Biomolekyylit ja aineenvaihdunta I

Transkriptio

1 Biomolekyylit ja aineenvaihdunta I Luentorunko Jarmo Niemi

2 Biomolekyylit ja aineenvaihdunta I Luennot 6 op. (3 ov) Jarmo Niemi ([email protected]) Biokemian ja elintarvikekemian laitos, Arcanum puh , Tavoitteet ja sisältö: Biomolekyylit ja aineenvaihdunta I -luentosarja perehdyttää opiskelijat keskeisten biomolekyylien, kuten hiilihydraattien, lipidien, proteiinien ja nukleiinihappojen rakenteisiin, toiminnallisiin ominaisuuksiin ja biokemialliseen merkitykseen, biologisten membraanien toimintaan ja signaalinvälitykseen. Kirjallisuus: Nelson ja Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4. painos, kappaleet Suoritustavat: Luentoihin ja oppikirjaan perustuva tentti. Luentorunko Tämä moniste on luentorunko, ei oppikirja! Se on tarkoitettu luentojen seuraamisen ja kirjan lukemisen tueksi ja muistiinpanotarpeen vähentämiseksi, ei yksinomaiseksi oppimateriaaliksi. 1. Maa-planeetan elämästä yleensä elolliset organismit ovat elottomiin kohteisiin verrattuna erittäin monimutkaisia rakenteeltaan elolliset organismit käyttävät toimintaansa ympäristöstään saamaansa energiaa: auringonvaloa tai ravintoaineita elolliset organismit pystyvät tuottamaan kopioita itsestään eliöillä on mekanismeja tunnistaa ympäristönsä muutoksia ja reagoida niihin Kaikki eliöt ovat perustoimintaperiaatteiltaan samanlaisia toimivat osat ovat makromolekyylejä, jotka rakentuvat suhteellisen harvalukuisista palikoista, monomeerisistä alayksiköistä nukleiinihapot ovat kahdeksan eri rakenneosan, nukleotidin muodostamia ketjuja proteiinit ovat kahdenkymmenen erilaisen aminohapon muodostamia ketjuja 2

3 kaikki eliöt käyttävät samoja nukleotidejä ja aminohappoja eliöt eivät ole kemiallisessa tasapainossa ympäristönsä kanssa eliöissä olevat yhdisteet ovat dynaamisessa vakaassa tilassa; niitä tuotetaan ja hajotetaan yhtä paljon eliöt ottavat sekä ainetta, että energiaa ympäristöstään, ja käyttävät niitä oman järjestyksensä rakentamiseen ja ylläpitoon Termodynamiikan ensimmäinen pääsääntö: Termodynamiikan toinen pääsääntö: Energia ei häviä. Entropia (epäjärjestys) lisääntyy Eliöt noudattavat kaikkia fysiikan ja kemian lakeja. Eliön järjestyneisyys voidaan saavuttaa vain ympäristön epäjärjestyksen lisääntymisen kustannuksella Eliöt käyttävät hyväkseen ns. kytkettyjä reaktioita: energiaa vapauttavan (eksergonisen) reaktion avulla saadaan energiaa sitova (endergoninen) reaktio tapahtumaan Kytkentään käytetään korkeaenergisiä yhdisteitä, joista tavallisin on adenosiinitrifosfaatti, ATP Reaktioita katalysoivat soluissa entsyymit, joista muodostuu reaktioteitä Biologinen tiedonsiirto Eliön toiminnan pohjana on geneettinen informaatio, jonka täytyy kopioitua lähes virheettömästi uuteen eliösukupolveen ilmentyä suhteellisen virheettömästi eliön toiminnassa Kopioitumisen virheettömyys perustuu DNA:n kaksinauhaiseen, komplementaariseen rakenteeseen Kopioitumisessa tapahtuvat (harvat) virheet mahdollistavat evoluution Ilmentyminen perustuu lineaarisen nukleiinihappomolekyylin translaatioon, kääntämiseen, lineaariseksi proteiinimolekyyliksi Lineaarinen proteiinimolekyyli omaksuu kolmiulotteisen rakenteen, joka riippuu sen rakenneosien järjestyksestä, ja johon sen toiminta perustuu. 3

4 O COO - COO - COO - C C COO Solujen rakenne Eliön perusyksikkö on solu. (yksisoluiset/monisoluiset) Kaikkia soluja ympäröi solukalvo (plasma membrane) Solukalvon sisäpuolella on solulima, sytoplasma Sytoplasmassa on erilaisia partikkeleita, sekä nestefaasi, sytosoli, joka on olemukseltaan geelimäinen Kaikissa soluissa (pl. tumattomat) sytoplasmassa on ribosomeja, joissa proteiinisynteesi tapahtuu Solun perimä, genomi on DNA:ta sisältävässä rakenteessa Aitotumallisilla (eukaryooteilla) tätä rakennetta kutsutaan tumaksi (nucleus). Tuman erottaa solulimasta tumakalvo. Esitumallisilla (prokaryooteilla) käytetään nimitystä nukleoidi Solujen koko Eläin- ja kasvisolut µm, bakteerisolut 1-2 µm Pienimmät mykoplasmat 300 nm -> tilavuus litraa Solun kokoa rajoittaa ravintoaineiden ja hapen saanti Nitella-levän solu on useita senttimetrejä pitkä! Aitotumallinen, eukaryootti (eukaryote) Esitumallinen, prokaryootti (prokaryote) Tuma (nucleus) Nukleoidi (nucleoid) Mitokondrio (mitochondrion) Solukalvo (plasma membrane) C 2 C 2 Enz Solulima, sytoplasma (cytoplasm) Lysosomi (lysosome) Endoplasmakalvosto (endoplasmic reticulum, ER) Golgin laite (Golgi complex) What is true for E. coli is true for elephants, only more so. - Jacques Monod 4

5 Koska kaikki eliöt ovat perustoimintaperiaatteiltaan samanlaisia, voidaan niiden tutkimisessa käyttää sellaisia koeorganismeja, joiden kasvattaminen ja käsittely on mahdollisimman helppoa. bakteeri, Escherichia coli hiiva, yksinkertainen eukaryootti Saccharomyces cerevisiae yksisoluinen kasvi, levä Chlamydomonas Prokaryoottisolun evoluutio ja rakenne Prokaryootit jakautuvat eubakteereihin ( varsinaiset bakteerit ) arkkeihin (Archaea, arkkibakteerit) Kreikk. arche alkuperä, alku Arkit ovat luultavasti vanhimpia jäljellä olevia solullisia eliöitä. Nykyään tehokkaammat eubakteerit ovat syrjäyttäneet ne tavallisista olosuhteista, ja arkkeja esiintyy ääriolosuhteissa. Me eukaryootit olemme läheisempää sukua arkeille, kuin eubakteereille. Prokaryoottien elinympäristöjä Aerobinen Anaerobinen (ei happea) Eliöt saavat energiaa hapetus-pelkistysreaktioista, jotka voidaan tulkita elektronien siirroksi. Aerobiset organismit siirtävät elektroneja hapelle. Anaerobiset käyttävät elektronien vastaanottajina muita molekyylejä, kuten nitraattia, rikkiä, hiilidioksidia. Useille anaerobisille organismeille happi on myrkkyä. Prokaryoottien energian ja ravinnon hankinta Fototrofit saavat energiansa valosta Kemotrofit saavat energiansa hapettamalla ravintoaineita Autotrofit saavat tarvitsemansa hiilen hiilidioksidista eterotrofit saavat tarvitsemansa hiilen ravintoaineista Litotrofit saavat energiansa hapettamalla epäorgaanisia ravintoaineita Organotrofit saavat energiansa hapettamalla orgaanisia ravintoaineita Escherichia coli on parhaiten tutkittu prokaryootti E. coli on enimmäkseen harmiton ruoansulatuskanavan asukas. Solu on n. 2 x 1 µm. Solua ympäröi soluseinä, joka koostuu peptidoglykaaneista. E. colilla on kaksinkertainen solukalvo, jonka ulompi kerros on peptidoglykaanikerroksen ulkopuolella (Gram-negatiivinen bakteeri). 5

6 Solun ulkopinnassa on piluksia, joilla solu tarttuu pintoihin, ja yksi tai useampi flagella, jolla solu pystyy liikkumaan uimalla. E. coli-solun sisällä on n ribosomia n. tuhatta erilaista entsyymiä kutakin tuhansia molekyylejä pienimolekyylisiä orgaanisia yhdisteitä epäorgaanisia ioneja n µm:n mittainen renkaanmuotoinen DNA-molekyyli, kromosomi mahdollisesti pienempiä renkaanmuotoisia DNA-molekyylejä, plasmideja Eukaryoottien alkuperästä Eukaryootteja on ollut maapallolla n. 1,5 mrd. vuotta. Niiden esivanhempina pidetään anaerobisia arkkeja. Nykyeukaryoottien arvellaan syntyneen toisaalta anaerobisen arkin ja toisaalta aerobisen eubakteerin ja kasvien osalta vielä syanobakteerin symbioosina => ns endosymbionttiteoria. Aerobisesta bakteerista ajatellaan muodostuneen nykyeukaryoottien mitokondriot, ja syanobakteerista nykykasvien kloroplastit. Sekä mitokondriolla, että kloroplastilla on edelleen omaa DNA:ta, jota pidetään jäänteenä niiden elämästä erillisenä organismina. Eukaryoottisen solun rakenteesta ja toiminnasta Solukalvo sisältää kuljetus- ja reseptoriproteiineja Solukalvo ei läpäise useimpia molekyylejä, joten niille on tehtävä aukko. Aukot ovat erityisiä kalvon läpäiseviä proteiineja, jotka yleensä päästävät vain yhtä tai harvaa molekyyliä lävitseen. Kuljetusproteiini voi olla joko passiivinen kanava (molekyylit kulkevat konsentraatiogradientin suuntaan) tai aktiivinen pumppu (käyttää ulkoista energiaa) Reseptori on proteiini, joka välittää informaatiota solukalvon yli (ionikanava, entsyymi) Endosytoosi ja eksosytoosi kuljettavat materiaalia solukalvon läpi Endosytoosissa sisäänotettava materiaali päätyy solukalvosta kuroutuvan vesikkelin (endosomin) sisään. Endosomi kuljetetaan solun sisään, jolloin se voi sulautua jonkin toisen kalvorakkulan (esim. lysosomin) kanssa. 6

7 Fagosytoosiksi nimitetään endosytoosia, jossa pieniä partikkeleja otetaan solun sisään. Eksosytoosiksi puolestaan nimitetään sitä, kun solun sisältä tuleva kalvorakkula sulautuu solukalvon kanssa, vapauttaen sisältönsä solun ulkopuolelle. uomattava, että endosytoosissa materiaali ei kulje solukalvon läpi. Endoplasminen kalvosto (endoplasmic reticulum) on solun pinnalle ja ulkopuolelle tulevien proteiinien ja lipidien valmistuspaikka Suuren osan eukaryoottisolusta täyttää mutkikas kalvoista koostuva rakenne, jota kutsutaan endoplasmiseksi kalvostoksi. Karhea endoplasminen kalvosto (rough endoplasmic reticulum) sisältää suuren määrän ribosomeja, jotka valmistavat erittyviä proteiineja kalvoston sisäiseen tilaan. Sileä (smooth) endoplasminen kalvosto puolestaan on lipidien biosynteesipaikka (jossa muun muassa valmistetaan lisää solukalvoa) Golgin laite (the Golgi complex) prosessoi ja lajittelee proteiineja Endoplasmiseen kalvostoon liittyy Golgin laitteeksi kutsuttu rakennelma, joka koostuu litistyneistä onteloista. Käsiteltävät proteiinit tuodaan kalvorakkuloissa ja ne siirtyvät Golgin laitteen ontelosta toiseen samalla mekanismilla. Golgin laitteesta proteiineja sisältävät rakkulat ohjataan esim. lysosomeihin tai ulos solusta. Golgin laitteessa proteiineihin lisätään erilaisia kemiallisia ryhmiä, kuten hiilihydraatteja (glykosylaatio), sulfaattiryhmiä, lipidejä. ajotusreaktiot tapahtuvat lysosomeissa Lysosomeja on vain eläinsoluissa. sisältävät makromolekyylejä pilkkovia entsyymejä. solukalvo suojaa solua lysosomiin suljettujen hajottavien entsyymien vaikutukselta. kun makromolekyyli on hajotettu monomeereikseen lysosomissa, ne pääsevät solukalvon läpi. lysosomin p on solulimaa (n. 7) selvästi alhaisempi (n. 5) Kasvisolun vakuolin tehtävät hajottavien reaktioiden tapahtumispaikka (vrt. lysosomi) pigmenttien sijoituspaikka (kukkien väri) osmoottisen paineen avulla ylläpitää kasvisolun sisäistä painetta => pitää kasvia pystyssä 7

8 Peroksisomit ja glyoksisomit Jotkut hajotusreaktiot tuottavat vetyperoksidia 2 O 2, joka solussa olisi erittäin vahingollinen hapetin. Tällaiset reaktiot tapahtuvat peroksisomeissa, joissa on vetyperoksidia hapeksi ja vedeksi hajottavaa katalaasi-entsyymiä. Kasveissa on peroksisomeja, jotka sisältävät ns. glyoksylaattisyklin entsyymejä; niitä kutsutaan glyoksisomeiksi. Lysosomeja, peroksisomeja ja glyoksisomeja kutsutaan mikrobodeiksi. Tuma sisältää genomin Tumaa rajoittaa kaksinkertainen kalvo, joka on yhteydessä endoplasmiseen kalvostoon Tumakalvossa on tumahuokosia (nuclear pore) joissa on proteiineista koostuva monimutkainen rakenne, ja n. 90 nm halkaisijainen aukko Kun solu ei ole jakautumassa, tuman täyttää DNA:sta ja proteiineista koostuva kromatiini Tumajyvänen (nucleolus) on tuman alue, jossa syntetisoidaan ribosomaalista RNA:ta (rrna) Solun jakautumista (cytokinesis) edeltää tuman jakautuminen, mitoosi Ennen mitoosia solun DNA on kahdentunut. Mitoosin yhteydessä se pakkaantuu kromosomeiksi, joissa on kaksi kromatidia Sisarkromatidit erkanevat toisistaan tumasukkulan vetäminä, ja kulkeutuvat solun eri päihin Kromosomien lukumäärä ja muoto on lajityypillinen ominaisuus Useimmissa soluissa kutakin kromosomia on kaksi kappaletta (diploidi solu) Sukusoluissa kutakin kromosomia on vain yksi (haploidi solu) DNA (joka on negatiivisesti varautunut) kiertyy positiivisesti varattujen histoni-nimisten proteiinien ympärille n. 1:1 Edelleen histoni-dna-kompleksi organisoituu nukleosomeiksi ja kromatiinikuiduiksi Ihmissolussa on 2 metriä DNA:ta, mutta kromosomien yhteenlaskettu pituus on vain 200 µm Mitokondriot tuottavat suurimman osan aerobisen solun energiasta Mitokondriot ovat kaksinkertaisesta kalvosta muodostuvia organelleja Niiden muoto vaihtelee suuresti, mutta tyypillinen halkaisija on 1 µm Mitokondrion ulkokalvo on tasainen, mutta sisäkalvo muodostaa cristoiksi kutsuttuja poimuja, jotka lisäävät sen pinta-alaa Sisäkalvon sisäpuolella olevaa, runsaasti proteiineja ja aineenvaihdunnan välituotteita sisältävää ainesta kutsutaan matriksiksi 8

9 Mitokondriot hapettavat ravintoaineita ilman hapen avulla, tuottaen hiilidioksidia, vettä ja ATP:tä Kloroplastit muuttavat aurinkoenergiaa kemialliseksi energiaksi Kasvit sisältävät mitokondrioiden ohella kloroplasteja Kloroplastit talteenottavat auringon energiaa ja tuottavat ATP:tä solun energiaksi Pelkistyneitä hiiliyhdisteitä CO 2 :sta appea Kloroplastien (ja kasvien) vihreä väri tulee klorofyllistä, joka on tärkein fotosynteettinen pigmentti Fotosynteesi tapahtuu tylakoideiksi kutsutuissa kalvorakenteissa Solun tukiranka (cytoskeleton) tukee, järjestää ja liikuttaa Eukaryoottisolussa on useista erilaisista proteiinikuiduista koostuva sisäinen tukiverkosto Tukirankaan kuuluu kolmentyyppisiä kuituja Mikrotubulukset, 25 nm Välikokoiset säikeet (intermediate filaments), 10 nm Mikrofilamentit (actin filaments) 5-9 nm Kukin tukikuiduista koostuu samankaltaisista proteiinialayksiköistä, joista kasaantuu dynaamisesti tasapaksuja kuituja Mikrofilamentit kasaantuvat aktiini-nimisestä proteiinista (myös lihassäikeissä) Fodriini ja filamiini proteiinit sitovat mikrofilamentteja toisiinsa Myosiiniproteiini mahdollistaa kohteiden, esim. soluorganellien liikuttamisen mikrofilamentteja pitkin Mikrotubulukset koostuvat tubuliiniyksiköistä Dyneiini ja kinesiini mahdollistavat liikkeen mikrotubuluksia pitkin Välikokoiset säikeet Rakenteeltaan ja toiminnaltaan hyvin vaihteleva ryhmä, tehtävänä tukea solun rakenteita ja lisätä solun kestävyyttä ulkoisia voimia vastaan Esim. Keratiinit toimivat hiusten ja kynsien muodostumisessa Vimentiini muodostaa sytoplasmaan pysyviä säikeitä, jotka tukevat solun muotoa Sytoplasma on ruuhkainen, järjestäytynyt ja dynaaminen Monisoluiset organismit ja solujen erilaistuminen Monisoluisilla organismeilla solut ovat erilaistuneita 9

