1 Tutkimusraportti hankkeesta: Kasautuvan univajeen aiheuttamat immunologiset vaikutukset Tarja Stenberg 2 Mikael Sallinen 1, Mikko Härmä 1, Harri Alenius 3 1 Työterveyslaitos, Fysiologian osasto 2 Helsingin Yliopisto, Biolääketieteen laitos 3 Työterveyslaitos, Työhygienian ja toksikologian osasto Hankkeen tausta: Merkittävästä, yli kahden tunnin univajeesta kärsii 15% suomalaisesta aikuisväestöstä(sallinen ym. 2000). Tärkeimmäksi univajeen syyksi raportoitiin työssä käynti. Univajeen yleisyys nykypäivän työelämässä näyttää liittyvän sekä työssä tapahtuneisiin muutoksiin (työn lisääntyneet henkiset vaatimukset ja poikkeavat työajat) että vapaa-ajan uusiin haasteisiin (ajankäytön ongelmat, digitaalinen vapaa-ajan tarjonta ja elintavat) ja yksilöllisiin ominaisuuksiin, kuten aamutyyppisyyteen ja koettuun terveyteen (Hublin ym. 2002, Härmä ym. 2002, Sallinen ym. 2000). Akuutti, vähintään yhden yön univaje heikentää monin tavoin ihmisaivojen tiedonkäsittelytoimintoja, joiden merkitys työelämässä on korostunut työn tietointensiivisyyden lisääntymisen myötä. Esimerkiksi suunnittelua ja tietoteknologian käyttöä edellyttävän tietotyö on kolminkertaistunut vuodesta 1988. Uusimman tutkimustiedon mukaan on todennäköistä, että univaje vaikuttaa myös elimistön stressireaktioihin. Univajeella näyttäisi olevan epäedullisia vaikutuksia autonomisen hermoston tasapainoon ja energia-aineenvaihduntaan. Univaje saattaa myös olla merkittävä ylipainon, diabeteksen ja sepelvaltimotaudin riskitekijä. Jos näin on, univajeella on erittäin merkittäviä kansanterveydellisiä ja kansantaloudellisia seuraamuksia. Työelämässä akuutti univaje on suhteellisen harvinainen ilmiö, mutta sitäkin yleisempää on osittainen, työviikon mittaan kasautuva univaje, jonka vaikutuksista toistaiseksi on tiedetty varsin vähän. Suoritimme vuosien 2004 2006 aikana kokeellisen tutkimuksen, jossa selvitettiin osittaisen, kasautuvan univajeen vaikutuksia ihmisen psyykkiseen suoriutumiseen ja fysiologiseen kuormittumiseen. Hankkeen osittaisesta rahoituksesta vastasi Työsuojelurahasto (hanke 104073), ja siitä on jätetty loppuraportti 7.12.2006. Tiivistelmänä kokeen tuloksista voidaan sanoa, että osittainen viiden päivän mittainen kasautuva univaje alensi huomiokykyä (Haavisto et al. 2010) ja aktivoi immuunijärjestelmää (Van Leeuwen et al. 2009). Nyt raportoitava hanke on jatkotutkimus juuri immuunijärjestelmän osalta. Halusimme selvittää miten immuunijärjestelmä kokonaisuudessaan reagoi osittaiseen univajeeseen.
