ASTROSYYTIT ALZHEIMERIN TAUDISSA JA TAUTIMALLI HUMANISOIDUILLA HIIRILLÄ

ASTROSYYTIT ALZHEIMERIN TAUDISSA JA TAUTIMALLI HUMANISOIDUILLA HIIRILLÄ Riitta Moisala Syventävä opinnäytetyö Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta A.I. Virtasen instituutti/neurotieteet PÄIVÄMÄÄRÄ Ohjaajat: Henna Konttinen Katja Kanninen Tarja Malm

Tiivistelmä: Alzheimerin taudissa soluvälitilaan kertyvän beeta-amyloidiplakin uskotaan aktivoivan astrosyytit tuottamaan proinflammatorisia, eli tulehdusta edistäviä, aineita. Tämä johtaa keskushermoston tulehdustilaan ja etenevään neurodegeneraation. Beeta-amyloiditeoria on kuitenkin kyseenalaistettu viime vuosina, sillä plakin määrä ei korreloi taudin pahenemisen kanssa odotetusti eikä plakin puhdistaminen estä tai hidasta taudin etenemistä. Uusi väline tutkimukseen on humanisoidut hiiret, joilla yksi tai useampi solutyyppi on korvattu ihmisen vastaavalla. Humanisoitujen hiirien etuna on, että voidaan tutkia ihmisen solujen toimintaa aidossa keskushermostossa ja solumuutosten vaikutuksia siihen. Tämän työn tavoitteeena oli siirtää hiirelle ihmisen astrosyytteja, jotta saataisiin eläinmalli Alzheimerin taudin prosessien tutkimiseen. Hypoteesina oli, että neonataalihiiren lateraalisiin aivokammioihin siirretyt esiastesolut leviävät aivoihin ja kypsyvät siellä toimiviksi astrosyyteiksi. Hiirten ollessa kahden kuukauden ikäisiä otettiin aivot analysoitavaksi. Leikkeet tehtiin kryostaatilla. GFAP + HuNu -kaksoisvärjäyksessä todettiin hiiren aivoissa olevan ihmisperäisiä astrosyytteja. Solujen määrä kuitenkin laski kauemmas aivokammioista siirryttäessä ja syvällä aivokudoksessa ei ihmisperäisiä soluja ollut. Lisäksi havaittiin HuNu-vasta-aineelle reagoineita soluja, joihin GFAP-vasta-aine ei ollut tarttunut. Näiden arveltiin olevan neuronaaliseen suuntaan erikoistuneita. Asia varmistui jatkovärjäyksessä, kun HuNu + Doublecortin - kaksoisvärjäyksessä havaittiin, että osa humaanisoluista oli hermosoluja. Aikaisempien tutkimusten perusteella todettiin, että solut humanisoiduilla hiirillä ovat laajemmalti levinneet vasta 4-5kk iässä. Neuronaaliseen suuntaan erilaistuminen saadaan taas estettyä kypsyttämällä astrosyyttien esiastesoluja aina 6kk aikapisteeseen asti, kun nyt ne transplantoitiin jo 4kk aikapisteessä. Transplantoitavien astrosyyttien esiastesolujen ollessa yli 6kk ikäisiä ja hiirien ollessa vähintään 5kk ikäisiä, saadaan luultavasti vielä parempia tuloksia. Lupaavat tulokset kuitenkin antavat viitteitä siitä, että humanisoituja hiiriä voidaan tulevaisuudessa käyttää Alzheimerin taudin tutkimukseen. Kun taudin yksityiskohtainen eteneminen on saatu selvitettyä, voidaan suunnitella toimiva lääkehoito. Tautitutkimuksen ohella humanisoituja hiiriä voidaan käyttää myös lääkekokeiluihin.

SISÄLLYS: 1. JOHDANTO...1 2. TUTKIMUKSEN TAUSTA...2 2.1. Alzheimerin tauti...2 2.2. Astrosyytit Alzheimerin taudissa...4 2.3. Taudin mallintaminen:...6 2.3.1. Perinteiset hiirimallit...6 2.3.2. ips-solut...7 2.4. Humanisoidut hiiret tautimallina...9 3. TAVOITTEET JA HYPOTEESIT...12 4. AINEISTO JA MENETELMÄT...12 4.1. Humanisoitujen hiirien luominen...12 4.1.1. Fibroblastien muuttaminen ips-soluiksi...12 4.1.2. ips-solujen erilaistaminen astrosyyteiksi...13 4.1.3. Transplantaatio...13 4.2. Hiiren kasvu, lopetus ja aivoleikkeiden valmistaminen...15 4.3. Värjäykset...17 4.3.1. GFAP ja HuNu kaksoisvärjäys...18 4.3.2. Ihmisspesifi GFAP värjäys...19 4.3.3. TUJ1 ja HuNu kaksoisvärjäys...19 4.3.4. Doublecortin ja HuNu kaksoisvärjäys...20 4.4. Tulokset...21 5. JOHTOPÄÄTÖKSET...23 5.1. Transplantaation onnistuminen...23 5.2. Tulevaisuus...25 6. EETTISET KYSYMYKSET...26 6.1. Hiirimallit...26 6.2. ips-solut...26 6.3. Humanisoidut hiirimallit...27 7. YHTEENVETO...27 8. LÄHDELUETTELO...30

1. JOHDANTO Opinnäytetyöni käsittelee astrosyyttien osuutta Alzheimerin taudissa ja taudin mallintamista humanisoiduilla hiirillä. Astrosyytit ovat gliasoluja, jotka ylläpitävät keskushermoston tasapainoa ja turvaavat sen moitteettoman toiminnan jatkumisen. Etenevä hermosolujen rappeutuminen ja muut patologiset muutokset taudissa selkeästi viittaavat siihen, ettei tasapainon ylläpito enää onnistu. Kysymys kuuluu, miksi? Alzheimerin taudin tutkiminen on ollut vaikeaa taudin etenevän luonteen ja monimutkaisuuden vuoksi. Ihmisen astrosyytit eroavat merkittävästi hiiren vastaavista, mikä on ollut haaste hiirimallien käyttämiselle. Ihmisen astrosyytteja ei kuitenkaan voida tutkia elävältä ihmiseltä. Soluviljelmällä kasvavilla soluilla taas ei voida tutkia monipuolisesti solujen välisten interaktioiden vaikutuksia koko keskushermostoon. Olisi myös tärkeää saada näytteitä ja tutkimusdataa tarkasti eri vaiheista taudin edetessä. Yksi uusi tapa tutkia Alzheimerin tautia on humanisoidut hiiret, joilla yksi tai useampi hiiren oma solutyyppi on korvattu ihmisen vastaavalla. Tässä nimenomaisessa tutkimuksessa mielenkiinnon kohteena ovat astrosyytit, joita tuotetaan hyödyntämällä indusoituja kantasoluja. Luovutetut ihmisen ihosolut uudelleenohjelmoidaan kantasoluiksi, erilaistetaan astrosyyteiksi ja siirretään hiiren aivoihin. Jos solujen luovuttajalla on Alzheimerin tauti, on tautiin johtava perimä myös ihosoluissa. Näistä soluista tuotettujen astrosyyttien pitäisi aiheuttaa hiirelle Alzheimerin tauti. Tautimalli tulee olemaan oiva lisäväline tutkimukseen. Humanisoituja hiiriä voidaan tulevaisuudessa käyttää Alzheimerin taudin yksityiskohtien selvittämiseen ja lääkekokeiluihin. Humanisoitujen hiirien etuna on, että aidot ihmisen solut ovat aidossa keskushermostossa, toisin kuin perinteisessä hiirimallissa tai soluviljelmämallissa. Tämän tutkimuksen hypoteesina on, että neonataalihiiren lateraalisiin aivokammioihin transplantoidut astrosyyttien esiastesolut kypsyvät toimiviksi valmiiksi astrosyyteiksi, tulevat leviämään hiiren aivoihin ja syrjäyttämään hiiren omat astrosyytit. Tutkimus suoritetaan A. I. Virtasen instituutissa Tarja Malmin tutkimusryhmässä. Käsiteltävät näytteet ovat pilottikokeen seitsemältä hiireltä.

