutumisen kannalta tärkeitä tähteitä PDI:ssä on poolittomat leusiinit ja isoleusiinit (Koivunen et al. 2005).Kummassakin katalyyttisessä yksikössä on yksi Cys-Gly-His-Cys-motiivi, jotka toimivat PDI:n isomeraasiaktiivisuuden katalyyttisenä motiivina (Tasanen et al. 1988). C-P4H:den β-domeenin rakenne on identtinen saperoniproteiini PDI:n kanssa (Koivu et al. 1987). PDI:n sitoutuminen α-domeeniin estää sitä agrekoitumasta, pitämällä α-domeenin liukoisessa muodossa. Siten PDI:n sitoutuminen on välttämätöntä α-domeenin katalyyttisen aktiivisuuden kannalta (Vuori et al. 1992). 5.2 Proliinin hydroksylaation vaikutukset tropokollageeniin Niitä proliineja, jotka eivät esiinny X-Y-Gly jaksossa, ei hydroksyloida. Proliinin konformaatio tropokollageeniketjussa on usein (2S) ja hydroksiproliinin (2S,4R). Polaarisen hydroksyyliryhmän elektronegatiivisuudesta johtuen, proliinin hydoroksyloinnilla on vähentävä vaikutus peptidisidoksen resonanssiin (Gorres et al. 2008). Hydrokslyyliryhmän additio pyrrolidiinirenkaaseen muuttaa molekyylin konformaatiota. Vierekkäisten poolisten C γ -C δ1 ja C δ2 -N atomien välinen sidoskulma on 60 astetta, joka on suurin mahdollinen sallittu kulma. Konformaatiota, jossa substituenttien väliset sidokset ovat 60:n asteen kulmassa, kutsutaan ns. gauche efektiksi. Sidoskulmat ohjaavat hydroksiproliinin rengaskonformaation C γ -endo asemaan ja proliinin rengaskonformaation C γ -ekso asemaan. Kollageenien välinen peptidisidos suosii ainoastaan trans konformeeriä (Gorres et al. 2008, Vitagliano et al. 2001). Suotuisin prokollageenin konfromaatio suhteessa C-P4H:hon katalyysivaiheessa on β-käännöslaskos, jolloin sen rakenne on hieman avonaisempi. Katalyysin jälkeen hydroksyyliryhmän vuoksi ketju jäykistyy, eikä sillä ole kovin paljon vapaata tilaa aminohappojen välillä (Chopra & Ananthanarayanan 1982). 14

6. Transmembraaninen prolyyli-4-hydroksylaasi 6.1 P4H-TM:n rakenne ja lokalisoituminen C-P4H:n ja HIF-P4H:n lisäksi solulimakalvostossa (ER) esiintyy uudenlainen P4H-entsyymi. Esiintyvä on P4H-TM, joka kuuluu myös Fe(II)-2-oksoglutaraatti dioksigenaasien superperheeseen (Oehme et al. 2002). Poiketen edellisistä P4H-entsyymeistä, P4H-TM sisältää transmembraanisen domeenin, joka sijoittuu oletettavasti aminohappojen 58-82 välille. P4H-TM:ää ekspressoituu etenkin munuaisissa. Muilta selkärankaisilta P4H-TM geeni löytyy ainakin seeprakalalta (Hyvärinen et al. 2010). P4H-TM:n sekvenssi on konservoitunut hieman suhteessa HIF-P4H:n ja C-P4H:n geeneihin. Sillä on enemmän identtisyyttä C-P4H:den kuin HIF-P4H:den kanssa. Sen aktiivisuus ja reaktion kannalta tärkeät aminohapot vastaavat C-P4H:ta, mutta kuitenkin sen toiminnallisuus liittyy HIF1α:n säätelyyn. P4H-TM ei hydroksyloi kollageenissa esiintyviä proliineja. Sekvenssianalyysien perusteella P4H-TM geeni on 14-15%:sti identtinen ihmisen C-P4Hα(I)- ja α(iii) domeenien kanssa. HIF-P4H 1-3 isomuotojen kanssa P4H-TM:llä on 12-13%:n identtisyys. P4H-TM ei kuitenkaan sisällä samanlaista substraattia sitovaa domeenia (PSB) (Koivunen et al. 2007). P4H-TM:n ekspressio indusoituu HIF1α:n ja HIF2α:n tavoin hypoksiassa ja sen on huomattu rajoittavan HIF2α:n määrää. P4H-TM voi hydroksyloida proliineja HIF1α:n