10 Kaikissa soluissa on kuitenkin sama genomi! Eri soluissa genomista ilmennetään eri geenejä Erilaistumiseen liittyy geneettinen ohjelma Solut ovat yhteydessä toisiinsa erilaisilla liitoksilla - tiukka liitos -desmosomi -aukkoliitos (gap junction) -plasmodesmit Virukset: solunsisäisiä loisia 3. Biomolekyyleistä yleensä Solu koostuu 99 %:sti alkuaineista C,, N ja O pienikokoisia, atomipainot 12, 1, 14, 16 eliöissä alkuaineiden osuus hyvin erilainen, kuin maankuoressa keskimäärin => nämä 4 ovat valikoituneet ominaisuuksiensa perusteella kykenevät muodostamaan stabiileja yhdisteitä, joissa atomien välillä kovalenttiset sidokset erityisesti kykenevät (varsinkin C) muodostamaan molekyyliketjuja kovalenttisen sidoksen energia kcal/mol keskimääräinen terminen energia 37 C:ssa 0.6 kcal/mol => kovalenttiset sidokset täysin stabiileja Stereoisomeria Kun atomiin (yleensä hiileen) on sitoutunut neljä erilaista ryhmää, muodostuu kiraalinen keskus; ryhmät voivat olla sitoutuneina kahdella eri tavalla, joita kutsutaan stereoisomeereiksi Stereoisomeerit käyttäytyvät yleensä eri tavalla biologisissa systeemeissä, ja biomolekyylit ovat tyypillisesti vain yhtä stereoisomeeriä Molekyylit, jotka ovat toistensa peilikuvia, ovat enantiomeereja Stereoisomeerit, jotka eivät ole peilikuvia, ovat diastereomeereja apetus-pelkistysreaktiot Solut saavat energiaa biomolekyylejä hapettamalla. Atomi hapettuu menettäessään elektroneja. Yleensä biologisessa hapettumisessa atomi menettää elektronien ohella siihen sitoutuneita vetyjä. 10

11 4. Vesi vanhin voitehista Vedellä on hyvin poikkeukselliset ominaisuudet, jotka enimmäkseen johtuvat vesimolekyylien välisistä vetysidoksista ja vesiatomin dipoliluonteesta Vetysidos syntyy, kun elektronegatiiviseen atomiin kovalenttisesti sitoutunut vety tulee lähelle toista elektronegatiivista atomia Tyypillisen vetysidoksen voimakkuus on n. 1/20 kovalenttisen sidoksen voimakkuudesta Vetysidoksella on voimakas suuntavaikutus: elektronegatiivisten atomien ja vetyatomien on oltava samalla suoralla, jotta sidos olisi voimakkaimmillaan Biologisissa makromolekyyleissä vetysidokset ovat hyvin tärkeitä, ja niitä muodostuu happi- ja typpiatomien välille, kun ko. välillä on jommankumman atomin kovalenttisesti sitoma vetyatomi Vetysidoksista muodostuvan verkoston ansiosta vedellä on nesteeksi epätavallisen paljon sisäistä rakennetta Vesimolekyylit vuorovaikuttavat liuenneiden aineiden kanssa Veteen liukenevat hyvin yhdisteet, joissa on polaarisia tai varattuja ryhmiä => pystyvät osallistumaan veden rakenteeseen. Tällaiset yhdisteet ovat hydrofiilisiä Suolat, kuten NaCl dissosioituvat vedessä ioneiksi. Vesimolekyylit ympäröivät (hydratoivat) ionit Ei-polaariset yhdisteet häiritsevät veden rakennetta => hydrofobisia Vesi pakottaa hydrofobiset aineet yhteen Ns. ei-kovalenttiset, heikot vuorovaikutukset molekyylien välillä Makromolekyyliä pitävät yhdessä vahvat kovalenttiset sidokset, mutta makromolekyylit liittyvät toisiinsa heikommilla nonkovalenttisilla vuorovaikutuksilla: ionisidokset vetysidokset van der Waalsin sidokset hydrofobiset vuorovaikutukset (vettähylkivien molekyylien yhteenliittyminen) 11

12 Nonkovalenttiset vuorovaikutukset pystyvät pitämään makromolekyylit yhdessä lämpöliikkeestä huolimatta, vain jos niitä on monta => makromolekyylien on oltava komplementaarisia Veden kolligatiiviset ominaisuudet Kun veteen (tai mihin tahansa yhdestä molekyylilajista koostuvaan nesteeseen) on liuenneena toista ainetta, tietyt fysikokemialliset ominaisuudet muuttuvat tavalla, joka riippuu yksinomaan liuenneiden hiukkasten (molekyylien, ionien ) lukumäärästä. Nämä ovat höyrynpaine kiehumispiste sulamispiste osmoottinen paine ja niitä kutsutaan kolligatiiviksi ominaisuuksiksi Kun kahta vesiliuosta erottaa kalvo, joka ei läpäise liuenneita aineita, mutta läpäisee vettä (kuten solukalvo), vettä siirtyy kalvon läpi, kunnes liuoksen osmolariteetti kalvon molemmilla puolilla on sama (liuokset isotoniset) vrt. hypertoninen ja hypotoninen liuos Veden ionisoituminen Puhtaassakin vedessä tapahtuu vähäisessä määrin autoprotolyysiä: 2 O + + O Vetyioni (protoni) esiintyy normaalisti hydroniumionina 3 O + ydronium- ja hydroksidi-ionilla on epätavallisen suuri liikkuvuus vedessä johtuen proton hopping -ilmiöstä Autoprotolyysireaktion tasapainovakio on Keq = [ + ][ O [ 2O] ] Koska veden konsentraatio on käytännössä vakio, voidaan yksinkertaistaa: K w = [ + ][O - ] = 1,0 * M 2 Puhtaassa vedessä [ + ] = [O - ] = 10 7 M Merkitään 12

13 p = -log[ + ] Puhtaan veden p = 7 p + po =14 eikon hapon (tai emäksen) vesiliuoksessa happo dissosioituu vain osittain, johon pätee tasapainoyhtälö: + K eq = [ ][A ]/[A] = K a pk a = -logk a Titrattaessa heikko happo vahvalla emäksellä havaitaan, että kun happo on puoliksi titrattu, p = pk a eikon hapon ja sitä vastaavan emäksen seos vastustaa p:n muutosta, ja sitä kutsutaan puskuriliuokseksi Jos halutaan laskea, mihin p:hon tietty puskuri puskuroi, tarvitaan enderson asselbalchin yhtälöä: p = pka + log [A ]/[A] 5. Aminohapot, peptidit ja proteiinit Aminohapot Proteiinit rakentuvat 20:sta α-aminohaposta 20 ns. proteiiniaminohappoa ovat universaaleja, kaikki maapallon eliöt käyttävät proteiineissaan niitä Näissä α-hiili (2-hiili) sitoo sekä karboksyyli- että aminoryhmää ei-ionisoituneessa muodossa: R C COO N 2 p7:ssä aminohappo esiintyy dipolaarisena ionina (zwitterion) R C COO - N

14 Glysiiniä lukuun ottamatta α-hiili on kiraalinen keskus. Proteiiniaminohapot ovat L-muotoa D ja L kuvaavat konfiguraatioita vertaamalla niitä D- ja L-glyseraldehydiin Aminohappojen funktion ratkaisee sivuketju R, jonka ominaisuuksien mukaan aminohapot myös ryhmitellään. Nonpolaariset, alifaattiset sivuketjut Glysiini, Gly (G) Glysiini on ainoa ei-kiraalinen aminohappo, jonka merkittävin ominaisuus on sen pieni koko. Sitä esiintyy proteiineissa mutkakohdissa ja ahtaissa paikoissa. Alaniini, Ala (A) Jossain mielessä ominaisuudeton aminohappo Valiini, Val (V) Leusiini, Leu (L) Isoleusiini, Ile (I) Ns. haaraketjuiset aminohapot ovat proteiineissa usein vedettömissä sisäosissa. 14

15 Metioniini, Met (M) Toinen rikkiä sisältävistä aminohapoista. Useimmissa tapauksissa proteiinin translaation aloittava aminohappo. Aromaattiset sivuketjut Fenyylialaniini, Phe (F) Ph=F Tryptofaani, Trp (W) isoin kirjain Tyrosiini, Tyr (Y) tyrosiini Aromaattiset aminohapot ovat hydrofobisia ja isoja, useimmiten proteiinien sisäosissa. Tyrosiinilla on myös fenolinen hydroksyyli, joka voi osallistua reaktioihin. Negatiivisesti varatut (happamat) sivuketjut Asparagiinihappo, Asp (D) niinkuin Carboksyylihappo C:stä seuraava, C Glutamiinihappo Glu (E) koska pitempi hiiliketju D:stä seuraava, appamat sivuketjut vaikuttavat proteiinin varaukseen, ja osallistuvat reaktioihin. Suomen kielellä käytetään usein suolan nimeä: aspartaatti ja glutamaatti. 15

16 Polaariset, varauksettomat sivuketjut Asparagiini, Asn (N) 2 N C Glutamiini, Gln (Q) N 2 O C 2 C 2 C C O O asparagiini??? Aspartaatin ja glutamaatin amidit. Ei varausta. Seriini, Ser (S) ydroksialaniini. Usein katalyysiin osallistuva aminohappo Treoniini, Thr (T) Kysteiini, Cys (C) merkaptoseriini. Tärkeä rikkisiltojen muodostajana proteiineissa. Proliini, Pro (P) Ainoa aminohapoista, joka ei ole aminohappo vaan iminohappo. Ei pysty proteiinissa toimimaan vetysidoksen donorina, joten rikkoo sekundäärirakenteita, erityisesti α-kierrettä. Positiivisesti varatut (emäksiset) sivuketjut Lysiini, Lys (K) L:stä seuraava 16

17 Arginiini, Arg (R) arginiini Arginiinissa oleva guanidiiniryhmä on voimakas emäs. istidiini, is () istidiini on heikko emäs, jonka pk on lähellä neutraalia, joten se pystyy proteiineissa toimimaan sekä happona, että emäksenä. Se myös usein sitoo metalli-ioneja proteiineissa. Aminohappojen optiset ominaisuudet Aromaattiset aminohapot absorboivat valoa, eniten tryptofaani Proteiini voidaan havaita (ja sen konsentraatio mitata) 280 nm aallonpituudella; kvantitatiivisen tuloksen saamiseksi täytyy tietää proteiinin aromaattisten aminohappojen lukumäärä Aminohappojen happo-emäsominaisuudet Molekyyliä, jossa on sekä happamia, että emäksisiä ryhmiä, sanotaan amfoteeriseksi tai amfolyytiksi. Titrattaessa neutraalisivuketjuista aminohappoa, esim. glysiiniä, havaitaan kaksi puskurointipistettä (=pk 1 ja pk 2 ) Niiden välissä on piste, jossa molekyylin nettovaraus =0, isoelektrinen piste. Aminohapossa sekä karboksyyli- että aminoryhmän pk-arvot ovat tavanomaista alhaisemmat johtuen ryhmien vaikutuksesta toisiinsa. Aminohapoilla, joiden sivuketjussa on titrautuva ryhmä, havaitaan kolme puskurointipistettä. Isoelektristä pistettä ei saada suoraan pk-arvojen keskiarvona. Peptidit ja proteiinit Peptidit ovat aminohappojen muodostamia ketjuja Kaksi aminohappoa voi liittyä yhteen toisen karboksyyli- ja toisen aminoryhmän muodostamalla peptidisidoksella, jolloin samalla eliminoituu vettä Peptidisidoksen muodostumisen tasapaino on voimakkaasti lähtöaineiden puolella, joten karboksyyliryhmä täytyy kemiallisesti aktivoida, jotta reaktio tapahtuisi 17

18 Koska peptidillä on edelleen amino- ja karboksyyliryhmä, voidaan aminohappoja liittää lisää rajoittamattomasti. Lyhyt peptidi on oligopeptidi, pitkä peptidi on polypeptidi, ja tarpeeksi pitkää polypeptidiä nimitetään myös proteiiniksi. Peptidin aminohappojärjestys ilmoitetaan alkaen aminopäästä, eli siitä aminohaposta, jolla on vapaa α-aminoryhmä. Toinen pää on vastaavasti karboksyylipää. Peptidien happo-emäsominaisuudet Peptidisidosten muodostuessa niihin osallistuvat amino- ja karboksyyliryhmät häviävät. Peptidissä ionisoituvia ryhmiä ovat vain amino- ja karboksipää sekä sivuketjujen ionisoituvat ryhmät Ympäristö saattaa muuttaa varsinkin polypeptideissä sivuketjujen pk-arvoja Peptidillekin on olemassa isoelektrinen piste, jota käytetään hyväksi puhdistuksessa (p:n ollessa pi:n yläpuolella peptidi on negatiivisesti varautunut, ja päinvastoin) Biologisesti aktiivisten peptidien ja polypeptidin koko vaihtelee suunnattomasti ( aminohappoa) Proteiini voi muodostua yhdestä tai useammasta polypeptidistä (oligomeerirakenne) Proteiineissa esiintyy myös muita ryhmiä, kuin aminohappoja -lipidejä -hiilihydraatteja -fosfaattiryhmiä -hemi (rautaporfyriini) -flaviininukleotidit -metalli-ionit Prosteettinen ryhmä vertaa koentsyymi Proteiinin rakenteen järjestäytymistasot Proteiinin rakennetta kuvataan neljällä eri tasolla Primäärirakenne on proteiinin aminohappojärjestys Sekundäärirakenne tarkoittaa eräitä erityisen stabiileja rakenteita (α-kierre ja β-levy) joista suurin osa useimmista proteiineista koostuu 18

19 Tertiäärirakenne tarkoittaa yhden polypeptidin koko kolmiulotteista rakennetta Kvaternäärirakenne tarkoittaa sitä, miten useasta polypeptidistä koostuva proteiini rakentuu osistaan Proteiinien puhdistus- ja tutkimusmenetelmät Tärkeimmät proteiinien puhdistusmenetelmät perustuvat kokoon varaukseen ja hydrofobisuuteen biologiseen aktiivisuuteen Kokoon perustuvat kalvosuodatusmenetelmät ja geelisuodatuskromatografia. Varaukseen ja hydrofobisuuteen perustuvat saostusmenetelmät (esim. ammoniumsulfaattisaostus) ja adsorptiokromatografia. Biologiseen aktiivisuuteen perustuvat erilaiset affiniteettikromatografiamenetelmät. Jotta proteiini voitaisiin puhdistaa, on oltava jokin keino mitata sen määrää -entsyymiaktiivisuus -sitoutuminen johonkin kohdemolekyyliin -antibodin (vasta-aineen) sitominen - Proteiinien puhdistus Proteiinit ryhmänä (ainakin liukoiset proteiinit) on suhteellisen helppo erottaa muista solun molekyyleistä, mutta varsinainen ongelma tulee siinä vaiheessa, kun on erotettava yksi proteiini muista. Puhdistusprosessi on johdonmukaista jakaa vaiheisiin: raakauutteen teko jossa solut hajotetaan, ei-liukoiset epäpuhtaudet poistetaan ja proteiiniliuos esikäsitellään puhdistusta varten pääpuhdistus jossa käytetään mahdollisimman harvoja, tehokkaita puhdistusmenetelmiä, jotta suurin osa epäpuhtauksista saadaan poistettua loppupuhdistus (polishing, kiillotus ) jossa preparaatin puhtaus nostetaan tarvittavalle tasolle Pääosa puhdistuksessa on nykyään erilaisilla kromatografisilla menetelmillä: ioninvaihtokromatografia (anionin- tai kationinvaihto): proteiinit tarttuvat vastakkaisen varauksen omaavaan kiintoaineeseen ja saadaan irtoamaan siitä suolakonsentraatiota nostamalla. Eri p:ssa eri proteiinit irtoavat luonteenomaisessa suolakonsentraatiossa. Ioninvaihtokromatografia 19

