Proteiinimääritys ja lineaarinen mittausalue Johdanto Useimmiten laboratoriomittaukset tehdään niin, että mittaustulosta verrataan tunnettuun standardikuvaajaan. Tämän takia erilaisten laimennossarjojen teko on rutiinia biolaboratoriotöissä. SFS 3700-standardissa on käsitelty mm. mittausten lineaarisuutta. Teknisessä raportissa CEN/TR 10345 on käsitelty tulosten tilastollista käsittelyä. Perinteisessä kemiamittakaavassa laimennossarjojen teko onnistuu useimmiten punnitsemalla eri määrä kiinteää ainetta tunnettuun liuostilavuuteen. Lopputuloksena on sarja liuoksia, joiden tarkat pitoisuudet tunnetaan ja näitä voidaan käyttää standardeina tai tunnettuina näytteinä tarvittavissa analyyseissä (kuva 1). Yleensä erilaisia standardeja on noin 5 kpl sekä nollanäyte (tausta). Kuva 1 Standardin laimentaminen onnistuu yksittäin kuvan mukaisesti kun tilavuudet ovat isoja tai laimennokset pieniä. Kun tarvittavat liuospitoisuudet ovat pieniä tai käytettävät tilavuudet pieniä niin silloin edellä kuvattu standardien valmistusmenetelmä ei toimi riittävän tarkasti. Suuren laimennuskertoimen takia standardista tarvitaan vain erittäin vähän ja tämä johtaa liuoksen ja standardikuvaajan epätarkkuuteen. Kuvassa 2 on esimerkki kun tarvitaan 25 µg/ml albumiinistandardia 50 µl ja kantaliuos on 1 mg/ml. Standardista tulee näin tehtynä epätarkka, koska 1,25 µl on mahdotonta pipetoida käsin tarkasti ja toistettavasti. Standardikuvaajasta tulee myös epätarkka. Kuva 2 Standardin laimentaminen ei onnistu suoraan jos tarvittava laimennoskerroin on suuri tai liuostilavuudet pieniä. 1
Laimennussarjojen avulla pienemmätkin standardit toimivat toistettavasti. Kun tarvitaan esimerkiksi kaiken kaikkiaan 50 µl proteiinistandardeja välillä 0,1-1,5 mg/ml ja kantaliuosstandardi (engl. stock) on 2 mg/ml (2000 µg/ml). Ensimmäiseksi mietitään määrityksessä tarvittavat standardipitoisuudet helpoilla päässä laskettavilla jakolaskuilla, esim. nyt ½-laimennokset vaikkapa 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml ja 0 µg/ml. Tämän jälkeen selvitetään tarvittavat liuostilavuudet, esim. 50 µl loppupäästä laskien seuraavasti: 125 µg/ml on tehty pitoisuudesta 250 µg/ml pipetoimalla puolet tätä ja puolet vettä. Pitoisuuden 250 µg/ml tarve on siis vähintään 50 µl + 25 µl eli 75 µl. Tämä määrä kannattaa käytännössä pyöristää ylöspäin 80 mikrolitraan, jotta työ voidaan tehdä yhdellä pipetillä. Sarjaa voi täydentää toisella sarjalla esim. 1500 µg/ml, 750 µg/ml ja 375 µg/ml jos tarvetta on. Esimerkkikuvassa 3 on malliesimerkki laimennossarjan laskemisesta kun tarvittavat standarditilavuuden ovat pieniä. Pyri välttämään alle 10 µl pipetointeja standardeja tehdessäsi, jotta toistettavuus (variaatiokerroin, CV %) pysyy hyvänä. CV-prosentti lasketaan rinnakkaisten keskihajonta jaettuna rinnakkaisten keskiarvolla. Laimennossarjoja tehdessä on syytä huomata, että standardit painottuvat helposti alkupäähän (kuva 4). Laimennosten laskeminen voi aluksi tuntua hieman hankalalta, mutta muutaman harjoituskerran jälkeen homma varmasti onnistuu kun idea tulee tutuksi. Mittalaitteisiin voi syöttää mitä lukuja tahansa, vaikka 333,33 µg/ml eli toimi sen mukaan mikä itsellesi on helpointa. Tällä logiikalla ei taskulaskinta tarvitse useinkaan käyttää. Jos tämä laskentatyyli tuntuu oudolta niin käytä jotakin sinulle sopivampaa. Pääasia toki on, että standardit syntyvät tarkasti ja tiedät niiden pitoisuuden. stock Kuva 3 Standardin laimentaminen laimennossarjan avulla. Kuva 4 Standardien painottuminen laimennossarjojen alkupäähän. 2
