(13) (11) KUULUTUSJULKA I SU UTLAGGN I NGSSKR I FT 84558 C ( 3) T t t y (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 2:1 A 61K 39/12, C 07K 7/08 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 854396 SUOMI-FINLAND (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 07.11.85 (FI) (24) Alkupäivä - Löpdag 06.03.85 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 07.11.85 Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 13.09.91 Patent- och registerstyrelsen (86) Kv. hakemus - Int. ansökan US85/00360 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 09.03.84 US 587983 P 09.03.84 US 588122 P (71) Hakija - Sökande 1. Scripps Clinic and Research Foundation, 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, Cal., USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Milich, David R., 11591 Polaris, Mira Mesa, Cal., USA, (US) 2. Chisari, Frank V., 1010 Crest Road, Del Mar, Cal., USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä rokotteen valmistamiseksi hepatitis B-virusta vastaan Förfarande för framställning av ett vaccin mot hepatitis B-virus (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Proceedings of the National Academy of Science of the USA, vol. 80 (1983), p. 2365-2369, Proceedings of the National Academy of Science of the USA, vol. 78 (1981), p. 3403-3407 (57) Tiivistelmä - Sammandrag Kemiallisesti syntetoidut polypeptidit sisältävät ame.:-.:happojäännösten ketjuja, jotka vastaavat olennaisesti amirzappojäännösten ketjuja luonnollisen, patogeeniin proteiinin T-solun ja B-solup determinanttialueissa, tämän p=2teiinin ollessa erityisesti hepatitis B-viruksen pinnan anticeeni (HBsAg). Kun näitä polymeerejä annetaan isännälle sellaisenaan, polymeereinä tai kantajaan sidottuina konjugaatteina, niin ne indusoivat kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen isännissä, jotka on immunoitu hepatitis ;3-virusta vastaan. Kemiskt syntetiserade polypeptider innehåller sekvenser av aminosyrarester,som motsvarar väsentiigen sekvenserna av aminosyrarester i T- och B-cellens determinantdelar hcs ett naturligt patogen-relaterat protein,sårskilt en hepatztis B- virusytantigen (HEsAg). Vid adminstrerinc åt en vard E.= sådana, som polymerer eller bärar-bundna konjugat irdezerar polypepziderna proliferation av thymus-härledda celler hos värdar, som är immunicerade mot hepatitis B-virus.
84558 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi hepatitis B-virusta vastaan Tämä keksintö kohdistuu rokotteen valmistusmenetelmään hepatitis B-virusta vastaan. Menetelmässä aikaansaadaan kemiallisesti syntetoituja polypeptidejä, jotka aminohappojäännösten järjestykseltään vastaavat olennaisesti aminohappojäännösten järjestystä luonnollisen, patogeeniin liittyvän proteiinin, erityisesti hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin, T-solun ja B-solun determinanttialueissa. Kun näitä polypeptidejä annetaan isännälle sellaisenaan, polymeereinä tai kantajaan sidottuina konjugaatteina, niin ne indusoivat kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen isännissä, jotka on immunoitu hepatitis B-virusta vastaan. Tämä keksintö kohdistuu uusien synteettisten antigeenien tuotantoon, joka perustuu DNA- ja/tai proteiiniketjuista saatuun informaatioon. Täsmällisemmin, tämä keksintö kohdistuu rokotteen valmistusmenetelmään, joka rokote perustuu synteettisiin antigeenisiin polypeptideihin, jotka vastaavat immunologisesti T-solun ja B-solun determinanttiosaa hepatitis B-viruksen pinnan antigeenissä (HBsAg), kun niitä käytetään sellaisenaan, polymeerina tai kantajaan kytkettyinä. Virusperäinen hepatitis on edelleen eräs merkittävimmistä hallitsemattomista ihmiskunnan sairauksista. Yleiskäsitteellä "virusperäinen hepatitis" tarkoitetaan periaatteessa hepatitis A:ta (hepatitis-infektio) ja hepatitis B:tä (seerumihepatitis), vaikka myös muut tunnetut virukset, kuten keltakuumeen virus, Epstein-Barr-virus ja sytomegalovirus voivat aiheuttaa hepatitista ihmisessä. Hepatitis on erityisen tunnettu siitä, että se hyökkää pääasiallisesti maksan (kreikkaa: hepar) kimppuun, mutta tämä sairaus vaikuttaa myös muihin elimiin. 1965 Blumberg havaitsi, että tiettyjen ihmisten veressä kiersi eräs antigeeni [J. Am. Med. Assoc., 191, 541 (1965) sekä Ann. Int.
2 84558 Med.,66 924 (1967)7. Myöhemmin Prince totesi tämän aineen olevan hepatitis B-viruksen pinnan antigeeni (HBsAg), jota syntyy runsaasti niissä henkilöissä, jotka kärsivät tämän viruksen kroonisesta infektiosta /i5roc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 814 (1968)7. HBsAg:n immunokemiallisia piirteitä on pyritty laajasti selvittämään. Serologiset tutkimukset osoittavat, että heptatitis B- viruksen (HBV) monilla kannoilla on yksi tai useampi yhteinen determinantti, jota merkitään kirjaimella a. Kullakin kannalla on myös kaksi muuta determinanttia: joko d tai y sekä joko w tai r. Täten virusta on olemassa neljää mandollista tyyppiä adw, ayw, adr ja ayr. HBsAg:n spesifisyys liittyy yhteen ainoaan polypeptidiin / -"old et al., J. Immunol., 117 7 1404 (1976) sekä Shih et al., J. Immunol., 120, 520 (1978)7, jonka koko 226 aminohappojäännöksestä muodostuva ketju perustuu nukleotidien järjestykseen HBV:n S-geenissä 4iollais et al., Science, 213, 406 (1981); Valenzuela et al., Nature (Lontoo), 280, 815 (1979); Galibert et al., Nature (Lontoo), 281, 646 (1979) sekä Pasek et al., Nature (Lontoo), 282, 575 (1979)7. Hepatitis B-rokote olisi välttämättä saatava aikaan niitä ryhmiä varten, jotka ryhmät ovat erityisen alttiita tälle infektiolle. Näihin ryhmiin kuuluvat terveydenhoitoon osallistuvat ja laboratorioissa työskentelevät henkilöt, sekä ne henkilöt, jotka tarvitsevat (1) ylläpitävää hemodialyysiä; (2) toistuvia verensiirtoja tai joille jatkuvasti annetaan verituotteita; (3) sekä henkilöt, joita hoidetaan immuunijärjestelmää lamauttavilla tai sytotoksisilla lääkeaineilla ja (4) henkilöt, joita hoidetaan immuunireaktion heikentymiseen liittyvien pahanlaatuisten sairauksien tai häiriöiden johdosta. Lisäksi rokotetta tarvitsevat henkilöt, jotka elävät tietyillä trooppisilla seuduilla, missä hepatitis B:n infektio on tavallista. Hepatitis A- ja B-virukset eivät kuitenkaan lisäänny merkittävästi soluviljelmissä, ja tällä hetkellä rokotteen valmistamiseksi ei ole käytettävissä laboratoriossa tuotettujen virusten lähdettä.