20 edellyttää alhaista suolapitoisuutta: näyte voi olla laimea, koska se konsentroituu ioninvaihdossa hydrofobinen interaktiokromatografia (IC): proteiinit tarttuvat hydrofobisilla osillaan (esim. aktiivisen keskuksen tasku ) kiintoaineeseen kiinnitettyihin hydrofobisiin ryhmiin korkeassa suolapitoisuudessa, ja irtoavat suolapitoisuutta laskettaessa affiniteettikromatografia perustuu proteiinin voimakkaaseen affiniteettiin ligandinsa kanssa. Esim. substraattianalogi tai muu spesifisesti proteiiniin sitoutuva molekyyli on liitetty kiinteään kantajaan; haluttu proteiini tarttuu siihen kiinni. Irti se saadaan lisäämällä ligandia liukoisessa muodossa tai esim. reversiibelisti denaturoivaa kemikaalia lisäämällä tavallisin viimeinen puhdistusvaihe on proteiinit koon mukaan erotteleva geelisuodatus eli geeliekskluusiokromatografia Proteiinien analysointi Tavallisin proteiinien analyysimenetelmä on elektroforeesi. Siinä proteiinit eroavat sähkökentässä kulkemalla eri nopeuksilla (pi:nsä yläpuolella proteiinit ovat negatiivisesti varattuja ja kulkevat kohti positiivista napaa ) Denaturoimalla proteiinit natriumdodekyylisulfaatilla (SDS) saadaan lähes kaikki proteiinit kulkeutumaan molekyylipainonsa mukaisella nopeudella, jolloin niiden molekyylipaino saadaan selville. Useammasta polypeptidistä koostuvat proteiinit hajoavat alayksiköikseen Isoelektrisessä fokusoinnissa käytetään erikoispuskuria (amfolyyttiseos), joka muodostaa p-gradientin. Kukin proteiini liikkuu, kunnes on pi:tään vastaavassa p:ssa (varaus, ja liikkuvuus sähkökentässä =0) Kaksiulotteisessa elektroforeesissa suoritetaan ensin isoelektrinen fokusointi, ja sitten SDS-geelielektroforeesi. Näin saadaan selville proteiinin pi ja molekyylipaino. Polypeptidin aminohappojärjestys ja sen selvittäminen Proteiinin aminohappojärjestys määrää proteiinin kolmiulotteisen rakenteen ja toiminnan Monien perinnöllisten sairauksien osalta geneettinen vika on voitu paikantaa yhden aminohapon vaihtumiseen yhdessä elimistön proteiinissa Sirppisoluanemia oli ensimmäinen perinnöllinen sairaus, jonka osoitettiin johtuvan aminohappomuutoksesta (hemoglobiinin β-ketjussa Glu-6 vaihtunut valiiniksi) 20

21 Eri lajeilla samat proteiinit eroavat toisistaan aminohappojärjestykseltään; aminohappojärjestysten perusteella voidaan laatia sukupuu Peptidin aminohappojärjestys voidaan määrittää ns. Edman-hajotuksella (Edman degradation), jossa peptidin aminopäästä saadaan joka syklillä yksi aminohappo irtoamaan fenyylitiohydantoini(pt-)-johdannaisena PT-aminohapot tunnistetaan nestekromatografialla (PLC) ajotukseen ja tunnistukseen käytetään nykyään automaattilaitteita, joiden herkkyys riittää polyakryyliamidigeeliltä eristettyjen bändien sekvenointiin (muutama µg) Laitteella pystytään määrittämään N 2 -päästä max. 50 aminohappoa Suurempien proteiinien aminohappojärjestys on määritettävä palasina. Disulfidisidokset katkaistaan pelkistämällä tai asetyloimalla Polypeptidi voidaan pilkkoa esim. spesifisten proteaasien tai kemikaalien, esimerkiksi syanogeenibromidin, avulla. Käytettäessä useampaa eri pilkkomistapaa saadaan koko sekvenssi koottua päällekkäisyyksien avulla Aminohapposekvenssi voidaan myös saada selville sekvensoimalla vastaava geeni (nykyään tavallisin!) massaspektrometrialla (pääasiassa proteiinitäplien tunnistukseen) Aminohapposekvenssi antaa runsaasti tietoa proteiinin rakenteesta ja toiminnasta. Tieto saadaan vertailulla rakenteeltaan ja funktioltaan tunnettujen proteiinien kanssa. Sekvenssiltään samankaltaiset proteiinit muodostavat proteiiniperheitä Pieniä peptidejä ja proteiineja voidaan valmistaa synteettisesti Ns. Merrifieldin synteesissä peptidi rakennetaan polystyreenihelmen pinnalle aminohappo kerrallaan käyttäen aktivoituja ja suojattuja aminohappoja. Syklit perustuvat siihen, että peptidisidoksen muodostuminen, ja suojaryhmien poisto tapahtuvat eri olosuhteissa Lopuksi peptidi irrotetaan hartsista hydrolyyttisesti ja puhdistetaan kromatografisesti Peptidisynteesiinkin on automaattisia laitteita saatavissa; lisäksi peptidisynteesiä voi tilata palveluna Pieniä biologisesti aktiivisia peptidejä ja niiden variantteja voidaan suoraan syntetisoida tutkimusta varten 21

22 6. Proteiinien kolmiulotteinen rakenne Puhdistetut proteiinit voidaan saada kiteytymään. Tämä osoittaa, että kaikki samaa proteiinia olevat molekyylit ovat kolmiulotteiselta rakenteeltaan samanlaisia. Molekyylin atomien kolmiulotteista sijoittumista toistensa suhteen nimitetään konformaatioksi. Proteiinin stabiili konformaatio (natiivi konformaatio) on se, jolla on pienin vapaa energia G Purkautuneen (denaturoituneen) ja natiivin konformaation vapaan energian ero on suhteellisen pieni, vain kj/mol vrt. kovalenttinen sidos kj/mol, ei-kovalenttinen sidos 4-30 kj/mol Natiivin konformaation määräävät lukuisat ei-kovalenttiset vuorovaikutukset ydrofobiset aminohapot muodostavat proteiinin sisuksen, joka ei ole kontaktissa veteen Proteiinin sisällä muodostuu mahdollisimman paljon vetysidoksia Peptidisidos on tasomainen Peptidisidoksessa C-N sidoksella on osittainen kaksoissidosluonne. Tämän seurauksena kiertyminen sidoksen ympäri on estynyt, ja sidos on tasomainen Peptidiketju voi kiertyä ainoastaan α-hiilen muodostamien C-N ja C-C sidosten ympäri Kiertokulmaa C α -N sidoksen ympäri merkitään φ (fii). Kiertokulmaa C α -C sidoksen ympäri merkitään ψ (psii) Proteiinin pääketjun konformaatio on periaatteessa täysin tunnettu, jos kaikkien aminohappojen φ ja ψ -kulmien arvot tunnetaan Peptidiketjun ja sivuryhmien steeristen esteiden vuoksi kaikki φ ja ψ -kulmien yhdistelmät eivät ole mahdollisia. Kuvaajaa, jossa on esitetty kunkin aminohappotähteen φ-kulma x-akselilla, ja ψ-kulma y-akselilla kutsutaan Ramachandran in kuvaajaksi. Kullakin sekundäärirakenteella on oma paikkansa Ramachandranin kuvaajassa; lisäksi kuvaaja toimii proteiinirakenteen selvittämisessä laaduntarkkailuna. 22

23 Oheisessa kuvaajassa on erään todellisen proteiinin (lysotsyymin) Ramachandran in kuvaaja. Sinisellä merkityt alueet ovat ns. sallittuja alueita joilla esiintyvillä φ ja ψ - kulmien arvoilla useimmat aminohapot mahtuvat esiintymään. Rasteilla on merkitty muut aminohapot, neliöillä glysiinit. Proteiinin sekundäärirakenteet Sekundäärirakenteet ovat säännöllisiä ja yleisiä rakenteita proteiineissa. Tärkeimmät ovat α-kierre ja β-levy Sekundäärirakenteita stabiloivat peptidisidosten väliset vetysidokset. α-kierre (α-helix) α-kierre syntyy, kun peptidiketju kiertyy spiraaliksi siten, että kunkin aminohapon N muodostaa vetysidoksen neljän aminohapon päässä olevan C=O ryhmän kanssa kierteen nousu on 5,4 Å (0,54 nm), 3,6 aminohappotähdettä α-kierteeseen osallistuvien aminohappojen φ-kulma on -60 ja ψ-kulma α-kierre on teoriassa mahdollinen sekä oikea- että vasenkätisenä, mutta vain oikeakätistä esiintyy luonnossa Proliini ei sovi α-kierteeseen, eikä myöskään pysty muodostamaan stabilointiin tarvittavaa vetysidosta Myös glysiini on harvinainen α-kierteessä taipuisuutensa takia 23

24 Negatiivisesti varatut aminohapot kierteen aminopäässä, ja positiivisesti varatut kierteen karboksipäässä stabiloivat kierrettä β-levy (β-sheet) β-levyssä vierekkäiset, suhteellisen suorat polypeptidiketjut sitoutuvat toisiinsa vetysidoksin. β-levy voi olla samansuuntainen (parallel) tai vastakkaissuuntainen (antiparallel) Lähekkäin oleviin β-levyihin mahtuvat parhaiten pienisivuketjuiset aminohapot (Gly ja Ala) β-käännös (β-turn) Vastakkaissuuntaissa β-levyssä nauhojen välissä on usein β-käännös Ketju kääntyy 180 neljän aminohapon matkalla, joista 2 keskimmäistä eivät osallistu vetysidoksiin Gly ja Pro ovat tavallisia β-käännöksissä Proliinin harvinainen cis-konformaatio esiintyy β-käännöksissä Sekundäärirakenteilla on luonteenomaiset kiertokulmat ja aminohappokoostumus 24

25 Proteiinien tertiääri- ja kvaternäärirakenteet Kuitumaiset ja globulaariset proteiinit Kuitumaiset proteiinit ovat rakenteellisia komponentteja Kuitumaiset proteiinit ovat liukenemattomia sekä kokonsa, että hydrofobisuutensa takia α-keratiini (hiukset, villa, kynnet, sarvikuonon sarvi ) rakentuu kahdesta toistensa ympärille kiertyvästä α-kierteestä (coiled coil rakenne) Tällaisista yksiköistä koostuu protofilamentteja ja edelleen protofibrillejä Kohdassa, jossa α-kierteet ovat kosketuksissa, on hydrofobisia aminohappoja (Ala, Val, Leu ) Keratiinin alayksikköjen välillä on disulfidisidoksia Kollageenissa on poikkeuksellinen kolmen aminohappoketjun muodostama kierteinen rakenne collagen triple helix α-kierrettä loivempaa kierrettä kutsutaan α-ketjuksi Kollageeni koostuu suurimmaksi osaksi aminohapoista Gly, Ala, Pro ja ypro (hydroksiproliini). Glysiinit ovat kolmoiskierteen sisäpuolella Kollageeni on poikkipinta-alaa kohden yhtä lujaa, kuin teräs. Kollageenissa ketjujen välille tehdään kovalenttisia ristisidoksia 25

26 Nisäkkäillä on n. 30 erityyppistä kollageenia Perinnölliset häiriöt kollageenin rakenteessa liittyvät eräisiin sidekudossairauksiin. Fibroiini koostuu tiiviisti pakkautuneista antiparalleelisista β-levykerroksista Silkkiperhoset ja hämähäkit tuottavat tätä venymätöntä ja äärimmäisen lujaa kuitua. Globulaariset (pallomaiset) proteiinit Globulaarisessa proteiinissa pitkä polypeptidiketju laskostuu kompaktiksi rakenteeksi Myoglobiini - ensimmäinen kolmiulotteiselta rakenteeltaan tunnettu proteiini Myoglobiini on lihaksen proteiini, jonka biologinen tehtävä on ilmeisesti toimia hapen puskurivarastona. Myoglobiini oli ensimmäinen proteiini, jonka kolmiulotteinen rakenne selvitettiin röntgenkristallografialla. Molekyylipaino 16700, 153 aminohappotähdettä Prosteettisena ryhmänä hemi, rauta-porfyriinikompleksi Kaskelotin myoglobiini kiteytyy helposti ja sitä oli (valaanpyynnin ollessa vielä sallittua) runsaasti saatavissa. Myoglobiini on hyvin kompakti proteiini; 45 X 35 X 25 Å. 26

27 Rakenne on n. 75%:sesti α-heliksiä. eliksejä on proteiinissa 8. Kolme helikseistä loppuu proliiniin (joka ei voi osallistua α-heliksiä ylläpitäviin peptidiketjun sisäisiin vetysidoksiin). Proteiinin sisäosa koostuu lähes kokonaan ei-polaarisista aminohappopäätteistä, ja siellä on hyvin vähän tyhjää tilaa. Ainoat polaariset aminohapot molekyylin sisäosissa ovat 2 sitoutumiskeskukseen kuuluvaa histidiiniä. emi on sitoutuneena hydrofobiseen taskuun Pelkkä hemi vesiliuoksessa ei sido happea, koska happi hapettaa sen raudan ferromuotoon reaktiossa, johon liittyy kahden hemin ja happimolekyylin muodostama hemi-happi-hemi -sandwich-kompleksi. emin sitoutuminen myoglobiiniin estää tällaisen hapettumisen. Proteiinin kolmiulotteisen rakenteen määrittäminen Vaikka aminohapposekvenssi määrää kolmiulotteisen rakenteen, emme pysty sitä laskemaan (vielä? ns. folding problem ) Kokeellisesti kolmiulotteinen rakenne määritetään röntgendiffraktiolla tai NMR:llä ( ydinmagneettinen resonanssi ) Röntgendiffraktiossa proteiini täytyy saada kiteytymään, mikä on usein aikaavievää, eikä kaikille proteiineille onnistu lainkaan Proteiinikiteessä on runsaasti vettä, joten rakenne ei paljonkaan poikkea rakenteesta vapaassa nesteessä. 27

28 Kiteeseen kohdistetaan yksitaajuinen röntgen- tai synkrotronisäteily, aallonpituudeltaan Å (samaa suuruusluokkaa, kuin atomien välinen etäisyys molekyylissä) Röntgensäteily siroaa kiteestä ja muodostaa diffraktiokuvion Ns. Fourier-analyysillä saadaan diffraktiokuviosta laskettua kolmiulotteinen ns. elektronitiheyskartta, johon mallinnusohjelmalla sovitetaan proteiinin rakennemalli Yksi diffraktiokuvio ei riitä, vaan ns. vaiheongelman ratkaiseminen edellyttää, että saadaan myös aikaan johdannainen, jossa proteiinikiteessä on spesifisessä kohdassa proteiinia raskasmetalliatomi tai atomeja Pienten proteiinien tai proteiinidomeenien rakenne voidaan selvittää myös NMR-tekniikalla NMR tuottaa tietoa spinin omaavien atomien ( 1, 13 C) sijainnista toistensa suhteen. 2-ulotteinen NMR tuottaa tietoa atomien keskinäisistä etäisyyksistä, joiden perusteella voidaan ratkaista 3-ulotteinen rakenne NMR-tekniikka tuottaa yleensä joukon lähisukuisia rakenteita, joiden voi sanoa olevan yhtä hyviä likiarvoja todellisesta rakenteesta NMR-rakenne on aito liuosrakenne. Kun samojen proteiinien rakenteita on selvitetty röntgendiffraktiolla ja NMR:llä, on havaittu niiden vastaavan hyvin toisiaan. Jos aminohapposekvenssiltään samankaltaisen proteiinin kolmiulotteinen rakenne tunnetaan, voidaan myös proteiinimallituksella (protein modelling) tehdä suhteellisen luotettavia johtopäätöksiä Muita pienten proteiinien tertiäärirakenteita 28

29 Sytokromi C on mitokondrion hengitysketjun osa, mp , 100 ah emi prostettisena ryhmänä, kuten myoglobiinissa α-kierrettä vain 39 % Lysotsyymi on bakteerien soluseinää hajottava entsyymi, jota on runsaasti mm. kananmunissa ja kyynelnesteessä α-kierrettä 40 %, β-levyä 12 % Ribonukleaasi on haiman erittämä ruuansulatusentsyymi, joka hajottaa RNA:ta α-kierrettä 26 %, β-levyä 35 % Pienissä proteiineissa on usein kovalenttisia sidoksia vakauttamassa rakennetta (cyt C:ssä hemi kovalenttisesti sitoutunut); erittyvissä proteiineissa rikkisiltoja Proteiineissa usein toistuvat rakenteet Proteiini on helpompi hahmottaa, jos sitä ajatellaan sekundäärirakenneelementteinä ja niitä yhdistävinä jaksoina 29