Määrityksen lineaarinen alue Määrityksen lineaarisen mittausalueen tunteminen on tärkeää, koska jossakin vaiheessa konsentraation lisäys ei enää nosta signaalitasoa ja se saattaa jopa laskea, vaikka mitattavan aineen pitoisuus kasvaa (kuva 5). Esimerkkikuvassa 6 on selvitetty punaista väriä fluoresoivan proteiinin dsred käyttäytymistä. Proteiinimäärä ei ole nyt tunnettu, joten x-akselilla on laimennokset. Selitysaste (R 2 ) on lyhyemmällä mallilla parempi, mutta toisaalta pidemmällä mallilla on helpompi tehdä töitä laboratoriossa. Malli valitaan työn vaatimusten perusteella. Malli ei ole toimiva 0-arvosta asti, vaan määritysraja määritetään analyysikohtaisesti. Määritysraja voi olla esim. 3 x tausta tai pienin analyysimäärä, jossa rinnakkaisten CV-% on alle tavoiterajan tai nollien keskiarvo + 6 x keskihajonta. Kuva 5 Lineaarinen mittausalueen määritys ja siihen liittyvät termit. Signaalin lineaarista mittausaluetta, esimerkiksi fluoresenssi- tai luminesenssimittauksissa, voidaan pidentää käyttämällä esimerkiksi mustaa tai valkoista kuoppalevyä. Korkeissa signaalitasoissa viereisten kuoppien signaalit voivat häiritä mittauksissa eli näissä tapauksissa kannattaa pipetoida esimerkiksi vain joka toiseen kuoppaan tai käyttää mustaa levyä. Esimerkkikuvassa 7 on tutkittu fluoresoivan GFP-proteiinin tuottaman signaalin lineaarisuutta normaalissa, läpinäkyvässä 96-kuoppalevyssä. GFP -proteiinia on tuotettu, eristetty ja puhdistettu laboratoriossa. Onko esimerkiksi proteiinipuhdistuksen rikastuskerroin 6 jos alussa signaali oli 100000 RFU/100 µl (engl. relative fluorescence unit) ja puhdistusvaiheiden jälkeen 600000 CPS/100 µl? 3
Kuva 6 dsred-proteiinin lineaarisen mittausalueen määritys. Kuva 7 Lineaarisen mittausalueen määrittäminen GFP-proteiinille kirkkaalla 96-kuoppalevyllä. 4
Laboratoriotyö: Proteiinimääritys 96-kuoppalevyllä ja lineaarisen mittausalueen määritys Proteiinimääritystä voi tehdä monella eri menetelmällä (esim. Bradford, BCA, Lowry). Tässä työssä käytetään laajalti käytettyä Bradford-menetelmää. Bradford-proteiinimäärityksen voi tehdä kaupallisella valmiilla reagenssilla tai vaihtoehtoisesti voit tehdä kaikki tarvittavat liuokset itse. Itse tehdyn väriaineen kanssa lineaarinen mitta-alue on usein pienempi kuin kaupallisella reagenssilla eli kaupallista reagenssin käyttöä voi kyllä lämpimästi suositella. Moni reagenssivalmistaja (esim. Pierce, Fermentas, Sigma, Bio-Rad) valmistaa tai myy käyttövalmista Bradford-reagenssia. Alla oleva ohje on tehty itse tehdylle värille. Tarvittavan BSA-standardin voi tehdä itse kiinteästä BSA:sta tai vaihtoehtoisesti voi ostaa kitin, jossa on valmiina tarvittava Bradford-reagenssi ja standardiampullit. Määrityksen hinta kuoppalevymittakaavassa tehtynä itse tehdyillä reagensseilla on lähes olematon ja ostettunakin Bradford-määritykset ovat edullisia toteuttaa. Standardien valmistaminen Reagenssin valmistaminen Standardien ja reagenssin pipetointi Mittaus ja kuvaajan laadinta Tulosten käsittely! HUOM. Muista työturvallisuus, Bradford-reagenssi on happoliuos. 