3 84558 Yritykset siirtää hepatitis B-virusta (HBV) järjestelmällises - ti kudos- tai elinviljelmiin, ovat jatkuvasti epäonnistuneet, mikä on estänyt tavanomaiseen rokotteeseen johtavaa kehitystyötä /Zuckerman, Amer. J. Med. Sci., 270, 205 (1975)7. Rokotetta tuotetaan perinteisesti siten, että tapettu tai vaimennettu organismi viedään isäntäanalogiin yhdessä sopivien apuaineiden kanssa, jolloin normaali, tätä organismia vastaan vaikuttava immuunireaktio käynnistyy, mutta jolloin kuitenkin, toivottavasti, isännässä vältytään tämän organismin patogeenisilta vaikutuksilta. Tähän lähestymistapaan liittyy lukuisia hyvin tunnettuja rajoituksia. Nämä rokotteet ovat monimutkaisia, ja ne eivät ainoastaan sisällä mielenkiintoista antigeenisyyden determinanttia, vaan myös monia muita asiaan kuuluvia ja kuulumattomia haitallisia aineita, joista mitkä tahansa saattavat indusoida isännässä, joissakin tai kaikissa yksilöissä, epätoivotun reaktion. Perinteisellä tavalla tuotetut rokotteet voivat esimerkiksi sisältää keskenään kilpailevia antigeenej,:l, jotka häiritsevät toivottua immuunireaktiota, antigeeneja, joihin liittyy asiaankuulumattomia immuunireaktioita, organismista tai viljelmåstä peräisin olevia nukleiininappoja, sekä koostumukseltaan ja alkuperältään tuntemattomia endotoksiineja ja aineita. Nämä monimutkaisten materiaalien avulla tuotetut rokotteet indusoivat luonnostaan suhteellisen suurella todennäköisyydellä jopa mielenkiinnon kohteena olevasta antigeenistä peräisin olevia kilpailevia reaktioita. Antigeenejä on saatu aikaisemmin useilla menetelmillä, kuten luonnollisista materiaaleista eristämällä, kytkemällä hapteeni kantajaan sekä yhdistelmä-dna-tekniikan avulla. Tiettyjä synteettisiä antigeenejä on kuvattu julkaisussa Sela et al. /15roc. Nat. Acad. Sci. (USA), 68, 1450 (1971); Science, 166, 1365 (1969); sekä Adv. Immun., 5, 129 (1966)7.
84558 Tiettyjä "synteettisiä" antigeeneja on tuotettu kytkemällä pieniä molekyylejä (esimerkiksi dinitrofenoli) kantajiin (kuten naudan seerumin albumiiniin), jolloin saadaan aikaan antigeenejä, jotka aiheuttavat tätä kytkettyä pientä molekyyliä vastaan vaikuttavien vasta-aineiden tuotannon. Kantajamolekyyli on usein siitä syystä välttämätön, koska immuunijärjestelmä ei ehkä "tunnista" itse tätä pientä molekyyliä, joka isäntäeläimeen injektoitiin. Tätä tekniikkaa on myös käytetty erillisissä kokeissa, joissa antigeenejä valmistettiin kytkemällä polypeptidifragmentteja tunnetuista proteiineista kantajiin, kuten edellä mainituissa et al. julkaisuissa esitetään. Tämä hapteeni-kantaja-yhdistelmää soveltava tekniikka on ollut hyödyllinen tutkittaessa immuunireaktion luonnetta, mutta sillä ei kuitenkaan ole ollut merkittävää käyttöä sellaisten antigeenien tuotannossa, joilla antigeeneillä olisi merkitystä diagnostisessa tai lääkinnällisessä käytännössä. Tämän puutteellisuuden eräänä syynä on se, että patogeenista (esimerkiksi hepatitis B-viruksesta) peräisin olevan antigeenisyyden determinantin valikoimiseksi ja muodostamiseksi tällä tekniikalla tämän patogeenin koko proteiiniketju on kyettävä määrittämään, jotta onnistumiseen olisi jonkinlaiset mandollisuudet. Tämän tehtävän vaikeudesta johtuen sitä on harvoin, mikäli koskaan, suoritettu. Yhdistelmä-DNA-tekniikka on parantanut rokotetekniikan mandollisuuksia, ja sen etuna on se, että valmistus aloitetaan monospesifisellä geenillä; kuitenkin suuri osa tästä edusta menetetään E. coli-bakteerissa tai muissa organismeissa tapahtuvassa antigeenin varsinaisessa tuotannossa. Tässä toimenpiteessä geenimateriaali viedään plasmidiin, joka tämän jälkeen istutetaan E. coli-bakteeriin, joka puolestaan tuottaa toivottua proteiinia yhdessä aineenvaihdunnan muiden tuotteiden kanssa, näiden kaikkien muodostaessa seoksen ravinteiden kanssa. Tätä lähestymistapaa vaikeuttaa se epävarmuus, ilmentyykö toivottu protciini transformoidussa E. coli-bakteerissa vai ei.
84558 Tämän lisäksi, vaikxa toivottua proteiinia muodostuisikin, niin varmoja ei kuitenkaan voida olla siitä, saadaanko tämä proteiini otettua talteen vai ei, vai tuhoutuuko se E. coli-bakteerin kasvutapahtuman aikana. Esimerkiksi hyvin tunnettua on se, että E. coli-bakteeri pilkkoo vieraita tai muuntuneita proteiineja. Vaikka tätä proteiinia olisikin läsnä riittävän suurina määrinä ollakseen mielenkiintoinen, niin se on kuitenkin ensin erotettava E.coli-bakteerin aineenvaihdunnan muista tuotteista, sellaiset haitalliset aineet mukaan lukien, kuten epätoivotut proteiinit, endotoksiinit, nukleiinihapot, geenit sekä tuntemattomat tai ennalta arvaamattomat aineet. Lopuksi, vaikka toivotun proteiinin erottaminen kaikista muista E. coli-bakteerin aineenvaihdunnan tuotteista olisikin mandollista (tai saataisiin mandolliseksi kehittyneiden, vaikkakin tällöin välttämättä hyvin kalliiden tekniikoiden avulla), niin rokote käsittäisi edelleen koko proteiinin, joka saattaa sisältää epätoivottuja antigeenisyyden determinantteja, joista eräiden tiedetään käynnistävän haitallisia reaktioita. Todellakin tunnettuja ovat eräät sellaiset proteiinit, joita muuten voitaisiin pitää rokotteina, mutta jotka sisältävät antigeenisyyden determinantin, joka indusoi vakavia häiriöitä tai sivureaktioita, jotka estävät tämän materiaalin käytön rokotteena. Hybridomiteknologiaa käyttäen on myös mandollista tuottaa viruksen geenituotteita vastaan vaikuttavia vasta-aineita. Periaatteessa, hybridomiteknologiassa lähdetään antigeenien monimutkaisesta seoksesta, ja myöhemmin prosessissa tuotetaan monospesifisiä vasta-aineita. Tämä keksintö on päin vastoin käänteinen prosessi, jossa lähdetään suhteellisesti erittäin puhtaasta antigeenisyyden determinantista, jolloin toivotun antigeenituotteen puhdistamisen tarpeelta vältytään. Tiedetään, että hybridomivasta-aineilla on alhainen vetovoima sekä alhaiset sitoutumisvakiot, ja näin ollen niiden arvo on rajoittunut. Lisäksi hybridomitekniikassa, vasta-aineiden tuotannossa on turvauduttava pahanlaatuisiin soluihin, jolloin