30 (RdmC-proteiinin topologiakaavio) Supersekundäärirakenteet, motiivit (motifs), foldit (folds) ovat usein toistuvia sekundäärirakenteiden yhdistelmiä airpin-β (RdmC:n β-nauhat β1 ja β2) β-α-β -silmukka (RdmC:n β5, αc ja β6) Monet isommat polypeptidit muodostavat useampia globulaarisia alayksikköjä, joita sanotaan domeeneiksi (domains) Usein domeeni säilyttää kolmiulotteisen rakenteensa silloinkin, kun se esim. proteolyyttisesti katkaistaan irralleen muusta proteiinista. Usein monidomeenisessa proteiinissa kukin biologinen funktio on yhden domeenin toteuttama. Proteiinissa voi olla esimerkiksi substraatin tunnistava domeeni ja katalyyttinen domeeni. Motiivien yhdistelminä saadaan suurempia kokonaisuuksia. Esim. βαβ motiiveista voi rakentua TIM-tynnyri. Proteiinien kolmiulotteisten rakenteiden luokittelu Proteiinirakenteiden luokittelu perustuu sekundäärirakenteisiin, ja niiden muodostamiin motiiveihin SCOP (Structural Classification of Proteins) tietokanta: neljä pääluokkaa, all α, all β α/β ja α + β 30

31 Proteiinit, joilla on merkittävää sekvenssin samankaltaisuutta, muodostavat proteiiniperheen. Proteiiniperheen jäsenet ovat evolutionaalisesti yhteistä alkuperää. Globulaaristen proteiinien kvaternäärirakenteet Proteiinin koostumisella useista alayksiköistä saadaan etua -kullekin alayksikölle voi olla oma geeninsä, joita säädellään tilanteen mukaan, esimerkki: sikiöaikainen hemoglobiini Varhaisella sikiöllä α-alayksikön tilalla on ζ (zeta) ja β-alayksikön tilalla ensin ε, sitten γ joka vasta syntymän jälkeen korvautuu β:lla -alayksiköt voivat liittyä yhteen (assosioitua) ja irrota (dissosioitua) tilanteen mukaan -assosiaatiossa voidaan eliminoida huonot alayksiköt; virheiden korjaus Protomeeri monialayksikköisen proteiinin yksittäinen osa Oligomeeri muutamista protomeereistä koostuva proteiini Multimeeri lukuisista, jopa sadoista protomeereistä koostuva proteiini emoglobiini koostuu neljästä (2 α, 2 β) myoglobiinin kaltaisesta happea sitovasta alayksiköstä. Samanlaisista alayksiköistä koostuvalla proteiinilla voi olla joko kiertosymmetria (rotational symmetry) tai kierresymmetria (helical symmetry) Kiertosymmetria voi olla syklistä tai dihedraalista emoglobiinin kaksi αβ-paria ovat toistensa suhteen kiertosymmetrisessa C 2 asetelmassa Virusten kuorissa löytyy monimutkaisempia rakennelmia, esim ikosahedraalinen (20-tahokas) Polypeptidiketjun kokoa rajoittaa geenin koko, ja proteiinisynteesikoneiston virhefrekvenssi (n. 1/ ah). Yleensä yli daltonin proteiini koostuu useista alayksiköistä Proteiinien denaturaatio ja laskostuminen (folding) Koska proteiinien rakennetta stabiloivat ei-kovalenttiset sidokset, olosuhteet ja kemikaalit, jotka häiritsevät niitä, johtavat proteiinin rakenteen hajoamiseen, denaturaatioon (Denaturoituessa polypeptidiketju siis pysyy ehjänä) 31

32 Lämpötilan nosto yleensä johtaa proteiinin denaturaatioon. Denaturaatio voi tapahtua äkillisesti, kun ylitetään kynnyslämpötila, mikä osoittaa, että kyseessä on ko-operatiivinen prosessi Denaturaation aiheuttavat myös p:n muutokset, orgaaniset liuottimet (heikentävät hydrofobisia vuorovaikutuksia) tietyt suolat ja yhdisteet (joita kutsutaan kaotrooppisiksi), detergentit (hydrofobiset vuorovaikutukset) Denaturaation seurauksena proteiini menettää biologisen aktiivisuutensa Joidenkin proteiinien (varsinkin puhtaiden) denaturaatio on reversiibeli Renaturaatio osoittaa aminohapposekvenssin määräävän kolmiulotteisen rakenteen Proteiini, esim ribonukleaasi voidaan denaturoida konsentroidulla urealiuoksella, johon on lisätty merkaptoetanolia pelkistämään rikkisillat Kun urea ja merkaptoetanoli poistetaan hitaasti, proteiini palautuu alkuperäiseen, entsymaattisesti aktiiviseen muotoonsa Myös alkuperäiset rikkisillat muodostuvat (Jos proteiinin rikkisiltojen annetaan muodostua poistamatta ureaa, ne muodostuvat satunnaisesti, ja urean poistosta huolimatta ei aktiivista konformaatiota enää löydy) Sama koe on onnistuneesti tehty myös kemiallisesti syntetisoidulla ribonukleaasilla. Polypeptidit laskostuvat vaiheittain Pelkästään todennäköisyyksiä ajatellen proteiinin oikean kolmiulotteisen rakenteen löytyminen on mahdotonta! (Lewinthalin paradoksi) Koska se kuitenkin tapahtuu (muutamassa sekunnissa), pelkkä todennäköisyyksien arviointi on ilmeisesti virheellistä Tietokonesimulaatioiden mukaan muodostuvat ensin sekundäärirakenteet. Niiden muodostuminen on ko-operatiivista (yhden sidoksen muodostuminen edistää seuraavan muodostumista) Välimuotona on arveltu esiintyvän osittain laskostuneen, mutta vielä epästabiilin rakenteen, josta on käytetty nimitystä sula möykky (molten globule) Jotkut mutaatiot saattavat aiheuttaa pikemminkin vian proteiinin laskostumisprosessissa, kuin lopullisessa rakenteessa. Proteiini jää ikään kuin roikkumaan virheelliseen rakenteeseen. 32

33 Todennäköisesti evoluutiossa valintapaine kohdistuu paitsi oikeaan loppurakenteeseen (energiaminimi), myös nopeaan laskostumiseen, eli että proteiini löytää lopullisen konformaationsa nopeasti! Joitain proteiineja täytyy auttaa laskostumisessa Monien proteiinien oikeaa ja nopeaa laskostumista auttavat soluissa kaperoneiksi (molecular chaperones) kutsutut proteiinit Kaperonit ovat oikeastaan proteiinien laskostumista katalysoivia entsyymejä. sp70 ryhmän proteiinit (eat Shock Protein dalt) sitoutuvat laskostumattomien proteiinien hydrofobisiin alueisiin estäen niiden virheellisen aggregoitumisen sp70 proteiinit edistävät proteiinien oikeaa laskostumista kuluttaen samalla ATP:tä Chaperoniinit (GroEL/GroES) puolestaan muodostavat monimutkaisen koneiston, jonka sisään puutteellisesti laskostunut proteiini sitoutuu hierottavaksi 7. Proteiinien toiminta Ligandi Kun proteiini sitoo reversiibelisti, yleensä ei-kovalenttisilla vuorovaikutuksilla, toisen molekyylin, jälkimmäistä kutsutaan ligandiksi Ligandi sitoutuu proteiinissa spesifiseen sitoutumiskohtaan, joka on ligandille komplementaarinen, niin että mahdollisimman paljon vuorovaikutuksia voi muodostua Proteiinien suuri spesifisyys ligandien sitomisessa perustuu juuri sitomiskohdan komplementaarisuuteen Proteiinin kolmiulotteinen rakenne voi muuttua ligandin sitoutumisen yhteydessä ( induced fit ) Esimerkki ligandin sitoutumisesta: happea sitovat proteiinit appi voi sitoutua hemiin Pelkkä hemi vesiliuoksessa ei sido happea, koska happi hapettaa sen raudan ferromuotoon reaktiossa, johon liittyy kahden hemin ja happimolekyylin muodostama hemi-happi-hemi -sandwich-kompleksi. emin sitoutuminen myoglobiiniin estää tällaisen hapettumisen. 33

34 Malliyhdiste picket fence iron porphyrin, jossa sandwich-kompleksin muodostuminen on steerisesti estetty, sitoo happea yhtä hyvin, kuin myoglobiini. Myoglobiinin rakenne mahdollistaa hiilimonoksidin hylkimisen iilimonoksidi CO sitoutuisi eristetyyn hemiin kertaa voimakkaammin, kuin happi. Koska elimistössä esiintyy endogeenista CO:ta pieniä määriä (sitä syntyy mm. hemin kataboliassa), se myrkyttäisi hemin kokonaan. Myoglobiinin rakenteeseen kuuluva proksimaalinen histidiini E7 pakottaa sekä hapen, että hiilimonoksidin sitoutumaan vinoon asentoon, jolloin CO sitoutuu vain 200 kertaa voimakkaammin, kuin happi. Tämä riittää estämään myoglobiinin saturoitumisen endogeenisella CO:lla, mutta ulkopuolinen CO pystyy silti myrkyttämään proteiinin. emoglobiinin alayksiköt ovat myoglobiinin kaltaisia emoglobiinin yksittäiset alayksiköt ovat käytännöllisesti katsoen samanlaiset kolmiulotteiselta rakenteeltaan toistensa ja myoglobiinin kanssa. Yllättäen näillä kolmella samanrakenteisella polypeptidiketjulla on vain 24 konservoitunutta aminohappoa 141:stä. Globin fold on nimitys tälle hyvin konservoituneelle kolmiulotteiselle rakenteelle. Tunnetaan yli 60 globin fold-rakenteista proteiinia; näissä vain 9 aminohappoa on hyvin konservoituneita. Molekyylin sisällä nonpolaariset aminohapot ovat vaihtuneet toisiin nonpolaarisiin aminohappoihin. Molekyylin pinnalla olevat polaariset aminohapot vaihtelevat sangen vapaasti toisiin polaarisiin aminohappoihin. emoglobiinin rakenne muuttuu hapen sitomisen yhteydessä Oksihemoglobiinin konformaatiota nimitetään R-konformaatioksi ja deoksihemoglobiinia T-konformaatioksi. Kun happi sitoutuu, hemin rauta siirtyy n. 0.4 Å lähemmäs porfyriinitasoa. Rauta vetää mukanaan siihen koordinoituneen histidiinin ja F-heliksin, johon se kuuluu. Tästä seuraa konformaationmuutos, joka johtaa toisen αβalayksikköpareista kiertymiseen toisen parin suhteen 15 astetta ja siirtymiseen 0.8 Å Merkittävimmät muutokset tapahtuvat α1β2 ja α2β1 -kontaktipinnassa. emoglobiini on allosteerinen proteiini Allosteerisessa proteiinissa ligandin sitoutuminen vaikuttaa toisen samassa proteiinissa olevan sitoutumiskohdan ominaisuuksiin. 34

35 Allosteerisen proteiinin kolmiulotteinen rakenne muuttuu ligandin sitoutumisen johdosta apen sitoutuminen hemoglobiiniin on ko-operatiivista. emoglobiinin happiaffiniteetti riippuu p:sta emoglobiini sitoo CO 2 :ta, ja CO 2 :n sitominen alentaa affiniteettia hapelle. Orgaaniset fosfaatit, kuten 2,3-bisfosfoglyseraatti, säätelevät hemoglobiinin happiaffiniteettia Ko-operatiivista tilanmuutosta selitetään joko sekventiaalisella mallilla tai MWC-mallilla (Monod, Wyman, Changeux); jälkimmäinen malli ilmeisesti kuvaa todellisuutta paremmin, ja siinä proteiinin kaikki alayksiköt vaihtavat tilaa samanaikaisesti. Ko-operatiivisuus ja ill in kerroin Merkitään Y:llä sitä osuutta hemoglobiinin kokonaismäärästä, joka on hapella saturoitunutta (0 Y 1). Jos hapen sitoutumisen reaktioyhtälöksi oletetaan: b(o 2 ) n b + no 2 log (Y/(1-Y)) = n log po 2 + n log P 50 Jos piirretään kuvaaja, jonka X-akseli on log (po 2 ) ja Y-akseli log (Y/(1-Y)) saadaan suora, jonka kulmakerroin = ko-operatiivisesti sitoutuvien molekyylien lukumäärä. Myoglobiinille tämä ill in kerroin on 1; hemoglobiinille 2.8. emoglobiinin hapen sitoutumisen ko-operatiivisuus tekee siitä tehokkaan kuljettajan; keuhkoissa hemoglobiini saturoituu lähes kokonaan, kun taas lihasten kapillaareissa siitä irtoaa lähes kaikki happi. Bohrin ilmiö emoglobiini kuljettaa hapen lisäksi hiilidioksidia ja vetyioneja p:n lasku alentaa hemoglobiinin happiaffiniteettia (Bohrin ilmiö). iilidioksidipitoisissa periferaalisissa kapillaareissa vallitseva alempi p johtaa hapen tehokkaampaan irtoamiseen hemoglobiinista. Myös hiilidioksidi (p:sta riippumatta) alentaa happiaffiniteettia. Vastavuoroisesti korkea happipitoisuus keuhkoissa edistää vetyionien ja hiilidioksidin dissosioitumista hemoglobiinista Bisfosfoglyseraatti määrää hemoglobiinin hapensitomiskyvyn Punasoluissa on bisfosfoglyseraattia (BPG) molaarisesti suunnilleen yhtä paljon, kuin hemoglobiinia. BPG nostaa hemoglobiinin P 50 :n 1 mmg:sta 26 mmg:hen 35

36 BPG alentaa happiaffiniteettia sitoutumalla alayksikköjen keskellä sijaitsevaan onkaloon. 8. Entsyymit Entsyymit ovat biokemiallisia katalyyttejä Poislukien muutamat katalyyttisesti aktiiviset RNA:t, entsyymit ovat proteiineja Useissa entsyymeissä on ei-polypeptidirakenteisia katalyyttisiä ryhmiä, kofaktoreja, joita kutsutaan koentsyymeiksi tai prosteettisiksi ryhmiksi Prosteettinen ryhmä on tiukasti, jopa kovalenttisesti kiinni entsyymissä, eikä irtoa normaalisti. Kofaktorit ovat yleensä metalli-ioneja tai vitamiineista johdettuja orgaanisia yhdisteitä Entsyymien luokitus 1. Oksidoreduktaasit -elektronien siirto 2. Transferaasit -ryhmien siirto 3. ydrolaasit -sidosten katkaiseminen liittämällä vesimolekyyli 4. Lyaasit -additio kaksoissidoksiin, tai kaksoissidosten muodostus eliminaatiolla 5. Isomeraasit -ryhmien siirto molekyylin sisäisesti 6. Ligaasit -C-O, C-S, C-C ja C-N -sidosten muodostus ATP:hen kytketyillä kondensaatioreaktioilla Jokaisella entsyymillä on EC (Enzyme commission) numero (ks. esim. Reaktiota ATP + D-glukoosi ADP + D-glukoosi 6-fosfaatti katalysoiva entsyymi on siten EC , ATP:glukoosi-fosfotransferaasi eli heksokinaasi. Miten entsyymit toimivat Katalyysi tapahtuu entsyymin pinnalla olevassa taskussa, josta käytetään nimitystä aktiivinen keskus. 36

37 Sitoutumiskohdan muodostavat vain muutamat aminohapot, jotka voivat olla aivan eri kohdissa proteiinin aminohapposekvenssissä. Loppuosan proteiinista voi katsoa olevan ainoastaan väline näiden tärkeiden aminohappojen tuomiseen yhteen tarkoin määrättynä rakennelmana. Molekyyliä tai molekyylejä, jotka sitoutuvat aktiiviseen keskukseen, ja joiden reaktiota entsyymi katalysoi, nimitetään substraatiksi/substraateiksi. Entsyymit voivat nopeuttaa reaktioita, mutta eivät tee niitä energeettisesti edullisemmiksi. Reaktion tasapainovakio ei voi muuttua. Entsyymi väistämättä nopeuttaa taaksepäin -reaktiota yhtä paljon kuin eteenpäin -reaktiotakin Energeettisesti epäedullinen reaktio saadaan kuitenkin tapahtumaan kytkemällä se ATP:n hydrolyysiin tai muuhun energeettisesti edulliseen reaktioon Reaktion tasapainovakio riippuu reaktion standardivapaaenergian muutoksesta: G = -RT ln K eq uolimatta siitä, että reaktion tasapaino olisi voimakkaasti lopputuotteiden puolella, ei reaktio välttämättä tapahdu havaittavalla nopeudella. Reaktion nopeus riippuu energiamuurista, joka reagoivien yhdisteiden täytyy ylittää, jotta reaktio voisi tapahtua. Tähän transitiotilaan liittyvää vapaaenergian muutosta G nimitetään aktivaatioenergiaksi. Katalyytit nopeuttavat reaktioita alentamalla aktivaatioenergiaa. Yksinkertaiselle reaktiolle S P reaktionopeus V = k[s] Transitiotilateorian mukaan k = (kt/h)e - G /RT (jossa k = Boltzmannin vakio ja h = Planckin vakio) 37