1. Laske ja valmista tarvittavat standardit esimerkiksi edellä kuvatun mallin mukaisesti. Standardiproteiinina käy esimerkiksi albumiini (BSA) tai gammaglobuliini 2 mg/ml. Laske ja tee esimerkiksi 5 erilaista standardipitoisuutta välille 0 2 mg/ml. Jokaista standardia tarvitaan 10 µl/mittaus ja kaikista tehdään rinnakkaiset määritykset eli tarve on 20 µl. Tämän lisäksi tarvitaan hieman ylimääräistä, koska kaikkea ei voi pipetoida astiasta pois. Valmista jokaista standardia vähintään 30 µl. 2. Tee Bradford-varastoliuos (engl. stock solution). Tarve muutamia millilitroja/työ. Tee Bradfordkäyttöliuos (engl. working buffer). Tarve yhteen työhön noin 10 ml. Liuos säilyy pimeässä, suodatettava läpi ennen käyttöä. Vaihtoehtoisesti käytä käyttövalmista, kaupallista Bradfordreagenssia (Sigma, Bio-Rad, Pierce, Fermentas). 3. Pipetoi kutakin standardia 10 µl/kuoppa ja Bradford-värireagenssia (working buffer) 300 µl kuoppaan. Muista pipetoida rinnakkaiset määritykset. HUOM: vältä/estä kuplien muodostuminen esimerkiksi käyttämällä käänteistä pipetointia tai hidasta sähköpipetissä nesteen ulostulovauhtia. Sekoita levyä pipetoinnin jälkeen 5 min levysekoittajassa. 4. Mittaa tulokset levylukijalla aallonpituudella 590 nm. Piirrä standardikuvaaja mittalaitteella tai taulukkolaskentaohjelmalla ja selvitä määrityksen lineaarinen mittausalue sekä standardisuoran hyvyys (R 2, selitysaste). Säilö reagenssit tarvittaessa säilöpulloihin riittävillä merkinnöillä varustettuna tai hävitä asianmukaisesti. 5
Tulosten käsittely Bradford-proteiinimittaustulokset sisältävät mitattavan proteiinin lisäksi signaalitaustaa esimerkiksi kyvettimateriaalin ja itse Bradford-reagenssin aiheuttaman signaalin. Taustan poistamisesta tuloskuvaajista ja sen tarpeellisuudesta ollaan montaa mieltä. Joidenkin mielestä tausta pitää poistaa, koska vain mitattavan aineen signaalivaikutus on tarpeellista informaatiota, mutta vastaavasti toinen haluaa nähdä kuvaajasta myös signaali-taustasuhteen. Toiminta toki yksinkertaistuu ja laskuvirheiden mahdollisuus vähenee kun taustaa ei poisteta. Tausta-signaalisuhde kertoo määritysmenetelmän herkkyyden. Jos tausta poistetaan standardeista niin tämä pitää muistaa vähentää myös näytteistä. Tuloksen käyttötarkoitus vaikuttaa useimmiten tuloksen esitystapaan. Kuvassa 7 on esitetty sama proteiinistandardisuora taustan poistolla ja ilman. Joidenkin määrityksien ohjeissa standardikuvaajien akselit muutetaan logaritmisiksi (kuva 8). Tämä ei muuta tulosta vaan standardikuvaajan ulkonäköä. Jos mittalaiteen ohjelmisto ei osaa käsitellä logaritmisuutta, niin myös lineaarisilla akseleilla pärjää mainiosti. Osaatko päätellä miksi moinen muokkaus joskus suoritetaan, vaikka sillä ei ole vaikutusta itse lopputulokseen? Kuva 7 Sama proteiinistandardisuora taustan poistolla ja ilman poistoa. Yhtälöissä on erilaiset selitysasteet, koska alempi suora on pakotettu alkamaan origosta. Kuva 8 Akselien logaritmisuuden vaikutus kuvaajaan ulkoasuun. 6