6 84558 huomiota on kiinnitettävä erityisesti erotustekniikoihin, puhtauteen ja turvallisuuteen. Hybridomien tuotanto perustuu kudosviljelmään tai hiireen istuttamiseen, jolloin ilmeisenä tuloksena on se, että tuotanto on kallista ja että eri erät poikkeavat toisistaan menetelmästä johtuen. Lisäksi sellaisten hybridomien valmistaminen on vaikeata, jotka hybridomit erittävät vasta-aineita niille molekyyleille, jotka edustavat ainoastaan pientä prosenttista osuutta välttämättömän lähtöaineen muodostaneesta monimutkaisesta seoksesta, tai jotka molekyylit ovat heikosti immunogeenisia ja joita häiritsevät voimakkaammat, dominoivat antigeenit. Julkaisuissa Arnon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 68, 1450 (1971), Atassi, Immunochemistry, 12, 423 (1975) sekä Vyas et al., Science, 178, 1300 (1972) esitettyjä tutkimuksia tulkitsemalla ollaan todettu, että yleisesti ottaen lyhyet lineaariset aminohappojen ketjut hyvin epätodennäköisesti saavat aikaan vastaaineita, jotka reagoivat luonnollisen proteiinirakenteen kanssa. Epäiltiin, että useimpien molekyylien useimpien alueiden tapauksessa antigeenisyyden determinantit olivat tuloksena aminohappojen jäännöksistä, jotka ovat selvästi erillään toisistaan lineaarisessa ketjussa, mutta lähellä toisiaan kokoontaittuneessa proteiinissa. Vasta-aineiden muodostamiseen käytettyjen polypeptidien täsmällisen kolmiulotteisen rakenteen oletettiin olevan kriittinen useimmissa tapauksissa, jopa niidenkin antigeenien tapauksessa, jotka antigeenit käsittävät ketjussa lähellä toisiaan olevia aminohappoja. Esimerkiksi Sela arveli välttämättömäksi syntetoida melko mutkikkaan kierukkarakenteen, jotta anti-lysotsyymireaktio saadaan aikaan. Atassi valmisti useita mutkikkaita molekyylejä, joista kukin pyrki jäljittelemään kohteena olevan proteiinin tertiääristä rakennetta. Ja Vyas päätteli, että hepatitis B-viruksen
7 84558 pinnan antigeenin kolmiulotteinen järjestäytyminen oli kriittinen tekijä, kun pyrkimyksenä oli saada aikaan tämän luonnollisen rakenteen kanssa reaktiivisia vasta-aineita. Julkaisussa Sutcliffe et al., Nature, 287, 801 (1980) havaittiin, että lineaaristen polypeptidien vasta-aineet reagoivat luonnollisten molekyylien kanssa, ja viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että suhteellisen lyhyillä, kemiallisesti syntetoiduilla polypeptideillä voidaan saada aikaan vasta-aineita, jotka reagoivat lähes minkä tahansa, proteiinin paljaalla pinnalla olevan alueen kanssa /Öreen et al., Cell, 28, 477 (1982)7. Lisäksi, koska aminohappojen ketjuja voidaan nykyään määrittää nopeasti nukleiinihappojen järjestyksen selvittävällä tekniikalla, niin on mandollista valmistaa synteettisiä polypeptidejä, joiden avulla voidaan tuottaa aikaisemmin mandottomia, täsmälleen toivottuja rokotteita. Täten vaivalloiset biosynteesit ovat tarpeettomia, epätaloudellisia ja vanhanaikaisia. Nimellä Vyas myönnetyssä US-patentissa 4 415 491 julkaistaan sarja sellaisia polypeptidejä, jotka vastaavat hepatitis B- viruksen pinnan antigeenin a-determinanttia. Vaikka tässä julkaisussa ei esitetä lainkaan isännän suojaamiseen liittyvää tietoa, niin kuitenkin peptidien esitetään olevan käyttökelpoisia hepatitis-rokotteen valmistuksessa. Tämän hetkiset HBV-rokotteet käsittävät kroonisesta HBV-infektiosta kärsivien luovuttajien plasmasta puhdistettuja, viruksen pinnan peitteen virusperäisiä komponentteja (HBsAg), jotka on inaktivoitu /RcAuliffe et al., Rev. Infect. Dis., 2, 470 (1980)7. Tämän hetkisten HBsAg-rokotteiden turvallisuus ja tehokkuus on osoitettu kliinisin kokein, mutta tällaisten rokotteiden saanti on rajallista ja ne ovat suhteellisen kalliita, erityisesti niissä maissa, joissa esiintyy eniten HBV-sairautta. Täten huomattavia etuja saavutetaan kemiallisesti syntetoiduilla polypeptideillä, ajatellen HBV-rokotteiden käytön kustannuksia ja turvallisuutta.
8 84558 Tiedetään, että HBV-viruksen S-geenin lukuisten alueiden nukleotidien järjestyksen perusteella ennustettujen synteettisten polypeptidien antiseerumit reagoivat luonnollisen HBsAg:n kanssa radioimmunosaostuksissa Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 3403 (1981)7 sekä kaupallisissa, anti-hbsag:n osoittamiseksi käytettävissä, kiinteän faasin radioimmunokokeissa /erin et al., Viral Hepatitis, Szmuness et al. (toim.), 49-55 (1982)7. Viime aikoina ollaan todettu, että patogeenin kaltaista proteiinia voidaan jäljitellä immunologisesti tuottamalla sellaista synteettistä polypeptidiä, jonka ketju vastaa tämän patogeenin kaltaisen proteiinin determinanttialueen ketjua. Tällaisia tuloksia esitetään julkaisuissa Sutcliffe et al., Nature, 287, 801 (1980) sekä Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 3403 (1981). Lisäksi julkaisussa Gerin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80, 2365 (1983) esitettiin jokin aika sitten, että rajoittunut suoja hepatitis B-virusta vastaan saavutetaan immunoinneilla, joissa käytetään kantajiin sidottuja synteettisiä polypeptidejä, joiden aminohappojäännösten järjestykset vastaavat aminohappoketjua HBsAg:n determinanttialueessa; erityisesti jäännöksiä 110-137. Synteettisen HBsAg-rokotteen muodostaminen saattaa kuitenkin edellyttää B-solun (vasta-ainetta tuottavien) epitooppeja vastaavien synteettisten polypeptidien lisäksi sellaisia synteettisiä polypeptidejä, jotka vastaavat T-solun determinantteja, jotka eivät mene toistensa kanssa päällekkäin. Edelleen taustana mainittakoon, että immuunijärjestelmässä on kolme solukomponenttia, B-solut (bursasta tai luuytimestä peräisin olevat lymfosyytit), T-solut (kateenkorvasta peräisin olevat lymfosyytit) sekä makrofaagit. B-solut kiertävät veressä ja imunesteessä, ja ne osallistuvat vasta-aineiden tuotantoon. T-solut vahvistavat tai heikentävät B-solujen aikaansaamaa reaktiota.