2. TUTKIMUKSEN TAUSTA 2.1. Alzheimerin tauti Alzheimerin tauti on yleisin yksittäinen muistisairaus ja yleisin dementian syy. Tällä hetkellä maailmanlaajuisesti sairaudesta kärsii yli 35 miljoona ihmistä, joten sairauden vaikutus on merkittävä 1. Sen hoitoon kuluu myös suuret summat rahaa, joten ongelma on kansanterveydellisen ohella taloudellinen. On arvioitu, että dementian hoitoon kulutettiin vuonna 2010 yhteensä 604 miljardia Yhdysvaltain dollaria 2. Alzheimerin taudin parantamisella tai edes etenemisen hidastamisella saataisiin merkittävät säästöt ja vähennettäisiin inhimillistä kärsimystä. Vaikka sairauden löytymisestä on kulunut yli 100 vuotta, ei sen tarkkaa syntymekanismia vieläkään tunneta täydellisesti. Alzheimerin taudille tyypillisiä neuropatologisia muutoksia ovat soluvälitilaan kertyvä beeta-amyloidiplakki, hyperfosforyloituneiden tauproteiinivyyhtien kertyminen hermosolujen sisälle ja neurodegeneraatio. Viime vuosina neuroinflammaatio on myös yhdistetty Alzheimerin tautiin ja sen osuutta tautiin on pyritty selvittämään 3. Tauti on etenevä ja vaikuttaa huomattavasti sairastuneen elämänlaatuun. Ensioireisiin kuuluu lievää hajamielisyyttä ja uusien asioiden muistamisen hankaluutta, mutta sairauden edetessä aivan perustoiminnot puhumisesta liikkumiseen katoavat 4. Etenevä aivojen rappeutuminen aiheuttaa neuropsykologisia ongelmia. Isolla osalla tautiin sairastuneista esiintyy masennuksen oireita 5. Potilailla on harhaluuloja, kuulo- ja näköharhoja ja lisäksi käytöshäiriöitä kuten aggressiivisuutta 6-8. Aivojen rappeutumisen myötä vaikutukset voivat näkyä myös motoristen toimintojen heikentymisenä, potilaat eivät esimerkiksi enää liiku, puhu ja heillä on kohonnut lihasjännitys ja vapinaa. Yleensä elinaika sairauden kanssa on kahdeksasta kymmeneen vuotta ja kuoleman aiheuttaa lopulta aliravitsemus ja keuhkokuume 4. Tällä hetkellä sairauden parantamiseen ei ole olemassa lääkettä. Neurodegeneraatioon liittyen myös synapsit keskushermostossa kuolevat ja välittäjäaineiden tasapaino häiriintyy 3. Olemassa olevat lääkkeet keskittyvätkin välittäjäainetasapainon palauttamiseen. Asetyylikoliiniesteraasin estäjä lisää asetyylikoliinin määrää synapsiraoissa, helpottaen hetkellisesti käytösoireita ja parantaen kognitiivisia toimintoja. Memantiini taas toimii NMDA-reseptorin antagonistina vähentäen glutamaatti-välittäjäaineen vaikutuksia keskushermostossa. Kuitenkin hyöty on vain 2

väliaikainen ja sairauteen liittyvä keskushermoston rappeutuminen etenee lääkityksestä huolimatta. Muutoin lääkitys kohdistuu lähinnä sairauden aiheuttamien oireiden hoitoon. Esimerkiksi masennusta voidaan hoitaa lääkityksellä 4. Tautia on useampaa tyyppiä. Tyypillisin on vanhuusiän tyyppi, johon sairastutaan yli 65- vuotiaana. Perinnölliseen tyyppiin sairastutaan tyypillisesti nuorempana, alle 60-65 vuotiaana ja se kattaa 1-6% sairastuneista. Perinnölliseen tyyppiin liittyy sairauteen altistavat geenimutaatiot, jotka periytyvät 9. Perinnöllisen taudin aiheuttavia geenejä on löydetty kolme. Kaikista harvinaisin on mutaatio preseniliini 2:ssa. Mutaatio preseniliini 1:ssä on taas yleisin mutaatiotyyppi 4. Preseniili on yksi gamma-sekretaasinkompleksin muodostava proteiini. Gamma-sekretaasi pilkkoo amyloidiprekursoriproteiinin keskushermostoon kertyväksi beetaamyloidiplakiksi. Mutaation arvellaan aiheuttavan sen toiminnan tehostumisen ja näin johtavan beeta-amyloidin kertymiseen enenevässä määrin 10. Mutaatio amyloidiprekursoriproteiinin geenialueella johtaa myös tautiin. Koska beeta-amyloidi vapautetaan amyloidiprekursoriproteiinista, määrää lisäävä mutaatio sen geenialueella johtaa tautiin johtavan beeta-amyloidin määrän lisääntymiseen 11. Esimerkiksi 21-trisomian omaavilla puhkeaa lähes kaikilla Alzheimerin tauti todella nuorena. Tämä siksi, että beeta-amyloidiksi pilkkoutuvan amyloidiprekursoriproteiinin geeni sijaitsee kahdentuneessa 21. kromosomissa. Amyloidiplakkia on löydettävissä jopa 8 vuoden ikäisiltä lapsilta, joilla on Downin syndrooma. 12 Beeta-amyloiditeoria on johtanut Alzheimerin taudin tutkimusta jo vuosia. Sen mukaan amyloidiprekursoriproteiini hajoaa sekretaasin vaikutuksesta epänormaalisti Aß42:ksi, joka kertyy soluvälitilaan johtaen neurodegeneraatioon ja taudin etenemiseen. Kilpailevia teorioita on useita, mutta amyloidiplakkiteoriaa tukevat myös varhain puhkeavan Alzheimerin taudin muodot. Nuoruusiän Alzheimerin tautiin johtaa nimenomaan beeta-amyloidiplakin määrän kasvuun johtavat mutaatiot 3. Beeta-amyloidiplakin kertymisen uskotaan häiritsevän solujen toimintaa aikaansaaden hermosolujen kuoleman. Tau-proteiini kuuluu solun normaaliin tukirankaan. Sen kertyminen patologisesti aikaansaa solun tukirakenteiden hajoamisen ja hermosolu kuolee, mikä kiihdyttää tautiprosessia entisestään. Loppuvaiheen Alzheimerin taudista kärsivän aivojen hippokampus ja isoaivokuori ovat silminnähden rappeutuneet 3. Ihmisten keskimääräisen eliniän kasvaessa vanhuustyypin Alzheimerin tautiin sairastuneiden määrän on ennustettu jatkavan kasvuaan. Toimivaa lääkehoitoa taudin parantamiseksi etsitään kuumeisesti 4. 3