38 Entsyymien yleisiä toimintaperiaatteita Entsyymi sitoo substraatin ei-kovalenttisilla vuorovaikutuksilla Sitomisenergialla on suuri osuus aktivaatioenergian alentamisessa Suurin sitoutumisenergia liittyy kuitenkin entsyymin ja transitiotilan väliseen kompleksiin Entsyymi stabiloi transitiotilaa siten, että sen sitoutuminen entsyymiin on tiukempaa (sitoutumisvakio suurempi) kuin substraattien tai tuotteiden => aktivaatioenergia alenee Voidaan laskea, että tyypillisen entsymaattisen reaktion nopeudenlisäyksen saavuttaminen edellyttää transitiotilan sitomista kj/mol veroisesti Tyypillisen ei-kovalenttisen sidoksen syntymiseen liittyvä vapaaenergian muutos on 4 30 kj/mol Edelleen, katalyysin mekanismeihin kuuluvat 1) entropian vähennys; reagoivat yhdisteet sidotaan entsyymiin reaktion tapahtumisen kannalta edullisessa asennossa 2) molekyyliä stabiloivan hydraatiokerroksen poistuminen 3) substraatin muodon muuttaminen 4) katalyyttisten ryhmien tuominen oikeaan orientaatioon reagoiviin sidoksiin nähden Spesifiset katalyyttiset ryhmät appo-emäskatalyysi Kovalenttinen katalyysi Metalli-ionien katalyysi Vesi tai entsyymin hapan tai emäksinen ryhmä voi stabiloida varattua välituotetta luovuttamalla tai ottamalla vastaan protonin ( + ). Entsyymin ryhmän toimiessa happo-emäskatalyyttinä puhutaan yleisestä happo-emäskatalyysistä. Protonin siirrot ovat tavallisimpia biokemiallisia reaktioita. Kovalentissa katalyysissä substraatti muodostaa tilapäisesti sidoksen entsyymin nukleofiilisen sivuketjun kanssa. Metalli-ioni voi varauksensa ansiosta polarisoida substraattia, tai hapettua/pelkistyä substraatin kustannuksella. Lähes kolmasosa entsyymeistä tarvitsee metalli-ionin tai -ioneja ollakseen katalyyttisesti aktiivisia 38

39 Entsyymikinetiikan perusteita Entsyymikinetiikka tutkii entsyymin vuorovaikutusta ligandiensa kanssa mittaamalla ligandien konsentraation vaikutusta entsyymin katalysoiman reaktion nopeuteen. Michaelis-Menten yhtälö Tarkastellaan mahdollisimman yksinkertaista entsyymireaktiota, jossa entsyymi muuttaa substraatin S tuotteeksi P (Kyseessä on siis isomeraasi...). Ensimmäinen yksinkertaistus, joka tässä aina tehdään, on se, että mitataan entsyymireaktion ns. alkunopeutta. Tämä tarkoittaa, että [P]=0: Alkunopeuden käsitteestä Käytännössä entsyymireaktion tuotteen muodostuminen voi tapahtua esim. seuraavan käyrän mukaisesti: Aluksi reaktio on epälineaarinen (burst- tai lag-vaihe) johtuen mm. reagenssien sekoittumisesta, aktiiviseen keskukseen sitoutumisen kinetiikasta y.m. Myöhemmin reaktio alkaa taas kaartua substraatin konsentraation alenemisen ja tuotteen konsentraation lisääntymisen johdosta. Alkunopeus on yllä olevassa kuvaajassa esitetty katkoviivalla. Alkunopeustilanteessa V= k 3 [ES]. Vakaassa tilassa (steady state) ES ei muutu. Tällöin k 1 [E][S]=(k 2 +k 3 )[ES] 39

40 Tämä on Michaelis -Menten yhtälö. Se on samanlainen kuin eräiden muidenkin saturoituvien prosessien yhtälöt, merkittävimmin samanlainen kuin Langmuir in yhtälö, joka kuvaa aineen absorptiota kiinteän faasin pintaan Jos [S] = K M, V= ½ V max. K M on siis substraattikonsentraatio, jolla reaktionopeus on puolet maksimista. Jos Michaelis-Menten kaavassa molemmista puolista otetaan käänteisarvo saadaan Lineweaver-Burk in kaava: 40

41 Tämän kaavan merkitys on siinä, että jos Michaelis-Menten kinetiikkaa noudattavalla entsyymillä mitataan reaktionopeuksia eri substraattikonsentraatioilla, ja piirretään kuvaaja, jossa X-akselilla on 1/[S] ja Y-akselilla 1/V, saadaan suora, joka leikkaa Y-akselin kohdassa 1/V max ja X- akselin kohdassa -1/K M : (Käytännössä Lineweaver-Burk in kuvaaja ei ole paras mahdollinen entsyymin kineettisten parametrien määrittämiseen; suositeltavampaa on käyttää Eadie- ofstee n tai anes in kuvaajia.) Jos k 3 on paljon pienempi kuin k 2 (kuten usein on) K M on ~ ES-kompleksin dissosiaatiovakio. Se kuvaa siis substraatin sitoutumisen lujuutta aktiiviseen keskukseen. Jos määritellään yksinkertaisen entsyymin tapauksessa vakio k cat =V max /E T saadaan luku, joka kertoo kuinka monta substraattimolekyyliä yksi entsyymimolekyyli muuttaa aikayksikössä (turnover number). Tyypillinen k cat on esim. 1000/s. Jos halutaan verrata kahden entsyymin katalyyttistä tehokkuutta, käyttökelpoinen suure on suhde k cat /K M, jota toisinaan kutsutaan spesifisyysvakioksi (specificity constant). Parhaiden entsyymien k cat /K M suhde on n M -1 s -1, jolloin rajoittavana tekijänä on substraattimolekyylien diffuusio. Monisubstraattiset entsyymit Kun entsyymi katalysoi useamman, kuin yhden molekyylin (yleensä kahden) keskinäistä reaktioita, tilanne on paljon monimutkaisempi. a) Reaktiossa syntyy ternäärikompleksi (molemmat substraatit sitoutuneet yhtä aikaa entsyymiin) -substraatit voivat liittyä mielivaltaisessa järjestyksessä -substraattien on liityttävä määrätyssä järjestyksessä 41

42 b) Reaktiossa ei synny ternäärikompleksia -ensimmäinen substraatti modifioi entsyymiä, joka sitten modifioi toista substraattia -ping-pong mekanismi Jos piirretään Lineweaver-Burk in kuvaajat eri substraattikonsentraatioilla, voidaan a) ja b) erottaa toisistaan. Entsyymi-inhibitio ja kinetiikka Monet molekyylit inhiboivat entsyymien aktiivisuutta. Tällainen inhibitio voi olla fysiologista (esim. metaboliateiden säätelyyn liittyvää) epäfysiologista (lääkeaineet, myrkyt) Inhibitio voi olla irreversiibeliä tai reversiibeliä Irreversiibeli inhibitio perustuu siihen, että inhibiittori sitoutuu entsyymiin hyvin tiukasti, joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti. Esimerkkinä seriinientsyymejä inaktivoiva di-isopropyylifluorofosfaatti, DIPF Reversiibeli inhibitio merkitsee sitä, että inhibiittori myös dissosioituu entsyymistä nopeasti. Kompetitiivinen (kilpaileva) inhibitio merkitsee, että inhibiittori sitoutuu aktiiviseen keskukseen siten, että se estää substraatin sitoutumisen samanaikaisesti. Tällaiset inhibiittorit ovat tyypillisesti substraattia rakenteeltaan muistuttavia molekyylejä Unkompetitiivinen inhibitio merkitsee sitä, että inhibiittori ja substraatti voivat sitoutua entsyymiin samanaikaisesti, mutta entsyymi, johon on sitoutunut inhibiittori, on katalyyttisesti inaktiivinen Kun piirretään Lineweaver-Burk -kuvaajat eri inhibiittorikonsentraatioiden läsnäollessa saadaan normaalisti selville inhibition tyyppi ja inhibitiovakio, eli inhibiittorin sitoutumisvakio entsyymiin. Kun inhibiittori voi olla esim. potentiaalinen lääkeaine, inhibitiovakion selvittäminen on tärkeä tieto lääkekehityksessä. Entsyymiaktiivisuus riippuu p:sta Kun sekä substraatin sitomiseen, että katalyysiin, osallistuu ionisoituvia ryhmiä, ei ole yllättävää, että entsyymit toimivat optimaalisesti vain tietyllä palueella. Aktiivisuus-p käyrä antaa myös vihjeitä siitä, millaiset ryhmät osallistuvat katalyysiin. 42

43 Esimerkkejä entsyymireaktioista Kymotrypsiini Kymotrypsiini on proteaasi, ruuansulatusentsyymi (M=25 000) Proteiini syntetisoidaan yhtenä ketjuna, entsymaattisesti inaktiivisena kymotrypsinogeeninä, josta proteolyyttisesti syntyy aktiivinen entsyymi (zymogeeniaktivaatio) Proteiinin rakenne koostuu pääasiassa β-levystä Kymotrypsiini katalysoi proteiinien hydrolyysiä aromaattisten ja suuren hydrofobisen sivuketjun omaavien aminohappojen karboksipuolelta Kymotrypsiini toimii myös esteraasina hydrolysoiden erilaisia estereitä Kovalenttinen välituote Jos kymotrypsiinillä hydrolysoidaan kromogeenistä (värillistä yhdistettä tuottavaa) esteriä, esim p-nitrofenyyliasetaattia, havaitaan että reaktio etenee aluksi lyhyen aikaa nopeasti (burst phase), mutta vakiintuu sitten hitaammalle tasolle Ilmiö johtuu siitä, että reaktiossa muodostuu kovalenttisesti sitoutunut välituote, jonka hydrolyysi on reaktion nopeutta rajoittava vaihe, mutta esterin alkoholiosaa (jota mitataan) vapautuu aluksi nopeammin, kunnes lähes kaikki entsyymi on asyloitu, ja saavutetaan vakaa tila (steady state) E+S ES E - P 2 E P 1 P 2 Asyloitu entsyymi voidaan eristää, jolloin havaitaan asyyliryhmän olevan esteröityneenä Ser-195:een Samaan, poikkeuksellisen reaktiiviseen seriiniin liittyy myös esim. proteaasinestäjä di-isopropyylifluorofosfaatti DIPF; kymotrypsiinissä on 27 seriiniä, mutta vain tämä reagoi DIPF inhiboi myös trypsiiniä, elastaasia, trombiinia, subtilisiinia (seriiniproteaaseja) ja asetyylikolinesteraasia (=> hermokaasuvaikutus) Katalyyttinen triadi Seriini on normaalisti ei-reaktiivinen aminohappo, mutta seriiniproteaaseissa seriinin, histidiinin ja asparagiinihapon muodostama katalyyttinen triadi tekee sen poikkeuksellisen aktiiviseksi istidiini pystyy ottamaan vastaan seriinin hydroksyylivedyn vetyionina, jolloin happi pystyy toimimaan voimakkaana nukleofiilinä Aspartaatin negatiivinen varaus stabiloi näin syntyneen histidiinin positiivisen varauksen 43

44 O C 2 Ser195 N N -O C O C 2 C 2 is57 Asp102 Entsyymin seriinin asylaatio ja deasylaatio istidiinin vastaanottaessa seriinin protonin, seriini hyökkää nukleofiilinä peptidisidoksen karbonyylihiileen Syntyy lyhytikäinen negatiivisesti varautunut välituote, jota stabiloi entsyymissä oleva ns. oxyanion hole N-terminaalinen peptidi irtoaa entsyymistä, ja C-terminaalinen osa jää esterisidokseen Ser195:een Seuraavaksi vesimolekyyli hyökkää nukleofiilisesti karbonyylihiileen, ja lopputuloksena C-terminaalinen peptidi hydrolysoituu irti entsyymistä. eksokinaasi eksokinaasi katalysoi reaktiota: C 2 O O Mg 2+. ATP + O Mg 2+. ADP + O O O O C 2 OPO2-3 O O O O Periaatteessa fosfaattiryhmän siirto glukoosin C-6 hydroksyyliin on samanlainen reaktio, kuin fosfaattiryhmän siirto vedelle so. hydrolyysi. eksokinaasi fosforyloi kuitenkin 10 6 kertaa tehokkaammin glukoosia, kuin vettä. eksokinaasin konformaatio muuttuu sen sitoessa glukoosin (induced fit) ja ATP:n. ATP:n ja veden sitoutuessa tätä konformaatiomuutosta ei tapahdu, aktiivinen keskus ei muodostu, eikä fosfaatin siirtoa vedelle tapahdu. 44

45 Jos glukoosi korvataan stereokemiallisesti samanlaisella, mutta ilman 6-hiiltä olevalla xyloosilla, heksokinaasi alkaa hydrolysoida ATP:tä, koska xyloosi yhdessä ATP:n kanssa muuttaa entsyymin aktiiviseen konformaatioon, mutta ei ole fosforyloitavissa Enolaasi Enolaasi on yksi glykolyysin entsyymeistä (kuten heksokinaasikin), ja katalysoi 2-fosfoglyseraatin dehydraatiota fosfoenolipyruvaatiksi: O - O C C O PO 2-3 O C 2 O - O C C O PO2-3 C O Enolaasissa on aktiivisessa keskuksessa kaksi Mg 2+ -ionia, jotka polarisoivat molekyyliä sitoutumalla karboksyyliryhmään. Lys345 vastaanottaa protonin molekyylin 2-hiileltä ja Glu211 luovuttaa protonin poistuvalle vesimolekyylille. Säädellyt ensyymit Aineenvaihduntateiden säätelyyn osallistuu entsyymejä, joiden aktiivisuus riippuu toisten molekyylien konsentraatioista. Yleensä kyseessä ovat tällöin allosteeriset entsyymit 45

46 Allosteeriset entsyymit ovat keskeisessä asemassa metabolian säätelyssä; entsyymissä on esim. reaktioketjun lopputuotteelle sitoutumiskohta, johon sitoutuminen muuttaa entsyymin katalyyttisesti inaktiiviseen tilaan. Sitoutumiskohta on erillään aktiivisesta keskuksesta. Biosynteesireaktioiden ensimmäistä vaihetta katalysoiva entsyymi on usein lopputuotteen inhiboima Inhibitio on reversiibeli, turvaa nopean uudelleen käynnistyksen Yleinen esim. aminohappojen biosynteesin säätelyssä Allosteeriset entsyymit eivät noudata Michaelis-Menten -kinetiikkaa, vaan reaktionopeuden riippuvuus substraattikonsentraatiosta on yleensä sigmoidaalinen. Substraatin sitoutuminen entsyymiin on ko-operatiivista. Entsyymien kovalenttinen modifikaatio säätelykeinona Lukuisien proteiinien aktiivisuutta säädellään reversiibelin fosforylaation avulla. Sekä fosforylaatio -fosfaattiryhmän siirto kinaasin toimesta ATP:ltä- että fosforylaation poisto -hydrolyysi fosfataasin toimesta- ovat solun olosuhteissa irreversiibelejä rektioita. Fosforyyliryhmä lisää proteiiniin kaksi negatiivista varausta, jotka mahdollistavat elektrostaattisten vuorovaikutusten muodostumisen Fosforyyliryhmä pystyy muodostamaan 3 vetysidosta Fosforylaatio ja defosforylaatio voivat olla äärimmäisen nopeita tai hitaita reaktioita Fosforylaatioon voi liittyä suuri vahvistus, koska yksi ainoa aktivoitunut proteiinikinaasi voi fosforyloida satoja kohdeproteiineja lyhyessä ajassa Kinaaseja on sekä erittäin spesifisiä että epäspesifisiä Proteolyyttinen aktivointi Monet entsyymit syntetisoidaan inaktiivisina prekursoreina, joista syntyy aktiivinen entsyymi vasta, kun niistä on katkaistu spesifisesti yksi tai useampi peptidisidos. Tällaista prekursoria nimitetään zymogeeniksi tai proentsyymiksi, ja tällaista ilmiötä zymogeeniaktivaatioksi. 1. Ruuansulatuksen proteaasit syntetisoidaan zymogeeneina mahalaukussa ja haimassa 2. Veren hyytyminen perustuu toisiaan kaskadina aktivoiviin proteaasizymogeeneihin 3. Eräät proteiinihormonit, kuten insuliini, ovat proteolyyttisen prosessoinnin tuotteita 46