9 84558 Toisaalta, makrofaagit osallistuvat B- ja T-solujen antigeenien muodostamiseen sekä konsentroimiseen. Lisäksi makrofaagit eristävät useita biologisesti aktiivisia välittäjäaineita, jotka säätelevät sekä T- että B-solun reaktioiden luonnetta ja suuruutta, joko edistämällä tai heikentämällä solun jakautumista tai erikoistumista. Makrofaagit eivät ole spesifisiä ja ne reagoivat jokaista vierasta antigeenia vastaan. T- ja B-solut ovat kuitenkin antigeenille spesifisiä ja ne reagoivat solumembraanin reseptoreiden avulla, jotka reseptorit ovat spesifisiä tälle tietylle antigeenille. HBsAg:tä vastaan vaikuttavien vasta-aineiden in vivo-tuotantoa hiirissä säätelee vähintään 2 immuunireaktion (Ir) geeniä, joista toinen on hiiren H-2-kompleksin I-A-ala-alueessa (Ir-HBs-1) ja toinen I-C-ala-alueessa (Ir-HBs-2). Todettiin, ettei d- determinanttia vastaavalla kemiallisesti syntetoidulla peptidillä toteutettu immunointi tehnyt mitään eroa erittäin reaktiivisen ja reaktioon kykenemättömän hiirikannan välillä Milich et al., J. Immunol., 130, 1401 (1983). Tämän perusteella voidaan olettaa, että Ir-restriktio voi tapahtua siten,että T-solu tunnistaa molekyylistä muita, mandollisesti toistensa kanssa päällekkäin joutumattomia alueita. Pääasiallisen histologisesti yhteensopivan kompleksin sekä HBsAg:hen kohdistuvan immunologisen reaktiivisuuden säätelyn välinen yhteys hiirissä on ulotettu ihmisen immuunireaktioon, koska ollaan todettu, että HLA-DR-fenotyyppi ja viimeaikaiselle HBsAg-koerokotteelle reagoimattomuus riippuvat toisistaan. Täten synteettisen HBsAg-rokotteen muodostaminen saattaa edellyttää B-solun epitooppien lisäksi sitä, että T-solujen determinantit ovat riittävän monipuolisia mukautuakseen ihmispopulaatiossa esiintyvään geneettiseen muunteluun epitoopin tunnistamisessa. Seuraavat tiedot olisivat erittäin arvokkaita synteettisen HBsAg-rokotteen kehittämisessä: (1) kykenevätkö luonnollisen 1lBsAg:n erittäin rajallisia alueita (eli noin 6 aminohappoa) vastaavat synteettiset peptidifragmentit indusoimaan T-solujen lisääntymiseen johtavan reaktion, jota H-2:een kytkeytyneet
1 0 b4 b geenit säätelevät, kuten luonnollisen HBsAg:n tapauksessa; (2) ovatko T-solun tunnistamiskohdat osittain päällekkäin vasta-aineen sitoutumiskohtien kanssa; (3) onko HBsAg:ssä lukuisia T-solun tunnistamiskohtia ja mikäli näin on, riippuvatko tunnistetut kohdat reagoivan kannan H-2-genotyypistä; (4) määräävätkö tunnistetut T-solun kohdat humoraalireaktion (nestereaktion) spesifisyyden ja laadun; sekä (5) aktivoituvatko ihmisen HBsAg:llä immunoidut T-solut niiden samojen determinanttien vaikutuksesta, jotka determinantit indusoivat T-solujen lisääntymisen hiirissä. Tämä keksintö kohdistuu rokotteen valmistusmenetelmään, joka rokote perustuu tiettyihin synteettisiin polypeptideihin, joilla on tietyt tunnusomaiset piirteet sekä ominaisuudet. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. Tässä hakemuksessa käsitteitä "peptidi" ja "polypeptidi" käytetään toistensa synonyymeinä. Ohessa käytetyllä käsitteellä "synteettinen polypeptidi" tarkoitetaan kemiallisesti muodostettua, eikä biologisesti muodostunutta ja hajotettua, aminohappojäännösten ketjua, joka ei sisällä luonnollisesti esiintyviä proteiineja tai sen fragmentteja. Tällaiset synteettiset polypeptidit voivat indusoida isännässä antipolypeptidisten vasta-aineiden tuotannon. Tämän keksinnön mukaisen polypeptidin aminohappojäännösten ketju on lyhyempi kuin hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin ketju mutta se sisältää sellaisen aminohappojäännöksistä muodostuvan ketjun, joka vastaa immunologisesti hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin (HBsAg) vähintään yhden determinanttiosan aminohappojäännösten ketjua. Kun tätä polypeptidiä, jota käytetään joko sellaisenaan, tai polymeerina (synteettinen multimeeri) tai esimerkiksi keyhole limpet -etanan hemosyaniinista (KHL) tai muusta vastaavasta muodostuvaan kantajaan sidottuna konjugaattina, annetaan isäntäeläi-
11 84558 melle rokotteen muodossa olevana tehokkaana määränä, fysiologisesti siedettävässä laimentimessa, kuten vedessä, suolaliuoksessa ja/tai apuaineessa, niin se saattaa indusoida vasta-aineiden tuotannon sekä kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen isännässä. Tämä rokote valmistetaan siten, että saadaan aikaan yksi tai useampi seuraavista polypeptideistä, niiden polymeeri tai niiden kantajaan sidottu konjugaatti, ja tehokas määrä tätä polypeptidiä liuotetaan tai dispergoidaan fysiologisesti siedettävään laimentimeen. Rokotteessa käytettävien synteettisten polypeptidien suositeltavimmat ketjut käsittävät HBsAg:n B-solun determinanttialueiden aminohappojäännösten ketjuja (tai niiden osia; joita ohessa kutsutaan myös B-soluja stimuloiviksi ja pohjustaviksi osiksi), ja niitä ovat mm. seuraavat, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän: (110) (120) Phe(Ile)ProGlySerSer(Thr)ThrThrSerThrGlyProCys (130) Arg(Lys)ThrCysMet(Thr)ThrThr(Pro)AlaGlnGly (137) Thr(Asn)SerMetTyr(Phe)ProSerCys; (125) (130) Met(Thr)ThrThr(Pro)AlaGlnGlyThr(Asn)SerMet (137) Tyr(Phe)ProSerCys; ja (107) (110) CysProLeuPhe(Ile)ProGlySerSer(Thr)ThrThrSerThr (120) GlyProCysArg(Lys)ThrCysMet(Thr)ThrThr(Pro)Ala (130) (137) GlnGlyThr(Asn)SerMetTyr(Phe)ProSerCys jossa kukin suluissa esitetty aminohappojäännös on vaihtoehtoinen sitä välittömästi edeltävälle aminohappojäännökselle, ja edellä
12 84558 olevissa ketjuissa tiettyjen aminohappojäännösten päällä suluissa esitetyt numerot tarkoittavat näiden tiettyjen aminohappojäännösten asemaa hepatitis B-viruksen pinnan proteiinin aminopään suhteen. Tällaiset polypeptidit indusoivat niiden vastaaineiden tuotannon, jotka vasta-aineet voivat immunoreagoida hepatitis B-viruksen kanssa ja suojata isäntää infektiota vastaan. Rokotteissa käytettävien synteettisten polypeptidien suositeltavimpiin ketjuihin kuuluvat myös HBsAg:n T-solun determinanttialueissa esiintyvät aminohappojäännösten ketjut (tai niiden osia), jotka indusoivat T-solujen lisääntymisen (ja joita ohessa kutsutaan myös T-solujen lisääntymistä edistäviksi osiksi), ja niitä ovat mm. seuraavat, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän: (38) (52) SerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCysLeuGlyGlnAsn; (47) (52) ValCysLeuGlyGlnAsn; (48) (60) CysLeuGlyGlnAsnSerG1nSerProThrSerAsnHis (70) SerProThrSerCysProProThrCysProGlyTyr (81) ArgTrpMetCysLeuArgArgPhelle; (9 5 ) (109) LeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeu; sekä (1 40 ) (150) (154) ThrLysProSerAspGlyAsnCysThrCysIleProIleProSer jossa edellä olevissa ketjuissa tiettyjen aminohappojäännösten päällä suluissa esitetyt numerot tarkoittavat näiden tiettyjen aminohappojäännösten asemaa hepatitis B-viruksen pinnan proteiinin aminopään suhteen. Lisäksi tämän keksinnön mukainen, hepatitis B-viruksen infektio- ta vastustava rokote saattaa sisältää tehokkaan määrän sellaista