2 Tutkimuksen tarkoitus: Tutkimuksen tarkoituksena oli 1) selvittää mitkä spesifiset immuunijärjestelmän osat aktivoituvat ja mitkä hiljenevät kasautuvan univajeen aikana 2) selvittää miten ihmisen geenien ilmeneminen muuttuu kasautuvan univajeen ja siitä toipumisen aikana. Projektin kuvaus Tutkittavat Tutkittavina oli 25 nuorta (20 25 v) vapaaehtoista, tervettä miestä, joista 17 kuului koeryhmään ja 8 toimi kontrolleina. Ennen koetta tutkittavat haastateltiin puhelimitse, minkä perusteella heidät kutsuttiin haastatteluun ja lääkärintarkastukseen. Haastattelulla ja testeillä suljettiin pois fyysiset ja psyykkiset sairaudet sekä unen ja vuorokausirytmin häiriöt. Henkilöistä otettiin myös verikoe, jonka tuloksia käytettiin yleissairauksien poissulkemiseksi. Tutkittavat välttivät kofeiinia, tupakkaa, alkoholia sekä useimpia lääkeaineita viikon ennen kokeen alkua, sekä kokeen ajan. He noudattivat säännöllistä ruokavaliota ja heidän uni-valverytminsä kontrolloitiin aktigrafilla viikon ajan ennen kokeen alkua. Tutkimusasetelma Tutkimus suorittiin Työterveyslaitoksen Aivotyölaboratoriossa. Koetta edeltävän viikon ajan suoritetaan kotirekisteröinti, jonka aikana tutkittava pitää aktigrafia ja unipäiväkirjaa sekä noudattaa säänneltyä ruokavaliota. Kokeen kahtena ensimmäisenä vuorokautena laboratoriossa tutkittava nukkui 8 tuntia yössä (23-07) ja suoritti testejä protokollan mukaisesti. Seuraavien 5 vuorokauden aikana koeryhmän jäsenet nukkuivat 4 t / vrk (03-07). Palautumista seurattiin kahden päivän ja kolmen yön ajan, jolloin unijakso oli jälleen klo 23 07. Kontrolliryhmän jäsenet suorittivat täsmälleen samat toimet, mutta he saivat nukkua 8 tuntia joka yö. Tutkittavat olivat kokeen aikana laboratoriossa yhteensä 9,5 päivää ja kymmenen yötä. Jokaisena tutkimuspäivänä tutkittavat suorittivat 150 min mittaisen testijakson klo 10 12. 30 ja 14.30 17.00. Tämän lisäksi lyhyempi testijakso (90 min) suoritettiin klo 00.30-02 rajoitetun yöunen vuorokausina (5 vrk). Päiväaikainen testijakso koostui monitehtävästä tauotta (50 min), PVT mittauksesta ja sakkaditestistä (20 min) sekä monitehtävästä 10 min tauolla (50 min). Tauottoman ja tauollisen monitehtäväjakson järjestys oli tasapainotettu. Yöaikaisesta testijaksosta tauollinen osuus jätetään pois. Edellisten lisäksi, joka päivä heti herättyä (klo 7) tehtiin PVT. Verenpaine mitattiin joka aamu ennen PVT:tä. Koejaksoon liittyi kolme tehomittausvuorokautta, jolloin edellisten testien lisäksi otettiin aamuiset verikokeet, suoritettiin syljen vuorokausikeräys, testattiin autonomisen hermoston toiminta ja mitattiin verenpaine 2 tunnin välein. Ensimmäinen laboratoriovuorokausi ja ensimmäinen palautumisvuorokausi univajeen jälkeen olivat osittain tehostetun mittauksen vuorokausia, jolloin toimenpiteet olivat kuten edellä, paitsi että veri- ja sylkinäytteitä ei kerätty. Koeasetelma suunniteltiin siis sellaiseksi, että jokainen koehenkilö toimii omana kontrollinaan verrattaessa tutkittavaa suuretta eri olosuhteiden välillä (perustila, unideprivaatio ja palautuminen), jolloin tutkittavan suureen vaihtelu aiheutui vain
3 olosuhteiden muutoksista. Käyttämällä kontrolliryhmää, joka sai nukkua normaalisti, voitiin selvittää oliko laboratoriossa vietetyllä ajalla sinänsä vaikutusta tutkittaviin suureisiin. Menetelmät Verinäytteiden otto Ennen tutkimuksen alkua tutkittavista otettiin 5 ml seerumia vastaainetutkimuksiin, joilla selvitettiin mm, onko jo ennen tutkimuksia todettavissa seerumissa vasta-aineita, jotka viittaavat poikkeavaan immuunivasteeseen. Tutkittavilta kysyttiin myös, onko suvussa autoimmuunisairauksia. Lisäksi otettiin näytteet HLA-tyypitystä varten, jonka avulla voidaan myöhemmin tutkia immuunijärjestelmän geneettistä häiriöherkkyyttä. Tutkimushankkeen aikana tutkittavilta otettiin immunologisia tutkimuksia varten 3 x 50ml hepariiniverta. Näytteet otettiin koeasetelman kaavion mukaisissa kohdissa tutkimusta. Näytemäärät: Kaikkiaan 22 koehenkilöstä on kolme näytettä kustakin (perustason, univajeen ja palautumisvaiheen näytteet), eli 66 verinäytettä. Jokaisesta on määritetty