2.2. Astrosyytit Alzheimerin taudissa Aivot ovat ihmiselimistön monimutkaisin elin, jonka tasaisten olosuhteiden ylläpito on moitteettoman toiminnan jatkumiselle välttämätöntä. Homeostaasia keskushermostossa ylläpitää heterogeeninen joukko soluja, neurogliasolut. Astrosyytit ovat neurogliasolujen yksi tyyppi, jolla on lukuisia tehtäviä homeostasian ylläpidossa. Astrosyytit on jaettu kahteen päätyyppiin. Aivojen harmaassa aineessa sijaitseviin runsaan haaroittuneisiin protoplasmisiin astrosyytteihin ja valkeassa aineessa sijaitseviin säikeisiin astrosyytteihin. Jako on kuitenkin todella karkea, sillä astrosyytteja on useita alatyyppejä jotka eroavat toisistaan niin rakenteeltaan kuin tehtäviltäänkin 13. Astrosyytit ovat hyvin aktiivisia keskushermoston soluja. Ne reagoivat keskushermostoon kohdistuviin muutoksiin aktivoitumalla ja vastaamalla ärsykkeelle spesifisti. Aivojen keskeisimpiin välittäjäaineisiin kuuluva glutamaatti esimerkiksi nostaa astrosyyttien kalsiumtasoja ja tämän signaalin astrosyytti voi välittää viereisille astrosyyteille. Ca 2+ - välitteisen signaloinnin avulla astrosyytit voivat kommunikoida pitkienkin matkojen päähän 14. Astrosyytit säätelevät tällä glutamaatti-indusoidulla mekanismilla esimerkiksi aivojen verisuonten läpimittaa. Aivojen alueella, joilla happipitoisuus on korkea, astrosyytit vapauttavat verisuonten supistumisen aikaansaavia kudoshormoneja. Alueilla joilla happipitoisuus on laskenut, astrosyytit saavat aikaan verisuonten sileitä lihaksia rentouttavan prostaglandiinin erityksen. Näin verisuonten läpimitta kasvaa ja veren virtaus ohjautuu tarkoituksenmukaisesti alueille, jossa happea tarvitaan 15. Veren virtauksen säätely on elintärkeää keskushermoston toiminnan jatkumiselle, mutta astrosyyttien toiminnot eivät suinkaan rajoitu vain siihen. Astrosyytit ylläpitävät synapsirakojen otollisia oloja säätämällä neste-, ioni-, ph- ja välittäjäainetasapainoa. Tämän vuoksi astrosyyttien solukalvolla onkin runsaasti veden kuljetukseen erikoistuneita akvaporiineja ja ionikanavia. Lisäksi solukalvoilla on välittäjäainespesifejä kuljetusproteiineja eli transporttereita, joilla astrosyytit poistavat ylimääräiset välittäjäaineet. Näin välittäjäaineen seuraavalle hermosolulle välittämä signaali ei pitkity epätarkoituksenmukaisesti. Astrosyytit liittyvät koko keskushermoston energiametaboliaan, vesi- ja ionitasapainoon, neurotransmissioon, hermosolujen uudistumiseen 4

ja muodostavat osaltaan veriaivoestettä. Koska tehtäviä on niin paljon, on astrosyytit hyvin heterogeeninen ryhmä soluja 13. Astrosyyttien roolista Alzheimerin taudissa on yhä enenevässä määrin löytynyt viitteitä. Astrosyyttien tehtävä on keskushermoston tasapainon ylläpito, mikä ilmiselvästi häiriintyy Alzheimerin taudissa. Lisäksi astrosyytteja on yli viisinkertaisesti hermosoluihin verrattuna, joten niiden toiminnan häiriö vaikuttaa dramaattisesti keskushermoston tilaan 13. Aktivoituessaan astrosyytit ja mikrogliasolut erittävät lukuisia tulehdusvälittäjäaineita, kuten sytokiineja. On tutkittu, että beeta-amyloidikompleksit ovat yksi tekijä, joka aktivoi astrosyytteja tulehdusvälittäjäainetuotantoon. Tulehdusvälittäjäainetasojen nousu soluvälitilassa tutkimusten mukaan stimuloi astrosytteja beeta-amyloidin tuotantoon amyloidiprekursoriproteiinista. Tämä johtaa noidankehään, jossa beeta-amyloidi aktivoi astrosyytit tuottamaan tulehdusvälittäjäaineita ja tulehdusvälittäjäaineet stimuloivat astrosyytteja beeta-amyloidin tuotantoon. Beeta-amyloidi kertyy ja muutokset johtavat keskushermoston inflammaatioon ja rappeutumiseen 16,17. Olisiko lääkehoito keskitettävä siis amyloidiplakin vähentämiseen, joka lopulta johtaisi neurodegeneraation pysähtymiseen? Lääkkeet esimerkiksi voivat vähentää amyloidiplakin tuotantoa, lisätä sen poistamista tai vähentää amyloidiprekursoriproteiinin pilkkoutumista plakiksi. Eräs faasi I ja II lupaavana pidetty lääke oli gamma-sekretaasin toiminnan salpaava semagacestat. Gamma-sekretaasin salpaamisen myötä amyloidiprekursorin pilkkoutuminen amyloidiplakiksi loppuu. Koe eteni faasi III lääkekokeisiin, mutta lääkkeeseen todettiin liittyvän liikaa sivuoireita kuten laihtumista, infektioita ja ihosyöpää. Kognitiiviset toiminnot heikkenivät verrattuna verrokkiryhmään ja kyky selvitä päivittäisistä toiminnoista laski. Kliiniset kokeet keskeytettiin 18. Lääkekokeilujen epäonnistuminen voi johtua myös siitä, ettei beeta-amyloidin yhteys Alzheimerin tautiin ole niin suoraviivainen kuin on ajateltu. Koko beetaamyloidiplakkiteoria on osin kyseenalaistettu, kun on havaittu, ettei amyloidiplakin määrä korreloi neurodegeneraation ja taudin vakavuuden kanssa odotetusti 19. Beeta-amyloidiplakki kiistatta liittyy Alzheimerin tautiin, mutta yhteyden laatu ei ole selvillä. Yhden arvion mukaan amyloidiplakki on patologisen prosessin käynnistämisen takana, mutta kerran sen käynnistettyään ei taudin eteneminen ole enää riippuvainen plakin läsnäolosta 19. Tässä tapauksessa taudin parantamiseksi ei riitä beeta-amyloidiplakin puhdistaminen. Jotta toimiva lääkehoito saataisiin kehitettyä, pitäisi tautiprosessi tuntea tarkasti. 5