13 84558 synteettistä polypeptidiä, jonka aminohappojäännösten ketju vastaa immunologisesti olennaisesti aminohappojäännösten ketjua siinä luonnollisessa patogeenin kaltaisessa proteiinissa, jota hepatitis B-virus koodaa, suurin piirtein asemasta 107 asemaan 154, 110-154 tai 125-154, lähtien proteiinin aminopäästä, sekä fysiologisesti siedettävää laimenninta. Kun tätä rokotetta annetaan isännälle, se kykenee indusoimaan isännässä vasta-aineiden tuotannon sekä kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen. Nämä vasta-aineet voivat immunoreagoida hepatitis B-viruksen kanssa ja rokote voi suojata isännän hepatitis B:stä johtuvaa virusinfektiota vastaan. Esimerkiksi tällainen synteettinen polypeptidi voi käsittää seuraavan kaavan mukaisen aminohappojäännösten ketjun, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän: Phe(Ile)ProGlySerSer(Thr)ThrThrSerThrGly ProCysArg(Lys)ThrCysMet(Thr)ThrThr(Pro)Ala GlnGlyThr(Asn)SerMetTyr(Phe)ProSerCysCysCys ThrLysProSerAspGlyAsnCysThrCysIleProIleProSer jossa kukin suluissa esitetty aminohappojäännös on vaihtoehtoinen sitä välittömästi edeltävälle aminohappojäännökselle. Tämä ketju vastaa asemia 110-154, kuten kuvissa 1 ja 2 esitetään. Kuvissa 1 ja 2 esitetään myös ne aminohappojäännösten ketjut, jotka vastaavat asemia 107-154 sekä asemia 125-154. Kutakin edellä mainitusta synteettisestä polypeptidistä voidaan käyttää sellaisenaan monomeerisessä muodossa tai kantajamolekyyliin, kuten KLH:on tai tetanustoksoidiin, konjugoituna. Näitä synteettisiä polypeptidejä voidaan myös käyttää multimeerisessä muodossa. Multimeerisessä muodossa käytettynä kukin polypeptidi muodostaa yhden lukuisista, tämän multimeerin toistuvista yksiköistä. Eräässä suoritusmuodossa tämä multimeeri käsittää vähintään kaksi
14 84558 tällaista polypeptidiä, jotka ovat sitoutuneet toisiinsa molekyylien päihin syntyneellä amidisidoksella, joka on muodostunut toisen polypeptidin aminopäässä olevan aminoryhmän ja toisen polypeptidin karboksipäässä olevan karboksiryhmän välille. Eräässä toisessa multimeerin suoritusmuodossa tämä polypeptidi muodostaa yhden lukuisista polymeerin toistuvista yksiköistä, jossa polymeerissä nämä polypeptidien muodostamat toistuvat yksiköt ovat sitoutuneet toisiinsa polypeptidien välisillä kysteiinin disulfidisidoksilla, jotka ovat muodostuneet polypeptidisissä toistuvissa yksiköissä olevien Cys-jäännösten välille. Eräässä toisessa suoritusmuodossaan tämä keksintö käsittää diagnostisen järjestelmän, jolla voidaan määrittää solujen välittämän, HBsAg:hen kohdistuvan immunologisen reaktiivisuuden läsnäolo sekä hepatitis B-virusperäisen antigeenin läsnäolo isännässä, johon järjestelmään kuuluu edellä kuvattu synteettinen polypeptidi, jonka aminohappojäännösten järjestys vastaa aminohappojäännösten järjestystä HBsAg:n T-solun determinantissa. Kun tätä polypeptidiä annetaan isännälle ihon sisäisesti tehokkaana määränä ja fysiologisesti siedettävässä laimentimessa, niin se kykenee indusoimaan isännässä kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen. Tämän lisääntymisen osoituksena on punotus (erythema) sekä ihon kovettuminen (induraatio) siinä kohdassa, jossa polypeptidiä annettiin ihon sisäisesti. Samoin oheisessa hakemuksessa julkaistaan menetelmät, joilla kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymistä voidaan indusoida isännässä, joka oli aikaisemmin immunoitu hepatitis B-virusta vastaan, sekä joilla voidaan määrittää hepatitis B- virusperäisen antigeenin läsnäolo isännässä. Nämä menetelmät käsittävät vaiheet, joissa käytetään ohessa tarkasteltua, T- solujen lisääntymistä indusoivaa polypeptidiä, ja tätä polypeptidiä annetaan tehokas annos isännälle ihon sisäisesti fysiologisesti siedettävässä laimentimessa, tämän menetelmän mukaisesti, ja kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntyminen sekä hepatitis B-virusperäisen antigeenin läsnäolo isännässä voidaan
15 84558 todeta punotuksena ja ihoh kovettumisena siinä kohdassa, jossa polypeptidiä annettiin ihon sisäisesti. Tällä keksinnöllä on lukuisia etuja ja hyviä puolia. Tämän keksinnön eräänä etuna on se, että synteettisen polypeptidin käyttö tekee sitä vastaavan kokonaisen proteiinin läsnäolon tarpeettomaksi. Tällä polypeptidillä itsellään saadaan aikaan rokote, joka riittää suojaamaan isännän tautia vastaan. Tämän seurauksena tämän keksinnön mukaisesta tuotteesta puuttuvat ne epäpuhtaudet, kuten esimerkiksi solujätteet sekä -toksiinit, jotka liittyvät virusperäisten proteiinien valmistamiseen bakteereissa. Lisäksi synteettisellä hepatitis B-viruksen rokotteella, jossa on sekä B-solun että T-solun determinantit, vältetään tarve valikoida ihmisissä käytettäväksi soveltuva kantaja, jotta kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymistä vastaanottajassa saataisiin stimuloiduksi. Tämän keksinnön muuna etuna on se, että antiseerumissa olevat, synteettisen polypeptidin vaikutuksesta muodostuneet vasta-aineet immunoreagoivat hepatitis B-virukseen liittyvien antigeenisten proteiinien ja polypeptidien kanssa, ja näitä vasta-aineita voidaan käyttää näiden proteiinien ja polypeptidien läsnäolon ilmaisemiseen. Tämän keksinnön muut edut ja hyvät puolet ilmenevät alan asiantuntijalle' seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen, esimerkkien ja patenttivaatimusten perusteella. Piirustuksissa, jotka muodostavat osan tästä julkaisusta: Kuva 1 esittää HBsAg/ayw-proteiinin 226 aminohappojäännöksestä muodostuvaa ketjua, joka on tulkittu julkaisussa Pasek et al., Nature, 282, 575 (1979) nukleiinihappojen järjestyksestä. Tämän keksinnön mukaiseen synteesiin valitut alueet tästä proteiinista on esitetty selvillä alleviivauksilla. Jäännökset, jotka eivät
