SIENET Pentti Kuusela dosentti, kliinisen mikrobiologian erik.lääkäri HUSLAB/kliininen mikrobiologia Bakteriologia & Immunologia, Haartman-instituutti, HY Luennon tavoitteet tarjota kuulijalle perusteita kliinisten sieninäytteiden otosta, prosessoinnista ja identifikaatiosta kliinisesti tärkeistä hiivoista, dermatofyyteistä ja rihmasienistä sienten aiheuttamista pinnallisista ja syvistä sekä systemaattisista infektioista sieni-infektioiden hoitoon käytetyistä lääkkeistä Sienet infektion aiheuttajina Yleistä erilaisia sieniä tunnetaan > 250000 lajia n. 200 aiheuttaa ihmisille infektioita jakaantuvat silmikoitumalla suvullisia ja suvuttomia JAKO hiivat (yeasts) pyöreitä pallukoita jakaantuva solu jää kiinni rihmasienet l. homeet (molds) rihmarakenteita itiöt dermatofyytit (dermatophytes) dimorfiset sienet Sieninäyte Sienten tutkiminen-1 http://intra.hus.fi/huslab/ohjekirja/erikoisalakohtaiset tutkimushakemistot/mykologian tutkimukset hyvä näyte koko identifikaation A&O taustatiedot sairaudet matka-anamneesi oleskelu ulkomailla eläinkontaktit ammatti/harrastukset HUOM! laboratorioinfektion mahdollisuus (hepatiitti, HIV, Histoplasma, Coccidioides) näytteiden kuljetus yleensä kuivassa steriilissä astiassa ihoraappeet, kynnet, hiukset kuivassa astiassa/pahvikuoressa HUOM! Näyte aina myös objektilasille, joka näytteen mukana labraan iho puhdistus 70% alkoholilla ennen näytteenottoa hiukset Woodin valo affisioalueelta hiuksen juuri mukaan Mikroskopointi Sienten tutkiminen-2 calcofluor white Sieniviljely Sienten tutkiminen-3 suora mikroskopia värjäämätön näyte valo/pimeäkenttä/faasikontrasti calcofluor white (UV mikroskopia) India ink (valomikroskopia) suora identifikaatio Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum India ink C. albicans useimmat sienet kasvavat yksinkertaisilla elatusaineilla hidas kasvu (2-3 pvää >> 4 vkoa) tunnistuksessa käytettävien rakenteiden heikko ilmentyminen erikoismaljat kasvatus 25 0 C -30 0 C ja 37 0 C (dimorfiset sienet) löydöksen merkityksen arviointi (määrä, laatu, kliininen tilanne, näytteen laatu) Cryptococcus neoformans 1
Identifikaatiorakenteita Sienten tutkiminen-4 Microsporum canis Candida albicans Trichophyton rubrum Serologiset testit antigeenia mittaavat b-d-glugaani, galaktomannaani (EIA-testejä) antigeenin määrä vaihtelee useita näytteitä vääriä positiivisia hinta vasta-aineita mittaavat Dg ja epidemiologinen seuranta Candida, Cryptococcus, Histoplasma immunopuutteiset reagoivat huonosti (monoclonaali JF5 vasta-aine) Aspergilluksen pintarakenne POC-testi (lateral diffusion assay) ei vielä kaupallisesti saatavissa!! Mahtaako tullakaan?? Histopatologia Sienten tutkiminen-5 subkutaanisten ja syvien sieniinfektioiden diagnostiikka sienet värjäytyvät huonosti esim. hematoksyliini/eosiini-värjäyksessä metenamiini/hopeavärjäys(groncott, Comori) kertoo sieni-infektion olemassaoson sienen nimeäminen vaikeaa!! Aspergillus vrs Fusarium, Scedosporium C. albicans vrs Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis Sienten tutkiminen-6 Molekulaaridiagnostiikka A. genomin useat alueet kohdealueina ribosomaalinen DNA 18S, 5.8S,28S intervening transcribed spacer (ITS) alueet PCR (polymerase chain reaction) multiplex-pcr real-rime PCR panfungal PCR microarray sienimäärän kvantitointi fluorescence in situ hybrization (FISH)- menetelmät työläitä poikkeus PNA-FISH!! B. sienen valkuaisten analyysi massaspektrometria (MALDI-TOF) PNA-FISH/C.albicans Sienisolun seinä Cholesterol vrs ergosterol 2