solujakauma, tehty proliferaatiotestit ja eristetty PHA:lla ja PPD:llä stimuloiduista soluista kokonais-rna, joka on käännetty cdna:ksi reaaliaikaista PCR:ää varten. Stimuloinnit tehtiin tuoreista, pakastamattomista verinäytteistä. Välittömästi stimulaation jälkeen eristettiin RNA ja käännettiin cdna:ksi, joka pakastettiin myöhempiä määrityksiä varten. Stimuloitujen solujen viljelysupernatantit on myös otettu talteen välittäjäainemäärityksiä varten. Kontrollinäytteinä stimuloiduille soluille toimivat viljelymediumissa saman ajan viljellyt potilaan solut. Näin saaduista 198 näytteestä (3 x 3 x 22 = 198) mitataan kustakin 14 mrna:n ja proteiinin pitoisuudet (kaikkiaan noin 5000 määritystä). Geenien ilmentymisen profilointi mikrosiruanalyysillä Geenien ilmentymisprofiili mitattuna koko genomista tuottaa merkittävää tietoa siitä, mitkä geenit aktivoituvat ja mitkä hiljenevät univajeessa sekä miten geenien ilmentyminen korjautuu palautumisjakson aikana. Tällaisia analyysejä on tehty mm. jyrsijöistä (Cirelli 2002;Terao et al. 2003) akuutin univajeen yhteydessä, mutta ihmisiltä ei vastaavia tuloksia ole raportoitu. Analyysi antaa tietoa siitä, millaiset elintoiminnot kärsivät univajeesta. Paitsi yksittäisten geenien ilmentymistä, tutkimme myös eri elintoimintoihin liittyvien geeniryppäiden ilmentymistä käyttäen mm. klusterianalyysiä. Verinäytteiden (perustaso, univaje ja palautuminen) soluista eristetty RNA on käännetty cdna:ksi ja laitettu -20C odottamaan mikrosiruanalyysiä. Geenien ilmentymisen profilointi suoritetaan hybridisoimalla tutkittava cdna mikrosiruille, joihin on kiinnitetty ihmisen genomin kaikki geenit. Yksittäisten geenien ilmentymisen tasoa univajeen ja toipumisen aikana verrataan perustasolla mitattuun ilmenemiseen. Ekspressiotulosten validointimittaus kvantitatiivista PCR:ää käyttäen Seuraavat geenit valittiin validointimittauksiin: UBE2D1, NCAM1, HIPK3, STX16, GNLY, BTG2, TBX21, TGFBR3, FCRL2, GNLY ja IKZF1. cdna syntetisoitiin käyttäen DyNAmo cdna Synthesis Kit F-470L:ää qrt-pcr primereille (Finnzymes, Helsinki, Finland) käyttäen 1 μg of kokonais RNA:ta templaattina, ja random heksameeri primereitä (Finnzymes) käyttöohjeen mukaan. Kvantitatiivinen reaaliaika RT-PCR suoritettiin DyNAmo Flash SYBR Green qpcr Kit:illä (Finnzymes) käyttäen AbiPrism 7900HT detektion systeemiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tulokset analysoitiin käyttäen SDS ohjelmaa AbiPrism 7900HT. Suhteellinen fold change geenien ilmentymisessä laskettiin käyttäen ΔΔCt menetelmää normalisoiden tulokset ACTB ja TBP konrolligeeneihin. Tilastolliset erot arvioitiin käyttäen parittaista t-testiä.
4 Tulokset Kuvassa 1 esitetään analyysistrategia tuloksineen. Geenien ilmentymisen muutosta arvioitiin kolmella tilastollisella tasolla, kaikilla tasoilla arvioitiin sekä yksittäisen geenien muutokset että etsittiin geenipolkuja, joissa muutokset ilmenivät. 1.a) 1.b) Up 43 73 Down 14791 227 Up Down Not significant 83 Not significant 134 60 Significant change in the control group as well 1.c) 1.d) 26 6 82 25 Up Down Not significant 33 12 Up Down Minor change Figure 1. Analysis strategy. The flow of statistical analysis is presented. a) The 15 101 entities (genes/transcripts) that passed filtering by flags and reannotation were analysed with 2-way ANOVA. Significant changes can be seen in both the up regulated (red) and the down regulated (green). b) Altogether 310 genes with 2-way ANOVA interaction p-value (taking into account both the case/control status and the timepoints) significant (p < 0.05) were further analysed with 1-way repeated measres ANOVA considering the three timepoints. c) The 133 genes with 1- way ANOVA p-value significant (p < 0.05) for sleep-deprived subjects but not for the control group were then analysed using T-test between the timepoints BL and SR. d) The genes survived the stringent p-value limit, p < 0.005, for T-test were then filtered with fold change limit between these two timepoints, fold change cutoff 1.5- fold. Six out of the remaining 18 genes were up regulated, twelve down regulated.