2.3. Taudin mallintaminen: 2.3.1. Perinteiset hiirimallit Hiiret ovat yleisimmin käytettyjä koe-eläimiä. Hiirien etu on niiden helppo saatavuus lyhyen lisääntymissyklin ansiosta, verrattain huokea ylläpito ja lisäksi niiden geenimanipulointi on helppoa. Hiirten elimistön toiminta on myös verrannollinen ihmisen elimistön toimintaan, koska molemmat ovat nisäkkäitä. Alzheimerin tautia voidaan tutkia hiiren avulla toteutetulla tautimallilla. Hiirelle voidaan saada geenimuuntelulla aikaiseksi keinotekoisesti Alzheimerin tauti ja näin taudin etenemistä voidaan tutkia. Yksi Alzheimerin taudin tutkimukseen käytetty tautimalli on Tg2576 -hiiret. Hiiret yliekspressoivat ruotsalaista mutaatiota amyloidiprekursoriproteiinista, joka johtaa ihmisellä nuoruustyypin Alzheimerin tautiin. Nämä hiiret kerryttävät amyloidiplakkia hermosoluihinsa kuten ihmisetkin. Hiiri sairastuu näin Alzheimerin tautiin. Oppimisen ja muistin heikkeneminen, kuten myös amyloidiplakin ilmaantuminen, on nähtävissä 9-10kk ikään mennessä 20. Tg2576 hiirissä on kuitenkin puutteensa. Toisin kuin aidossa Alzheimerin taudissa, ei hiirillä esiinny taudissa keskeistä neurodegeneraatiota 21. Puutteet johtuvat luultavasti siitä, että hiirillä ei luonnostaan esiinny amyloidiplakkia ja Alzheimerin tautia erilaisen beeta-amyloidin rakenteen vuoksi 22. Hiirimalleja on erilaisia ja toiset transgeeniset hiiret kehittävät tyypillisen taupatologian. Vaikka jyrsijöillä saadut tulokset ovat usein vertailukelpoisia ihmisten kanssa, ei keskushermosto ole identtinen: hiirten aivot ovat yksinkertaisempia. Esimerkiksi ihmisen isoaivokuori on suhteessa suurempi ja aivot ovat poimuisemmat. Myös Alzheimerin tautiin liitettyjen astrosyyttien osalta on merkittäviä eroja. Kun astrosyyttien tärkeä rooli aivojen toiminnalle on alkanut valjeta, on vertailevaa anatomian tutkimusta jyrsijöiden ja ihmisten aivojen astrosyyttien osalta tehty. Ihmisten astrosyytit ovat 2.6-kertaa suurempia ja niiden haarat sisältävät yli kymmenkertaisesti enemmän GFAP:ta (glial fibrillary acidic protein, gliasolujen säikeinen hapan proteiini) kuin jyrsijöiden astrosyytit 23.Yksi astrosyyttidomeeni voi hiirellä ympäröidä 20 000 120 000 synapsia, mutta ihmisen astrosyyteilla vastaava luku on 270 000-2 000 000 johtuen suuremmista astrosyyteista ja synapsien tiheämmästä esiintymisestä. Ihmisellä on useampia alatyyppejä astrosyytteja, joista osaa ei löydy lainkaan jyrsijöillä 23. Myös astrosyyttien toiminnassa ja sen tehokkuudessa on eroja. Ihmisen astrosyytit 6

voivat esimerkiksi monistaa kalsiumaaltoja 4-10-kertaisella nopeudella jyrsijän astrosyytteihin verrattuna. Kalsiumaallot ovat osa astrosyyttien pitkän matkan solusignalointia ja tehokkaamman toiminnan vuoksi ihmisen astrosyyteillä kalsiumsignalointi on myös nopeampaa ja etenee pidemmälle 23. Lääkkeitä testataan monessa portaassa ja ennen ihmisille suoritettavia kliinisiä kokeita on lääkkeen oltava toimivaksi ja turvalliseksi todettu eläin- ja soluviljelmämalleilla. Silti kliinisiin kokeisiin välillä etenee lääkkeitä, jotka aiheuttavat vakavia haittoja ihmisille. Näin kävi esimerkiksi Alzheimerin tautiin suunnitellun semagacestatin tapauksessa. Ihmisen ja hiiren keskushermostot erosivat liikaa, joten vakavia haittoja ei havaittu ajoissa. Perinteiset hiirillä tehtävät kokeet ovat ja tulevat olemaan tärkeä osa tutkimusta, mutta olisi löydettävä turvallisia ja eettisiä tapoja päästä lähemmäs Alzheimerin taudista kärsivän ihmispotilaan keskushermostoa lääkekokeita varten. 2.3.2. ips-solut Soluviljelmämallilla on mahdollista tutkia ihmisen solujen muutoksia Alzheimerin taudissa ja sitä voidaan käyttää myös lääketestaukseen. Perinteisten eläinkokeiden heikkous onkin, että jyrsijöiden ja ihmisten solut eroavat toisistaan jossain määrin, mikä voi vaikuttaa sairauden etenemiseen ja lääkkeiden vaikutusmekanismeihin. Alzheimerin tautia tutkittaessa voidaan soluviljelmällä käyttää esimerkiksi tautiin liittyviä ihmisen astrosyytteja. Astrosyytteja ei voida kerätä elävältä ihmiseltä suoraan. Astrosyytteja hankitaan soluviljelykäyttöön esimerkiksi erilaistamalla niitä pluripotenteista kantasoluista. Pluripotentteja kantasoluja saadaan kahdella tapaa. Voidaan käyttää alkiosta saatavia kantasoluja, sillä blastokystivaiheen alkion sisäsolumassa on pluripotentteja kantasoluja. Toinen tapa on käyttää ips-soluja (induced pluripotent stem cells), joita saadaan uudelleenohjelmoimalla jo kerran erilaistuneita somaattisia soluja geeninsiirtotekniikalla takaisin pluripotenttiin vaiheeseen. IPS-solujen käyttö on voimakkaasti yleistynyt tekniikan kehittämisen jälkeen alkioperäisten solujen käyttöön liittyvien eettisten ongelmien vuoksi. IPS-solujen etu alkioperäisiin soluihin on, että solut voidaan kerätä Alzheimerin taudista kärsivältä potilaalta, toisin kuin alkioperäisten solujen kohdalla. 7