lääkkeet l. antimykootit A: POLYEENIT -sitoutuvat sienisolun solukalvoon, pääasiassa ergosteroliin -muuttaa kalvon läpäisevyyttä >> solun kuolema -mammaalisolukalvossa kolesterolia >> polyeeni sitoutuu huonommin Natamysiini Amfoterisiini B Amfo B deoksikolaatti (Fungizone R ) lipidimuotoinen Amfo B (Ambisome R, Abelcet R ) C: ALLYYLIAMINIT -inhiboi ergosterolin synteesiin osallistuvaa svaleeniepoksidaasia terbinafiini (Fungorin R, Lamisil R ) B: ATSOLIJOHDANNAISET -estavät sytokromi P450 14a-metylaasia (lanosterol > ergosterol) Imidatsolit mikonatsoli, ketokonatsoli, klotrimatsoli, ekonatsoli, tiokonatsoli Triatsolit flukonatsoli (Diflucan R ), itrakonatsoli(sporanox R ) vorikonatsoli (Vfend R ) posakonatsoli (Noxafil R ) D: EKINOKANDIINIT -estävät sienen seinämän 1,3 b-d-glukaanin synteesiä Kaspofungiini (Cancidas R ) Mikafungiini (Mycamine R ) Anidulafungiini (Ecalta R ) Ergosterol synthesis and hit points of antimycotic drugs squalene synthetase; ERG20 2 acetyl-coa farnesyl diphosphate squalene polyens ergosterol 4,4-dimethyl-cholesta- 8,12,24-trienol allylamines azoles lanosterol lanosterol 14a-demethylase ERG11 1) lisäksi flusytosiini (antimetaboliitti) ja griseofulviini (mikrotubulusten toiminta) lääkkeet l. antimykootit-1 POLYEENIT sitoutuvat sienisolun solukalvoon, pääasiassa ergosteroliin muuttaa kalvon läpäisevytta >> solun kuolema mammaalisolukalvossa kolesterolia >> polyeeni sitoutuu huonommin Natamysiini Amfoterisiini B syvien sieni-infektioiden hoitoon tehoaa useimpiin hiiva- ja rihmasieniin uudemmat sienilääkkeet korvaamassa OBS! invasiiviset Mucor-sieni-infektiot Amfo B deoksikolaatti (Fungizone R ) munuaistoksinen elektrolyyttihäiriöt kuumereaktiot lipidimuotoinen Amfo B (Ambisome R, Abelcet R ) kalliita paremmin siedettyjä lääkkeet l. antimykootit-2 Atsolijohdannaiset estavät sytokromi P450 14a-metylaasia (lanosterol > ergosterol) Imidatsolit mikonatsoli, ketokonatsoli, klotrimatsoli, ekonatsoli, tiokonatsoli Triatsolit Flukonatsoli (Diflucan R ) iv- ja po-annostelu teho vain hiivasoluihin syvien Candida-infektioiden peruslääke C. krusei ja C. glabrata usein resistenttejä Itrakonatsoli (Sporanox R ) po-annostelu tehoaa sekä hiiva- että rihmasieniin estää useiden sytokromi P450 entsyymien toimintaa > interaktiot jatkuu Triatsolit Vorikonatsoli (Vfend R ) po- ja iv- annostelu tehoaa sekä hiiva- että rihmasieniin hyvä kudospenetraatio (myös cns) sivuvaikutuksia (ohimenevät näköhäiriöt) estää useiden sytokromi P450 entsyymien toimintaa > interaktiot soveltuu erityisen hyvin syvien Aspergillus-infektoiden hoitoon Posakonatsoli (Noxafil R ) po-annostelu uusin sienilääke erityisesti Aspergillus- ja Fusarium-infektiot OBS! tehoaa mucor-ryhmän rihmasieniin varsin hyvin siedetty lääkkeet l. antimykootit-3 Allyyliamiinit inhiboi ergosterolin synteesiin osallistuvaa svaleeniepoksidaasia Terbinafiini (esim. Fungorin R, Lamisil R ) paikallisesti ja systemaattisesti vain ihon ja kynsien sieni-infektioiden hoidossa 3
lääkkeet l. antimykootit-4 Ekinokandiinit estävät sienen seinämän 1,3 b-d-glukaanin synteesiä Kaspofungiini (Cancidas R ) vain iv-annostelu ei vaikutusta sytokromi P450-entsyymeihin syvät kandidainfektiot vaihtoehto Aspergillus-infektioissa flukonatsoli-r-hiiva-infektioiden hoito empiirinen (kokemukseen perustuva) hoito neutropeniapotilailla lääkkeet l. antimykootit-5 Muut Flusytosiini antimetaboliitti Griseofulviini sitoutuu polymerisoituneisiin mikrotubuleihin ja estää sienen jakautumisen Mikafungiini (Mycamine R ) Anidulafungiini (Ecalta R ) viimeksi rekisteröityjä Suomessa kokemukset vasta karttumassa silsataudit eli tineat eli dermatomykoosit Trichophyton Microsporum Epidermophyton geofiilinen (maaperä), zoofiilinen (eläinperäinen), anthropofiilinen (ihmisperäinen) keratofiilejä > iho, kynnet, stratum corneum (marraskesi) sienen alkuperä vaikuttaa infektion vaikeusasteeseen ja epidemiologiaan anthropofiiliset sienet aiheuttavat tietyn alueen infektioita T. rubrum, E. floccosum ihon ja kynnen infektioita M. audoiuinii, T. tonsurans hiuspohjan infektioita Näytteenotto tärkeää kielto: iho paikallishoito 2 vkoa sisäinen lääkitys 1 kk kynsi paikallishoito (lääkelakka) 3 kk sisäinen lääkitys 6 kk mikroskopia (AINA, nopea) viljely selektiiviset maljat (kloramfenikoli, sykloheksimiidi) Taudit Tinea capitis (hiuspohjan silsa) valtaosaltaan lapsilla M. canis (Länsi-Eurooppa) T. violaceum (Etelä- ja Itä-Eurooppa) T. tonsurans (Pohjois-Amerikka) T. violaceum T. tonsurans M. canis M. audoiuinii Hoito: terbinafiini 250 mg/vrk tai itrakonatsoli 200 mg/vrk po 2-4 (-6) vkoa lasten hoito tapauskohtaisesti oireettomien perheenjäsenten hoito ketokonatsoli- tai seleenisulfidishampoot vektorien (kammat, hiussoljet, hiusharjat jne) hävittäminen Tinea corporis (vartalon silsa) sieni-infektio vartalolla ja raajojen iholla (ei nivuset, kämmenet eikä jalkapohjat) Trichophyton-, Microsporum- ja Epidermophyton-sukujen sienet kaikkialla, yleisimpiä trooppisilla ja subtrooppisilla alueilla infektio potilaan vartalon osasta toiseen (päänäha > vartalo) henkilöltä toiselle (T. tonsurans, paini) lemmikkieläimistä (M. canis, T. mengagrophytes) karja (T. verrucosum) hevonen (T. equinum) natamysiini imidatsolit terbinafiini amorolfiini Dx1-2/1-4 vkoa sisäinen lääkitys laaja-alaiset, hankalat infektiot flukonatsoli itrakonatsoli terbinafiini 4
Tinea cruris (nivussilsa) infektio usein peräisin omalta iholta (varvasväli) T. rubrum E. floccosum Näyte ihottuman reuna-alueelta sisäinen lääkitys Tinea pedis (jalkasilsa) varvasväli vasta murrosiän jälkeen T. rubrum tavallisimmin 4.-5.varvasvälissä koko jalkapohja (mokkasiinisilsa) : 1-4- viikkoa kylvetykset (KMnO4, Hibitane) penslaukset (Castellanin liuos) Tinea unguium (kynsisilsa) yhdessä tai monissa kynsissä pääasiassa kynnenaluksessa kynnen pinnalla > kynsi valkoiseksi näyte muista sienilääkkeiden tauot ennen näytteen ottoa!! näyte terveen ja affisioituneen kynnen rajalta kynnenalustan hyperkeratoottista massaa paras tulos sisäisellä lääkityksellä terbinafiini 250 mg/vrk/ 6 tai12 vkoa itrakonatroli 200 mg/vrk 12 vkoa tai 2-4 hoitojaksoa (200mgx2/vrk/1vko + 3 vkon tauko) flukonatsoli 150 mg/1 vko kunnes uusi kynsi on kasvanut tilalle amorolfiini-kynsilakka (LocerylR) sormien kynnet 6 kk varpaiden kynnet 9-12 kk Candidat Kliinisesti tärkeitä hiivoja pieniä soluja lisääntyvät silmikoitumalla kuuluvat normaaliflooraan iho, suolisto, genitaalialue, suun limakalvot identifikaatio itumuodostus (germ tube formation) hiilihydraattien assimilaatiotestit (API ID 32C) massaspektrometia (MALDI-TOF) Candida albicans C. tropicalis C. krusei C. paraspilosis C. glabrata C. lusitaniae C. guillermondii C. albicans Ituputki kandidat INFEKTIOT Infektiolle altistavia tekijöita laajakirjoinen antibiootti perustauti vierasine iv-kanyylit GI-operaatiot/vammat A. PINNALLISET INFEKTIOT suun infektiot l. sammas/suupielen tulehdus l keiliitti pienet lapset syöpäpotilaat HIV po-steroideja käyttävät hammasproteesi mikonatsoligeeli nystatiinitipat amfob-imeskelytabletit posakonatsoli joskus po-lääkitys genitaalialueen infektiot vaginiitti, vulvovaginiitti, vulviitti C. albicans 90%:sti hoito paikallishoito po-lääkitys relapsit n 25% ihon infektiot ihon taivealueet, poimut kynsivalli usein sekainfektio (S. aureus, G- sauva) paikallishoito krooninen mukokutaaninen