5 Taulukoissa 1 a ja 1 b näkyvät ne polut, joihin kuuluvat geenit muuttuivat osittaisen univajeen kuluessa (ilmentyminen lisääntyi= upregulated, ilmentyminen väheni=downregulated) Kuva 2. Esimerkki yhden geenipolun (NF-KB) geenien ilmentymisen muutoksista
6 Sleep-deprived subjects Control group up regulated no change down regulated fold change > 5 2 5 1.5 2 1.2 1.5 1.2 1.5 1.5 2 2 5 > 5 Kuva 3 esittää tiukemmilla tilastollisilla kriteereilla seulottujen geenien ilmenemisen muutokset (kaikkiaan 310 geeniä); lisääntynyt ilmentyminen= punasävyt Vähentynyt ilmentyminen= vihreät sävyt Ei muutosta= musta Kuvassa esitetty kaikkien koehenkilöiden geenimuutokset Figure 3. The 310 transcripts with significant interaction p-value by 2-way ANOVA (p < 0.05) sorted by average fold change from baseline to sleep restriction in the sleep deprived group. Colour codes representing the fold change from BL to SR timepoint for each individual subject.
7 Taulukko 2 esittää kaikkein tiukimpien tilastollisen kriteerien mukaan seulotut geenit Affymetrix Probe Up regulated 210148_at HIPK3 016 1,91 up homeodomain interacting protein kinase 3 214590_s_at UBE2D1 047 1,71 up ubiquitin conjugating enzyme E2D 1 216901_s_at IKZF1 031 1,71 up IKAROS family zinc finger 1 201235_s_at BTG2 029 1,65 up BTG family, member 2 221638_s_at STX16 030 1,63 up syntaxin 16 221239_s_at FCRL2 033 1,58 up Fc receptor like 2 Down regulated Gene symbol p value Fold change Direct. Gene Title 211687_x_at KIR3DL1 036 2,18 down killer cell immunoglobulin like receptor 210164_at GZMB 017 1,87 down granzyme B (cytotoxic T lymphocyte associated serine esterase 1 212843_at NCAM1 004 1,75 down neural cell adhesion molecule 1 228774_at CEP78 020 1,69 down centrosomal protein 78kDa 210321_at GZMH 019 1,69 down granzyme H (cathepsin G like 2, protein h CCPX) 227819_at LGR6 041 1,65 down leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 6 37145_at GNLY 015 1,63 down granulysin 205495_s_at GNLY 019 1,62 down granulysin 226625_at TGFBR3 040 1,55 down transforming growth factor, beta receptor III 210140_at CST7 029 1,53 down cystatin F (leukocystatin) 220684_at TBX21 022 1,52 down T box 21 213915_at NKG7 048 1,52 down natural killer cell group 7 sequence
8 4.a) GNLY expression, BL=1 1,5 0,5 GNLY expression, BL=1 1,5 0,5 SR Rec 4 5 8 9 12 14 15 17 18 Sleep deprived subjects 23 28 29 31 Control subjects 4.b) GNLY GNLY expression, BL=1 BL=1 1,5 0,5 GNLY expression, BL=1 BL=1 1,5 0,5 SR SR Rec Rec 4 5 8 9 12 14 15 17 18 4 5 8 9 12 14 15 17 18 Sleep deprived Sleep deprived subjects subjects 23 28 29 31 23 28 29 31 Control subjects subjects Figure 4. The individual expression of the GNLY gene by two separate Affymetrix probes a) 205495_s_at and b) 37145_at in the sleep-deprived and the control group. Expression values after sleep restriction period (SR) and recovery phase (Rec) normalised to the baseline (BL) of each subject. Kuva 4. Esimerkki yksittäisen geenin (GNLY) ilmentymisen muutoksista kaikissa koehenkilöissä. Geenin alueella oli kaksi eri koetinta, joiden tulokset ovat identtiset. Yhteenvetona tuloksista voidaan sanoa, että useat immunologiseen järjestelmään liittyvät geenit muuttavat ilmentymistään osittaisen univajeen aikana. Tulokset tukevat aiemmin julkaisemiamme tuloksia, joissa osoitimme immuunijärjestelmän muutoksia solutasolla (van Leeuwen et al. 2009). Näistä tuloksista on tekeillä käsikirjoitus, jonka abstrakti ohessa. Jatkossa tutkimme geenien ilmentymismuutosten yhteyttä muihin kokeessa mitattuihin suureisiin yksilötasolla.