Soluviljelmämallin luominen yksinkertaistetusti koostuu kolmesta vaiheesta: Somaattisten solujen keräys Solujen uudelleenohjelmointi pluripotenteiksi Solujen erilaistaminen astrosyyteiksi Pluripotenteiksi palautettaviksi soluiksi käy kaikki ihmisen solut, mutta yleisimmin käytetään ihon fibroblasteja niiden keräämisen helppouden vuoksi. Ihobiopsiassa saadut fibroblastit uudelleenohjelmoidaan monikykyisyyttä säätelevillä transkriptiotekijöillä 24. Tuloksena on pluripotentteja ihmisen soluja, jotka lähes täysin vastaavat ihmisen alkion pluripotentteja soluja 24. IPS-soluista voidaan erilaistaa mitä tahansa ihmisen kolmen alkiolevyn soluja. Alkiolevy tarkoittaa ihmisen alkukehityksen gastrulaatiossa muodostunutta kolmea kerrosta, endodermiä, mesodermiä ja ektodermiä. Nämä eri solukehityslinjoille erilaistuneet solut erilaistuvat edelleen jokaiseksi ihmisen solutyypiksi. Pluripotentti solu ei kuitenkaan ole enää riippuvainen alkiolevyrajoista, vaan siitä voidaan erilaistaa mikä tahansa solu, tässä tapauksessa ektodermiperäisiin soluihin kuuluva astrosyytti 25. Soluviljelmämallin etu on ihmissolujen käyttö, jolloin ei tarvitse ottaa huomioon ihmisten ja jyrsijöiden solujen rakenne-eroja ja tutkimustulokset vastaavat paremmin todellista tilannetta. Fibroblastit voidaan kerätä joko terveeltä tai Alzheimerin taudista kärsivältä. Jokaisessa ihmisen solussa, sukusoluja lukuun ottamatta, on sama perimä. Näin ollen sairauteen johtava perimä löytyy yhtä lailla fibroblasteistakin ja ne toimivat hyvin tautimallina 24. Kun tautiin sairastuneen fibroblastit palautetaan ips-soluiksi ja erilaistetaan kohdesoluiksi, etenee tautiprosessi soluissa todenmukaisemmin kuin keinotekoisesti hiirelle aiheutettuna. Taudin kantajalta tehdyistä ips-soluista erilaistetut hermosolut kerryttävät beeta-amyloidiplakkia sairastuneen keskushermoston hermosolun tavoin, oli taudin tyyppi sitten perinnöllinen tai sporadinen eli vanhuustyypin. Solumaljalla on myös saatu aikaan onnistuneita lääkekokeita 26,27. IPS-soluja käytettäessä voidaan tutkia eläviltä henkilöiltä kerättyjä sairastuneita soluja suoraan ensimmäistä kertaa, sillä sairastuneen potilaan keskushermostoon ei voida hänen eläessään kajota. IPS-soluista luoduilla tautimalleilla on kuitenkin heikkoutensa. Solut eivät itsenäisinä ilman muun elimistön hormoneja, kudoshormoneja ja solukontakteja välttämättä kehity samanlaisiksi kuin ne kehittyisivät in situ tilanteessa 28. On epävarmaa, kypsyvätkö esimerkiksi hermosolut 8

loppuun asti ips-soluista lainkaan. Lisäksi Alzheimerin tauti on kokonaisvaltainen sairaus, joka vaikuttaa koko keskushermostoon. Soluviljelmämalli ei mitenkään voi täysin kopioida sitä 24. Erityisesti lääketestauksen kohdalla törmätään ongelmiin soluviljelmätautimallissa. Huomioon otetaan vain yksi solutyyppi, kun ihmiskehossa kaikki vaikuttaa kaikkeen. Esimerkiksi vain astrosyytteihin kohdistuvaa lääkitystä on kenties mahdoton suunnitella, koska astrosyyteilla ja hermosoluilla on reseptoreja samoille ligandeille. Hermosoluilla taas on reseptoreja, joita astrosyyteissa ei esiinny ja päinvastoin. Lääkeaineita ei voida testata vain puhtaalla astrosyytteja sisältävällä soluviljelmämallilla, koska astrosyytteihin kohdentuvat molekyylit vaikuttavat myös ympäröiviin hermosoluihin ja vaikutukset voivat olla arvaamattomia 28. Tämä toki useassa tutkimusmallissa on etu ja tutkimustulokset saadaan täsmällisesti solutyypeittäin ilman sekoittavia häiriötekijöitä. IPS-solut ovat varmasti tulevaisuudessa yhä enenevässä määrin tärkeitä työkaluja tutkimukselle. 2.4. Humanisoidut hiiret tautimallina Humanisoitu hiiri tarkoittaa hiirtä, jonka keskushermostossa on yhtä tai useampaa ihmisperäistä solutyyppiä sen omien hiiriperäisten solujen ohella tai niiden sijaan. Humanisoituja hiiriä voidaan käyttää taudin perustutkimukseen tai esimerkiksi lääketestaukseen. Tätä tautimallia käytettäessä minimoidaan sekä perinteisten koe-eläintautimallien ja soluviljelmätautimallien ongelmat ja ollaan lähempänä sairastuneiden ihmisaivojen tilannetta kuin koskaan ennen 29,30. Alzheimerin taudin muutoksia ollaan tutkittu kuolleiden potilaiden aivonäytteitä analysoimalla. Silmämääräisesti voidaan nähdä aivojen rappeutuneen aivokuorelta ja aivojen syvistä osista, esimerkiksi muistissa keskeisestä hippokampuksesta 31,32. Solutasolle mentäessä voidaan tutkia tauvyyhtejä ja amyloidiplakkeja. Ihmisaivojen ollessa kyseessä, väistämättä kuoleman ja aivojen analysoitavaksi saamisen välissä on viive, jonka aikana kudos ehtii jonkin verran hajota. Tämä voi vaikuttaa tuloksiin, riippuen kuinka pitkä viive on. Humanisoitujen hiirien kanssa humaanisolut saadaan tarvittaessa heti analyysiin. 9

Kaavakuva, kuinka humanisoituja hiiriä luodaan immunopuutteellisesta rag1-hiirestä: Hiireen voidaan siirtää joko ihmisen geenejä tai sitten hiiri voidaan humanisoida korvaamalla hiiren solutyyppi ihmisen vastaavalla. Geenimanipulaatio nojaa AA-virusten kykyyn läpäistä alle vuorokauden ikäisen hiiren poikasen aivokammiota reunustava neuroepiteliaalinen solukko ja levitä keskushermostoon. AA-virus kuljettaa humaanigeenin ja siirtää sen hiiren omiin soluihin. Geeni alkaa ilmentyä parissa päivässä ja solut jakaantuvat leviten kauttaaltaan hiiren aivoihin. Geeni ekspressoituu ja säilyy koko hiiren loppuelämän 33. Toinen tekniikka on siirtää ihmisen esiastesoluja, jotka keskushermostossa erilaistuvat ja kypsyvät. Transplantoidut esiastesolut alkavat hiiren keskushermostossa kypsyä riippuen aivoalueen erilaistumistekijöistä joko astrosyyteiksi tai myeliiniä hermosolujen ympärille tuottaviksi oligodendrosyyteiksi 29. Huomionarvoista on, että keskushermoston humanisointi ei jää vain transplantoitujen alkuperäisten solujen varaan, vaan solut jakaantuvat ja lisääntyvät keskushermostossa. Noin vuoden ikään mennessä hiirten keskushermostossa transplantoidut solut eivät kasva yhdessä 10