16 84558 ole samat kolmessa, tästä nukleotidien järjestyksestä tehdyssä analyysissä, on alleviivattu heikosti /r5asek et al mainittu edellä; Valenzuela et al., Nature, 280, 815-819 (1979); sekä Galibert et al., Nature, 281, 646-650 (1979)7. Seuraavat yksikirjaimiset sekä kolmikirjaimiset lyhenteet (katso kuva 2) vastaavat esitettyjä aminohappoja: A, Ala (L-alaniini); C, Cys (L-kysteiini); D, Asp (L-asparatiinihappo); E, Glu (L-glutaamihappo); F, Phe (L-fenyylialaniini); G, Gly (Glysiini); H, His (L-histidiini); I, Ile (L-isoleusiini); K, Lys (L-lysiini); L, Leu (L-leusiini); M, Met (L-metioniini); N, Asn (L-asparagiini); P, Pro (L-proliini); Q, Gln (L-glutamiini); R, Arg (L-arginiini); S, Ser (L-seriini); T, Thr (L-treoniini); V, Val (L-valiini); W, Trp (L-tryptofaani); ja Y, Tyr (L-tyrosiini). Kuva 2 esittää polypeptidien 1, 5, 5a, 6, 49, 49a, 71, 72, 72a ja 73 aminohappojäännöksistä muodostuvia ketjuja, käyttäen kustakin aminohaposta tavanomaista kolmikirjaimista lyhennettä. Nämä ketjut luetaan vasemmalta oikealle ja suunnassa polypeptidin aminopäästä karboksipäähän. Polypeptidit 1, 5, 5a ja 6 vastaavat HBsAg:n jäännöksiä 48-81, 38-52, 47-52. sekä 95-109, vastaavasti. Polypeptidit 49 ja 72 vastaavat HBsAg:n jäännöksiä 110-137 (peptidi 73 vastaa jäännöksiä 107-137), mikä on ennustettavissa S-geenin nukleotidijärjestyksestä ayw-luovuttajasta peräisin olevassa HBV DNA:ssa (polypeptidi 49) /alibert et al., Nature (Lontoo), 281, 646-650 (1979)7 sekä adw-luovuttajasta peräisin olevassa HBV DNA:ssa (polypeptidit 72 ja 73 /Valenzuela et al., Nature (Lontoo), 280, 815-819 (1979)7. Polypeptideissä 72 ja 73 alleviivatut jäännökset osoittavat niitä asemia, joissa aminohappo vaihtelee näiden kanden ketjun ja polypeptidin 49 välillä. Polypeptidit 49a ja 72a muodostuvat polypeptidien 49 ja 72, vastaavasti, 12:sta C-pään aminohaposta (jäännökset 125-137). Polypeptidi 71 vastaa HBsAg:n jäännöksia 140-154. Kuva 3 esittää hiiren C 3 H.Q-kannassa T-solujen lisääntymisreaktioita polvitaipeen imusolmukkeen soluissa, jotka oli immunoitu HBsAg:llä (ad- tai ay-alatyyppi), jotka reaktiot oli indusoitu
17 84558 in vitro: luonnollisella HBsAg:llä; P25:llä (HBsAg:n 1-226 jäännöksen alayksikkö); seuraavilla P25:n tryptisillä fragmenteilla: P25-1 (jäännökset 1-122) ja P25-2 (jäännökset 123-226) sekä peptideillä P73, P72, P49, P6, P5, P5a ja P2 (jäännökset 140-148). Ohessa käytetty kirjain "P" ennen numeroa tarkoittaa "peptidiä" tai "polypeptidiä". Lisääntyminen määritettiin sisällyttämällä tritiumia sisältävää tymidiiniä ( 3 HTdR) solun DNA:han, ja se ilmaistiin prosenttisena osuutena immunogeenin aikaansaamasta reaktiosta. Immunogeeni HBsAg/ad sai aikaan lisääntymisen, joka tuotti 20477 sykettä minuutissa (cpm) ja immunogeeni HBsAg/ay sai aikaan lisääntymisen, joka tuotti 33000 cpm. Kuva 4 esittää hiiren B10.A-kannassa T-solujen lisääntymisreaktiot, jotka indusoitiin: luonnollisella HBsAg:llä, P25:llä (1 226 jäännöstä); P25:n seuraavilla tryptisillä fragmenteill::: P25-1 (jäännökset 1-122) ja P25-2 (jäännökset 123-226); sekä peptideillä P73, P72, P49, P6, P5, P5a ja P2. Lisääntymisreaktion annokset ja menetelmät niiden mittaamiseksi olivat samat kuin kuvan 3 yhteydessä. Immunogeenien HBsAg/ad ja HBsAg/ay aikaansaamat lisääntymisreaktiot olivat 8724 cpm ja 11444 cpm, vastaavasti. Yksityiskohtia kuvissa 3 ja 4 esitetyistä kokeista on löydettävissä osissa III ja IV. I. Johdanto Synteettisten polypeptidien, jotka aminohappojäännösten järjestykseltään vastaavat olennaisesti HBsAg:n determinanttien d (P72) ja y (P49) aminohappoketjuja, synteesi on esitetty julkaisussa Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 3403 (1981). Näillä polypeptideillä on luonnollisten determinanttien antigeenisyyden spesifisyyttä, minkä osoittaa se, että ne kykenevät sitoutumaan luonnollista HBsAg:tä vastaan vaikuttaviin vasta-aineisiin. Lisäksi ollaan osoitettu, että keyhole limpetetanan hemosyaniiniin (KLH) konjugoidulla peptidillä P49 toteutettu immunointi indusoi suuritiitterisen anti-y-reaktion hiiren synnynnäisesti reagoivassa kannassa Milich et al., J. Immunol., 130, 1401 (1983).
18 84558 Kuitenkin immunointi vapaalla (konjugoimattomalla) peptidillä P49 indusoi ainoastaan vähäistä tai ei lainkaan anti-ytuotantoa. Samoin vapaa P72 indusoi erittäin vähäistä antid-reaktiota. Lukuisat tutkijat ovat todellakin törmänneet konjugoimattomien, synteettisten HBsAg:n peptidianalogien alentuneeseen immunogeenisyyteen (konjugoituihin peptideihin verrattuna). Täten, näille synteettisille determinanteille on saatu aikaan epäspesifistä T-solujen avustajatoimintoa käyttämällä proteiinien muodostamia kantajamolekyylejä, kuten KLH:ta tai tetanustoksoidia. Sekä T-solun että B-solun determinantit sisältävän synteettisen HBsAg-rokotteen muodostamiseksi T-solun ja B-solun determinantit on ensin välttämättä tunnistettava HBsAg:stä. Tiedetään, että hiiressä HBsAg:hen kohdistuvaa immuunireaktiota säätävät H-2-kytkeytyneet Ir-geenit, ja että tämä säätely ilmentyy T-solujen tasolla. Epäreaktiivisten haplotyyppien tunnusomaisena piirteenä on T-avustajasolun vajavainen toiminta, kun taas HBsAg:lle spesifiset B-soluesiintymät ovat vahingoittumattomat. Sen lisäksi, että HBsAg:n vapaiden, konjugoimattomien synteettisten peptidianalogien immunogeenisyys on alentunut, peptideillä P72 (jäännökset 110-137) tai P49 (jäännökset 110-137) toteutetuissa immunoinneissa ei todettu eroa erittäin reaktiivisten ja epäreaktiivisten kantojen välillä. Nämä tulokset osoittavat, että P72 ja P49 edustavat B-solun epitooppeja luonnollisessa rakenteessa, mutta niistä puuttuvat asianmukaiset T-solujen determinantit. Täten pelkästään näillä B-solun epitoopeilla toteutetut immunoinnit ei saa aikaan välttämätöntä Ir-rajoitteista T-solun avustajatoimintoa.
19 84558 Lukuisia synteettisiä HBsAg-peptidejä seulottiin ohessa kuvatusti HBsAg-spesifisessä, T-solujen lisääntymistä selvittävässä kokeessa, jotta T-solun determinantit saataisiin määritetyksi. Hiiriä immunoitiin in vivo joko luonnollisella HBsAg/ad:llä tai HBsAg/ay:llä, ja polvitaipeen imusolmukkeen (PLN) solut otettiin talteen ja altistettiin in vitro joko luonnolliselle HBsAg:lle tai erilaisille synteettisille polypeptideille. Useita sellaisia polypeptidejä tunnistettiin, jotka stimuloivat HBsAg:llä immunoitujen PLN-solujen lisääntymistä in vitro. Erityisesti polypeptidit P5 (jäännökset 38-52), P5a (jäännökset 47-52), P6 (jäännökset 95-109) ja P71 (jäännökset 140-154), jotka on esitetty kuvissa 1 ja 2, stimuloivat T-solujen lisääntymistä hiiren PLN-soluissa, jotka on immunoitu in vivo HBsAg:n joko ad- tai ay-alatyypillä. Lisäksi vähintään polypeptidi P1 (jäännökset 48-81) sekä polypeptidi P5 indusoivat T-solujen lisääntymisen ihmisen ääreisverenkierron lymfosyyteissä (PBL). Huomattakoon, etteivät peptidit Pl, P5, P5a, P6 ja P71 indusoi luonnollisen HBsAg:n kanssa ristireaktiivisten vasta-aineiden tuotantoa, ja ne eivät myöskään sitoudu luonnollisiin anti-hbsvasta-aineisiin. Sitä vastoin P72 ja P49 eivät indusoi (tai parhaimmillaankin indusointi on minimaalista) T-solujen lisääntymistä, mutta sitovat spesifisyydeltään sopivaa anti-hbs:ää ja saavat aikaan vähäisen suojan hepatitis B-tautia vastaan. Nämä tulokset osoittavat, että T-solun ja B-solun determinanteilla on selvät sijaintikohdat samassa HBsAg-polypeptidissä. Mandollinen synteettinen antigeeni saadaan aikaan tämän keksinnön mukaisesti käyttämällä synteettistä T-solun determinanttia B-solun determinantin kanssa, mandollisesti synteettisen B- solun determinantin kanssa.
