Sähkökemiallisten mikroelektrodien soveltuvuus glutamaatin ja dopamiinin mittaukseen syväaivostimulaatiohoidon yhteydessä

Sähkökemiallisten mikroelektrodien soveltuvuus glutamaatin ja dopamiinin mittaukseen syväaivostimulaatiohoidon yhteydessä Emilia Berg

Aalto-yliopisto Sähkötekniikan korkeakoulu Bioinformaatioteknologian tutkinto-ohjelma Emilia Berg Sähkökemiallisten mikroelektrodien soveltuvuus glutamaatin ja dopamiinin mittaukseen syväaivostimulaatiohoidon yhteydessä Kandidaatintyö 7.12.2011 Työn ohjaaja: TkT Tomi Laurila i

Tiivistelmä AALTO-YLIOPISTO SÄHKÖTEKNIIKAN KORKEAKOULU KANDIDAATINTYÖN TIIVISTELMÄ Aalto-yliopisto Sähkötekniikan korkeakoulu Bioinformaatioteknologia Tekijä: Emilia Berg Työn nimi: Sähkökemiallisten mikroelektrodien soveltuvuus glutamaatin ja dopamiinin mittaukseen syväaivostimulaatiohoidon yhteydessä Päiväys: 7.12.2011 Sivumäärä: 36 + 4 Vastuuopettaja: TkT Markus Turunen Ohjaaja: TkT Tomi Laurila Kieli: Suomi Glutamaatti ja dopamiini ovat hermoston välittäjäaineita, joiden solunulkoisten pitoisuuksien uskotaan olevan yhteydessä Parkinsonin taudin oireisiin. Edenneen Parkinsonin taudin hoitoon käytetyn syväaivostimulaation on koe-eläin tutkimuksissa havaittu kohottavan glutamaatin ja dopamiinin solunulkoisia pitoisuuksia tyvitumakkeissa. Pitoisuuksien mittaus hoidon yhteydessä voisi auttaa optimaalisten stimulaatioparametrien löytämisessä. Sähkökemialliset mikroelektrodit mahdollistavat reaaliaikaisen välittäjäainemittauksen, mutta niiden suorituskyvyn riittävyys haastaviin in vivo-olosuhteisiin on kyseenalainen. Tämä kandidaatintyö selvittää minkälaisissa pitoisuuksissa ja aika-ikkunoissa glutamaattia ja dopamiinia solunulkoisessa tilassa esiinty, ja peilaa niitä kehitettyjen glutamaatti- ja dopamiinielektrodien suorituskykyyn. Viime vuosien intensiivinen elektrodikehitys on johtanut alhaisen nanomolaariluokan havaitsemiskykyihin, sekä glutamaatille parhaimmillaan noin sekunnin ja dopamiinille jopa reilusti alle sekunnin ajallisiin vasteisiin. Tämä suoritustaso on riittävä syväaivostimulaatiohoidon yhteydessä havaittujen suhteellisten suurten ja hitaiden pitoisuusmuutosten havaitsemiseen. Johtopäätös ei kuitenkaan ole yksiselitteinen monesta syystä, joista merkittävimpiä ovat pitkäaikaisten ihmistutkimusten puute, ja heikko tietämys solunulkoisten välittäjäainepitoisuuksien fysiologisista vaikutuksista syväaivostimulaatiohoidossa. Elektrodien ensisijaisiksi kehityskohteiksi nousevat näin ollen bioyhteensopivuus ja suorituskyvyn pitkäaikaisstabiliteetti, jotta elektrodit voitaisiin pysyvästi implantoida ihmisaivoihin. Tärkeä tutkimuskohde elektrodikehityksessä on myös Parkinsonin taudin ja syväaivostimulaation solutason tapahtumien selvittäminen, minkä avulla elektrodeille asetetut vaatimukset tarkentuisivat. Avainsanat: syväaivostimulaatio, glutamaatti, dopamiini, Parkinsonin tauti, sähkökemiallinen välittäjäainemittaus, mikroelektrodi, tyvitumakkeet ii

Sisällysluettelo Tiivistelmä... ii Sisällysluettelo... iii Käsitteet... iv 1. Johdanto... 1 2. Aivojen glutamatergisen ja dopaminergisen välityksen karakterisointi... 2 2.1 Glutamatergisen välityksen luonne... 3 2.2 Tutkimustuloksia glutamaatin pitoisuuksista ja ylivuodosta... 4 2.3 Tutkimustuloksia kohonneista glutamaattipitoisuuksista tyvitumakkeissa syväaivostimulaation yhteydessä... 7 2.4 Dopaminergisen välityksen luonne... 9 2.5 Tutkimustuloksia dopamiinipitoisuuksista ja -transienteista tyvitumakkeissa... 10 2.6 Tutkimustuloksia kohonneista dopamiinipitoisuuksista tyvitumakkeissa syväaivostimulaation yhteydessä... 12 3. Välittäjäaineiden mittaus sähkökemiallisilla mikroelektrodeilla... 14 3.1 Pääperiaatteet glutamaatin sähkökemiallisessa mittauksessa... 14 3.2 Pääperiaatteet dopamiinin sähkökemiallisessa mittauksessa... 16 4. Anturien suorituskyky ja sen parantaminen... 17 4.1 Glutamaattiantureiden herkkyyteen ja ajalliseen vasteeseen vaikuttavat tekijät... 18 4.2 Dopamiinianturien herkkyyteen ja ajalliseen vasteeseen vaikuttavat tekijät... 22 5. Johtopäätökset elektrodien suorituskyvystä in vivo mittauksiin syväaivostimulaation yhteydessä... 27 5.1 Glutamaattiantureiden vaatimuksista... 27 5.2 Dopamiiniantureiden vaatimuksia... 28 5.3 Yhteenvetoa heränneistä tutkimuskysymyksistä ja elektrodien kehitystarpeista... 30 6. Lähdeluettelo... 32 iii

Käsitteet Aivojen anatomiaan liittyvät käsitteet Tyvitumakkeet Etuaivoissa aivokuoren alla sijaitseva, muun muassa motorisia toimintoja säätelevä joukko tumakkeita: - Mustatumakkeet (substantia nigra, SN) pars reticulate (SNr) & pars compacta (SNc) - Subtalaminen tumake (subthalamic nucleus STN) - Aivojuovio (striatum) Nucleus accummens (NAcc) & Caudate-Putamen (CP) - Linssitumake (Globus pallidus, GP) internal (GPi) & external (GPe) Ventraalinen keskiaivojen peitealue (ventral tegmental area, VTA) Keskiaivoissa sijaitseva nippu dopaminergisiä hermosoluja, josta dopaminergisiä yhteyksiä projisoi muihin aivojen osiin. Mediaalinen etuaivonippu (medial forebrain bundle, MFB) Dopaminerginen hermorata, johon kuuluu muun muassa dopaminergisiä yhteyksiä VTA:n ja tyvitumakkeiden välillä. Kontralateraalinen Vastakkaispuoleinen Ipsilateraalinen Saman puoleinen Dorsaalinen Selänpuoleinen Ventraalinen Vatsanpuoleinen Hermosoluihin ja niiden signaalinvälitykseen liittyvät käsitteet Sooma Dendriitti Aksoni Glutamaterginen Dopaminerginen Ionotrooppinen Metabotrooppinen Hermosolun tuman ja soluelimet sisältävä runko-osa Hermosolun signaalien tuojahaarakkeena toimiva ulkonema Hermosolun signaalin viejähaarakkeena toimiva ulkonema Glutamaattia signaloinnissa käyttävä Dopamiinia signaloinnissa käyttävä Reseptorityyppi, jonka aktivoituminen avaa solukalvon läpäisevän ionikanavan Reseptorityyppi, jonka aktivoituminen laukaisee pitkävaikutteisia hermoston toimintaa sääteleviä reaktioketjuja Muut käsitteet in vitro in vivo Kapasitiivinen virta Faradinen virta Elävän organismin ulkopuolella suoritettava koe Elävässä organismissa suoritettava koe Varauksen uudelleenjakautumisesta rajapinnan molemmin puolin aiheutuva virta Varauksensiirrosta rajapinnan yli, esimerkiksi kemiallisissa reaktioissa, aiheutuva virta iv