47 4. Kuitumainen kollageeni syntyy zymogeeniaktivaation kautta liukoisesta prokollageenista 5. Yksilönkehitykseen kuuluu usein proteolyyttisten prosessien aktivoimia vaiheita; esim. sammakon muodonvaihdoksessa prokollagenaasi aktivoidaan kollagenaasiksi, joka hajottaa hännän kollageenikuidut. Kymotrypsinogeeni Kymotrypsiini syntetisoidaan haimassa kymotrypsinogeeninä. Proteiini eritetään solun sisällä oleviin membraanin ympäröimiin rakkuloihin, zymogeenigranuloihin, jotka hormonaalisen vaikutuksen seurauksena tyhjentävät sisältönsä haimatiehyeeseen. Trypsiini katkaisee aminohappojen 15 ja 16 välillä olevan sidoksen, jolloin syntyy entsymaattisesti aktiivinen π-kymotrypsiini. Kymotrypsiini itse poistaa vielä aminohapot ja , jolloin syntyy aktiivinen α-kymotrypsiini. Kymotrypsiinin aktiivisen keskuksen lopullinen konformaatio syntyy vasta zymogeeniaktivaation seurauksena. Ruuansulatusentsyymien aktivaatio Trypsiini aktivoi muut haiman ruuansulatusproteaasit; trypsiinin, kymotrypsiinin, elastaasin ja karboksipeptidaasin Ohutsuolen tuottama enteropeptidaasi aktivoi ketjun alkuunpääsemiseksi tarvittavan trypsiinin, joka sitten aktivoi lisää trypsiiniä, ja muita entsyymejä Pepsiini aktivoi itse itsensä alhaisessa p:ssa. 9. iilihydraatit monosakkaridit disakkaridit - oligosakkaridit polysakkaridit Monosakkaridit (C 2 O) 3-7 aldoosit (C=O ryhmä ketjun päässä) vs ketoosit (C=O ryhmä useimmiten hiilessä 2) heksoosit (6 hiiltä) vs. pentoosit (5 hiiltä) pyranoosit (6-rengas) vs furanoosit (5-rengas) Yksinkertaisin monosakkaridi on glyseraldehydi. 2-hiili on kiraalinen, joten on olemassa D- ja L-glyseraldehydi: 47

48 D-glyseraldehydi Fischerin projektio O C C O C 2 O Perspektiivikuva O C C O C 2 O L-glyseraldehydi O O C C C 2 O O C O C C 2 O Muut monosakkaridit nimetään niin, että jos karbonyylihiilestä kauimpana olevan hiilen konfiguraatio on sama, kuin D-glyseraldehydissä, molekyyli on D-sarjaa, ja päinvastainen konfiguraatio L-sarjaa. Fischerin projektiossa D-sarjassa hydroksyyli on oikealla. Muiden hiilien konfiguraatio määrää monosakkaridin nimen. Näin ollen on olemassa kaksi neljähiilistä (tetroosia) aldoosia (ja molemmista D- ja L- muodot), neljä viisihiilistä (pentoosia), 8 kuusihiilistä (heksoosia) Ketooseissa on yksi kiraalinen hiili vähemmän. Kaksi monosakkaridia, jotka eroavat vain yhden hiilen konfiguraation suhteen, ovat toistensa epimeerejä. Sykliset rakenteet Useimmat monosakkaridit ovat enimmäkseen rengasmuodossa, joka syntyy molekyylin karbonyyliryhmän reagoidessa saman molekyylin jonkin hydroksyyliryhmän kanssa, jolloin muodostuu hemiasetaali tai hemiketaali. Riippuen siitä, minkä hydroksyylin kanssa reaktio tapahtuu, muodostuu viisirengas (furanoosi) tai kuusirengas (pyranoosi), joista kuusirengas on stabiilimpi. Rengasrakenteen muodostuessa syntyy yksi kiraalinen keskus lisää (anomeerinen hiili); muodostuu kaksi stereoisomeeriä α ja β, jotka pystyvät muuttumaan toisikseen avoketjuisen muodon kautta. 48

49 yleisin glukoosi: C 6 12 O 6 CO O C C O C C O O C 2 O O C 2 O O O O O aworthin kaavio Kuusirengas on todellisuudessa ei-tasomainen, tavallisesti tuolikonformaatiossa, jolloin substituentit ovat aksiaalisia tai ekvatoriaalisia. Tavallisimpia monosakkarideja: glukoosi on aldoheksoosi fruktoosi on ketoheksoosi riboosi on aldopentoosi Monosakkaridien johdannaiset Aminosokerit ja niiden johdannaiset Deoksisokerit Sokerihapot (esim glukonihappo ja glukuronihappo) Fosforyloidut sokerit Pelkistävät sokerit Monosakkaridit ja sellaiset polysakkaridit, joissa on vapaa 1-hiili voivat hapettua vastaaviksi karboksyylihapoiksi. (Esim. Fehlingin reaktio) Glykosidisidos emiasetaalin muodostumisen jälkeen muodostunut hydroksyyliryhmä voi reagoida toisen hydroksyylin kanssa, jolloin eliminoituu vesi, ja muodostuu asetaali. Asetaalin muodostuessa anomeerisen hiilen α tai β konfiguraatio jää pysyväksi (avoketjuinen muoto ei mahdollinen). Jos molekyylissä on jonkin sakkaridiyksikön anomeerinen hiili on vapaana, on kyseessä pelkistävä sokeri. Disakkaridit esim. sakkaroosi. C O 11 49

50 C 2 O O O O O O C 2 O O O O C 2 O β-d-fruktofuranosyyli(β2 1α)α-D-glukopyranosidi Koska sakkaroosissa anomeeriset hiilet ovat reagoineet keskenään, kyseessä ei ole pelkistävä sokeri. Polysakkaridit eli glykaanit ovat monosakkaridien muodostamia polymeerejä Polysakkaridit voivat koostua samanlaisista (homopolysakkaridit) tai erilaisista (heteropolysakkaridit) sakkaridiyksiköistä. Ketjut voivat olla suoria tai haaroittuneita. Polysakkaridien koko vaihtelee. Ominaisuudet riippuvat yksiköiden tyypistä, määrästä ja sitoutumistavasta. Tärkkelys ja glykogeeni Tärkkelys ja glykogeeni ovat periaatteessa samanlaisia (α1 4) glukoosipolymeerejä. Tärkkelystä on kasveissa, sitä on kahta tyyppiä Amyloosi koostuu pitkistä, haaroittumattomista ketjuista (muodostaa spiraalin) Amylopektiini on haaroittunutta; glukoosiyksikön välein on (α1 6) sidoksellinen haarakohta Glykogeeniä on eläimissä maksassa ja lihaksissa (α1 6) haaroja 8-12 yksikön välein Molekyylissä vain yksi pelkistävä pää, mutta useita ei-pelkistäviä päitä Molekyyliä hajotetaan ei-pelkistävistä päistä. Selluloosa ja kitiini Selluloosa on myös polyglukoosia, mutta sillä on aivan erilaiset ominaisuudet Yksiköiden väliset sidokset (β1 4) sidoksia 50

51 Yksiköiden välille muodostuu runsaasti vetysidoksia, jotka tekevät molekyylistä liukenemattoman. Selluloosa on massaltaan yleisin biomolekyyli. Vain eräät mikrobit pystyvät tuottamaan selluloosaa hajottavaa entsyymiä sellulaasia, kun taas tärkkelyksen ja glykogeenin hajotuskyky on erittäin yleinen. yönteisten tukirangan kitiini on N-asetyyli-D-glukosamiinin (β1 4) polymeeri. Kuten selluloosa, se on lujaa, liukenematonta ja vaikeasti hajotettavaa. Bakteerien soluseinän peptidoglykaanit Bakteerien soluseinän runkona on polysakkaridi, jossa on vuorotellen N- asetyyliglukosamiini- ja N-asetyylimuramiinihappoyksiköitä (β1 4)-sidoksilla liitettynä. Polysakkaridiketjuja yhdistää peptidiketju, jossa on myös D-aminohappoja. Gram+ ja Gram- -bakteereilla peptidiketjun rakenteessa on eroa. Soluväliaineen glykosaminoglykaanit Solujen välissä olevassa tilassa on soluväliainetta extracellular matrix tarjoten soluille kiinnittymispinnan. Soluväliaine koostuu kuitumaisista proteiineista (kollageeni, elastiini, fibronektiini ja laminiini y.m.) sekä polysakkarideista Glykosaminoglykaanit koostuvat toistuvista disakkaridiyksiköistä, joissa toinen sokeri on N-asetyyliglukosamiini tai N-asetyyligalaktosamiini. Glykosaminoglykaanit liittyvät solunulkoisiin proteiineihin muodostaen proteoglykaaneja. Esim. silmän lasiaisessa ja nivelnesteessä on molekyylipainoltaan yli 10 6 daltonin hyaluronihappoa, joka koostuu glukuronihaposta ja N- asetyyliglukosamiinista. Muut glykosaminoglykaanit ovat pienimolekyylisempiä, ja kovalenttisesti kiinnittyneitä proteiineihin (kondroitiinisulfaatti, kerataanisulfaatti, dermataanisulfaatti, hepariini ) Glykokonjugaatit Ravintovarasto- ja rakenteellisten tehtäviensä ohella poly- ja oligosakkaridit toimivat eräänlaisina molekylaarisina tunnuslippuina, jotka tunnistetaan mm. solujen välisissä vuorovaikutuksissa, proteiinien ohjaamisessa oikeaan kohteeseen, veren hyytymisessä, immuunivasteessa, haavojen paranemisessa 51

52 Tällöin sakkaridiyksikkö on yleensä kovalenttisesti kiinnittynyt toiseen molekyyliin (glykokonjugaatti). Proteoglykaaneissa glykosaminoglykaani (ks. ed.) on kovalenttisesti liittyneenä erittyvään proteiiniin tai kalvoproteiiniin. Glykosaminoglykaani käsittää yhdistelmästä suurimman osan, ja proteoglykaanit ovat yleensä rakenteellisia osia. Glykoproteiineissa proteiiniin on kiinnittyneenä yksi tai useampi oligosakkaridi, jonka toiset proteiinit voivat tunnistaa. Glykolipideissä vastaavasti solukalvon lipideihin on liittyneenä oligosakkaridi. Proteoglykaanit Tyypillisessä proteoglykaanissa on ydinproteiini, johon glykosaminoglykaani liittyy. Ns. tyvikalvon (basal lamina) daltonin ydinproteiiniin liittyy useita kovalenttisesti kiinnittyneitä heparaanisulfaattiketjuja (hepariinia muistuttava, mutta vähemmän sulfaattiestereitä sisältävä glykaani). Jotkut proteoglykaanit muodostavat valtavia aggregaatteja. yaluronihappomolekyyliin voi tarttua esim. sata aggrekaani-proteiinia (MW = ), joista kuhukin on liittynyt kondroitiinisulfaatti- ja kerataanisulfaattiketjuja. Koko yhdistelmän koko voi olla 2 x 10 8 daltonia. Kuitumaiset proteiinit ja proteoglykaanit muodostavat verkkomaisen rakenteen, joka antaa kudoksille lujuutta ja joustavuutta. Glykoproteiinit Glykosylaatio liittyy seriinien ja treoniinien hydroksyyleihin (O-linked) tai asparagiinien amidityppeen (N-linked). Oligosakkarideja liittyy proteiiniin esim. 1-16; hiilihydraattia on proteiinin kokonaismassasta 1-70% Glykoforiini on erytrosyyttien (punasolujen) solukalvossa oleva integraalinen kalvoproteiini, johon kuuluu huomattava määrä glykosylaatiota; 60% glykoproteiinin massasta on hiilihydraattia. Glykoforiini kulkee solukalvon läpi: kalvon läpäisevän osan muodostaa yksi hydrofobinen α-heliksi. N-terminaalinen osa on solun ulkopuolella, ja sisältää n. 100 sokeriyksikköä 16 ketjussa, joista 15 on O-linkattuja ja 1 N-linkattu. Kalvoproteiinit ja erittyvät proteiinit ovat hyvin usein glykoproteiineja. Glykosylaatio todennäköisesti vaikuttaa proteiinin liukoisuusominaisuuksiin. Todennäköisesti glykosylaatio myös vaikuttaa siihen, miten glykoproteiini vuorovaikuttaa muiden proteiinien kanssa, mutta tätä ei tunneta kovin hyvin. 52

53 Glykolipidit Myös eräissä kalvolipideissä on kovalenttisesti kiinnittyneitä hiilihydraattiryhmiä. Gangliosideissä on monimutkainen, sialihappoa sisältävä glykosylaatio. Gram-negatiivisten bakteerien lipopolysakkaridi (LPS) suojaa bakteeria immuunijärjestelmältä (ja on antibodien tärkein maali). LPS on toksista eläimille, ja osaltaan pahentaa gram - -infektioiden oireita. Lektiinien ja oligosakkaridien vuorovaikutukset Lektiinit ovat proteiineja, jotka sitoutuvat spesifisesti tiettyihin hiilihydraatteihin. Lektiinit osallistuvat lukuisiin solujen välisiin tunnistus- ja tarttumisilmiöihin. Esim. kuparia kuljettavan seruloplasmiini-proteiinin glykosylaatiossa uloimpana on sialihapporyhmä. Sialidaasi-niminen entsyymi poistaa tämän ryhmän vanhoista proteiineista, jolloin maksasolujen asialoglykoproteiinireseptorit (lektiinit) sitoutuvat niihin, ja ne otetaan maksasoluun hajotettavaksi. Selektiinit ovat solukalvoissa esiintyviä lektiinejä, jotka välittävät solujen välisiä tunnistusprosesseja. Esim. P, E ja L selektiinit osallistuvat T-solujen tunkeutumiseen kapillaarien seinämän läpi tulehdusreaktion yhteydessä. Myös monet patogeenit tarttuvat lektiineillä solunpinnan hiilihydraatteihin, esim. mahahaavan aiheuttaja elicobacter pylori, influenssavirus, koleratoksiini ja hinkuyskätoksiini. 10. Nukleotidit ja nukleiinihapot Nukleotidien tehtävät 1) Nukleiinihappojen (DNA, RNA) rakenneosia 2) Energiansiirrossa, ATP, GTP (UTP ja CTP) korkeaenergiset sidokset 3) Entsyymien kofaktorien osina Aktiivisten ryhmien siirto biokemiallisissa reaktioissa 4) Signaalimolekyyleinä Syklinen AMP, camp Nukleotidit koostuvat Typpipitoisesta, rengasrakenteisesta emäksestä Pentoosisokerista 53

54 Fosfaattiryhmästä emäkset: puriinit: adeniini, A tai guaniini, G N 2 O N N N N N N 2 N N N A G pyrimidiinit: sytosiini, C, tymiini, T tai urasiili, U N 2 O O N N C 3 N O N O N O N C T U Nimeäminen Emäs Nukleosidi Nukleotidi Emäs + sokeri Emäs + sokeri + fosfaatteja Adeniini Adenosiini Adenylaatti adenosiinimonofosfaatti, AMP 54

55 AMP N 2 N N O O P O O C 2 O N N O O Deoksi-AMP (damp) N 2 N N O O P O O C 2 O N N O Nukleiinihapoissa fosfodiesterisidos yhdistää peräkkäisten nukleotidien 5 ja 3 hiilet 55

56 O C 2 5' O Base { O O P O O 3' C 2 O Base { O O P O O C 2 O Base { O O P O O Nukleotidijärjestys ilmoitetaan alkaen siitä nukleotidistä, jossa on vapaa 5 ryhmä (5 3 ) Yleensä riittää ilmoittaa emästen tunnuskirjaimet (ACGT). Fosfodiesterisidokset voivat hydrolysoitua erityisesti happamissa tai emäksisissä olosuhteissa. Ribonukleiinihappo on herkkä hydrolysoitumaan emäksisissä olosuhteissa reaktiossa, jossa välituotteena esiintyy 2,3 - syklinen monofosfaatti. DNA on paljon vaikeammin hydrolysoituva, koska 2 - hydroksyylin puuttuminen estää tämän välituotteen syntymisen. Oligonukleotidi polynukleotidi Emästen ominaisuuksien vaikutus nukleiinihappojen ominaisuuksiin Nukleiinihappoemäkset absorboivat UV-valoa siten, että absorptiomaksimi nukleiinihapoilla on n. 260 nm (vrt. proteiineilla 280 nm) Emäkset ovat hydrofobisia, ja aromaattisina rakenteina ne sitoutuvat jossain määrin päällekkäin (stacking interaction) Emäkset pystyvät muodostamaan vetysidoksia, ja parit A-T ja G-C muodostavat ns. Watson-Crick emäsparit. 56