Seuraavissa esimerkeissä (kuvat 9 ja 10) on tehty opiskelijavoimin Bradford-proteiinimääritys kahdella eri standardiproteiinilla ja tilavuussuhteilla 10 µl + 300 µl reagenssia sekä 50 µl + 200 µl. Lineaarinen alue on Bradford-määrityksessä sitä pidempi mitä isompi on mitattavan aineen (standardi tai näyte) ja reagenssin suhde. Määrityksen mittausalue on lineaarinen 1500 µg/ml asti kun standardien ja Bradford-reagenssin suhde on 10 µl + 300 µl (kuva 9). Esimerkissä pipetointi on onnistunut laboratoriossa hyvin, koska rinnakkaisten standardien signaaliero (CV %, toistettavuus) on pieni. Määrityksessä on nyt käytetty poikkeuksellisesti kahta eri standardia, jotta myös standardiproteiinin vaikutus standardisuoraan voidaan nähdä. Ympyröidyssä kohdassa on tapahtunut jokin työvirhe, koska se on merkittävästi muista poikkeava (engl. outlier). Matemaattisten sääntöjen avulla voidaan selviä työvirheitä poistaa mittaustuloksista. Kuvassa 10 on määritetty lineaarinen mittausalue kun standardien ja Bradford-reagenssin suhde on 50 µl + 200 µl. Lineaarinen mittausalue on nyt huomattavasti pienempi, noin 150 µg/ml asti. Käyttötarve määrittää aina minkälainen standardikuvaaja valmistetaan: välillä tarvitaan ison mittakaavan työkalua ja joskus taas pientä ja tarkkaa. Kuva 9 Bradford-proteiinimäärityksen standardisuorat eri standardiproteiineilla kun seossuhteet ovat 10 µl standardi + 300 µl reagenssi. 7
Kuva 10 Bradford-proteiinimäärityksen standardisuora kun seossuhteet ovat 50 µl standardi + 200 µl reagenssi. Rinnakkaisissa määrityksissä iso CV % ja suoran selitysaste (R 2 <0,9) on huono. Standardisuoran tekovaiheet taulukkolaskentaohjelmalla kun tausta poistetaan: 1. Signaalitaustan (eli 0-näytteiden) keskiarvo funktiolla tai käsin tehdyllä kaavalla. 2. Kaikista tuloksista vähennetään saatu taustasignaali eli pudotetaan standardisuora niin, että signaalin ollessa 0 myös pitoisuus on 0. 3. Tehdään standardi XY-pistekuvaaja nollatuista mittaustuloksista ja tunnetuista konsentraatioista. 4. Lisää trendiviiva pistekuvaajaan. Trendiviivan optioista yhtälön kaava ja R 2 näkyviin ja tarvittaessa myös 0-pakotus. Hyvästä korrelaatiosta voidaan matemaattisesti puhua kun selitysaste on > 0,9. Labrassa tuo 0,9 on jo kyllä melko heikko tulos. Herkässä määrityksessä selitysaste on luokkaa 0,99. 5. Hylkää näytelaskuissa standardin ulkopuoliset tulokset (signaali standardisignaalien ulkopuolella). 6. Laske tuntemattomien näytteiden pitoisuudet yhtälön kaavan avulla. Muista huomioida laimennokset laskuissa eli kerro välitulos laimennoksen käänteisluvulla. Kuvaajasta saat yhtälön kertoimet, mutta ne voit selvittää myös laskentaohjelmissa funktioilla. Funktioita käyttämällä kertoimet päivittyvät jos data muuttuu, kuvaajan yhtälö ei välttämättä päivity muutoksissa. Standardisuora on muotoa: y = m * x + b, ja kertoimet saat seuraavilla taulukkolaskentaohjelman funktioilla selville m = SLOPE (y,x) b = INTERCEPT (y,x) 8
Esimerkki 1 Seuraavassa on esimerkki miten tulokset saadaan taulukkolaskentaohjelmalla tehtyä. 1. Taulukoi mittaustulokset ja standardien konsentraatiot ohjelmaan. Mikäli olet ottanut useita rinnakkaisia mittauksia, laske niistä keskiarvo. 2. Lisää uusi kaaviokuva ja valitse kaavion tyypiksi Scatter (pistekuvaaja). 3. Paina tyhjää kaaviota oikealla hiiren napilla ja valitse Select Data. Lisää uusi sarja painamalla Add ja valitse X arvoiksi konsentraatiot ja Y arvoiksi keskiarvot. Voit myös nimetä sarjasi, esimerkiksi Standardisuora. Tämän jälkeen kuittaa valinnat OK. 9