1. Johdanto Aivojen kemiallisten signaalinvälittäjämolekyylien välittäjäaineiden olemassaolon varmistumista 1920-luvulla voidaan pitää merkittävänä läpimurtona aivotutkimukselle. Tästä lähti liikkeelle tutkimusala, jonka pyrkimyksenä on karakterisoida välittäjäaineita ja niiden vaikutusmekanismeja aivoissa, ja jonka ansiosta välittäjäaineiden merkitystä ei ainoastaan aivojen signaalinkuljettajina, vaan laajavaikutteisina aivojen toiminnan modulaattoreina vähitellen ymmärretään paremmin. (Bear 2007, kpl. 5) Välittäjäaineiden toiminnan tunteminen on tärkeää muun muassa siksi, että useiden neurologisten sairauksien yhteydessä on havaittu muutoksia aivojen välittäjäainepitoisuuksissa, esimerkkeinä Parkinsonin, Alzheimerin ja Huntingtonin tauti (Wilson 2008, Rieben 2009). Näiden sairauksien synnystä ja etenemisestä tiedetään vielä suhteellisen vähän, eikä niitä kyetä parantamaan, vaikka tehokkaiden hoitomuotojen kehitys on jatkuvasti käynnissä. Kehityksen kannalta on välittäjäaineiden roolin mahdollisimman tarkka tunteminen oleellista. Pitkälle edenneen Parkinsonin taudin motoristen oireiden hoitoon käytettävän syväaivostimulaation (Deep brain stimulation, DBS) on viimeisimmissä tutkimustuloksissa havaittu vaikuttavan useiden välittäjäaineiden kuten glutamaatin ja dopamiinin solunulkoisiin pitoisuuksiin tyvitumakkeissa. Pitoisuuksien on myös havaittu riippuvan stimulaation parametreista. Tämän perusteella on välittäjäainepitoisuuksien jopa ehdotettu voivan toimia takaisinkytkentäparametreina itsesäätelevälle syväaivostimulaatiohoidolle, jonka hoidon tehokkuus optimoituisi potilaskohtaisesti (Behrend 2009). Tämä vaatisi välittäjäainepitoisuuksia mittaavien anturien implantointia aivoihin. Glutamaatin ja dopamiinin mittaukseen in vitro ja in vivo koe-eläimillä on yleisesti käytetty sähkökemiallisia mikroelektrodeja (Robinson 2008). Tarkka, luotettava ja pitkäaikainen mittaus on kuitenkin kaikkea muuta kuin ongelmatonta; aivojen äärimmäisen herkkä ja dynaaminen ympäristö asettaa erityisiä rajoitteita ja haasteita mittausmenetelmille. Välittäjäaineiden luontaiset pitoisuudet aivoissa ovat mikro- tai nanomolaarien luokkaa, ja vaihtelut aivoalueittain suuria. Hermosolujen aktivaatiosta seuraavat välittäjäainevapautukset ovat hyvin nopeita ja pienen mittakaavan ilmiöitä: vapautuksen on tutkimuksissa havaittu tapahtuvan alle millisekunnissa synapsirakoon, jonka leveys on muutamia kymmeniä nanometrejä (Scimemi 2009). Vapautuksen jälkeen valtava määrä erilaisia tekijöitä vaikuttavat mittaelektrodille mahdollisesti havaittavissa olevan välittäjäainepitoisuustransientin muotoon. Tämä työn tarkoitus on selvittää mitä vaatimuksia välittäjäaine-elektrodeilla on ajallisen vasteen, herkkyyden ja havaitsemisrajojen suhteen glutamaatin ja dopamiinin mittaamista syväaivostimulaation yhteydessä silmällä pitäen. Toisessa luvussa kartoitetaan mitä nykypäivänä tiedetään glutamaatin ja dopamiinin pitoisuuksista ja niiden pitoisuustransienttien aika-ikkunoista aivoissa. Kolmannessa luvussa kerrotaan lyhyesti perusperiaatteista glutamaatin ja dopamiinin mittauksessa mikroelektrodeilla, ja neljännessä luvussa kartoitetaan mitkä seikat vaikuttavat elektrodien suorituskykyyn sekä millä keinoin sitä voidaan parantaa. Viimeisessä luvussa pohditaan työn tuloksia, eli elektrodien suorituskyvyn soveltuvuutta syväaivostimulaatiomittauksiin. 1

2. Aivojen glutamatergisen ja dopaminergisen välityksen karakterisointi Glutamaatti ja dopamiini ovat keskushermoston välittäjäaineita, joiden toimintatapa ja -kohteet eroavat monessa mielessä toisistaan. Glutamaatti on aivojen pääasiallinen eksitatorinen välittäjäaine; arvioidusti 50 % kaikista keskushermoston hermosoluista, ja jopa 95 % kaikista eksitatorisista hermosoluista ovat glutamatergisiä (Rieben 2009). Glutamatergiset hermosolut ovat laajalti jakautuneet koko aivojen alueelle (Thompson 1985, s.113). Dopamiinin rooli taas on tiettyjen hermoratojen toiminnan säätely, ja dopaminergisiä hermosoluja löytyy aivoista vain muutamilta alueilta. Näistä merkittävin on tyvitumakkeiden (joukko syväaivo-rakenteita jotka yhdessä säätelevät muun muassa motorisia toimintoja) mustatumakkeista (substantia nigra, SN) muihin tyvitumakkeiden osiin projisoivat dopaminergiset hermoradat. Nämä ovat myös syväaivostimulaatiossa mielenkiinnon kohteena, sillä juuri mustatumakkeiden dopaminergisten hermosolujen rappeutuminen on Parkinsonin taudin pääpiirre (Thompson 1985, s. 123-125). Tyvitumakkeiden subtalaminen tumake (subthalamic nucleus, STN) on syväaivo-stimulaation tavallinen kohde Parkinsonin taudissa (Modolo 2009). Glutamaatin ja dopamiinin toisistaan hyvin erilaisten ominaisuuksien takia ne käsitellään tässä luvussa ja koko lopputyössä erikseen omina kokonaisuuksinaan. Glutamaatin ja dopamiinin toiminta aivojen signaalinvälittäjinä käsittää erityksen hermosolusta, diffuusion synapsissa ja/tai synapsin ulkopuolella, sitoutumisen solukalvoihin ankkuroituihin reseptoreihin, ja lopulta sisäänoton takaisin solujen sisään välittäjäainekantajien avulla. Erityksen jälkeen kohoaa siis ympäröivän solunulkoisen tilan välittäjäainepitoisuus. Kohonneen pitoisuuden suuruus, laajuus ja kesto taas määräytyvät pääsääntöisesti diffuusion ja sisäänoton yhteisvaikutuksesta. Näiden prosessien suhteellinen teho vaihtelee välittäjäaineittain ja aivoalueittain, ja niiden mekanismit ovat pitkälti erikoistuneet välittäjäaineen tehtävään. Niinpä tässä luvussa kuvataan aluksi glutamatergisen ja dopaminergisen välityksen ominaispiirteet. Tämän jälkeen ovat fokuksessa tyvitumakkeet ja syväaivostimulaatio. Katsauksella alan tutkimuksiin pyritään selvittämään minkälaisia välittäjäainepitoisuuksia ja -purkauksia välittäjäaineanturit tulevat syväaivorakenteissa kohtaamaan. Kysymys on erityisen haastava sillä vaihtelevista, usein jopa ristiriitaisista tutkimustuloksista ilmenee, että välittäjäaineiden toiminnasta tiedetään yhä aivan liian vähän. Syy- ja seuraussuhteita välittäjäaineiden pitoisuusmuutosten, Parkinsonin taudin, syväaivostimulaation, ja itse mittausmenetelmän mahdollisesti aiheuttamien hermostollisten häiriötilojen välillä ei vielä tunneta. Tutkimuskysymykset eivät siis rajoitu siihen minkälaisista pitoisuuksista ja miten nopeista pitoisuusmuutoksista anturien on selvittävä, vaan sisältävät myös mistä niitä yleensä kannattaisi mitata ollakseen relevantteja syväaivostimulaatiohoidon tehon kannalta. Näihin kysymyksiin palataan luvussa 5. 2