ODDD:stä. HIF1α:n ekspressio indusoituu huomattavasti eniten HIF-P4H 2:n ollessa hiljennettynä, mutta lähes samankaltainen vaikutus on P4H-TM:llä. Siten sillä on samanlainen vaikutus HIF1α:n stabiliteettiin kuin muilla HIF-P4H:lla ja siten sillä on rooli HIF-ohjautuvien geenien säätelyssä (Koivunen et al. 2007). Stoikiometrialtaan P4H-TM on homodimeeri, jolla on kaksi potentiaalista N-glykolysoitua motiivia Asn 368 -Val 369 -Thr 370 ja Asn 382 -Arg 383 -Thr 384. Sen N-terminaalinen osa eroaa muista P4H:sta, mutta sen rautaa ja 2-oksoglutaraattia sitovat aminohapot ovat konservoituneita. P4H-TM:ssä 2- oksoglutaraattia sitoo lysiini. Lysiini esiintyy myös C-P4H:ssa, mutta HIF-P4H:ssa sama aminohappo on arginiini. P4H-TM sisältää EF-hand-domeenin joka sitoo Ca 2+ -ionin Se sijaitsee N-terminaalisessa osassa aminohappojen 192 ja 249 välissä. P4H-TM:n katalyyttinen domeeni suuntautuu luumenin puolelle (Koivunen et al. 2007). 15

6.2 P4H-TM:llä ei ole vielä spesifistä roolia P4H-TM:n aktiivisuus on osoittautunut kokeellisissa aktiivisuusmittauksissa heikommaksi kuin HIFp4H:t tai C-P4H:t Kokeellisesti näiden entsyymien aktiivisuutta voidaan mitata epäsuorasti 2- oksoglutaraatin dekarboksylaatioreaktiolla, jossa muodostuu sukkinaattia ja hiilidioksidia. Toistaiseksi P4H-TM:n rooli on läheisesti yhteydessä HIF-signalointiin, mutta sen toiminnasta on saatu lukuisia havaintoja eri kudoksissa. (Myllyharju & Koivunen 2013) Epäsuora aktiivisuuden mittaus voidaan suorittaa ilman substraattia. On huomioitava, että P4H- TM:lle ei ole voitu osoittaa substraattia. Reaktiota seurataan C 14 - tai H 3 -radion(rw.error - Unable to find reference:3)uklidilla leimatun 2-oksoglutaraatista vapautuvan hiilidioksidin avulla. Suurin aktiivisuus esiintyy C-P4H:lla n. 3,0mol/mol entsyymiä/min kun taas P4H-TM sama arvo on vain n.0,2. Tämä johtuu osaltaan P4H-TM ongelmista in vitro olosuhteissa, joka on siten vaikeuttanut karakterisointia (Koivunen et al. 2007). Kirjallisuudesta ei löydy viitteitä sille, että proteiinia oltaisiin onnistuttu ekspressoimaan ja puhdistamaan siinä määrin, jotta sille oltaisiin voitu tehdä kristallografisia määrityksiä. Toisaalta HIF-P4H2:n (McDonough et al. 2006) ja C-P4H α2β2-tetrameerin eri domeenien (Pekkala et al. 2004, (Anantharajan et al. 2013) olemassa olevat kiderakenteet helpottavat P4H-TM:n kiderakenteen selvittämistä. Transmembraanisen osan irtoaminen Asp 88 kohdalta osoittaa proteiinin olevan homodimeeri ja toisaalta helposti hajoava. Toistaiseksi HIF-P4H:lle ei ole pystytty osoittamaan varmasti spesifistä substraattia. Kuitenkin HIF1α:n ODDD proliinit voidaan hydroksyloida P4H:n toimesta, mutta tähän liittyy epävarmuuksia johtuen yllä mainituista in vitro tekijöistä. P 402 :n ja P 564 :n mutaatioilla on kuitenkin havaittu, että P4H-TM voi hydroksyloida sellaisia proliineja ODDD:sta, joita HIF-P4H:t eivät hydroksyloi. (Koivunen et al. 2007). Tämän hetkisten uusimpien tutkimusten mukaan P4H- TM:n geenin puuttumisella tai poikkeavuudella on havaittu muutoksia silmän retinassa ja renaalisessa kudoksessa (Leinonen et al. 2016). 16