9 Nyt raportoitavasta tutkimuksesta on tekeillä käsikirjoitus: Partial sleep deprivation alters immune functions a microarray study on healthy young men Vilma Aho 1, Hanna M. Ollila 1,2,7, Wessel Van Leeuwen 1,3, Maili Lehto 4, Harri Alenius 4, Mikko Härmä 3, Mikael Sallinen 3, Ida Lindqvist 2, Samuli Ripatti 2,5, Janna Saarela 2,6, Tiina Paunio 2,7, Tarja Porkka-Heiskanen 1 1 Department of Physiology, Institute of Biomedicine, University of Helsinki, Finland 2 Department of Molecular Medicine, National Institute for Health and Welfare, Helsinki, Finland 3 Brain and Work Research Centre, Finnish Institute of Occupational Health, Helsinki, Finland 4 Unit of Excellence for Immunotoxicology, Finnish Institute of Occupational Health, Helsinki, Finland 5 Department of Medical Epidemiology & Biostatistics, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden 6 FIMM, Finnish Institute of Molecular Medicine, Helsinki, Finland 7 Department of Psychiatry, HUCH, Helsinki, Finland Abstract Objectives: Recurrent loss of sleep is an increasing problem in modern information societies. Sleep deprivation has been associated with many immunological and psychological diseases, as well as with impairment of cognitive performance. To elucidate both the detriments of sleep deprivation and the core function and molecular mechanisms of sleep homeostasis, we simulated a 5-day working week with restricted sleep and subsequent recovery sleep of two nights. Materials and Methods: Subjects, healthy young men, spent a week in laboratory conditions. After two nights baseline sleep (8 hours sleep/night), thirteen subjects were partially sleep deprived for five successive nights (4 h/night) followed by two nights recovery sleep (8 h/night). Control subjects (n=6) spent the time in laboratory sleeping normally (8 h/night). Blood samples were collected from 10 sleep-deprived and 6 control subjects after baseline, sleep deprivation and recovery phases. Total RNA was extracted from blood mononuclear leukocytes. RNA expression was analysed using Affymetrix whole genome microarrays complemented with pathway and transcription factor analysis of differentially expressed genes. Results: After sleep deprivation, expression changes were observed at gene and pathway levels. The most enriched pathways included those of immune response, metabolic processes, interleukin signaling, stress response and apoptosis. We also observed that the changes induced by sleep deprivation were partially reversed after recovery sleep, as expected. However, for a number of genes, the expression levels did not reach baseline levels. Conclusions: Altogether, these changes in RNA expression may contribute to the pathological outcomes observed in sleep deprivation. Our data suggest that sleep deprivation has strong pathophysiological effect on many signaling pathways related to the immune system and that the recovery from sleep deprivation is a long-term process also at cellular level.
10 Kokonaisprojektista on tähän mennessä julkaistu kolme artikkelia Van Leeuwen, W.M.A., Lehto,M, Kaarisola, P, Lindholm, H., Sallinen, M., Härmä, M., Porkka- Heiskanen, T., Alenius, H., Sleep restriction increases the risk of cardiovascular diseases by enhancing proinflammatory responses through IL-17 and CRP. PloS ONE 4(2): e4589, 2009 Haavisto M-L, Porkka-Heiskanen T, Hublin C, Härmä M, Mutanen P, Müller K, Virkkala J, Sallinen M, Sleep Restriction for the Duration of a Work Week Impairs Multitasking Performance J Sleep Research (in press 2010) Van Leeuwen, W.M.A, Hublin, C, Sallinen, M, Härmä, M, Porkka-Heiskanen, T, Increased leptin and IGF-1 after prolonged sleep restriction and subsequent recovery sleep in healthy young men. Int J Endocrinol (in press 2010)