hiiren omien gliasolujen kanssa, vaan humaanisolut ovat syrjäyttäneet hiiren omat solut kokonaan 29. Ihmisen valkoisen aineen esiastesolut ovat vielä potentteja erilaistumaan sekä astrosyyteiksi, oligodendrosyyteiksi tai jopa hermosoluiksi. Toisaalta tämä on hyvä asia, toisaalta ei. On hyvä, että keskushermostoon saadaan useaa humaanisolutyyppiä, sillä keskushermosto tällöin vastaa enemmän ihmisen vastaavaa. Toisaalta tutkimuksen kontrollointi voi olla haastavaa, kun ennen värjäyksiä ei tarkalleen ottaen voida olla varmoja mitä humaanisolutyyppejä hiiren aivot sisältävät 34. Transplantoitujen esiastesolujen on todettu kypsyvän asianmukaisesti ja toimivan keskushermostossa kuten kuuluukin. Synnynnäisesti hermosolujen myeliinipuutoksesta kärsivät hiiret parantuvat, jos niille transplantoidaan ihmisen keskushermoston gliasolujen esiastesoluja. Transplantoidut solut erilaistuvat toimiviksi oligodendrosyyteiksi ja myeliinittömänä korkeintaan 21 viikon ikään selviävät hiiret voivat elää aina hiirten tyypilliseen kahden vuoden ikään asti 35. Lisäksi transplantoidut solut säilyttävät humaanisoluille tyypilliset piirteensä. Esiastesoluista kehittyneet astrosyytit ovat monimutkaisempia ja isompia kuin hiirten vastaavat ja humanisoidut hiiret ovat villityypin lajitovereitaan nopeampia oppimaan 36. Syventävien opintojen opinnäytetyössä käsiteltävä tutkimus on suoritettu Kuopiossa A.I. Virtasen instituutissa, Tarja Malmin tutkimusryhmässä. Tavoitteena on transplantoida hiirelle astrosyyttien esiastesoluja, jotta saataisiin tautimalli astrosyyttien osuudesta Alzheimerin taudissa. 11

3. TAVOITTEET JA HYPOTEESIT Tutkimuksessa tähdätään onnistuneesti humanisoituun hiireen. Hypoteesina on, että vastasyntyneelle hiirelle transplantoidut astrosyyttien esiastesolut kypsyvät keskushermostossa toimiviksi astrosyyteiksi, ne jakaantuvat normaalin astrosyytin tavoin leviten hiiren aivoihin ja syrjäyttävät hiiren omat astrosyytit. 4. AINEISTO JA MENETELMÄT 4.1. Humanisoitujen hiirien luominen 4.1.1. Fibroblastien muuttaminen ips-soluiksi Solujen palauttamisen fibroblasteista ips-soluiksi ja ips-solujen erilaistamisen astrosyyttien esiastesoluiksi suoritti Minna Oksanen Jari Koistinahon tutkimusryhmästä (Eettinen lupa Dnr 123/2016 Pohjois-Savon sairaanhoitopiirin eettiseltä toimikunnalta) Toimivia transkriptiotekijäyhdistelmiä on useita, mutta tätä koetta varten käytettiin Thermofisherin CytoTune ips 1.0 kittiä, jossa vektorina käytettyyn Sendai-virukseen on liitetty transkriptiotekijät OCT4, SOX2, KLF4 ja C-MYC. Virusvektori kuljettaa tekijät fibroblasteihin ja kuukauden kuluttua soluviljelmään on kehittynyt ips-solujen kolonisaatioita, jotka voidaan värjäyksin tai morfologian perusteella tunnistaa ja poimia erilleen. Tuloksena saadut pluripotentit ihmisen kantasolut lähes täysin vastaavat ihmisen alkion pluripotentteja kantasoluja. Niiden kromosomisto säilyy normaalina, niillä on tyypillinen telomeraasiaktiivisuus ja ne ilmentävät ihmisen pluripotentille kantasolulle tyypillisiä geenejä ja solukalvon proteiineja. Fibroblastit voidaan kerätä joko terveeltä tai Alzheimerin tautia sairastavalta. Jokaisessa ihmisen solussa, sukusoluja lukuun ottamatta, on sama perimä. Näin ollen sairauteen johtava perimä löytyy yhtä lailla fibroblasteistakin ja ne toimivat hyvin tautimallina 24. 12

4.1.2. ips-solujen erilaistaminen astrosyyteiksi Astrosyytit saadaan erilaistettua ips-soluista Krencikin menetelmällä 37. Yksinkertaistettuna ips-solut ohjataan ensin kehittymään ektodermaaliseen suuntaan käyttämällä mesodermi- ja endodermi-inhibiittoreita. Kantasolut erilaistuvat multipotenteiksi neuroepiteelisoluiksi. Oikeat solut voidaan erottaa ei-neuronaalisista solurykelmistä soluviljelmässä lieriöepiteelisolujen ilmaantumisesta, jotka muodostavat hermostoputkimaisen ruusukkeen. Ruusukemaiset solurykelmät poimitaan maljalta erikseen jatkoerilaistukseen. Tästä eteenpäin solujen erilaistumista astrosyyttien esiastesoluiksi ylläpidetään kasvattamalla niitä solunjakautumista stimuloivien kasvutekijöiden (EGF & FGF2) kanssa ja leikkaamalla solurykelmiä pienemmäksi viikottain. Ensimmäisinä kuukausina solut kehittyvät hermosolujen suuntaan, ennen kuin gliasolujen kehitys alkaa. Värjäyksissä on havaittu, että kuukauden erilaistamisen jälkeen vain muutama solu on astrogliasolulle tyypillisesti GFAP-positiivinen, mutta huomattavasti useampi on hermosoluille tyypillisesti beta III-tubulin, eli Tuj1, positiivisia. Kuukauden jälkeen GFAPpositiivisten solujen määrä alkaa nousta ja myöhemmin Tuj1 -positiivisten solujen määrä alkaa laskea. Puolen vuoden aikapisteellä viljelmässä ei ole enää hermosoluja, vaan pelkästään astrosyyttien esiastesoluja ja solut ovat valmiita siirrettäväksi. Saadut solut ovat astrosyyttien esiastesoluja ja ne kypsyvät hiiren aivoissa valmiiksi 38. 4.1.3. Transplantaatio Transplantaatiot suoritti Henna Konttinen Tarja Malmin ryhmästä ja itse olin seuraamassa osaa transplantaatioista. Käytetyt hiiret (koe-eläinlupa ESAVI-2015-000744) ovat Rag1- poistogeenisiä. Rag1-geenin poistaminen johtaa hiirillä T- ja B-lymfosyyttien puutteeseen, minkä vuoksi immuunipuolustus ei toimi kunnolla. Immuunipuutteellisia hiiriä käytetään, jotta puolustusmekanismit eivät hylkisi transplantoituja astrosyytteja 39. Hiirten tulisi olla mahdollisimman vasta syntyneitä, jotta astrosyytit saadaan onnistuneesti korvaamaan hiiren omat astrosyytit. Itse transplantaatio oli verrattain helppo toimenpide, joka ei vaadi paljoa välineitä. Operaation ajaksi hiirelle käytettiin anestesiamenetelmänä hypotermiaa, koska oikea rauhoittavan lääkkeen annostelu näin pienelle ruumiinpainolle on erittäin vaikeaa. Hypotermiaanestesia toteutetaan pyörittämällä hiiren poikanen folioon ja upottamalla kauttaaltaan jäihin kolmeksi minuutiksi. Vähempi aika ei riitä riittävän syvään anestesiaan ja pidempi aika voi olla riski hiirelle. Anestesian riittävyys testataan kokeilemalla hiiren ärtyvyyttä. Hiiri kiinnitetään 13