2.1 Glutamatergisen välityksen luonne Glutamatergisen välityksen uskottiin pitkään rajoittuvan vain eksitatoriseen signaalinvälitykseen synapsiraon sisällä. Tässä hyvin tunnetussa prosessissa presynaptisesta terminaalista vapautuneet glutamaattimolekyylit diffusoituvat postsynaptiseen terminaaliin ja sitoutuvat tämän solukalvoon ankkuroituihin ionotrooppisiin glutamaattireseptoreihin. Tämän seurauksena reseptorien ionikanavat avautuvat, mikä aiheuttaa ionivirtoja solukalvon läpi depolarisoiden sitä. Mikäli ionivirtojen aiheuttama depolarisaatio ylittää kynnysarvon, laukaisee se aktiopotentiaalin postsynaptisessa hermosolussa. Koko prosessi kestää tyypillisesti alle millisekunnin. (Bear 2007). Aivot hyödyntävät tämäntyyppistä glutamatergistä välitystä nopeassa signaloinnissa, jota jatkuvasti tapahtuu esimerkiksi aisti-informaation ja ajatusten prosessoinnin, sekä kehon toimintojen säätelyn yhteydessä. Glutamaattivapautus synapsirakoon kuvaa siis aktiviteettiä kyseissä hermosolussa. Hermostollista aktiviteettia voidaan suhteellisen helposti mitata esimerkiksi elektrofysiologisesti, eli solukalvojen jännityksen tai reseptorien ionivirtojen mittauksella, tai optisesti jännite- tai kalsiumherkkien merkkiaineiden avulla, sen sijaan, että yritetään suoraan mitata glutamaattipitoisuutta hyvin vaikeasti tavoitettavan, vain muutamia kymmeniä nanometrejä leveän synapsiraon sisältä. Näytteitä toisenlaisesta, säätelevästä glutamaattivälityksestä on kuitenkin viimeisen kahdenkymmenen vuoden sisällä noussut esiin. Glutamaatin ylivuodoksi (extrasynaptic overspill) kutsutussa ilmiössä glutamaatti diffusoituu ulos synapsista solunulkoiseen tilaan. Teorioita ylivuodosta puoltavat ensinnäkin havainnot metabotrooppistista glutamaattireseptoreista (mglur) synapsien ulkopuolisissa solukalvoissa (Rusakov 1998). Metabotrooppisten reseptorien aktivoituminen laukaisee monivaiheisia kemiallisia reaktioketjuja, jotka pitkällä aikavälillä säätelevät hermosolujen toimintaa. Myös glutamaattikantajien (excitatory amino acid transporter EAAT) tiheää esiintymistä synapsien ulkopuolisissa astrosyyteissä (hermotukisolu, jonka tehtävä on huolehtia hermosolujen kemiallisesta tasapainosta) pidetään näytteenä siitä, että glutamaatilla on fysiologinen rooli myös solunulkoisessa tilassa (Bergles 1999). Viimeaikaisissa tutkimuksissa on havaittu myös astrosyyttien voivan vapauttaa glutamaattia suoraan synapsien ulkopuoliseen tilaan (Lee 2007). Glutamaattiylivuodon kokonaisvaltainen fysiologinen merkitys on kuitenkin vielä hyvin epäselvä. Toisaalta uskotaan sen olevan perusta esimerkiksi muistiin ja oppimiseen liittyviin ilmiöihin metabotrooppisten reseptoreiden aktivoitumisen kautta, mutta toisaalta tiedetään kohonneiden solunulkoisten glutamaattipitoisuuksien olevan haitallisia hermosoluille. Glutamaattikantajien pääasiallisena tehtävänä pidetäänkin solunulkoisen glutamaatin puskurointia; ne sitovat nopeasti solunulkoista glutamaattia ja siirtävät sen solujen sisään. (Bergles 1999). Ylivuotaneen glutamaatin pitoisuuksien mittaaminen on erityisen tärkeää sen fysiologisen merkityksen selvittämiseksi. Kohonneen solunulkoisen pitoisuuden suuruus ja kesto ratkaisevat kykeneekö glutamaatti aktivoimaan synapsien ulkopuolisia reseptoreita, vai onko vaikutus peräti haitallinen. Mielenkiintoa glutamaattiylivuotoa kohtaan nimenomaan syväaivostimulaation kannalta herättävät esitetyt teoriat glutamaatin roolista Parkinsonin taudissa (Barone 2010) ja havainnot 3

kohonneista solunulkoisista glutamaattipitoisuuksista tyvitumakkeissa syväaivostimulaation yhteydessä (Windels 2000, Windels 2003, Lee 2007, Yu 2011). 2.2 Tutkimustuloksia glutamaatin pitoisuuksista ja ylivuodosta Glutamaatin basaalipitoisuutta, eli keskimääräistä solunulkoista glutamaattipitoisuutta, on yleisesti mitattu mikrodialyysillä. Menetelmässä aivojen solunulkoiseen tilaan asetetun kanavan kautta solunulkoisen nesteen komponentteja otetaan talteen ja analysoidaan ulkoisesti (Rieben 2009). Mikrodialyysillä ei kuitenkaan voida havaita nopeita muutoksia glutamaattipitoisuuksissa, joita glutamaattiylivuodon seurauksena on odotettavissa. Parempaan ajallliseen vasteeseen on pyritty suoraan mittauskohteeseen upotettavilla sähkökemiallisilla mikroelektrodeilla, joita tässä työssä käsitellään tarkemmin luvuissa 3.1. Hyvin lupaava menetelmä glutamaattiylivuodon tutkimiseen on optiset glutamaatti-indikaattorit. Näiden molekylaaristen anturien fluoresenssiemission intensiteetti korreloi glutamaattipitoisuuteen, ja ne voidaan kohdentaa nimenomaan synapsien ulkopuoliseen tilaan (Hires 2008, Okubo 2010). Menetelmä on ajalliselta (vaste glutamaatille millisekunneissa) ja paikalliselta (molekylaaristen anturien leviäminen mahdollistaa 2D-kuvantamisen) resoluutioltaan ylivertainen muihin kokeellisiin menetelmiin, mutta rajoittuu optisten signaalien heikkouden takia aivokuoren tai ohutleikkeiden tutkimiseen. Yksityiskohtaisia mallinnuksia glutamaattiylivuodosta on tehty muisti-ilmiöihin liitetyssä aivoalueessa hippokampuksessa (Diamond 2005, Zheng 2008). Vastaavia tutkimuksia ei tyvitumakkeille ikävä kyllä ole raportoitu, mikä johtunee siitä, että kiinnostus glutamaattiylivuodon merkitykseen tyvitumakkeissa on herännyt vasta viimeaikaisten tutkimustulosten myötä. Myöskään optisia indikaattoreita ei toistaiseksi ole hyödynnetty tyvitumaketutkimuksissa. Seuraavaksi esitellyt tutkimustulokset kuvaavat näin ollen glutamaattipitoisuuksia tyvitumakkeissa melko karkealla tasolla. Taulukossa 1 sivuilla 5-6 on esitetty tutkimustuloksia glutamaattipitoisuuksista ja transienteista, pääpainona tyvitumakkeisiin kohdistuneet tutkimukset mikrodialyysillä ja mikroelektrodeilla. Mukana on vertailun vuoksi myös muutamia muilla menetelmillä ja muissa aivoalueissa tehtyjä tutkimuksia. Tutkimusasetelmia on lukuisia; glutamaattivapautusta on stimuloitu muun muassa kaliumionin, sähköisen stimulaation ja tuntoärsykkeiden hermosoluja depolarisoivan vaikutuksen avulla. Glutamaattikantajien roolia on yleisesti tutkittu vertaamalla glutamaattipitoisuuksia ja transienttien ajanjaksoja ennen ja jälkeen glutamaattiantajien antagonistin treo-βbentsyloksiaspartaatin (TBOA) applikaation, mikä vähentää kantajien kykyä siirtää glutamattia solun sisään. 4