4. Valitse kaaviosta yksi mittapiste hiiren oikealla napilla ja valitse Add Trendline. Valitse suoran tyypiksi Linear ja laita ruksi kohtiin Display Equation on Chart ja Display R-squared value on chart. Tällöin näet standardisuoran selitysasteen ja suoran yhtälön, josta voit laskea näytteen pitoisuuden. 5. Ratkaise suoran yhtälöstä x ja kirjoita yhtälö ylös johonkin. Lisää standardien perään näytteet ja listaa näytteiden absorbanssit. 6. Laske yhteen soluun näytteen konsentraatio käyttämällä näytteen absorbanssia ja suoran yhtälöä. CV-prosentit voi toki myös laskea ja lisätä kuvaajaan. Lineaarisen mittausalueen ulkopuolelle osuvat mittauspisteet voidaan poistaa esim. IF-funktion avulla. Kuvaajasta käsin tehdyn yhtälön avulla laskettaessa laskut eivät päivity automaattisesti jos raakadata muuttuu. Tämän ongelman poistamiseksi voit käyttää funktioita SLOPE ja INTERCEPT laskuissa kaavan käsinkirjoittelun sijaan. Tee äskeinen standardikuvaaja funktioiden avulla ja tarkastele tuloksia. Miksi lopputuloksissa voi olla eroja? 10
Kaikesta huolimatta aina eivät kaikki laskut ja pipetoinnit mene kuten elokuvissa. Jos kuvaajasi näyttää lopulta kuten kuvassa 11, niin harjoittele uudestaan. Esimerkissä rinnakkaiset määritykset ovat hyvin kasassa, mutta laimennosten teko ei ole onnistunut ja tämän takia matemaattinen malli on huono (R 2 <0,9) Kuva 11 Epäonnistunut Bradford-proteiinimäärityksen standardisuora. 11
Esimerkki 2. Standardin ja näytteiden mittatulokset ovat taulukoissa. Laimennoksien merkinnässä esim. 1/20 (engl. 1 in 20) tarkoittaa 1+19 osaa, ei 1+20. 1. Tehdään standardikuvaaja, taustaa ei nyt poisteta. 2. Selvitä minkä näytteiden tuloksen voi laskea. Nyt suurimman standardin signaali on luokkaa 0,6 eli näytelaimennokset ½ ja 1/10 hylätään, koska menevät yli. Näille ei kukaan osaa tulosta laskea. 3. Näytelaimennosten 1/20 keskiarvo on 0,4485. Tämä on nyt yhtälön Y-arvo. Ratkaistaan yhtälöstä X. Y = 0,0042X + 0,2389 (Y 0,2389) = X 0,0042 (0,4485 0,2389) = 49,9 µg/ml 0,0042 Laskettu tulos on 1/20-osatulos eli kerrotaan lopuksi laimennos ulos 49,9 mg/ml x 20 = 998 µg/ml 12
Reagenssit Bradford-varastoliuos (engl. stock solution) 100 ml etanoli (95 %) 200 ml fosforihappo (88 %) 350 mg Serva blue G väriaine Bradford-käyttöliuos (engl. working buffer) 425 ml laboratoriovesi 15 ml etanoli (95 %) 30 ml fosforihappo (88 %) 30 ml Bradford-varastoliuos Suodata suodatinpaperin (Whatman numero 1 = karkea suodatus) läpi. Säilytys huoneenlämmössä (engl. room temperature, RT) ja valolta suojattuna (folioon käärittynä tai ruskeassa säilytyspullossa). Säilyy viikkoja, suodata liuokset aina ennen käyttöä. Kysymyksiä/tehtäviä 1. Mitä tarkoittaa selitysaste, R 2? 2. Mitä tarkoittaa CV-prosentti? Miten se lasketaan? 3. Tarvitset kantaliuoksesta (2000 µg/ml) standardin, jonka pitoisuus on 250 µg/ml ja tilavuus 30 µl. Miten valmistat standardin? 4. Standardikuvaaja on muotoa y = 2x + 1,8. Näytteen absorbanssitulos y on 188. Mikä on näytteen pitoisuus? 5. Proteiinistandardin rinnakkaisista mittaustuloksista tulee eri lukemia. Mitä syitä tähän voi olla? 6. Näytteesi proteiinipitoisuus on etukäteistietojen perusteella noin 1 mg/ml, mutta Bradfordmittauksessa saat tuloksen 2,5 mg/ml. Miksi näin voi käydä? 7. Tunne alla olevan kuvan termit ja merkitykset Tarkkuus hyvä (engl. accuracy), mutta toistettavuus huono. Toistettavuus hyvä (engl. repeatability), mutta tarkkuus huono. 13