injektoitavaksi molemmin puolin korvien kohdalle asetettavilla päätuilla. Hiiren pään suoruus voidaan tarkistaa sutura sagittaliksen, eli pitkittäisen kallon luusauman, suoruudesta. Alusta kylmennetään, jotta hiiri ei heräisi kesken toimenpiteen. Hiirellä ei ole vielä karvoja ja sen iho on hyvin läpikuultava, joten aivokammiot voidaan paikantaa suunnistamalla kallon maamerkkejä hyväksikäyttäen. Hiiren bregma ja lambda ovat hyvin nähtävissä. Bregma on pääkallon frontaali- ja parietaalilohkojen risteyskohta, lambda taas parietaali- ja occipitaalilohkojen. Yhteensä pistoksia on viisi. Neljä injektiota pistettiin lateraalisiin ventrikkeleihin, eli sivuaivokammioihin. Käytetty liuos sisälsi 100 000 astrosyytin esiastesolua PBS:ssä per mikrolitra. Liuosta injektoidaan 0.5µl per pistos. Viimeinen pistos tehtiin vapaalla kädellä aivorunkoon ja sinne liuosta lisätään 1.0µl. Yhteensä hiiri siis saa viisi pistosta, 3µl liuosta ja näin 300 000 astrosyyttien esiastesolua. Tutkimuksen edetessä havaittiin, että kaiken kaikkiaan hypotermian kesto on pyrittävä pitämään alle kymmenessä minuutissa, sillä pidempi aika hidastaa hiiren toipumista. Lopuksi hiiri merkitään poistamalla siltä sormi. Negatiivikontrollihiirille injektoitiin pelkkää 0.1M PBS:ää, eli suolaliuosta fosfaattipuskurissa. Tutkimuksessa käytetty fosfaattipuskuri valmistettiin itse käyttäen 1M NaH2PO4 x 2 H20 - jauhetta ja 1M Na2HPO4 x 2 H20. Fosfaattipuskuriin lisätty suola oli NaCl. Kuitenkaan negatiivikontrollihiiriä ei päätynyt ensimmäisiin seitsemään analysoitavaan hiireen, joita syventävien opintojen opinnäytetyönä käsitellään. Toimenpiteen jälkeen hiiri herätetään hypotermiasta. Hiiri laitetaan lämpökaappiin käärittynä sen omiin pesämateriaaleihin, jotta poikanen tuoksuisi tutulta ja emo hyväksyisi sen takaisin paremmin. Emon hyväksymistä voidaan edesauttaa myös poistamalla pesästä vain osa poikasista toimenpidettä varten, ei kerralla kaikkia. Kun poikasen väri on palannut normaaliksi ja se liikkuu vilkkaasti, voidaan poikanen palauttaa emolleen. Emon ja poikasten vointia on syytä seurata varovaisesti lähipäivinä ja häiriötekijät on minimoitava, sillä stressi voi saada emon jopa syömään poikasensa 33. 14

4.2. Hiiren kasvu, lopetus ja aivoleikkeiden valmistaminen Onnistuneen transplantaatiotoimenpiteen kuolleisuusaste hiirille on olematon ja suurempi merkitys selviytymisasteeseen onkin emolla. Siksi hiirtä poikasineen on valvottava, mutta kuitenkin on varottava stressaamasta emoa. On syytä katsoa, hyväksyykö emo poikaset toimenpiteen jälkeen odotetusti ja imettääkö se niitä 33. Eristystä tai muita varotoimenpiteitä ei kuitenkaan tarvita, koska metodissa ei käytetä viruksia. Hiiren kasvun myötä astrosyytit leviävät aivokammioista hiiren parenkyymiin, jakaantuvat ja leviävät. Toimenpide ei vaikuta hiiren kasvuun ja kehitykseen negatiivisesti. Vieroituksen jälkeen hiiren annettiin kasvaa pilottikoetta varten aina kahden kuukauden ikäiseksi asti, jolloin aloitettiin aivojen analyysi. Opinnäytetyö on osa isompaa tutkimusprojektia, jossa on luotu 55 humanisoitua hiirtä, joista 5 ovat negatiivikontrolleja. Opinnäytetyön materiaalina on seitsemän ensimmäistä hiirtä, jotka otettiin analysoitavaksi pilottikokeeseen. Humaanisolujen keräys, niiden palautus kantasoluiksi, erilaistaminen astrosyyteiksi ja hiirten solutransplantaatiot on tehty ennen opinnäytetyötä tutkimusryhmän jäsenten toimesta. Oma osuuteni on aivoleikkeiden valmistaminen, immunohistokemialliset värjäykset ja tulosten pohdinta. Lopetus. Hiiret merkittiin transplantaatiovaiheessa sormia irrottamalla ja aikuisvaiheessa oikea hiiri on löydettävissä tämän tuntomerkin avulla. Näin voidaan seurata mahdollisten transplantaatiovaiheen ongelmien vaikutusta lopputulokseen. Hiirten anestesiaan käytetään 0.1M PBS:ään laimennettua tribromoetanolia (Avertin, Aldrich Chemicals, T48402), jota voidaan käyttää sekä nukutukseen että yliannostettuna lopetukseen. Aine pistetään intraperitoneaaliseen tilaan. Hiirelle yliannostukseen käytetty annos on 250mg/kg ja tämä johtaa muutamassa minuutissa hiirellä hengityslamaan ja kuolemaan. Perfuusio. Perfuusion tarkoitus on poistaa hiiren elimistöstä veri, jotta se ei sotkisi näytteiksi poimittavia aivoja. Kun hiiri on tajuton, eikä käpälän voimakas puristus aikaansaa sätkivää refleksiä, krusifioidaan hiiri styroksialustaan. Hiiren rintakehä avataan kylkiluiden läpi kainaloita kohti, avaamalla pallea ja siirtämällä iho, kylkiluut ja lihakset syrjään näkyvyyden tieltä. Kalvot poistetaan sydämen päältä. Perfuusioneula asetetaan sydämen vasempaan kammioon, josta neste leviää suuren verenkierron mukana kaikkialle hiireen puhdistaen elimistön verestä. Perfuusioliuoksena käytetään 0.9% NaCl-liuosta (Baxter, KKF7123) jossa 15