Taulukko 1: Tutkimustuloksia glutamaattipitoisuuksista ja transienteista (jatkuu seuraavalla sivulla) Mittausmenetelmä Mikrodialyysi Mikrodialyysi Mikrodialyysi Koe-eläin & aivoalue Rotta, nukutettu, hippokampus Jänis, nukutettu, hajukäämi Rotta, vapaasti liikkuva, aivojuovio Mittauskohde & ärsyke Aikaresoluutio Pitoisuus Solunulkoinen basaalitaso. 2.9 μm Solunulkoinen basaalitaso. 4.3 µm Solunulkoinen basaalitaso. 3.0 ± 0.6 μm Viite Lerma 1986 Jacobson 1985 Miele 1996 Mikroelektrodi Rotta, nukutettu aivojuovio Solunulkoinen basaalitaso. (26 rotan keskiarvo) 29 ± 9 μm Kulagina 1999 Mikrodialyysi Rotta, nukutettu aivojuovio Solunulkoinen basaalitaso 1.5 ± 0.27 μm Zhang 2004 Solunulkoinen basaalitaso. 2.0 ± 0.5 µm Mikroelektrodi Rotta, nukutettu dorsaalinen aivojuovio Kokaiinin vaikutus. (akuutisti tai 7 päivän toistuvan applikaation jälkeen) Mittaukset 30 min applikaation jälkeen. Kerta-annos: ei muutoksia Toistuva annos 7.5 ± 1 µm Rahman 2005 Solunulkoinen basaalitaso (85 rotan keskiarvo) 18.2 ± 9.3 µm Mikroelektrodi Mikrodialyysi Rotta, nukutettu, aivojuovio Rotta, nukutettu aivojuovio Diabeetikkorotta, nukutettu, aivojuovio K + ionin aiheuttama depolarisaatio. Kainaatin aiheuttama depolarisaatio. Kantajablokkeri TBOA:n vaikutus basaalitasoon. Solunulkoinen basaalitaso. 45.7 µm Diabeteksen vaikutus solunulkoiseen basaalitasoon. Nousaika n. 6 s. Lasku alkaa 15-20 s applikaatiosta. Paluu basaaliiin 2 min. Nousuaika n. 30 s. Lasku alkaa n. 1.5 min applikaatiosta. Paluu basaaliiin >7.5 min. Nousuaika n. 30 s. Laskua ei havaita lainkaan 5 min sisään applikaatiosta. nousu 150-400 % KCL annoksesta riippuen. nousu 250 % nousu 175 % 91.6 µm Oldenziel 2006 Li 2007 Optinen glutamaattiindikaattori (SuperGluSnFR) Soluviljelmä, hippokampus Glutamaattiylivuoto dendriitin läheisyydeessä aktiopotentiaaleja (AP) aiheuttavan sähköisen stimulaation seurauksena. a) 1 AP b) 10 AP (15 Hz) c) 10 AP (30 Hz) d) 1 AP + TBOA e) 10 AP (15 Hz) + TBOA f) 10 AP (30 HZ) + TBOA Nousuaika/Puoliitumisaika a) 67 ms / 90 ms b) 4 stimulaatiopulssia / 160 ms c) 4 stimulaatiopulssia / 140 ms d) 67 ms / 140 ms e) koko stimulaation kesto / 650 ms f) koko stimulaaiton kesto / 390 ms Huippupitoisuudet: a) 0.27 µm b) 0.54 µm c) 0.83µM d) 0.44 µm e) 1.2 µm f) 1.3 µm Hires 2008 5

Solunulkoinen basaalitaso. (kun synaptinen aktivaatio on vähäistä = 0.05 HZ vapautustaajuus) 30-50 nm Matemaattinen mallinnus Optinen glutmaattiindikaattori (EOS) Mikroelektrodiasetelma, joka mittaa glutamattivuota Rotta, hippokampus. Mallinnusalue (40 µm) 3 Hiiri, pikkuaivot, ohutleikkeet Hiiri, neokorteksi ohutleikkeet Hiiri, hippokampus ohutleikkeet Rotta, tuntoaivokuori Hiiri, soluviljelmä (16 % neuroneja, 7 % astrosyyttejä) Mittaukset 1 µm solujen pinnasta. Ylivuoto aktivaation seurauksena. Isompi ja pienempi aktiivisen synapsin populaatio, joiden vapautustaajus 2 Hz. Loput alueesta 0.05 Hz. Kantajien aktiivisuutta varioitiin: A) 100 % aktiivisia B) 2.5 % aktiiviai Sähköisesti stimuloidun (100 Hz, 1/2/3/5 pulssia) synaptisen aktiivisuuden aiheuttamat synapsin ulkopuoliset glutamaattitransientit Tuntoärsykkeen (käpälän kosketus) aiheuttama ylivuoto Solunulkoinen basaalitaso. K+ ionin aiheuttama depolarisaatio. Kantajien TBOA blokkauksen vaikutus basaalitasoon. Kantajien TBOA blokkauksen vaikutus K + depolarisaatioon. Nousuaika mikromolaarin luokkaan (väh. 2 pulssia) kymmeniä millisekunteja. Pitoisuus arvioitiin keskiarvona 50 ms sekunnin sisään stimulaatiosta. Noin sekunnin kestävä terävä signaalipiikki Pitoisuuden nousuaika n. 1 min Vapautusvuon nousuaika <1.5 s Sisäänottovuon eksponentiaalinen aikavakio: 1.6/min Vapautusvuon nousuaika <1.5 s Sisäänottovuon eksponentiaalinen aikavakio: 1.2/min A) Isomman aktiivisen populaation ympärillä pitoisuus n. 1 µm n.1 µm 2 kokoisella alueella. B) Pitoisuus nousee > 1 µm yli 10 µm 2 alueella. Isomman aktiivisen alueen läheisyydessä jopa 3 µm 0 µm / 1 µm / 3.5 µm / 8 µm 2.2 µm 2.1 µm ei kvantisoitu pitoisuus: 5.8 ± 0.6 µm vuo sisäänpäin: 34 ± 6 fmol/cm 2 s Pitoisuus kohosi 2.1 ± 0.4 µm Maks. vuo ulos/sisään: 500 ± 190 / 135 ± 14 fmol/cm 2 s Pitoisuus: 7.4 ± 0.5 µm Vuo sisäänpäin: 1.1 ± 7.4 fmol/cm 2 s Maks. vuo ulos/sisään: 370 ± 86 / 36 ± 3 fmol/cm 2 s Zheng 2008 Okubo 2010 McLamore 2010 Reaaliaikainen mikrodialyysi yhdistettynä mikroelektrodiin Rotta, nukutettu aivojuovio Solunulkoinen basaalitaso. K+ ionin aiheuttama depolarisaatio. Nousu alkaa 400 s applikaation jälkeen. Nousu maksimiin 900 s Lasku takaisin basaaliin n. 600 s 3.01 ± 0.67 μm Nousu basaalitasosta 2.04 ± 0.40 μm Yu 2011 6

2.3 Tutkimustuloksia kohonneista glutamaattipitoisuuksista tyvitumakkeissa syväaivostimulaation yhteydessä Subtalamiseen tumakkeeseen kohdistuvan syväaivostimulaation aikana on koe-eläin tutkimuksissa mitattu solunulkoisen glutamaattipitoisuuden kasvua tyvitumakkeiden eri osissa: linssitumakkeessa (Globus pallidus, GP), mustatumakkeessa, aivojuovuissa (striatum) ja itse subtalamisessa tumakkeessa. Taulukossa 2 on yhteenveto kyseisten tutkimusten tuloksista. Kaikissa tutkimuksissa ovat koe-eläiminä olleet nukutetut rotat. Glutamaattipitoisuuksien on myös havaittu olevan stimulaatioparametreista riippuvaa. Kuvassa 1 on esitetty rotan subtalamisesta tumakkeesta mitattujen glutamaattipitoisuuksien parametririippuvuuksia, lähteestä Lee (2007). Parametririippuvuus on erityisen tärkeä ilmiö, koska kyky näiden eroavaisuuksien havaitsemiseen on oleellista glutamaattielektrodeille, kun tavoitteena on syväaivostimulaation parametrien säätely glutamaattipitoisuuden mukaan. Kuva 1: Rotan subtalamisessa tumakkeessa mitattu glutamaattipitoisuuden riippuvuus syväaivostimulaation parametreista. I. intensiteettiriippuvuus, II. aikariippuvuus, III. taajuusriippuvuus. Muokattu lähteestä (Lee 2007). 7

Taulukko 2: Tutkimustuloksia glutamaattipitoisuuksista ja -transienteista syväaivostimulaation yhteydessä Stimulaatioparametrit taajuus//pulssinleveys// intensiteetti//stimulaatioaika 130 Hz // 60 µs // 500 µa // 1 h Mittausmenetelmä Mittauskohde Mustatumake (pars reticulata ) ipsilateraalinen stimulaatiolle Mustatumake (pars reticulata ) kontralateraalinen Linssitumake (internal ) ipsilateraalinen Linssitumake (internal ) kontralateraalinen Mikrodialyysi Aikaresoluutio Näytteenottoväli 15 min: A) 3 ennen stim. (basaalitaso) B) 4 stim. aikana C) 8 stim. jälkeen Pitoisuudet A) 0.55 µm B) 166 ± 53 % (4. näyte) C) 512 ± 77 % (5. näyte, jonka jälkeen alkoi hidas lasku) A) 0.55 µm B) 336 ± 40 % (4. näyte) C) 480 ± 40 % (laskua ei havaittu mittauksen A) 0.35 µm B) 172 ± 38 % (4. näyte) C) 330 ± 52 % (5. näyte, jonka jälkeen alkoi hidas lasku) ei havaittu muutoksia Viite Windels 2000 10/60/130/350 Hz // 60 µs // 500 µa // 1 h Mustatumake (pars reticulata ) Linssitumake ipsilateraalinen Mikrodialyysi Näytteenottoväli 15 min: A) 4 ennen stim. (basaalitaso) B) 4 stim. aikana C) 8 stim. jälkeen Samaa luokkaa kuin yllä. Taajuusriippuvuus 10 Hz: ei merk. muutosta 130 Hz: maksimimuutokset Windels 2003 100 Hz // 100 µs // 100-3000 µa // 10 s 100 Hz // 100 µs // 300 µa // 10-3600 s 25-1000 Hz // 100 µs // 300 µa // 10 s Subtalaminen tumake Mikroelektrodi Kuva 1 Pitoisuuksien nousajat riippuivat parametreistä, kymmenien sekuntien - minuuttien mittaluokassa. Kuva 1 Pitoisuudet voimakkaasti parametririippuvaisia ja nousivat kymmenistä satoihin mikromolaareihin, Variaatio rottien välillä suurta. Lee 2007 120 Hz // 2 ms // 10 V // 300 s Aivojuovio Mikrodialyysi yhdistettynä mikro-elektrodiin Nousi tasanteeseen 10 min ajaksi jonka jälkeen lasku takaisin basaaliin kesti 200 s. Basaali: 3.01 ± 0.67 μm Lisäys basaaliin: 4.68 ± 0.30 µm Yu 2011 8