20 84558 H-2-hiirten samangeenisissä yhdistelmäkannoissa HBsAg:hen kohdistuvien immuunireaktioiden aikaisemmin suoritetun geneettisen analyysin perusteella voidaan päätellä "kantaja-determinan - tin" olemassaolo HBsAg:ssä, sillä kaikkien HBsAg-determinant - tien aiheuttamaan immuunireaktioon kohdistuva määräävä vaikutus on peräisin yhdestä ainoasta Ir-geenin sijaintikohdasta. Polypeptidit 5, 5a ja 6 vastaavat tällaista kantaja-determinanttia luonnollisessa molekyylissä. Nämä polypeptidit toimivat sisäisinä kantajina ja saavat aikaan toiminnallista T-solun avustusta kaikissa niissä synteettisissä B-solun epitoopeissa, johon ne ovat kytkeytyneet. Täten tämän keksinnön eräs piirre kohdistuu rokotteisiin, jotka sisältävät aktiivisena aineenaan tehokkaan määrän ohessa kuvattua, T-solujen lisääntymisen aikaansaavaa polypeptidiä, eli vähintään yhtä polypeptideistä 1, 5, 5a ja 6. Tätä rokotetta voidaan antaa isäntäeläimelle (tai ihmiselle) sen jälkeen, kun tämä eläin on immunoitu (pohjustettu) HBsAg:n B-solujen aktivaattorilla, kuten esimerkiksi täydellisellä HBsAg-molekyylillä tai polypeptideillä, kuten esimerkiksi polypeptideillä 49, 49a, 72 ja 72a. Tämän keksinnön mukaista T-solujen lisääntymisen aiheuttavaa polypeptidiä annetaan isäntäeläimelle mieluiten yhdessä pohjustavan, B-soluja stimuloivan immunogeenin kanssa, kuten esimerkiksi polypeptidien 49, 49a, 72 ja 72a kanssa. Suositeltavampia, T-solujen lisääntymistä aiheuttavia ja B- soluja stimuloivia sekä pohjustavia polypeptidejä voidaan antaa isännälle erillisinä kokonaisuuksinaan yhdessä rokotteessa, jossa kumpikin on kytketty omaan kantajaansa tai homopolymeerinä, jonka toistuvat yksiköt muodostuvat aktiivisista polypeptideistä. Molemmat polypeptidityypit on mieluummin kytketty yhteen ainoaan kantajaan, jolloin ne muodostavat rokotteessa yhden ainoan aktiivisen kokonaisuuden. Edelleen, selvästi suositeltavampi ratkaisu on synteettinen HBsAg-rokote, joka sisältää polypeptideistä muodostuvia, kopolymeroituja toistuvia yksiköitä, jotka aminohappojäännösten järjestykseltään vastaavat
21 84558 olennaisesti luonnollisen molekyylin T-solun ja myös B-solun determinantteja, verrattuna siihen, että pyrittäisiin valitsemaan sopiva proteiinista muodostuva kantajamolekyyli, jota voidaan käyttää ihmiskohteiden immunointiin. Lisäksi HBsAg:n kaltaisten synteettisten polypeptidien immunogeenisyyden parantaminen on perustavaa laatua oleva tekijä synteettisen HBsAg-rokotteen kehittämisessä. Ohessa kuvatulla, erittäin immunogeenisellä synteettisellä HBsAg-rokotteella on toivottuja lääketieteellisiä sekä taloudellisia etuja tämänhetkisiin, ihmisen plasmasta saatuihin rokotteisiin verrattuna. II. Tarkastelua Tästä tutkimuksesta saadut tiedot osoittavat, että hepatitis B- viruksen pinnan antigeeni-(hbsag)-molekyylissä olevat rajalliset alueet; erityisesti jäännökset 48-81 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P1), jäännökset 38-52 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P5), jäännökset 95-109 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P6), jäännökset 47-52 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P5a) sekä jäännökset 140-154 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P71), ovat kohtia, jotka HBsAg:llä pohjustetut T-solut mieluiten tunnistavat. Vaikka synteettiset peptidit P1, P5, P5a, P6 ja P71 indusoivatkin T-solujen lisääntymisen aiheuttavan reaktion, niin nämä peptidit eivät kuitenkaan vastaavasti indusoi tai sido vastaaineita, jotka tunnistavat luonnollisen molekyylin. Tämä havainnollistaa sitä eroa determinantin spesifisyydessä, joka ero voi esiintyä B- ja T-solujen aiheuttamien, kompleksisiin, proteiinien muodostamiin antigeeneihin kohdistuvien reaktioiden välillä. Tällainen ero on havaittu lukuisissa antigeenisissä järjestelmissä, ja sitä on kuvattu seuraavissa julkaisuissa Senyk et al., J. Exp. Med., 133, 1294 (1971); Thomas et al., J. Immunol., 126, 1095 (1981); Berkower et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, 4723 (1982); Kipps et al., J. Immunol., 124, 1344 (1980).
22 84558 Sitä vastoin toiset tutkijat ovat todenneet T- ja B-solureseptoreiden samanlaista antigeeniin kohdistuvaa spesifisyyttä, jota kuvataan julkaisuissa Twining et al., Mol. Immunol., 18, 447 (1981); Rajewsky et al., Eur. J. Immunol., 4, 111 (1974); Backer et al., Eur. J. Immunol., 5, 262 (1975). Kuitenkin 'oletukset, että T-solun ja B-solun tunnistusalueet menevät aina keskenään päällekkäin tai etteivät ne koskaan mene päällekkäin, ovat näin ollen liian yksinkertaistettuja. HBsAg:ta tarkastellen, hiirikannat C 3 H.Q (H-2 g ), tai yksinkertaisesti "C 3 H. Q" sekä 810.T(6R)(H-2 g ) eli "B10.T(6R)" tunnistavat mieluiten HBsAg:n aminopäässä olevan fragmentin /erityisesti jäännökset 1-122 HBsAg:n polypeptidisessä P25-alayksikössä (P25-1)7 sekä komponenttipeptidit P5, P5a ja P6. Hiirikantoja C 3 H.Q ja B10.T(6R) kutsutaan ohessa "reaktiivisiksi kannoiksi" tai "erittäin reaktiivisiksi kannoiksi", perustuen lisääntymistä aiheuttavan reaktion suuruuteen. Toisaalta hiirikannan B10.A(H-2 a ) eli "B10.A" T-solujen lisääntymistä aiheuttava reaktio kohdistuu lähes yksinomaan HBsAg:n karboksipäässä olevaan fragmenttiin /erityisesti P25:n jäännöksiin 123-226 (P25-2,7 sekä synteettiseen P72-peptidiin, jotka toimivat myös vasta-aineen sitoutumiskohtana HBsAg:ssä. Hiirikantaa B10.A nimitetään ohessa "keskinkertaisesti reagoivaksi kannaksi", koska lisääntymistä aiheuttava reaktio on pienempi kuin kannoissa C 3 H.Q tai B10.T(6R). Hiirikanta SJL (H-2 S ) tai "SJL" on todettu epäreaktiiviseksi HBsAg:llä toteutetulle immunoinnille, ja näin ollen sitä kutsutaan "epäreaktiiviseksi kannaksi". Näin ollen vaikuttaa siltä, että HBsAg:ssä on lukuisia T-solun tunnistamiskohtia ja lisääntyvien T-solujen valikoiva aktivoituminen riippuu reagoivan hiirikannan pääsiallisen, histologisesti yhteensopivan kompleksin (H-2) haplotyypistä. Samankaltaista T-solun epitooppien suositummuisuusvalikointia I-alueen
2 3 84558 geenien säätelemässä hapteeni-kantaja-järjestelmässä, hiiren H-2-kompleksissa, esitetään julkaisussa Seman et al., J. Immunol., 129, 2082 (1982). Humoraalista anti-hbsag-reaktiota säätelee vähintään kaksi immuunireaktion (Ir) geeniä. Toinen näistä geeneistä on hiiren H-2-kompleksin I-A-ala-alueessa (Ir-HBs-1) ja toinen I-C-alaalueessa (Ir-HBs-2). IrHBs-1 säätää kaikkia HBsAg:n determinanttien aiheuttamia reaktioita; kun taas Ir-HBs-2:n vaikutus on spesifistä alatyypille. (Yleiskuvaus Ir-geeneistä ja alaalueista on löydettävissä julkaisusta Bach, Genetic Control of Immune Responses in Immunology, kappale 24, sivut 677-703 (John Wiley & Sons, New York 1982), joka julkaisu liitetään oheiseen hakemukseen tällä viittauksella). Ohessa käytetyissä kannoissa HBsAg:n P25-polypeptidin alayksikön P25-1 sijaitsevan aminopään fragmentin sekä synteettisten polypeptidien P5a tai P6 aiheuttamat positiiviset, T-solujen lisääntymisen aikaansaavat reaktiot osoittivat, että kaikkia HBsAgdeterminantteja vastaan vaikuttavien anti-hbs-vasta-aineiden tuotanto oli parantunut. Sitä vastoin T-solujen lisääntymismalli hiirikannassa B10.A vastaa alentunutta anti-hbs-vastaaineiden primääriä tuotantoa, joka rajoittuu alatyypin spesifisyyteen. Synteettisten peptidien P5, P5a ja P6 aminopään fragmentissa oleva kohta, tai kohdat, toimii T-solun "kantaja-determinanttina", jonka T-avustajasolut tunnistavat, jotka T-avustajasolut kykenevät toimimaan a-, d- ja y-epitoopeille spesifisten ja I-A-alaalueen rajoittamien B-solun kloonien toiminnallisena apuna. "Kantaja-determinantin" tunnistamisen puuttuessa I-C-ala-alueen rajoittamien, alatyypille spesifisten avustaja- tai vaimentaja- T-solujen vaikutusta tarkkaillaan. Koska kanta B10.A tuottaa minimaalisen sekundäärisen anti-a-vasta-aineen reaktion, niin alatyypille spesifiset T-solut voivat myös toimia rakenteelliselle a-epitoopille spesifisten B-solun kloonien apuna.