57 A=T G C Nukleiinihappojen rakenne avainnot ennen DNA:n rakenteen keksimistä Avery, MacLeod ja McCarty osoittivat, että puhdistettu DNA pystyy muuttamaan ei-virulentin Streptococcus pneumoniae kannan virulentiksi; käsittely DNAasilla, DNA:ta pilkkovalla entsyymillä, hävitti tämän kyvyn. ershey ja Chase osoittivat, että bakteriofagin (bakteereja infektoivan viruksen) kiinnittyessä soluun ainoastaan DNA, ei proteiini, tunkeutuu infektoituvaan soluun. Chargaff tutki eri DNA:iden emäskoostumuksia, ja havaitsi Chargaff in säännöt : 1) Eri lajien emäskoostumus on yleensä erilainen 2) Saman eliön eri kudoksissa on samanlainen emäskoostumus 3) Ikä, ravinto tai ympäristö ei vaikuta eliön DNA:n emäskoostumukseen 4) Kaikissa DNA-näytteissä adeniinin määrä on yhtä suuri, kuin tymiinin; samoin guaniinin sama kuin sytosiinin Franklin ja Wilkins osoittivat röntgensädediffraktiolla, että DNA on rakenteeltaan kierteinen, ja rakenteessa on kaksi jaksollisuutta; 3.4 Å ja 34 Å. 57

58 Watsonin ja Crickin malli Watson ja Crick kehittivät ennenkaikkea Chargaffin, Franklinin ja Wilkinsin tulosten perusteella DNA:n kaksoiskierremallin: Siinä kaksi vastakkaissuuntaista (antiparalleelia) polynukleotidiketjua kiertyy toistensä ympäri siten, että emäkset ovat keskellä. Emäkset ovat aina pareittain siten, että A pariutuu T:n kanssa ja G C:n kanssa (Chargaffin 4. sääntö). Spesifiset vetysidokset voivat muodostua vain oikeiden, eli komplementaaristen emäsparien välille. Emästen pinoutumisesta päällekkäin seuraa havaittu 3.4 Å jaksollisuus; 34 Å jaksollisuus vastaa kierteen nousua. Fosfodiesteriketjujen väliin jää kaksi kierteistä uraa, joista käytetään nimitystä major groove ja minor groove. Uriin sitoutuvat proteiinit pystyvät tunnistamaan tietyn emäsjärjestyksen kaksoiskierrettä avaamatta. ( Rakenteesta voi päätellä, että sen voi replikoida helposti erottamalla vastinnauhat toisistaan, ja syntetisoimalla kummallekin uuden vastinnauhan (ns. semikonservatiivinen replikaatiomalli). DNA:n kolmiulotteisen rakenteen vaihtelu Watsonin ja Crickin malli tunnetaan nykyään DNA:n B-muotona, ja se vastaa parhaiten satunnaisen DNA:n rakennetta fysiologisissa olosuhteissa. A-muoto vallitsee vedettömissä olosuhteissa; siinä emäkset ovat kallistuneet kierteen akselin suhteen, ja se on muutenkin kompaktimpi. Vasenkätinen Z-DNA ilmeisesti esiintyy luonnossa eräissä säätelysekvensseissä. Vuorottelevat puriinit ja pyrimidiinit, erityisesti 58

59 vuorottelevat G:t ja C:t suosivat sen syntymistä. A-DNA Z-DNA Epätavalliset DNA-rakenteet DNA:ssa esiintyy epätavallisia rakenteita, joista osalla on biologista merkitystä. Poly-A-sekvenssit aikaansaavat DNA-ketjun taipumista Palindromiset sekvenssit saattavat ottaa cruciform rakenteen Watson-Crick emäspari voi sitoa vetysidoksilla kolmannen emäksen, jolloin muodostuu oogsteenin pari. Tällöin voi muodostua kolmisäikeinen DNAmolekyyli. Neljä hyvin guanosiinirikasta DNA-ketjua voi muodostaa nelisäikeisen DNAmolekyylin. Messenger-RNA (mrna) Vastaavalla tavalla, kuin DNA replikoituu, voidaan DNA-nauhalle valmistaa komplementaarinen RNA. RNA-molekyyliä, jonka emäsjärjestys käännetään (transloidaan) proteiinin aminohappojärjestykseksi, nimitetään messenger- RNA:ksi. Prokaryoottien mrna voi olla monokistroninen (koodaa vai yhtä polypeptidiä) tai polykistroninen. 59

60 RNA:n kolmiulotteinen rakenne RNA on yksinauhaista. Emäsjärjestyksestä riippuen komplementaariset jaksot voivat liittyä yhteen muodostaen kaksoiskierteisiä jaksoja. Näiden yhdistelminä voi syntyä hyvin monimutkaisia kolmiulotteisia rakenteita. Kaksoiskierteet RNA:ssa ovat A-muotoa; riboosin 2-hydroksyyli estää B- muodon syntymisen. Samoin kuin proteiineilla, järjestys määrää kolmiulotteisen rakenteen, ja joillain RNA-molekyyleillä on katalyyttisiä ominaisuuksia ( ribotsyymit ). (RNA-maailmahypoteesi) Nukleiinihappokemiaa Kaksinauhainen DNA ja RNA voidaan denaturoida Kaksinauhaisia nukleiinihappomolekyylejä pitävät yhdessä ei-kovalenttiset voimat, ja samoin kuin proteiinit, nauhat voidaan erottaa (denaturoida) kuumentamalla, ääri-p:ssa ym. Koska GC-pareja pitää yhdessä kolme vetysidosta AT-parien kahden asemasta, on DNA sitä vaikeampi denaturoida, mitä enemmän siinä on G:tä ja C:tä. Lämmitettäessä DNA-liuosta denaturaatio voidaan havaita siitä, että valon absorptio 260 nm:ssä kasvaa jyrkästi. Näin saadun sulamispisteen perusteella voidaan laskea DNA:n GC-pitoisuus. ybridisaatio Sopivissa olosuhteissa denaturoituneet DNA-nauhat liittyvät uudelleen yhteen. Yhteenliittyminen tapahtuu myös silloin, kun emäsjärjestyksissä on pieniä eroja, joten pystytään esim. arvioimaan eri eliöiden DNA:n samankaltaisuutta. Jos DNA-nauha (koetin, probe) leimataan esim. radioisotoopilla tai fluoresoivalla kemikaalilla, ja kohde-dna sidotaan kiinteään kantajaan, voidaan komplementaarinen DNA havaita spesifisesti. Tämä on perustana useille DNA:n havaitsemistekniikoille. Nukleiinihappoja vahingoittavat reaktiot Nukleiinihapoilla on useita hitaita reaktioita, jotka saattavat johtaa emäsjärjestyksen muutoksiin eli mutaatioihin. Elävässä solussa on jatkuvasti toiminnassa entsymaattisia korjausreaktioita, jotka pyrkivät korjaamaan näiden reaktioiden vaikutukset. 60

61 Sytosiini voi deaminoitua, jolloin siitä tulee urasiili. DNA:ssa urasiilin paikalla on tymiini, jolloin DNA:sta löytyvä urasiili voidaan virheellisenä poistaa ja korvata sytosiinillä. DNA:n puriininukleotideistä voi irrota emäs, erityisesti happamassa p:ssa (~3). UV-säteily voi aihettaa vierekkäisten tymiinien liittymisen yhteen kovalenttisesti. Samalla DNA:n rakenteeseen tulee mutka (jonka perusteella korjausentsyymien on helppo havaita tymiinidimeeri ja poistaa se ). Deaminaatioreaktioita edistävät kemikaalit tai alkyloivat kemikaalit voivat muuttaa emäksiä sellaisiksi, että ne eivät enää pariudu normaalisti, jolloin replikaation yhteydessä syntyy mutaatio. Myös reaktiiviset hapen muodot vahingoittavat DNA:ta aiheuttaen mutaatioita. Yleensä mutaatioita aiheuttavat kemikaalit tai vaikutukset lisäävät syövän riskiä. Metyloidut emäkset Erityiset entsyymit metyloivat spesifisiä emäksiä DNA:ssa. Bakteereilla metylaatio liittyy suojautumiseen bakteriofageja vastaan (oma DNA on metyloitu, vieras ei, joten se tiedetään hajottaa.) Miten DNA:n nukleotidisekvenssi määrää proteiinin aminohapposekvenssin DNA ja proteiini muodostuvat alayksiköiden lineaarisista sekvensseistä. DNA:n nukleotidien järjestys vastaa proteiinin aminohappojärjestystä eli sekvenssit ovat kolineaarisia Miten aminohappojärjestys ohjautuu? DNA-transkriptio; vastaa tapahtumana replikaatiota eli syntetisoidaan uutta polynukleotidinauhaa mallin mukaisesti, mutta muodostuva nauha on RNA:ta muodostuva RNA-nauha (messenger RNA eli mrna) syntetisoidaan koodaavalta alueelta, eli geeni transkriptoidaan RNA:ssa geneettinen informaatio säilyy eli emäsjärjestys on komplementaarinen mallinauhalle ja vastakkaisnauhan kanssa (+ strand) identtinen Muodostunut RNA ei emäspariudu vastinnauhan (DNA-juoste) kanssa vaan DNA kaksoisheliksi sulkeutuu takaisin emäspariutumisella. 61

62 -> RNA-molekyylit ovat 1-nauhaisia RNA-nauha on myös selvästi lyhyempi; DNA-ketjussa on tuhansia geenejä, jotka transkriptoidaan mrna:ksi Yhdestä aktiivisesta geenistä saadaan tuhansia RNA transkriptejä/solun jakautuminen Geenien transkriptiota säätelevät säätelyproteiinit. Muita RNA-molekyylejä: siirtäjä-rna (trna), ribosomaalinen RNA (rrna) Prokaryoottien DNA toimii mallina transkriptiossa muodostuvalle mrna:lle, joka edelleen muunnetaan vastaavaksi aminohappojärjestykseksi translaatiossa Translaatio on proteiinisynteesi, jossa mrna määrää kasvavan peptidiketjun aa-järjestyksen. Monimutkaista proteiinikoneistoa, joka suorittaa translaation, kutsutaan ribosomiksi. Eukaryoottien RNA:ta muokataan transkription jälkeen (ns. splicing). Eukaryooteilla geenien koodaavien alueiden (=eksonit) välissä on eikoodaavia alueita (=intronit). Intronien poisto tapahtuu splicing tapahtumana leikkaa-liimaa -periaatteella useiden RNA:ta prosessoivien entsyymien toimesta. Transkriptiossa muodostuneesta RNA-nauhasta käytetään nimitystä primääritranskripti, josta splicingilla saadaan mrna. Eukaryootilla replikaatio ja transkriptio tapahtuvat tumassa, translaatio sytoplasmassa. Splicingin tarkoitus? Geenit voidaan transloida eri proteiineiksi, koska splicing voi osua eri kohtiin primääritranskriptissä. Eksonit vastaavat usein proteiinien toiminnallisia osia. Koska rekombinaatio osuu todennäköisimmin introniin, ehjät eksonit rekombinoituvat. Geneettinen koodi -ohjeet, miten geenin nukleotidijärjestys transloidaan proteiinin aminohappojärjestykseksi * Nukleotidit luetaan tripletteinä, kolmen nukleotidin sarjassa = kodoni * Kodoni vastaa aina tiettyä aminohappoa * mrna:ssa 4 erilaista nukleotidia, jotka luetaan 3 jaksoissa eli 43 = 64 kodonia 62

63 * 20 aminohappoa proteiineissa, joten useampi kodoni /aa -> geneettinen koodi on degeneroitunut (degenerate, matemattinen termi, ei tarkoita rappeutunut ) * 3 kodonia on varattu translaation lopetukseen * koodi on konservoitunut joitain poikkeuksia lukuunottamatta (esim. mitokondriot) * RNA:sta 3 mahdollista tapaa lukea koodi (DNA:sta 6) = lukukehyksiä * yleensä vain yksi lukukehys saa aikaan toimivan proteiinin = avoin lukukehys (ORF, Open Reading Frame) * Lukukehyksen määrää translaation initiaatioproseesi, jossa etsitään oikea aloituskohta Yhteenveto: DNA(+) DNA(-) mrna(+) trna(-) aa-aa-aa-aa + DNA:n emäsjärjestyksen määrittäminen DNA:n emäsjärjestyksen määrittäminen on niin tehokasta, että esim. aminohapposekvenssitieto on nykyään useimmiten peräisin vastaavan geenin emäsjärjestyksestä. Määritykseen käytetään Maxam-Gilbertin tai nykyään useimmiten Sangerin menetelmää. Molemmat perustuvat siihen, että sekvenoitavasta DNA:sta tuotetaan joukko yksinauhaisia molekyylejä, jotka alkavat kaikki samasta kohtaa, ja loppuvat spesifisesti tiettyyn emäkseen. Maxam-Gilbertin menetelmässä päästään radioaktiivisesti leimattu DNA - molekyyli pilkotaan neljällä eri kemiallisella käsittelyllä, jotka pilkkovat DNA:n selektiivisesti tietyn emäksen kohdalta. Sangerin menetelmässä käytetään DNA:ta replikoivaa entsyymiä, DNApolymeraasia. Kun yksinauhaiseen DNA:han on hybridisoitunut komplementaarinen aluke (synteettisesti valmistettu oligonukleotidi), polymeraasi liittää uuden komplementaarisen nukleotidin aina molekyylin 3-63

64 päähän, kun entsyymille annetaan kaikkia neljää deoksinukleotiditrifosfaattia (dntp:tä). Kerrallaan yhtä nukleotideistä lisätään myös dideoksinukleotidina, jolta puuttuu 3 -hydroksyyli. Kun polymeraasi liittää tällaisen, se ei enää pysty jatkamaan ketjua. Muodostuu joukko DNA-molekyylejä, jotka ovat eri pituisia, mutta loppuvat kaikki tiettyyn emäkseen. Molekyylit voidaan erottaa pituusjärjestykseen elektroforeesilla. Kun kaikki neljä reaktiota fraktioidaan rinnakkain, voidaan DNA:n emäsjärjestys suoraan lukea geeliltä. Kerrallaan voidaan lukea n. 600 emästä. Isommat jaksot on pilkottava palasiksi (esim. restriktioentsyymeillä, tai kloonaamalla satunnaisesti pilkottuja DNA-jaksoja) Koko sekvenssi voidaan sitten koota päällekkäisyyksien avulla. Pisin DNA-molekyyli, jonka emäsjärjestys tunnetaan, on ihmisen kromosomi 14; emäsparia. DNA:n synteesi DNA:ta voidaan syntetisoida vastaavalla tavalla, kuin peptidejä Merrifieldin menetelmällä; kiinteän kantajan pintaan rakennetaan oligonukleotidi nukleotidi kerrallaan kayttäen aktivoituja ja suojattuja nukleotidejä. Rutiinisti voidaan valmistaa nukleotidin mittaisia oligonukleotidejä. Proteiinia koodaava DNA voidaan valmistaa kokonaan synteettisesti. Tähän tarvitaan joko oligonukleotidit geenin molemmille nauhoille, tai sarja oligonukleotideja, jotka muodostavat aukollisen kaksinauhaisen kokonaisuuden, jonka aukot sitten voidaan täyttää DNA-polymeraasilla. Jälkimmäisessä tapauksessa tarvitsee syntetisoida vähemmän DNA:ta kemiallisesti. Molemmissa tapauksissa liitetään nauhat yhtenäiseksi DNA:ksi ligaasilla (entsyymi, joka paikkaa DNA:ssa yhden nauhan katkoksia). Nukleotidien muut tehtävät Nukleotidit kantavat kemiallista energiaa solussa Nukleotidin 5 -fosfaattiin voidaan liittää lisää fosfaatteja fosfoanhydridisidoksella. Tällaisen liittämisreaktion vapaan energian muutos on suuri, ja vastaavasti hydrolysoitaessa fosfoanhydridisidos, reaktio on vahvasti lopputuotteiden puolella ( G~-30 kj/mol) Tärkein energian kantaja on adenosiinifosfaatti, ATP, mutta myös muut trifosfaatit toimivat joissain reaktioissa. 64

65 Monissa entsyymien kofaktoreissa on adeniininukleotidi kahvana Monien koentsyymien rakenteeseen kuuluu adenosiini, joka ei kuitenkaan osallistu katalyysiin. Adenosiinijohdannaisia ovat mm: asyyliryhmiä kuljettava koentsyymi A (CoA) hydridinkuljettaja nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi (NAD + ) hydridinkuljettaja flaviini-adeniini-dinukleotidi (FAD) metyyliryhmiä kuljettava S-adenosyylimetioniini (SAM) Adenosiinia sitovan kohdan aminohappojärjestys (ja kolmiulotteinen rakenne)on konservoitunut (säilynyt) evoluutiossa. Jotkut nukleotidit osallistuvat säätelyyn ja viestintään Useiden hormonien ja välittäjäaineiden vaikutus välittyy solun sisällä toisiolähetin (second messenger) avulla. Tavallisin toisiolähetti on 3, 5 - syklinen AMP (camp) (ei sama, kuin RNA:n hydrolyysissä syntyvä 2, 3 - syklinen AMP). Syklinen GMP osallistuu mm. näköaistin toimintaan. Bakteereilla aminohappojen loppuessa ravinnosta syntyy guanosiinitetrafosfaattia (ppgpp), joka mm. estää ribosomaalisen ja siirtäjä- RNA:n synteesiä. 11. Lipidit veteen liukenemattomia biomolekyylejä rasvahappojohdannaiset steroidit polyisoprenoidit Ravintovarastona toimivat lipidit Varastolipidit ovat rasvahappojen johdannaisia. Rasvahapot ovat hiilivetyjohdannaisia O C O - Rasvahapot ovat hiilivetyjen 1-karboksyylihappoja. Yleensä hiilivetyketju on suora, siinä on 4-36 hiiltä, ja rasvahapon hiilten lukumäärä on parillinen. 65