2.4 Dopaminergisen välityksen luonne Dopamiinin vaikutus on tunnetusti vain synapsien ulkopuolista. Välittäjäainevapautuksen jälkeen dopamiinin siis uskotaan vuotavan ulos synapseista, missä se sitoutuu muun muassa hermosolujen dendriiteissä sijaitseviin metabotrooppisiin reseptoreihin. Ilmiötä kutsutaan dopamiinin volyymitransmissioksi, jonka kautta dopamiinin säätelevä vaikutus hermosoluihin tapahtuu. Yksinomaan synapsin ulkopuolista, säätelevää vaikutusta tukee ensinnäkin, että dopamiinille on löydetty vain metabotrooppisia reseptoreita (Robinson 2008). Toiseksi, ovat sekä dopamiinin reseptorit, että dopamiinikantajat (dopamine active transporter DAT), jotka siirtävät dopamiinia takaisin solujen sisään, sijoittuneet pääasiallisesti synapsien ulkopuolelle. Dopamiinikantajien on todettu rajoittavan dopamiinipitoisuuksia huomattavasti vähemmän kuin mitä glutamaattikantajat rajoittavat glutamaatin pitoisuuksia synapsien ulkopuolella (Rice & Gragg 2008). Lisäksi synapsien ulkopuolisia dopamiinitransientteja dopaminergisten hermosolujen sähköisten tai toiminnallisten ärsykkeiden seurauksena on havaittu lukuisissa mittauksissa, kuten taulukoissa 4-5 (s. 11-12) esitetyissä tutktimustuloksissa käy ilmi. Toinen erityispiirre dopaminergiselle välitykselle on, että hermosolujen aksonipäätteisiin sijoittuneiden synapsien lisäksi dopamiinia vapautuu solujen soomasta ja dendriiteistä. Tämä somatodendriittinen dopamiinivapautus on ominaista dopamiinin lähdetumakkeille, eli tyvitumakkeiden mustatumakkeet ja tämän läheisyydessä sijaitseva ventraalinen keskiaivojen peitealue (ventral tegmental area VTA). Kyseisten tumakkeiden dopaminergisten solujen aksonit projisoivat muihin tyvitumakkeisiin, joissa taas dopamiinivapautus tapahtuu pääosin synapseista aksonipäätteissä (Rice & Gragg 2008). Dopamiinia vapauttavien päätteiden ja dopamiinikantajien tiheydessä on eroja tyvitumakkeiden eri osien välillä. Kaikkein tiheiten dopamiinia vapauttavia päätteitä esiintyy aivojuoviossa (Benoit-Marand 2007). Dopaminergiset hermosolut laukovat aktiopotentiaaleja vapauttaen dopamiinia eri toiminnallisissa tiloissa, joita kutsutaan tooniseksi ja faasiseksi tilaksi (Venton 2003). Kukin tila aiheuttaa ominaisia muutoksia solunulkoisiin dopamiinipitoisuuksiin. Tooninessa tilassa solut vapauttavat dopamiinia matalalla taajudella, satunnaisesti ja toisistaan riippumatta. Tämä aikaansaa dopamiinin basaalitason, joka on vakio laajalla alueella. Faasisessa aktiviteetissa ryppäät vierekkäisiä hermosoluja vapauttavat tahdistetusti dopamiinia, mikä aiheuttaa paikallisesti hetkittäin kohonneita dopamiinipitoisuuksia, eli transientteja solunulkoiseen tilaan. On havaittu, että solujen faasisen ja toonisen laukomisen taajuusparametrit vaihtelevat huomattavasti niin eri tumakkeiden välillä kuin tietyssä tumakkeessa olevien hermosolujen välillä (Hyland 2002). Faasinen laukomisen taajuuden lisääntyminen on seurausta dopaminergisestä aktivaatiosta. Dopaminergisten aksonipäätteiden, somatodendriittisten vapautuskohtien, dopamiinikantajien tiheyden ja toonisen ja faasisen laukomisen taajuusparametrien lisäksi dopamiinipitoisuuskiin vaikuttavaa oleellisesti dopaminergisen välityksen plastisuus. Vielä melko puutteellisesti tunnettujen fysiologisten prosessien seurauksena on dopamiinivapautus itsesäätelevää eli plastista. Tämä tarkoittaa, että riippuen dopaminergisten solujen aktivaation kestosta, muuttuu niiden vapauttaman dopamiinin määrä laukomista kohden. Laukomistaajuudesta riippuen voi määrä joko 9

vähentyä (depressio) tai kasvaa (fasilitaatio), ja ilmiöt voivat olla lyhyt- tai pitkäkestoisia. (Montague 2004) Dopamiinilla on tärkeä rooli tyvitumakkeiden liikettä säätelevissä hermoradoissa, ja yhteenvetona edelliseen, ovat fysiologiset mekanismit sen pitoisuuksien ja transienttien säätelyyn todella hienostuneita ja monimutkaisia. Osoitus tyvitumakkeiden dopaminergisen välityksen mukautumiskyvystä on, että Parkinsonin taudissa rappeutuvat mustatumakkeiden dopaminergisistä hermosoluista noin 85 % ennen kuin ensimmäiset motoriset oireet ilmenevät (Bergström 2003). Monet tutkijat pitävät dopamiinipitoisuuksien laskua tyvitumakkeissa Parkinsonin taudin oireiden aiheuttajana ja niiden ulkoisesti kohottamista mahdollisena oireiden lievityskeinona. Niinpä dopamiinin solunulkoisten pitoisuuksien ja transienttien mahdollisimman tarkka mittaus on tärkeää ymmärryksen kartuttamiseksi ja Parkinsonin taudin hoitomuotojen kehittämiseksi. 2.5 Tutkimustuloksia dopamiinipitoisuuksista ja -transienteista tyvitumakkeissa Dopamiinia on tutkittu erityisen paljon juuri tyvitumakkeissa. Sen sähkökemialliset ominaisuudet ja välityksen lokalisoitunut ja pääasiallisesti synapsien ulkopuolinen luonne mahdollistavat sen mittaamisen suoraan aivoista hyvällä ajallisella vasteella mikroelektrodeilla, joita kuvataan tarkemmin kappaleessa 3.2. Mikroelektrodimittaukset ovat näin ollen selvästi yleisin menetelmä dopamiinidynamiikan karakterisointiin ja tutkimuksia on tehty todella paljon. Lisäksi dopamiinin basaalipitoisuuksia on arvioitu mikrodialyysin avulla. Seuraavissa taulukoissa on esitetty tuloksia dopamiinitutkimuksista, joissa on mitattu tyvitumakkeiden eri osien dopamiinipitoisuuksia ja -transientteja erilaisissa olosuhteissa. Taulukossa 3 on luonnollisia basaalipitoisuuksia. Taulukossa 4 on luonnollisten ärsykkeiden aiheuttamia transientteja. Taulukon 5 tutkimuksissa on mitattu dopaminergisten solujen sähköisen stimulaation aiheuttamia transientteja. Stimulaaiton kohteena on joko dopaminergisten solujen lähdealue, eli mustatumakkeet ja ventraalinen peitealue (SN/VTA), tai mediaalinen etuaivonippu (medial forebrain bundle MFB), eli aksoninippu joka sisältää muun muassa VTA:sta aivojuovioon projisoivia aksoneja. Taulukko 3: Tutkimustuloksia dopamiinin luonnollisesti esiintyvistä basaalipitoisuuksista Mittausmenetelmä Mikrodialyysi (kirjallisuuslähteistä) Mikroelektrodit ja Teoreettiset estimaatiot (kirjallisuuslähteistä) Mikrodialyysi Mikrodialyysi Koe-eläin & aivoalue Teoreettinen estimaatio Rotta, aivojuovio 30 nm Apina, aivojuovio Apina, Parkinson malli, aivojuovio Rotta, nukutettu, aivojuovio Häntätumake: 82 ± 50 nm Aivokuorukka: 34 ± 19 nm Häntätumake: 36 ± 12 nm Aivokuorukka: 13 ± 8 nm 65 nm Pitoisuus Viite Rotta, aivojuovio 5-20 nm Robinson 2003 Rotta, aivojuovio 50-100 nm Robinson 2003 Venton 2003 Zhao 2009 Wen 2009 10