24 84558 Näillä havainnoilla on huomattavaa merkitystä synteettisen HBsAg-rokotteen kehittämisessä; ajatellen erityisesti sitä mandollisuutta, että ihmisen HBsAg-pohjustetut T-solut saattavat tunnistaa samat epitoopit kuin hiiren T-solut. Erityisesti pääasiallisen histologisesti yhteensopivan kompleksin ja HBsAg:n aiheuttaman immuunireaktiivisuuden säätelyn välinen yhteys hiirissä on ulotettu ihmisen immuunireaktiivisuuteen. Julkaisussa Walker et al., Proc. Amer. Assoc. Blood Banks, 4 (1981) esitetään, että ihmisen pääasiallisen histologisesti yhteensopivan kompleksin DR-geenin sijaintikohdassa esiintyvän tietyn fenotyypin ja jokin aika sitten kokeillun HBsAgrokotteen epäreaktiivisuuden välillä on yhteyttä. Täten synteettisen HBsAg-rokotteen muodostaminen käsittää mieluiten, B-solun determinanttien lisäksi, riittävän monipuolisten T-solun determinanttien läsnäolon, jotta nämä determinantit kykenisivät mukautumaan tavanomaisessa ihmispopulaatiossa epitoopin tunnistamisessa esiintyvään geneettiseen vaihteluun. III.Tulokset A. Hiiren B-solun epitooppien tunnistaminen Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenista (HBsAg) tunnistettiin ne polypeptidiketjut, jotka indusoivat hiiren anti-hbsag-vastaaineiden tuotannon ja sitoutuvat näihin vasta-aineisiin. Synteettisen polypeptidin synteesiin valittiin lukuisia polypeptidiketjuja HBsAg-ryhmän a alatyypeistä yw (HBsAg/ayw). Näistä polypeptideistä käytetään lyhenteitä Pl, P2, P3, P4, P5, P5a, P6, P49, P49a, P71, P72, P72a sekä P73 ja ne on esitetty kuvassa 1. Nämä peptidit syntetoitiin kemiallisesti oheisen julkaisun osassa VI kuvattuja kiinteän faasin menetelmiä käyttäen, jotka on kuvattu yksityiskohtaisemmin julkaisuissa Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963) sekä Houghten et al., Int. J. Peptide Protein Research, 16, 311 (1980). Kullekin näille
25 84558 synteettisille peptideille spesifisiä anti-polypeptidisiä vastaaineita muodostui, kun nämä synteettiset polypeptidit kytkettiin KLH:hon ja annettiin kaniineille rokotteena, joka sisälsi myös vettä ja lisäainetta. Nestemäiset puhdistetut HBsAg-ryhmän a alatyypin d (HBsAg/ad) sekä HBsAg-ryhmän a alatyypin y (HBsAg/ay) preparaatit saatiin tutkijalta Dr. Robert Louie (Cutter Laboratories, Berkeley, California). Synteettisten peptidien aikaansaamien vastaaineiden ja HBsAg/ad- sekä HBsAg/ay-tyyppien välistä reaktiivisuutta analysoitiin ohessa kuvatulla tavalla hemagglutinaation kokeella (HA). Samoin jäljempänä kuvattavalla tavalla määritettiin näiden kiinteän faasin menetelmällä valmistettujen polypeptidien kyky sitoa hiiren luonnollista HBsAg:tä vastustavia vasta-aineita, joiden spesifisyys oli joko d tai y. Polypeptidit P73 (jäännökset 107-137), P72 (jäännökset 110-137) ja P72a (jäännökset 125-137) indusoivat sellaisten vasta-aineiden tuotannon, jotka vasta-aineet olivat ristireaktiivisia luonnollisen HBsAg:n ad-alatyypin kanssa. Toisaalta polypeptidit P49 (jäännökset 110-137) ja P49a (125-137) indusoivat sellaisten vasta-aineiden tuotannon, jotka olivat ristireaktiivisia pääasiallisesti luonnollisen HBsAg:n ay-alatyypin kanssa. (Katso taulukko I).
26 84558 Taulukko 1 B-solun epitooppien tunnistaminen HBsAg:n synteettisissä peptidianalogeissa Peptidi l P73 P72 P72a Anti-peptidin reaktiivisuus luonnollisen HBsAg:n kanssa HA-tiitteri Anti-luonnollisen HBs:n reaktiivisuus ki inteän faasin peptidien kanssa` RIA-tiitteri HBsAg/ad HBsAg/ay Anti-HBs/d3 Anti-HBS/y 1:1280 1:160 1:160 1:40 0 0 1:512 1:1024 ND 4 1:32 P49 1:80 5 1:160 1:32 1:128 P49a 0 1:160 0 1:64 P6 0 0 0 0 P5 0 0 1:8 0 P5a 0 0 0 0 P4 0 0 1:4 0 P3 0 0 1:16 1:8 P2 0 0 0 0 P1 0 0 1:16 0 1. Anti-peptidiset antiseerumit tuotettiin kaniineissa; ja kaik-- ki peptidit konjugoitiin keyhole limpet-etanan hemosyaniiniin (KLH), peptidejä P73, P72 ja Pl lukuunottamatta. Hiirissä /Milich et al., J. Immunol., 130, 1401 (1983)7 ja simpansseissa /Gerin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80, 2365 (1983)7 tuotettujen anti-peptidisten antiseerumeiden spesifisyydet luonnolliselle HBsAg:lle todettiin samoiksi. 2. Peptidit (5 mikrogrammaa koloa kohden) adsorboitiin polystyreenistä valmistettuihin mikrotiitterilevyihin. 3. Anti-HBs/d ja y tuotettiin immunoimalla B10.S(9R)-hiiriä HBsAg/ad- ja HBsAg/ay-tyypillä, vastaavasti. Tässä H-2-yhdistelmäkannassa saatiin ainoastaan alatyypille spesifinen vastaainereaktio. 4. ND = ei määritetty. 5. Ei spesifinen yhteiselle a-determinantille. 0 ND