kandidiaasi infektio useammassa elimessä samanaikaisesti lymfosyyttitoiminnan häiriöt APECED-oireyhtymä kandidat Infektiot B. SYVÄT INFEKTIOT taudinkuvat vaihtelevia eri potilailla kandidemia (+/- pesäkkeitä elimistössä) 4. yleisin veriviljelylöydös Suomessa 50% C. albicans altistavia tekijöita (kts aik.) kanyylisepsis (biofilmimuodostus!!) endoftalmiitti pneumonia meningiitti endokardiitti osteomyeliitti VTI diagnoosi eristys steriilit paikat yleistynyt kandidiaasi n. 50%:lla veriviljely positiivinen Molekulaariset tekniikat PCR microarray PNA-FISH Hoito atsolit ekinokandiinit AmfoB Kliinisesti tärkeitä hiivoja Cryptococcus neoformans esiintyy monissa paikoissa persikkamehu lehmän maito eristetty useilta eläimiltä aiheuttaa infektioita harvoin keuhkojen kryptokokkoosi meningiitti 5
Muita kliinisesti tärkeitä hiivoja Klinisesti tärkeitä rihmasieniä (homeita) Malassezia furfur Infektiot savipuoli vartalolla, ei raajoissa diagnoosi ketokonatsoli (6x50mg x1 + lasi vettä + lenkille) Aspergillus kaikkialla luonnossa huoneilmassa ja pölyssä ruoka-aineet, mausteet tee, tupakka Aspergillus fumigatus A. flavus A. niger A. terreus A. nidulans helposti hengitysteihin ja limakalvoille INFEKTIOT Aspergillooma aspergilluksen aiheuttama mysetooma tavallisimmin keukoissa syntyy vauraioituneeseen kudokseen kirurginen komplikaatioina usein verenvuodot, fistelii tai empyeema AmfoB:n ruiskutus suoraan mysetoomaan atsolit A. niger A. fumigatus A. flavus A. terreus Klinisesti tärkeitä rihmasieniä (homeita) Infektiot Nenänielun infektiot erityisesti postionteloiden alueella akuutti/krooninen sinuiitti aspergillooma kirurginen po sienilääkitys korvakäytävässä usein A. niger Silmäinfektiot sarveiskalvon vaurio erilaiset silmävammat iv-huumeiden käyttö osana yleistynyttä aspergillus-infektiota konjunktiviitti endoftalmiitti paikallinen hoito, systeemihoito Klinisesti tärkeitä rihmasieniä (homeita) Infektiot Invasiiviset infektiot Yleensä taustalla immunostatusta heikkentävä tilanne maligniteetti kantasolu- tai elinsiirto invaasio verisuoniin >> paikallinen kudoskuolio yleistyneen infektio ennuste huono Diagnostiikka varhainen dg + varhainen Rq > paras hoitotulos epäile etsi diagnosoi tietokonetomografia (keuhkot, sinukset, pään alue) antigeenien mittaaminen molekulaarimenetelmät Hoito Invasiivinen keuhkojen aspergilloosi (IPA) AmfoB itrakonatsoli triatsolit ekinokandiinit Muiden elinten aspergilloosi vorikonatsoli hyvä CNS-penetraatio Systeemi-infektioita aiheuttavat sienet Dimorfiset sienet dimorfisia sieniä rihmana 25-30oC hiivapesäkkeenä 37oC Coccidioides immitis endeemiset alueet (lounais USA, Meksikko, Etelä- ja Väli Amerikka) infektioita terveille infektio inhaloimalla maasta irronneita itiöitä useimmiten keuhkoinfektioita useimmiten paraneminen ilman hoitoa AmfoB fluconatsoli itrakonatsoli Histoplasma capsulatum Pohjois-, Väli- ja Etelä-Amerikka, Afrikka, Australia, Itä-Aasia, Malesia pääasiassa maaperässä infektio linnunulosteiden välityksellä LOPUKSI potilashoidon kehittyessä systeemisten sieni-infektioiden määrä lisääntyy hemato-onkogeeniset potilaat tehohoitopotilaat maapallon kutistuessa Suomessakin voi törmätä harvinaisiin sieniinfektioihin (coccidioosi, histoplasmoosi) varhainen oikea hoito parantaa hoidon onnistumista profylaktinen pre-emptiivinen kohdistettu hoito varhaisen diagnostiikan tarve lisääntyy klinikka röntgen patologia mikrobiologia-yhteistyö mikrobiologiassa meneillään nopean identifikaation murrosvaihe PCR massaspektrometria sienten perimätiedon lisääntyessä sienten nimeäminen saattaa muuttua merkittävästi tulevaisuudessa 6