Taulukko 4: Tutkimustuloksia luonnollisesti esiintyvistä dopamiinitransienteista Mittausmenetelmä Mikroelektrodi (FSCV) Mikroelektrodi (FSCV) Koe-eläin & aivoalue Rotta, vapaasti liikkuva, aivojuovio (NAcc) Rotta, hereillä oleva, aivojuovio Ärsyke a) Ei ärsykettä b) Kanssakäyminen lajitoverin kansa Aikaresoluutio Huippupitoisuus [DA] max Viite Ei ärsykettä Transientin kesto 2-4 s 32 nm Transientin kesto a) 4.4 ± 0.20 s b) 6.0 ± 0.4 s Transienttien taajuus kasvoi noin nelinkertaiseksi (noin 0.4-1.1 /min) basaalista lajitoverin esityksestä a) 160 ± 10 nm b) 240 ± 20 nm Vaihtelut rottien välillä suuria Cheer 2004 Robinson 2002 Miktoelektrodi (FSCV) Rotta hereillä oleva, aivojuovio Luonnolliset ärsykkeet (ruoka, haju, ääni) Transientin kesto 4.8 ± 0.4 s Ärsykkeet kasvattivat esiintymistaajuutta 140 ± 20 nm Robinson 2004 Taulukko 5: Tutkimustuloksia sähköisen stimulaation avulla aiheutetuista dopamiinitransienteista (jatkuu seuraavalla sivulla) Mittausmenetelmä Koe-eläin & aivoalue Sähköinen stimulaatio (kohde & parametrit) Aikaresoluutio Huippupitoisuus [DA] max / Yhden stimulaatiopulssin vapauttama pitoisuus [DA] p Viite Mikroelektrodi (FSCV) Rotta, nukutetu, aivojuovio (CP) & amygdala (BAN) SN/VTA tai MFB (300-350 µm, 2 ms) A) 20 Hz, 6 s B) 60 Hz 10 s Tasainen nousu stimulaaiton keston (2-6 s) ajan, jonka jälkeen laskua sekuntien ajan. Hitaampi lasku BAN:ssa kuin CP:ssä. [DA] max A) 200nM (CP) B)11 µm (CP) A) 600 nm (BAN) B) 2.5 µm (BAN) Garris 1994 Mikroelektrodi (FSCV) Rotta, nukutettu, aivojuovio (NAcc & CP) MFB (300 µa, 4 msec, 2 s, 10-60 Hz) Nousuaika stimulaation keston ajan. Laskuaika muutamia sekunteja. [DA] p CP, 10-30 Hz: 70 nm CP, 40-60 Hz: 80 nm NAcc, 10-30 Hz: 55 nm NAcc, 40-60 Hz: 70 nm Wu 2002 Mikroelektrodi (amperometria) ja matemaattinen mallinnus [DA] p :n taajuusriipuvuudesta Rotta Aivojuovio (CP) Amygdala (BAN) SN/VTA 300 µa, 2 ms 100 Hz, 4 pulssia 60 Hz, 24 pulssia 60 Hz, 24 pulssia < 10 ms 83 ± 7 ms 340 ± 35 ms Nousuaika [DA] p 160 ± 20 nm 120 ± 20 nm 8 ± 2 nm Venton 2003 Mikroelektrodi (FSCV) Rotta, vapaasti liikkuva, aivojuovio (NAcc) MFB 25 µa, 2 msec, 60 Hz (+ kannabinoidi reseptori agonostin vaikutus) Transientin kesto 4-5 s (nousuaika alle sekunnin). Agonisti pienensi transientteja, mutta lisäsi niiden esiintymistaajuutta (1.4 -> 3.9 /min) [DA] max 521 nm Agonistin kanssa: 161 nm Cheer 2004 Mikroelektrodi (FSCV) ja matemaattinen mallinnus Rotta, vapaasti liikkuva, aivojuovio (CP) Rotta, nukutettu, aivojuovio SN/VTA (120 µa, 60 Hz) 24 pulssia SN/VTA (120 µa, 60 Hz) 600 pulssia 2 min välein Nousuaika stimulaation keston ajan (n. 0.5 s) Laskuaika samaa luokkaa Merkittävää pitoisuusvasteen laskua pulssisarjaan havaittiin stimulaation alkuvaiheilla [DA] max noin 250 nm [DA] max 1. pulssisarja: 5 µm viimeinen pulssisarja: 1 µm Montague 2004 Mikroelektrodi (FSCV) Rotta, nukutettu, aivojuovio (NAcc) SN/VTA (125 µa, 2 ms, 24 pulssia, 60 Hz) Nousuaika /laskuaika Alle sekunti / 2-3 s [DA] max n. 600 nm Heien 2005 Mikroelektrodi (FSCV) Rotta, nukutettu, aivojuovio (CP) SN/VTA (125µA, 2 ms, 40 pulssia, 60 Hz, 2 min välein) Nousu kestää stimulaation keston ajan [DA] max n. 2 µm [DA] max Hermans 2008 11

Mikroelektrodi (FSCV) Mikroelektrodi (FSCV) Mikroelektrodi (FSCV) Rotta, nukutettu, aivojuovio Rotta, nukutettu, aivojuovio (CP) Hiiri, ohutleikkeet: Aivojuovio VTA SNc MFB (300 µa, 2 ms, 0.5-4 s, 60 Hz) SN/VTA (300 µa, 2 ms, 130 pulssia, 130 Hz) Kunkin aivoalueen soluihin kohdistettu stimulaatio. a) 1 pulssi (60 ms) b) 5 pulssia, 40 Hz Nousu kestää stimulaation keston ajan Lasku noin yhtä pitkään, mutta pitoisuus jää tasanteeseen hieman alkuperäistä Nousu stimulaation keston ajan (1 s) Lasku 2-3 s. Nousuaika / Puoliintumisaika [DA] max a) 133 ± 33 ms / 415 ± 40 ms a) 948 nm a) 177 ± 26 ms / 755 ± 79 ms b) n. 300 ms / n. 1500 ms a) 47 nm b) 171 nm b) n. 300 ms / n. 1500 ms [DA] max n. 200 nm - 7.5 µm stimulaation kestosta riippuen [DA] max 0.24-0.41 µm b) 61 nm Bledsoe 2009 Shon 2010 Ford 2010 2.6 Tutkimustuloksia kohonneista dopamiinipitoisuuksista tyvitumakkeissa syväaivostimulaation yhteydessä Subtalamiseen tumakkeeseen kohdistuvan syväaivostimulaation on useissa tutkimuksissa havaittu kohottavan solunulkoisia dopamiinipitoisuuksia aivojuoviossa, niin lyhytaikaisesti kuin pitkäkestoisesti. Ilmiötä pidetään mahdollisena syväaivostimulaation vaikutusmekanismina, minkä vuoksi se on erityisen kiihkeän tutkimuksen kohteena. Taulukossa 6 on esitetty dopamiinipitoisuuksia syväaivostimulaation yhteydessä mitanneiden tutkimusten tuloksia. Myös dopamiinipitoisuuksien riippuvuutta syväaivostimulaation parametreista on havaittu. Tästä syystä myös dopamiinipitoisuus on mahdollinen itsesäätelyparametri syväaivostimulaatiohoidolle ja dopamiinielektrodien selviäminen parametrien mukaan tapahtuvasta pitoisuusvaihtelusta on tärkeää. Kuvassa 2 on esitetty eräässä tutkimuksessa havaittuja anturien dopamiinivasteen parametririippuvuuksia, lähteestä Lee (2006). Kuva 2: Rotan aivojuoviossa mitattu dopamiinipitoisuuden riippuvuus syväaivostumulaation parametreista I. taajuusriippuvuus, II. intensiteettiriippuvuus. Muokattu lähteestä (Lee 2006) 12