66 Metyyli- tai hydroksyylisubstituentit hiilivetyketjussa ovat harvinaisia. iilivetyketjussa voi olla yksi tai useampia kaksoissidoksia (tyydyttymättömät rasvahapot). Kaksoissidokset ovat luonnollisissa rasvahapoissa cis-konfiguraatiossa. Jos kaksoissidoksia on useampia, niiden välissä on vähintään 1 metyleeniryhmä (kaksoissidokset eivät ole konjugoituneita). Rasvahappo voidaan kuvata ilmoittamalla hiilten luku:kaksoissidosten luku (kaksoissidosten paikka) esim. 18:1( 9 ) öljyhappo (oleic acid): 18 hiiltä, 1 kaksoissidos hiilten 9 ja 10 välissä COO - 18:3( 9,12,15 ) α-linoleenihappo: COO - Tämä on myös θ-3 (omega miinus kolme) rasvahappo, koska kaksoissidos on molekyylin lopusta katsoen kolmannen ja neljännen hiilen välissä. Rasvahappojen sulamispisteet C N: Kaksoissidoksilla on dramaattinen vaikutus rasvahappojen sulamispisteisiin, koska niitä sisältävät rasvahapot ovat mutkallisia eivätkä helposti pakkaudu kiteiksi. Rasvahapot ovat niukkaliukoisia veteen. 66

67 Rasvahappoja on selkärankaisilla jonkin verran verenkierrossa albumiiniin sitoutuneina. Triasyyliglyserolit (= tavallinen rasva) Triasyyliglyserolissa kuhunkin glyserolin kolmesta hydroksyyliryhmästä on esteröityneenä rasvahappo. Mikäli kaikki kolme rasvahappoa ovat samanlaisia, molekyyli voidaan nimetä; esim. tristeariini, tripalmitiini Yleensä kuitenkin luonnon rasva on seos. Triasyyliglyserolit ovat veteen liukenemattomia; tyydyttymättömimpiä rasvahappoja sisältävät ovat öljyjä, muut rasvoja. Kaikki ovat vettä kevyempiä. Triasyyliglyserolit ovat soluissa erillisinä pisaramaisina partikkeleina. Eniten rasvoja on rasvasoluissa (adiposyyteissä). Lipaasit ovat esteraaseja, jotka hydrolysoivat triglyseridejä vapauttaen rasvahapot ja glyserolin käytettäväksi ravintona Rasvat ovat tehokkaita ravintovarastoja, koska niiden hapettamisesta saatava energia on suurempi, kuin hiilihydraattien, koska ne ovat pelkistyneempiä ne eivät sido vettä, toisin kuin polysakkaridit Merinisäkkäät käyttävät rasvoja lämmöneristyksenä, ja parantamaan kelluvuuttaan. Talvehtivilla karhuilla rasvat toimivat vararavintona, lämmöneristeenä ja metabolisena veden lähteenä. Ravinnossa olevat triglyseridit vaihtelevat rasvahappokoostumukseltaan; useimmat kasvisrasvat sisältävät tyydyttymättömiä rasvahappoja, ja lämminveristen eläinten rasvat tyydyttyneitä. Kaloissa on kuitenkin runsaasti tyydyttymättömiä rasvahappoja. Tyydyttymättömiä rasvahappoja sisältävät rasvat pilaantuvat herkemmin, koska kaksoissidokset hapettuvat ilman hapen vaikutuksesta. Vahat Vahat ovat pitkäketjuisten rasvahappojen ja pitkäketjuisten 1-alkoholien estereitä. Planktoneliöt käyttävät vahoja varastoravintona. Eläimet ja kasvit tuottavat vahoja pääasiassa pintansa suojaksi, höyhenten tekemiseksi vettähylkiviksi, ja mehiläiset rakennusaineena. 67

68 Kalvojen rakenteelliset lipidit Biologiset membraanit muodostuvat lipideistä joissa on toisaalta hydrofobinen osa, toisaalta hydrofiilinen osa. Tällaiset molekyylit ovat amfipaattisia(amfifiilisiä, vrt. amfolyytti, joka on aivan eri asia). Tärkeimmät kalvolipidit ovat glyserofosfolipidejä, sfingolipidejä ja steroleja. Fosfolipidit voivat olla glyserolipohjaisia tai sfingosiinipohjaisia Glykolipidit ovat sfingosiinipohjaisia. Glyserofosfolipidit ovat fosfatidihapon johdannaisia Fosfatidihappo on molekyyli, jossa glyserolin 1 ja 2 hiileen on esteröityneenä rasvahappo ja 3-hiileen fosfaatti. Tavallisimmin 1-hiilessä oleva rasvahappo on tyydyttynyt ja 2-hiilessä oleva tyydyttymätön. O O O C 2 O C 2 C 2 O PO 3 - Fosfatidihappo on kiraalinen yhdiste; kantayhdiste on L-glyseroli-3-fosfaatti. Fosfatidihapon fosfaattiin on yleensä esteröityneenä polaarinen alkoholi, joka voi olla: etanoliamiini koliini seriini glyseroli myo-inositoli-4,5-bisfosfaatti fosfatidyyliglyseroli fosfatidyylietanoliamiini fosfatidyylikoliini fosfatidyyliseriini fosfatidyyliglyseroli fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatti kardiolipiini Eetterisidokselliset fosfolipidit (fosfatidyylikoliini) 68

69 Eräissä fosfolipideissä toinen rasvahapoista on esterisidoksen sijasta kiinnittynyt eetterisidoksella (eli se ei oikeastaan enää ole rasvahappo, vaan pitkäketjuinen enoli tai alkoholi). Esimerkiksi plasmalogeeniä, erästä eetterifosfolipidiä, on noin puolet sydänlihaksen fosfolipideistä. Verihiutaleita aktivoiva tekijä, platelet activating factor on välittäjäaine, joka rakenteeltaan on eräänlainen eetterifosfolipidi. Sfingolipidit Sfingolipidien perusmolekyyli on pitkäketjuinen aminoalkoholi sfingosiini 3 CO 2 N 2 C 1 C 2 O Sfingosiinin 2-hiileen sitoutuu amidisidoksella rasvahappo, jolloin syntyvä molekyyli on ceramidi. Kun ceramidin 1-hiileen esteröityy fosfokoliini, syntyy sfingomyeliini. Glykosfingolipideissä ceramidin 1-hiileen liittyy asetaalisidoksella monosakkaridi tai oligosakkaridi. Glykosfingolipidit esiintyvät normaalisti solukalvon ulkopinnalla. Monosakkaridin kyseessä ollessa molekyyli on cerebrosidi; hermosoluissa sokeri on tyypillisesti galaktoosi, ei-hermosoluissa glukoosi. Jos kyseessä on neutraali oligosakkaridi, molekyyliä kutsutaan globosidiksi. Jos oligosakkaridiin kuuluu negatiivisesti varautunut sokeri N- asetyylineuramiinihappo (siaalihappo) molekyyli on gangliosidi, jotka ovat glykolipideistä monimutkaisimmat. Sfingolipidit osallistuvat tunnistusreaktioihin Sfingolipidien glykosylaatio osallistuu tunnistusreaktioihin; esim. ABOveriryhmät perustuvat punasolujen pinnassa olevien globosidien sokeriketjun rakenteeseen. Fosfolipidit ja sfingolipidit hajotetaan lysosomeissa A-tyypin fosfolipaasit hajottavat glyserofosfolipidimolekyylin irrottamalla toisen asyyliryhmistä, ja lysofosfolipaasit irrottavat jäljellä olevan asyyliryhmän. 69

70 Gangliosidien hajotukseen osallistuu joukko lysosomaalisia entsyymejä, jotka parhaiten tunnetaan vakavista synnynnäisistä sairauksista, jotka niiden puute aiheuttaa, ja jotka johtavat hajoamattomien sfingolipidien kertymisen kudoksiin. Steroleiden rakenteessa on neljä rengasta Sterolit ovat kalvolipidejä, joita esiintyy useimmilla eukaryooteilla. Niiden rakenteeseen kuuluu neljästä yhteensulautuneesta renkaasta koostuva sterolirunko (3 kuusirengasta ja 1 viisirengas, nimeltään perhydrosyklopentanofenantreeni). Rengasrakenne on lähes tasomainen ja jäykkä. Kolesteroli, yleisin steroli, on amfipaattinen molekyyli, koska sillä on polaarinen hydroksyyliryhmä ja nonpolaarinen sterolirunko, johon liittyy haaroittunut alkyylisivuketju. Vastaavia kalvosteroleja ovat kasvien stigmasteroli ja sienien ergosteroli. (Bakteerit eivät syntetisoi steroleja, mutta niillä on kalvoissaan samantapaisia lipidejä, joita kutsutaan hopanoideiksi). Kolesterolista tuotetaan sappihappoja, jotka auttavat rasvojen ruuansulatusta emulsifioimalla ne. Steroidihormonit ovat myös sterolijohdannaisia. Lipidit signalointimolekyyleinä, kofaktoreina ja pigmentteinä Kalvolipidejä on yleensä 5-10 % solun kuivapainosta. Kalvolipidit toimivat passiivisina rakenneosina, mutta on myös aktiivisia, signaalinvälitykseen, elektroninsiirtoon ja glykosylaatioon, sekä valon absorptioon osallistuvia lipidejä. Fosfatidyyli-inositolit toisiolähetteinä Fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatti solukalvon sisäpinnassa toimii eräiden solun tukirangan proteiinien kiinnittymiskohtana, mutta myös kahden tärkeän signalointimolekyylin, solunsisäisen hormonin eli toisiolähetin, lähtöaineena. 70

71 Esimerkiksi kun vasopressiini-hormoni sitoutuu reseptoriinsa, reseptori aktivoi erityisen lipaasin, fosfolipaasi C:n. Fosfolipaasi C hydrolysoi solukalvon fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaattia tuottaen kaksi tärkeää toisiolähettiä: inositoli 1,4,5-trisfosfaatin (IP3) ja diasyyliglyserolin (DAG) IP3 vaikuttaa nopeasti avaamalla ionikanavat, jotka vapauttavat Ca 2+ -ionia endoplasmisessa retikulumissa olevista varastoista DAG vaikuttaa hitaammin yhdessä kohonneen Ca 2+ -tason kanssa aktivoimalla proteiinikinaasi C:n (PKC). PKC säätelee muiden proteiinien toimintaa fosforyloimalla niitä. Myös ceramidi ja sfingomyeliini säätelevät proteiinikinaasien aktiivisuutta. Eikosanoidit toimivat solujenvälisinä viestimolekyyleinä Eikosanoidit ovat lyhyen kantaman hormoneja, jotka vaikuttavat paikallisesti, mm. lisääntymisessä, tulehdus- ja kipureaktioissa, veren hyytymisreaktiossa, verenpaineen säätelyssä, vatsahapon erityksen säätelyssä Eikosanoidien lähtöaineena on 20-hiilinen (eikosi =20) 20:4( 5,8,11,14 ) rasvahappo arakidonihappo. Eikosanoidit ryhmitellään prostaglandiineihin, tromboksaaneihin ja leukotrieeneihin. Prostaglandiinien rakenteessa on viisirengas, joka muodostuu arakidonihaposta syklo-oksigenaasi-entsyymin vaikutuksesta. Aspiriini ja muut tulehduskipulääkkeet, NSAID:it (non-steroidal anti-inflammatory drugs) vaikuttavat inhiboimalla tätä entsyymiä. Prostaglandiinit säätelevät camp:in synteesiä, ja näin vaikuttavat hyvin moniin soluihin. Tromboksaanien rakenteessa on eetterisillan sisältävä kuusirengas, ne osallistuvat verihyytymän muodostumiseen ja veren virtauksen säätelyyn. Niidenkin biosynteesi on syklo-oksigenaasista riippuvainen. Leukotrieenit supistavat sileitä lihaksia, ja mm. astmakohtaukset ja anafylaktinen shokki liittyvät niiden epätarkoituksenmukaiseen tuottoon. Steroidihormonit Steroidihormoneilla on steroidirunko, mutta kolesterolin pitkä sivuketju puuttuu; lisäksi hydrofiiliset substituentit tekevät niistä kolesterolia polaarisempia. 71

72 Erikoista steroidihormoneissa on se, että ne pääsevät tunkeutumaan kohdesolun tumaan, ja sitoutuvat siellä steroidireseptoriin, joka suoraan säätelee steroideista riippuvien geenien transskriptiota. Sukupuolihormonit, kortisoli ja aldosteroni ovat tärkeimmät steroidihormonit. Myös monet tärkeät lääkeaineet ovat steroidirakenteisia. A- ja D-vitamiinien johdannaiset 1900-luvun alkupuolella tunnistettiin vitamiinit ravinnossa olevat orgaaniset yhdisteet jotka, usein pieninä määrinä, ovat ihmiselle välttämättömiä. Vitamiinit jaettiin vesiliukoisiin ja rasvaliukoisiin; rasvaliukoisia vitamiineja ovat A, D, E ja K-vitamiinit. Kaikki rasvaliukoiset vitamiinit ovat polyisoprenoideja; ne rakentuvat viisihiilisistä, haaroittuneista isopreeniyksiköistä. (Kolesterolikin on polyisoprenoidi). D 3 -vitamiini, kolekalsiferoli, syntyy 7-dehydrokolesterolista ihossa auringon UV-valon vaikutuksesta. Maksassa ja munuaisissa toimivat entsyymit muuttavat sitä 1,25-dihydroksikolekalsiferoliksi, joka säätelee kalsiumin ottoa ravinnosta, ja kalsiumpitoisuuksia munuaisissa ja luussa. O D-vitamiinin puute aiheuttaa riisitautia (rickets), jossa luusto ei muodostu kunnolla. Lääkkeenä ja ravintolisänä käytetty D 2 -vitamiini (ergokalsiferoli) valmistetaan UV-säteilyttämällä ergosterolia. 1,25-dihydroksikolekalsiferolilla on tumassa oleva reseptori, kuten steroideillakin. A-vitamiini, retinoli, on rengasrakenteen sisältävä pitkäketjuinen isoprenoidi. C 3 C 3 O C 3 Retinoiinihappo on epiteelin kehitykseen ja kasvuun osallistuva hormoni, jolla on tumassa toimiva reseptori. 72

73 Retinaali on silmän verkkokalvolla olevan rodopsiinin valoa absorboiva osa, joka on näköaistin toiminnalle välttämätön. Kasvien β-karoteeni on retinolin esiaste, jonka selkärankaisten metabolia pystyy katkaisemaan. E- ja K-vitamiinit ja lipidikinonit hapetus-pelkistys-kofaktoreina Vitamiini E käsittää ryhmän myös tokoferoleiksi kutsuttuja polyisoprenoideja, jotka toimivat antioksidantteina, ja hakeutuvat solukalvoihin. C 3 O C 3 C 3 (C 2 ) 3 C(C 2 ) 3 C(C 2 ) 3 C(C 3 C 3 C 3 O C 3 Vitamiini K on naftokinoni; se voi helposti osallistua hapetuspelkistysreaktioihin. Tärkeä osuus sillä on aktiivisen protrombiinin muodostuksessa; K-vitamiini on välttämätön veren normaalille hyytymiskyvylle. O C 3 C 3 C 3 C 3 O C 2 C C(C 2 ) 3 C(C 2 ) 3 C(C 2 ) 3 C(C 3 Warfariini on lääkeaine, joka muistuttaa rakenteeltaan K-vitamiinia; sitä käytetään sekä rotanmyrkkynä, että lääkkeenä estämään patologista veren hyytymistä. Ubikinoni (koentsyymi Q) ja plastokinoni ovat mitokondrioiden ja kloroplastien kalvoissa olevia elektroninsiirtoketjun hapetus-pelkistys-kofaktoreja. Dolikoli on pitkäketjuinen polyisoprenoidi, joka siirtää glykosylaatioryhmiä glykoproteiinien ja glykolipidien biosynteeseissä. 73