7. Kirjallisuusluettelo Anantharajan J, Koski M, Kursula P, Hieta R, Bergmann U, Myllyharju J & Wierenga R (2013) The structural motifs for substrate binding and dimerization of the α subunit of collagen prolyl 4-hydroxylase. Structure 21(12): 2107. Annunen P, Helaakoski T, Myllyharju J, Veijola J, Pihlajaniemi T & Kivirikko KI (1997) Cloning of the human prolyl 4-hydroxylase alpha subunit isoform alpha(ii) and characterization of the type II enzyme tetramer. The alpha(i) and alpha(ii) subunits do not form a mixed alpha(i)alpha(ii)beta2 tetramer. J Biol Chem. 272(28): 17342-8. Beck I, Ramirez S, Weinmann R & Caro J (1991) Enhancer element at the 3 -flanking region controls transcriptional response to hypoxia in the human erythropoietin gene. J Biol Chem 266(24): 5563 15566. Bishop T & Ratcliffe PJ (2014) Signaling hypoxia by hypoxia-inducible factor protein hydroxylases: a historical overview and future perspectives. Hypoxia (Auckl). 2: 197-213. Bowes JH & Kenten RH (1948) The amino-acid composition and titration curve of collagen. Biochem J. 43(3): 358-65. Chopra RK & Ananthanarayanan VS (1982) Conformational implications of enzymatic proline hydroxylation in collagen. Proc Natl Acad Sci U S A. 79(23): 7180 7184. Compernolle V, Brusselmans K, Acker T, Hoet P, Tjwa M, Beck H, Plaisance S, Dor Y, Keshet E, Lupu F, Nemery B, Dewerchin M, Van Veldhoven P, Plate K, Moons L, Collen D & Carmeliet P (2002) Loss of HIF-2alpha and inhibition of VEGF impair fetal lung maturation, whereas treatment with VEGF prevents fatal respiratory distress in premature mice. Nat Med. 8(7): 702-10. Costas M, Mehn MP, Jensen MP & Que LJ (2004) Dioxygen activation at mononuclear nonheme iron active sites: enzymes, models, and intermediate. Chem Rev. 104(2): 939-86. Culpepper MA, Scott EE & Limburg J (2010) Crystal structure of prolyl 4-hydroxylase from Bacillus anthracis. Biochemistry 49(1): 124-33. de Jong L, Albracht SP & Kemp A (1982) Prolyl 4-hydroxylase activity in relation to the oxidation state of enzyme-bound iron. The role of ascorbate in peptidyl proline hydroxylation. Biochim Biophys Acta. 704(2): 326-32. Edman JC, Ellis L, Blacher RW, Roth RA & Rutter WJ (1985) Sequence of protein disulphide isomerase and implications of its relationship to thioredoxin. Nature 317(6034): 267-70. Epstein AC, Gleadle JM, McNeill LA, Hewitson KS, O'Rourke J, Mole DR, Mukherji M, Metzen E, Wilson MI, Dhanda A, Tian YM, Masson N, Hamilton DL, Jaakkola P, Barstead R, Hodgkin J, Maxwell PH, Pugh CW, Schofield CJ & Ratcliffe PJ (2001) C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell. 107(1): 43-54. 17

Eriksson M, Myllyharju J, Tu H, Hellman M & Kivirikko KI (1989) Evidence for 4-hydroxyproline in viral proteins. Characterization of a viral prolyl 4-hydroxylase and its peptide substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 86(12)): 4392-6. Fischer E (1902) Ber. them. Ges. 36: 2660. Freedman SJ, Sun ZY, Poy F, Kung AL, Livingston DM, Wagner G & Eck MJ (2002) Structural basis for recruitment of CBP/p300 by hypoxia-inducible factor-1 alpha. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(8): 5367-72. Gorres KL, Edupuganti R, Krow GR & Raines RT (2008) Conformational preferences of substrates for human prolyl 4-hydroxylase. Biochemistry 47(36): 9447-55. Gorres KL & Raines RT (2010) Prolyl-4-hydroxylase. Crit Rev Biochem Mol Biol. 45(2): 106-24. Gu YZ, Moran SM, Hogenech JB, Wartman L & Bradfield CA (1998) Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible factor subunit, HIF3alpha. Gene Expr. 7: 205 213. Hanauske-Abel HM & Günzler V (1982) A stereochemical concept for the catalytic mechanism of prolylhydroxylase: applicability to classification and design of inhibitors. J Theor Biol. 94(2): 421-55. Heino J & Vuento M (2009) Kollageenit muodostavat soluväliaineen suuret säikeet. In: Anu Stormi (ed) Biokemian ja solubiologian perusteet. Helsinki, WSOY: 213-218. Helaakoski T, Vuori K, Myllylä R, Kivirikko KI & Pihlajaniemi T (1989) Molecular cloning of the alpha-subunit of human prolyl 4-hydroxylase: the complete cdna-derived amino acid sequence and evidence for alternative splicing of RNA transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 86(12): 4392-6. Hieta R & Myllyharju J (2002) Cloning and characterization of a low molecular weight prolyl 4- hydroxylase from Arabidopsis thaliana. Effective hydroxylation of proline-rich, collagen-like, and hypoxia-inducible transcription factor alpha-like peptides. J Biol Chem. 277(26): 23965-71. Hoffart LM, Barr EW, Guyer RB, Bollinger JMJ & Krebs C (2006) Direct spectroscopic detection of a C-H-cleaving high-spin Fe(IV) complex in a prolyl-4- hydroxylase. Proc Natl Acad Sci U S A. 103(40): 14738-43. Hoffman EC, Reyes H, Chu FF, Sander H, Conley LH, Brooks BA & Hankinson O (1991) Cloning of a factorrequired for activity of the Ah (dioxin) receptor. Science 252: 954-958. Huang J, Zhao Q, Mooney SM & Lee FS (2002) Sequence determinants in hypoxia-inducible factor-1alpha for hydroxylation by the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3. J Biol Chem. 277(42): 39792-800. 18

Huang LE, Gu J, Schau M & Bunn HF (1998) Regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(14): 7987-92. Hutton JJ,Jr, Trappel AL & Udenfriend S (1966) A rapid assay for collagen proline hydroxylase. Anal. Biochem. 16: 384 394. Hyvärinen J, Parikka M, Sormunen R, Rämet M, Tryggvason K, Kivirikko KI, Myllyharju J & Koivunen P (2010) Deficiency of a transmembrane prolyl 4-hydroxylase in the zebrafish leads to basement membrane defects and compromised kidney function. J Biol Chem. 285(53): 42023-32. Ivan M, Haberberger T, Gervasi DC, Michelson KS, Günzler V, Kondo K, Yang H, Sorokina I, Conaway RC, Conaway JW & Kaelin WG (2002) Biochemical purification and pharmacological inhibition of a mammalian prolyl hydroxylase acting on hypoxia-inducible factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(21): 13459-64. Ivan M, Kondo K, Yang H, Kim W, Valiando J, Ohh M, Salic A, Asara JM, Lane WS & Kaelin WG (2001) HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science 292(5516): 464-8. Iyer NV, Kotch LE, Agani F, Leung SW, Laughner E, Wenger RH, Gassmann M, Gearhart JD, Lawler AM, Yu AY & Semenza GL (1998) Cellular and developmental control of O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1 alpha. Genes Dev. 12(2): 149-62. Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, Wilson MI, Gielbert J, Gaskell SJ, von Kriegsheim A, Hebestreit HF, Mukherji M, Schofield CJ, Maxwell PH, Pugh CW & Ratcliffe PJ (2001) Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science 292(5516): 468-72. Jiang BH, Rue E, Wang GL, Roe R & Semenza GL (1996) Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 271: 17771-17778. John DC & Bulleid NJ (1996) Intracellular dissociation and reassembly of prolyl 4-hydroxylase:the alpha-subunits associated with the immunoglobulin-heavy-chain binding protein (BiP) allowing reassembly with the beta-subunit. Biochem J. 317(3): 659-65. Kallio PJ, Okamoto K, O'Brien S, Carrero P, Makino Y, Tanaka H & Poellinger L (1998) Signal transduction in hypoxic cells: inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17(22): 6573-86. Kibel A, Iliopoulos O, DeCaprio JA & Kaelin WGJ (1995) Binding of the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein to Elongin B and C. Science 269(5229): 1444-6. Kivirikko KI & Pihlaniemi T (1998) Collagen hydroxylases and the protein disulfide isomerase subunit of prolyl 4-hydroxylases. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 72: 325-98. Kivirikko KI & Prockop DJ (1967) Partial characterization of protocollagen from embryonic cartilage. Biochem J. 102(2): 432-42. 19

Koivu J, Myllylä R, Helaakoski T, Pihlajaniemi T, Tasanen K & Kivirikko KI (1987) A single polypeptide acts both as the beta subunit of prolyl 4-hydroxylase and as a protein disulfideisomerase. J Biol Chem. 262(14): 6447-9. Koivunen P, Salo KE, Myllyharju J & Ruddock LW (2005) Three binding sites in protein-disulfide isomerase cooperate in collagen prolyl 4-hydroxylase tetramer assembly. J Biol Chem. 280(7): 5227-35. Koivunen P, Tiainen P, Hyvärinen J, Williams KE, Sormunen R, Klaus SJ, Kivirikko KI & Myllyharju J (2007) An endoplasmic reticulum transmembrane prolyl 4-hydroxylase is induced by hypoxia and acts on hypoxia-inducible factor alpha. J Biol Chem. 282(42): 30544-52. Koski MK, Hieta R, Hirsilä M, Rönkä A, Myllyharju J & Wierenga RK (2009) The crystal structure of an algal prolyl 4-hydroxylase complexed with a proline-rich peptide reveals a novel buried tripeptide binding motif. J Biol Chem. 2009 284(37): 25290-301. Krebs C, Galonić-Fujimori D, Walsh CT & Bollinger JMJ (2007) Non-heme Fe(IV)-oxo intermediates. Acc Chem Res. 40(7): 484-92. Kung AL, Wang S, Klco JM, Kaelin WG & Livingston DM (2000) Suppression of tumor growth through disruption of hypoxia-inducible transcription. Nat. Med 6: 1335 1340. Lamberg A, Pihlajaniemi T & Kivirikko KI (1995) Site-directed mutagenesis of the alpha subunit of human prolyl 4-hydroxylase. Identification of three histidine residues critical for catalytic activity. J Biol Chem. 270(17): 9926-31. Lando D, Peet DJ, Whelan DA, Gorman JJ & Whitelaw ML (2002) Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science 295(5556): 858-61. Leinonen H, Rossi M, Salo AM, Tiainen P, Hyvärinen J, Pitkänen M, Sormunen R, Miinalainen I, Zhang C, Soininen R, Kivirikko KI, Koskelainen A, Tanila H, Myllyharju J & Koivunen P (2016) Lack of P4H-TM in mice results in age-related retinal and renal alterations. Hum Mol Genet. Levine RL (1983) Oxidative modification of glutamine synthetase. I. Inactivation is due to loss of one histidine residue. J Biol Chem. 258(19): 11823-7. Levine RL, Oliver CN, Fulks RM & Stadtman ER (1981) Turnover of bacterial glutamine synthetase: oxidative inactivation precedes proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 78(4): 2120 2124. Lin F, Suggs S, Lin C, Browne J, Smalling R, Egrie J, Chen K, Fox G, Martin F & Stabinsky Z (1985) Cloning and expression of the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci U S A 82(22): 7580-7584. 20

Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Bretscher A, Ploeg H & Matsudaira P (2007) Integrating cells to tissues. In: Anonymous Molecular biology of the cell. New York, W.H Freeman company: 801-847. Longbotham JE, Levy C, Johannissen LO, Tarhonskaya H, Jiang S, Loenarz C, Flashman E, Hay S, Schofield S,J & Scrutton NS (2015) Structure and Mechanism of a Viral Collagen Prolyl Hydroxylase. Biochemistry 54(39): 6093 6105. Maes C, Carmeliet G & Schipani E (2012) Hypoxia-driven pathways in bone development, regeneration and disease. Nat Rev Rheumatol. 8(6): 358-66. Majamaa K, Günzler V, Hanauske-Abel HM, Myllylä R, Myllylä R & Kivirikko KI (1986) Partial identity of the 2-oxoglutarate and ascorbate binding sites of prolyl 4-hydroxylase. J Biol Chem. 261(17): 7819-23. Majamaa K, Hanauske-Abel HM, Günzler V & Kivirikko KI (1984) The 2-oxoglutarate binding site of prolyl 4-hydroxylase. Identification of distinct subsites and evidence for 2-oxoglutarate decarboxylation in a ligand reaction at the enzyme-bound ferrous ion. Eur J Biochem. 138(2): 239-45. Makino Y, Cao R, Svensson K, Bertilsson G, Asman M, Tanaka H, Cao Y, Berkenstam A & Poellinger L (2001) Inhibitory PAS domain protein is a negative regulator of hypoxia-inducible gene expression.. Nature 414(6863): 550-4. McDonough MA, Li V, Flashman E, Chowdhury R, Mohr C, Liénard BM, Zondlo J, Oldham NJ, Clifton IJ, Lewis J, McNeill LA, Kurzeja RJ, Hewitson KS, Yang E, Jordan S, Syed RS & Schofield CJ (2006) Cellular oxygen sensing: Crystal structure of hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase (PHD2). Proc Natl Acad Sci U S A. 103(26): 9814-9. Myllyharju J & Kivirikko KI (1997) Characterization of the iron- and 2-oxoglutarate-binding sites of human prolyl 4-hydroxylase. EMBO J. 16(6): 1173-80. Myllyharju J & Koivunen P (2013) Hypoxia-inducible factor prolyl 4-hydroxylases: common and specific roles. 394(4): 435-448. Oehme F, Ellinghaus P, Kolkhof P, Smith TJ, Ramakrishnan S, Hütter J, Schramm M & Flamme I (2002) Overexpression of PH-4, a novel putative proline 4-hydroxylase, modulates activity of hypoxia-inducible transcription factors. Biochem Biophys Res Commun. 296(2): 343-9. Ohh M, Park CW, Ivan M, Hoffman MA, Kim TY, Huang LE, Pavletich N, Chau V & Kaelin WG (2000) Ubiquitination of hypoxia-inducible factor requires direct binding to the beta-domain of the von Hippel-Lindau protein. Nat Cell Biol. 2(7): 423-7. Pekkala M, Hieta R, Myllyharju J, Kivirikko K, Wierenga R & Myllyharju J (2004) The peptide-substrate-binding domain of collagen prolyl 4-hydroxylases is a tetratricopeptide repeat domain with functional aromatic residues. J Biol Chem 279(50): 52255. Peterkofsky B & Udenfriend S (1965) Enzymatic hydroxylation of proline in microsomal polypeptide leading to formation of collagen. Proc Natl Acad Sci U S A. 53(53): 335-42. 21