Taulukko 6: Tutkimustuloksia dopamiinipitoisuuksista ja -transienteista syväaivostimulaation yhteydessä Stimulaatioparametrit taajuus//pulssinleveys// sähkövirta//stimulaaitoaika Mittausmenetelmä Mittauskohde Aikaresoluutio Pitoisuudet Viite 50 Hz // 0.5 ms // 300 µa // 15 pulssia Nousuaika: 211 ± 13 ms Paluu basaaliin: 577 ± 22 ms Huippu lähes kolminkertainen basaaliin 50 Hz // 0.5 ms // 300 µa // 1000 pulssia 50 Hz // 0.5 ms // 300 µa // 1000 pulssia (Stimulointikohde hieman STN ulkopuolella) Rotta, nukutettu, aivojuovio Mikroelektrodi, amperometria (pitoisuuksia ei kvantisoitu) Nousuaika huippuoitoisuuteen: 365 ± 14 ms, jonka jälkeen lasku vakiopitoisuuteen, joka basaalia hieman korkeampi 1030 ± 35 ms Nousuaika huippupitoisuuteen: 6 s, josta alkaa hidas lasku alaspäin Huippu lähes kolminkertainen basaaliin, vakiotaso noin 30 % basaalia korkeampi Huippu yli 20-kertainen basaaliin nähden Lee 2006 5-300 Hz // 0.5 ms // 0-1600 µa // 15 pulssia Kuva 2. Maksimidopamiinipitoisuuden nousu 50 Hz, 300 µa. Erot taajuus-parametrien välillä moninkertaiset. Optimoitiin jatkuvasti hoidon aikana parhaiten oireita lievittäviksi Apinat, joiden toisen aivopuolen SN tuhottu hermomyrkyllä (parkinson malli) ja hoidetaan syväaivostimulaatiolla Mikrodialyysi basaalimittaus ennen stimulaation aloitusta ja 6 mittausta sen jälkeen ( 8 h / 1 vko / 1 kk / 2 kk / 8 kk / 10 kk) Terve, ei stimuloitu puolisko: Ei muutoksia basaalista 82 ± 50 nm / 34 ± 19 nm (häntätumake / aivokuorukka) Myrkytetty, stimulotu puolisko: Häntätumake: 36 ± 12 nm (ennen stim.) -> 80 ± 23 (8 kk) nm Aivokuorukka: 13 ± 8 (ennen stim.) -> 39 ± 4 nm (10 kk) Zhao 2009 60 Hz // 2 ms // 300 µa // 2 s (verrattiin myös MFB stimulointiin samoilla parametreilla) Rotta, nukutettu, Aivojuovio Mikroelektrodi, (FSCV) Nousuaika noin stimulaation keston ajan (2 s) Laskuaika n. 2 s [DA] max n. 500 nm (noin kolme kertaa pienempi kuin MFB stimuloinnin) Covey 2009 A) 120 Hz // 0.5 ms // 3-7 V // 2 s B) 60-240 Hz // 0.5 ms// 3 V // 2 s Sika, aivojuovio Mikroelektrodi, (FSCV) Nousuaika noin stimulaation keston ajan (2 s). Laskuaika 5-25 s parametreista riippuen Yksilöt joiden [DA] max jyrkimmät param. riippuvuudet: A) 0-4 µm (kasvavalla intensiteetillä) B) 0.05-0.7 µm (pitoisuushuippu 120 Hz) Shon 2010 13

3. Välittäjäaineiden mittaus sähkökemiallisilla mikroelektrodeilla Sähkökemialliset menetelmät ja mikroelektrodit ovat muutaman viimeisen vuosikymmenen ajan yleistyneet välittäjäainemittauksissa in vitro ja in vivo. Mikroelektrodien läpimitta on parhaimmillaan vain muutamia mikrometrejä, mikä verrattuna mikrodialyysiin parantaa mittauksen paikallista resoluutiota ja vähentää invasiivisuutta. Mikrodialyysianturin läpimitta on yleensä yli 200 µm. Toinen sähkökemiallisten menetelmien selkeä etu mikrodialyysiin verrattuna on ajallinen vaste; ne mahdollistavat jopa alle sekunnissa tapahtuvien pitoisuusmuutosten havaitsemisen, kun taas mikrodialyysillä näytteiden analysointiin kuluu useita minuutteja. Mikroelektrodeilla voidaan siis mitata reaaliajassa. (Robinson 2008) Sähkökemialliset menetelmät perustuvat työelektrodille (itse mittaelektrodi) viedyn ulkoisen potentiaalin aiheuttamiin aineiden hapetus- ja pelkistysreaktioihin. Elektrolyytin, eli analysoitavan liuoksen, ja työelektrodin välillä siirtyvä varaus aiheuttaa mitattavan virtasignaalin, joka on verrannollinen havaittavan aineen pitoisuuteen. Välittäjäainemittauksissa potentiaalit ovat tyypillisesti muutamia satoja millivoltteja ja signaalivirrat piko- tai nanoampeereja. Potentiaali ilmaistaan mittausliuokseen yhteydessä olevaa niin kutsuttua referenssielektrodia vasten. Tässä työssä kaikki elektrodipotentiaalit on ilmaistu hopea-hopeakloridi referenssielektrodia (Ag/AgCl) vasten. Välittäjäainemittauksissa on sovellettu useita erilaisia sähkökemiallisisa menetelmiä (Robinson 2008), joista tässä työssä keskeisiä ovat amperometria, jota käytetään glutamaatti- ja tietyissä tapauksissa dopamiinimittauksissa, ja nopean pyyhkäisyn syklinen voltammetria (fast scan cyclic voltammetry, FSCV), jota käytetään useimmissa dopamiinimittauksissa. Amperometriassa työelektrodia pidetään vakiopotentiaalissa, joka on tarpeeksi korkea halutun aineen havaitsemiseen, eli sen hapetus-pelkistysreaktion käynnistämiseen. FSCV-menetelmässä potentiaali pyyhkäistään lineaarisesti edestakaisin valittujen potentiaaliarvojen välillä yli 100 V/s pyyhkäisynopeudella. Tietyssä potentiaalin arvossa mitattava aine hapettuu tai pelkistyy aiheuttaen mitattavan virran. Tässä luvussa on kuvattu glutamaatin ja dopamiinin sähkökemiallisten mittausten pääperiaatteet, joita soveltaen kaikki glutamaatti- ja dopamiinianturit yleisellä tasolla toimivat. Ratkaisut anturien arkkitehtuurissa ja mittausasetelmissa ovat kuitenkin hyvin vaihtelevia. Erilaisia anturiratkaisuja käsitellään laajemmin seuraavassa luvussa, jossa niitä arvioidaan edellisessä luvussa kuvattujen glutamaatti- ja dopamiinipitoisuuksien ja niiden muutosten kannalta tärkeiden ominaisuuksien kannalta. 3.1 Pääperiaatteet glutamaatin sähkökemiallisessa mittauksessa Glutamaatti ei ole sähkökemiallisesti aktiivinen aine; se ei hapetu tai pelkisty tarpeeksi matalissa potentiaaleissa, jotta sen voisi suoraan havaita työelektrodilla. Ongelma on ratkaistu entsymaattisella tunnistuksella; elektrodille immobilisoidaan entsyymi, jonka katalysoimassa reaktiossa glutamaatista muodostuu jokin sähkökemiallisesti havaittava yhdiste. Glutamaatti- 14

antureissa yleisimmin käytetty entsyymi on glutamaattioksidaasi (glutamate oxidase, GluOx), mutta myös glutamaattidehydrogenaasia (glutamate dehydrogenase, GluDH) on käytetty. Glutamaattioksidaasia hyödyntävät glutamaattianturit voidaan jakaa ensimmäisen ja toisen sukupolven antureihin, riippuen reaktioketjusta, josta varsinaisen signaalin aiheuttama hapettuminen seuraa. Ensimmäisen sukupolven antureissa glutamaatti hapettuu glutamaattioksidaasin katalysoimassa reaktiossa, glutamaatti + O 2 α-ketoglutaraatti + NH 3 + H 2 O 2. (1) Reaktiossa syntynyt vetyperoksidi hapettuu elektrodilla, mistä virtasignaali aiheutuu. Suhteellisen korkea potentiaali, jonka vetyperoksidin hapetusreaktio vaatii (noin 400 700 mv elektrodista riippuen) kuitenkin aiheuttaa ongelmia anturin selektiivisyydelle; muut solunulkoisen tilan aineet saattavat myös reagoida elektrodilla, aiheuttaen häiriötä signaaliin. Potentiaalin madaltamiseksi kehitettiin toisen sukupolven glutamaattianturit. Näissä on elektrodille glutamaattientsyymin lisäksi immobilisoitu toinen entsyymi, piparjuuri-peroksidaasi (horseradish peroxidase HRP), ja mediaattoriksi kutsuttu yhdiste. HRP katalysoi reaktion, jossa reaktiossa 1 syntynyt vetyperoksidi hapettaa mediaattorin. Mediaattorin pelkistysreaktio elektrodilla on virtasignaalin aiheuttaja. Mediaattori-nimike on peräisin yhdisteen elektroneja elektrodille välittävän tehtävän vuoksi. (Qin 2008) Mediaattoreiden hyödyntämisen lisäksi on erilaisten puoliläpäisevien polymeerikalvojen liittäminen elektrodien pinnalle toinen yleinen menetelmä selektiivisyyden parantamiseksi. Pinnoite voi sijoittua joko entsyymikerroksen alle tai päälle, tai se voidaan yhdistää entsyymikerrokseen. (O Neill 2004) Pinnoitekalvot estävät ei-toivottujen aineiden pääsyä elektrodin pinnalle. Niiden toinen funktio on estää anturien suorituskykyä heikentävää biosaastumista (biofouling), eli erilaisten biologisten molekyylien tai rakenteiden kerääntymistä anturin pinnalle in vivo mittauksissa. (Qin 2008) Ensimmäisen ja toisen sukupolven anturien lisäksi on myös lukuisia muita anturiratkaisuja glutamaatin mittaamiseen kehitetty; reaktiossa (1) syntyvän vetyperoksidin pelkistysreaktion virtaa on mitattu elektrodilla hapetusreaktion sijaan (You 2004, McLamore 2010). Glutamaatti voi myös glutamaattioksidaasin katalysoimana suoraan pelkistää tiettyjä mediaattoreita (ilman välireaktiota HRP:n kanssa), joiden hapettuminen elektrodilla aikaansaa signaalin (Rieben 2009). Tällä tekniikalla on pyritty eroon mittauksen riippuvuudesta hapen läsnäolosta, mikä in vivo sovelluksissa usein on rajoitettu. Glutamaattidehydrogenaasia glutamaattitunnistuksessa käyttävät anturit vaativat toimiakseen koenstyymi nikotiiniamidiadeniinidinukleotidin (NADH) läsnäolon; GluDH katalysoi reaktion glutamaatti + NAD + + H 2 O 2-oksoglutaraatti + NADH + NH 4 + + H +, (2) ja syntyneen NADH:n hapettuminen elektrodilla aikaansaa virtasignaalin (Tang 2007). Myös GluDH-antureissa on hyödynnetty mediaattoreita elektrodipotentiaalin alentamiseksi; NADH pelkistää mediaattorin, jonka hapettuminen havaitaan elektrodilla (Chakraborty 2007). 15

3.2 Pääperiaatteet dopamiinin sähkökemiallisessa mittauksessa Dopamiini on sähkökemiallisesti aktiivinen yhdiste, eli se hapettuu ja pelkistyy elektrodille viedyn ulkoisen potentiaalin vaikutuksesta. Dopamiinin tunnistukseen ei siis tarvita entsymaattista välireaktiota, mikä yksinkertaistaa anturiratkaisuja ja tekee mittauksesta herkempää ja nopeampaa. Dopamiinin hapettumisreaktio, dopamiini dopamiini-ο-kinoni + 2e - + 2H + (3) aikaansaa työelektrodilla mitattavan signaalin (Robinson 2008). Hiilikuitu on ylivoimaisesti käytetyin elektrodimateriaali dopamiinimittauksissa. Hiilikuituelektrodeja on helppo valmistaa mikrometrien kokoluokassa, materiaali on helposti saatavilla, edullista ja bioyhteensopivaa, ja sen pintarakenne on ihanteellinen sähkökemiallisille reaktioille. (Swamy 2007, Suzuki 2007) Selektiivisyys on dopamiinin mittauksessa erityisen suuri haaste, sillä dopamiinia esiintyy aivoissa nanomolaariluokan pitoisuuksissa, ja muita sähkökemiallisisesti aktiivisia yhdisteitä, kuten askorbiinihappoa, kymmen- satakertaisissa pitoisuuksissa (Suzuki 2007). FSCV-menetelmällä saavutetaan jonkin verran selektiivisyyttä, sillä aineiden hapettuminen tapahtuu niille ominaisissa potentiaaleissa. Suurissa pitoisuuksissa ilmenevien häiriöaineiden hapetusreaktiot peittävät kuitenkin helposti dopamiinin hapetumissignaalin. Ratkaisuksi on dopamiinielektrodeja päällystetty selektiivisillä, dopamiiniherkkyyttä edistävillä päällysteillä. Dopamiinin adsorptio elektrodin pinnalle edistää hiilikuitumikroelektrodien dopamiinispesifisyyttä. Hiilikuitupinnalla esiintyvät oksidit, kuten karbonyyli- ja hydroksyyliryhmät, sekä pinnan karheus edistävät fysiologisessa ph:ssa positiivisesti varautuneen dopamiinin adsorptiota elektrodin pinnalle. Adsorboituvien aineiden aiheuttama signaalivirta on FSCV-menetelmässä tutkimusten mukaan suoraan verrannollinen pyyhkäisynopeuteen. Ei-adsorboituvien aineiden, kuten askorbiinihapon, signaalivirta taas on verrannollinen pyyhkäisynopeuden neliöjuureen (Bath 2000). Mittauksen selektiivisyys dopamiinille siis teoriassa paranee pyyhkäisynopeutta kasvattamalla. Pyyhkäisynopeutta ei kuitenkaan voi loputtomiin kasvattaa, sillä potentiaalin pyyhkäisy aikaansaa kapasitiivisen virran muodostumisen elektrodin ja elektrolyytin rajapintaan. Tämä elektrodin pintaalaan ja pyyhkäisynopeuteen verrannollinen virta aiheuttaa mittaukseen taustakohinaa, joka on vähennettävä varsinaisesta dopamiinisignaalista. Signaali/kohina suhde siis heikkenee pyyhkäisynopeutta kasvattamalla, ja suuri taustavirta saattaa saturoida signaalinprosessoinnissa käytettäviä instrumentteja (Keithley 2011). Myös amperometriaa on jonkin verran sovellettu dopamiinimittauksissa, mutta tällöin on varmistuttava mitattavan signaalin todella olevan peräisin dopamiinista, eikä muista käytettävän potentiaaliarvon sisällä hapettuvista tai pelkistyvistä aineista. Amperometriaa voidaan siis soveltaa in vitro mittauksissa sekä nukutettujen rottien tietyissä aivoalueissa, joissa on osoitettu tietynlaisten ärsykkeiden vapauttavan ainoastaan dopamiinia (Benoit-Marand 2007). 16

4. Anturien suorituskyky ja sen parantaminen Välittäjäaineita mittaavien elektrodien suorituskykyä kuvaavia ominaisuuksia ovat herkkyys, havaitsemisraja, lineaarinen mittausalue, ajallinen ja paikallinen resoluutio, selektiivisyys ja stabiilisuus. Tämän työn tarkoituksena on selvittää miten nykypäivän glutamaatti- ja dopamiinielektrodeissa neljä ensimmäiseksi mainittua ominaisuutta soveltuvat mittauksiin syväaivostimulaation yhteydessä, ja ovat näin ollen tämän luvun painopisteinä. Muita ominaisuuksia ei kuitenkaan voi täysin sivuuttaa, sillä ominaisuuden parantamiseen suunnatut toimenpiteet aiheuttavat lähes poikkeuksetta jonkin toisen ominaisuuden heikkenemistä, mistä tässä luvussa on lukuisia esimerkkejä. Tämä on todella keskeinen huomio anturikehityksessä; on tiedettävä tarkkaan mitä ominaisuuksia antureilta kussakin tilanteessa vaaditaan. Seuraavassa luvussa pohditaan tämän työn tulosten perusteella, mitä tämä syväaivostimulaatiomittausten kannalta tarkoittaa. Kuvassa 3 on esitetty tekijät, jotka yleisellä tasolla vaikuttavat elektrodien ominaisuuksiin. Kuvassa havainnollistuu anturien suorituskyvyn parantamiseen käytettyjen menetelmien moniulotteisuus ja laajuus. Kaikkien ratkaisujen yksityiskohtainen kuvaaminen ei kuulu tämän työn laajuuteen ja tarkoitukseen. Sen sijaan pyritään antamaan yleiskuva kirjallisuudessa esitetyistä lähestymistavoista ja anturikehityksen ongelmakohdista. Kuva 3: Välittäjäaine-elektrodien ominaisuuksiin (vasen palsta) vaikuttavat suorat (keskimmäinen palsta) ja epäsuorat (oikea palsta) tekijät. Glutamaatti- ja dopamiiniantureille erityisen tärkeät ja/tai ominaiset tekijät ovat korostettu violetilla ja punaisella värillä vastaavasti. 17