Pihlajaniemi T, Helaakoski T, Tasanen K, Myllylä R, Huhtala ML, Koivu J & Kivirikko KI (1987) Molecular cloning of the beta-subunit of human prolyl 4-hydroxylase. This subunit and protein disulphide isomerase are products of the same gene. EMBO J. 6(3): 643-9. Rankin EB & Giaccia AJ (2008) The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis. Cell Death Differ. 15(4): 678-685. Rankin EB & Giaccia AJ (2016) hypoxic control of metastasis. Science 352(6282): 175. Ryan HE, Lo J & Johnson RS (1998) HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization. EMBO J. 17(11): 3005-15. Schnicker NJ & Dey M (2016) Bacillus anthracis Prolyl 4-Hydroxylase Modifies Collagen-like Substrates in Asymmetric Patterns. J Biol Chem. 291(25): 13360-74. Semenza GL (2001) HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing. Curr Opin Cell Biol. 13: 167. Semenza GL (2012) Molecular mechanisms mediating metastasis of hypoxic breast cancer cells. Trends Mol Med. 18(9): 534-43. Shan B, Schaaf C, Schmidt A, Lucia K, Buchfelder M, Losa M, Kuhlen D, Kreutzer J, Perone MJ, Arzt E, Stalla GK & Renner U (2012) Curcumin suppresses HIF1A synthesis and VEGFA release in pituitary adenomas. J Endocrinol. 214(3): 389-98. Shaw LM & Olsen BR (1991) FACIT collagens: diverse molecular bridges in extracellular matrices. Trends Biochem Sci. 16(5): 191-4. Stebbins CE, Kaelin WGJ & Pavletich NP (1999) Structure of the VHL-ElonginC-ElonginB complex: implications for VHL tumor suppressor function. Science 284(5413)): 455-61. Tarhonskaya H, Rydzik AM, Leung IK, Loik ND, Chan MC, Kawamura A, McCullagh JS, Claridge TD, Flashman E & Schofield CJ (2014) Non-enzymatic chemistry enables 2- hydroxyglutarate-mediated activation of 2-oxoglutarate oxygenases. Nat Commun. 5(5): 3423. Tasanen K, Parkkonen T, Chow LT, Kivirikko KI & Pihlajaniemi T (1988) Characterization of the human gene for a polypeptide that acts both as the beta subunit of prolyl 4-hydroxylase and as protein disulfide isomerase. J Biol Chem. 263(31): 16218-24. Tian H, McKnight SL & Russell DW (1997) Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. Genes Dev. 11(1): 72-82. Vitagliano L, Berisio R, Mazzarella L & Zagari A (2001) Structural bases of collagen stabilization induced by proline hydroxylation. Biopolymers 58(5): 459-64. Vuori K, Pihlajaniemi T, Myllylä R & Kivirikko KI (1992) Site-directed mutagenesis of human protein disulphide isomerase: effect on the assembly, activity and endoplasmic reticulum 22

retention of human prolyl 4-hydroxylase in Spodoptera frugiperda insect cells. EMBO J. 11(11)): 4213-7. Wang GL, Jiang BH, Rue E & Semenza GL (1995) Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helixloop-helix-pas heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92(12): 5510 5514. Wenger RH & Gassman M (1997) Oxygen(es) and the hypoxia-induc-ible factor-1. Biol. Chem. 378: 609 616. Yamashita T, Ohneda O, Nagano M, Iemitsu M, Makino Y, Tanaka H, Miyauchi T, Goto K, Ohneda K, Fujii-Kuriyama Y, Poellinger L & Yamamoto M (2008) Abnormal Heart Development and Lung Remodeling in Mice Lackingthe Hypoxia-Inducible Factor-Related Basic Helix-Loop-Helix PAS Protein NEPAS. Mol Cell Biol. 4: 1285-97. 23