hepariinia 2,5IU (LEO Pharma, 015226-06). Hepariini estää verta hyytymästä. Veri ja perfuusioliuos poistuvat hiiren elimistöstä oikeaan eteiseen tehdyn reiän kautta. Perfuusio on onnistunut, jos maksa vaalenee ja hiiren nenästä ei valu nestettä. Perfuusioon kuluu 80ml liuosta per hiiri 20ml/min nopeudella ja perfuusio vie aikaa neljä minuuttia. Tämän jälkeen irrotetaan hiiren aivot varovaisesti kallosta. Aivojen käsittely. Aivot säilötään siirtämällä ne 4 % PFA-liuokseen (Sigma-Aldrich, P6148). Aivot pidetään paraformaldehydissä 22 tuntia 4 C. Paraformaldehydi fiksaa aivot ja säilöö ne, joten ne eivät ala pilaantua. Tämän jälkeen aivot siirretään 48 tunniksi 4 C sukroosiliuokseen joka suojaa solut pakastamiselta. Sukroosin (VWR Chemicals, 27480.294) pitoisuus liuoksessa on 300g yhdessä litrassa fosfaattipuskuria. Sokeri estää solun rakenteen rikkovia jääkiteitä muodostumasta. Kun aivot lisätään liuokseen, kelluvat ne pinnalla, mutta 48 tunnin kuluttua aivot painuvat liuospullon pohjaan niiden tiheyden noustua samaksi ympäröivän liuoksen kanssa. Käytettyjen liuospullojen vetoisuus on 50ml. Aivojen pakastaminen. Aivot kuivataan sukroosista ja jäädytetään nopeasti siirtämällä ne korkin päällä kellumaan nestemäiseen typpeen 43 sekunniksi ja kääritään korkissa folioon. Aivojen sulaminen tulee estää säilyttämällä niitä siirtojen ajan kuivajään päällä, ennen kuin aivot saadaan säilytykseen pakastimeen -70 C lämpötilaan. Aivojen leikkaaminen kryostaatilla. Kryostaatti on leikkuri, jolla tehdään leikkeet jäätyneistä kudosnäytteistä. Kryostaatti pitää näytteet ja leikkeet -20 C lämpötilassa. Istukka on metallinen tuki, joka kiinnitetään kryostaatin liikkuvaan osaan. Liikkuva osa painaa aivot stabiilia terää vasten tehden leikkeet. Leikkeet siirretään pensselillä kuoppalevyille. Istukkaan muotoillaan O.C.T. compound:illa (Sakura Finetek, 4583) kertakäyttöinen alusta, johon aivot kiinnitetään. Aine jäätyy nopeasti -20 C asteessa ja jäätymisen jälkeen aivot kiinnitetään alustaan embedding matrix:illa (Thermo electron corporation, 1310) pystyasennossa. Aivojen hemisfäärejä voidaan hyödyntää, jotta näyte saadaan asemoitua kohtisuoraan terän kanssa ja leikkeet ovat mahdollisimman suoria. Aivoista tehdään 20 mikrometrin leikkeitä, jotka siirretään 24-kuoppalevylle, jossa on jäätymisen estävää antifreeze liuosta. Liuoksessa on 150g sukroosia, joka estää solujen nesteitä kiteytymästä ja jäätymisen estävää 300ml etyleeniglykolia (VWR Chemicals, 24041.297) liuotettuna 500ml 0.05M PB. 16

Pilottikokeessa aivoleikkeitä kerättiin 3 levyä, 20 kuoppaa per levy. Kuopat täytettiin järjestyksessä kierros kierroksella, joten kuoppia ollessa 20 ja leikkeiden paksuuden 20 mikrometriä, olivat leikkeet jokaisessa kuopassa tasaisesti 400 mikrometrin välein. Ensimmäisellä levyllä 6 leikettä per kuoppa, toisella levyllä 3 leikettä per kuoppa, kolmannella levyllä 4 leikettä per kuoppa. Loppujen lopuksi hiirellä numero 5, levyllä 1 oli eniten humaanisoluja analysoitavaksi ja värjäykset suoritettiin tältä levyltä. Aivojen siirtäminen lasille värjäyksiä varten. Halutut leikkeet pitää huuhdella anti-freeze liuoksesta 0.1M PB:llä ennen kuin niitä voidaan käyttää immunohistokemiallisiin värjäyksiin. Huuhtelu tapahtuu reikäkuoppalevyllä 3x30min huoneen lämpötilassa, yön yli 4 C, minkä jälkeen uudelleen 3x30min huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen leikkeet voidaan nostaa varovasti superfrost-laseille (Thermo scientific, J1800AMNZ) 0.1M PB:ssä käyttäen avuksi pientä pensseliä. Superfrost-lasit sopivat jääleikkeille ja näytteet pysyvät sähköisen varauksen ansiosta lasilla kiinni ilman erillistä liimaa. Leikkeet laseilla ovat valmiita värjäyksiä varten kuivuttuaan noin tunnin ajan. Lopuksi leikkeet lasilla ympyröidään ImmEdge kynällä (Vector, H-4000), jonka avulla värjäysaineet saadaan pidettyä lasilla, eivätkä ne valu pois. Lasille muodostuu ikään kuin todella matala malja. 4.3. Värjäykset Oma osuuteni tutkimuksessa oli siirtää tehdyt leikkeet lasille ja suorittaa värjäyksiä osin yksin ja Jari Koistinahon tutkimusryhmän jäsenen Mirka Tikkasen ohjauksessa. Värjäyksiä suoritettiin neljä erilaista, A. GFAP-HuNu -kaksoisvärjäys, B. Ihmisspesifi GFAP, C. TUJ1- HuNu -kaksoisvärjäys, D. Doublecortin-HuNu -kaksoisvärjäys. Värjäyksen onnistumisen varmistamiseksi käytettiin negatiivikontrolleja. Negatiivikontrolleista voidaan tarkistaa, onko kiinnittyminen ollut epäspesifiä. Jos sekundaarivasta-aine on kiinnittynyt, vaikka primaarivasta-ainetta ei ole laitettu, on värjäys epäonnistunut ja tulos virheellinen eikä kelpaa. Kaksoisvärjäyksiin (A, C, D) käytettiin neljä 17

lasia per värjäys, ja värjäykseen B kului kaksi lasia. Alla taulukoitu värjäykset, lasit ja käytetyt primaarivasta-aineet. Kaikille saman värjäyksen laseille käytettiin samat sekundaarivasta-aineet, jotka ovat lueteltuna myöhemmin jokaisen värjäyksen protokollan alla. Taulukossa viiva tarkoittaa poisjätettyä primaarivasta-ainetta. 4.3.1. GFAP ja HuNu kaksoisvärjäys, värjäys A Ensimmäisen värjäyksen tavoite oli nähdä, onko hiiren aivoissa ihmisperäisiä astrosyytteja. Tätä varten käytettiin GFAP-primaarivasta-ainetta. GFAP on astrosyyttien prosesseissa esiintyvä proteiini, jonka avulla astrosyytit saadaan värjättyä 13. Käytetty vasta-aine reagoi niin ihmisen kuin hiirenkin GFAP:han. Tämän vuoksi toisena vasta-aineena käytettiin humaaninukleotidispesifiä HuNu:a, joka siis reagoi vain ihmisen solujen tumaan. Näiden päällekkäisyyttä tutkimalla saadaan selville, ovatko solut peräisin ihmiseltä vai hiireltä. Aluksi lasit kostutetaan 5 min 1 x PBS (0.01M) ja permeabilisoidaan 30min huoneenlämmössä 0.4% Triton x-100 (Fisher BioReagents, 153677) liuotettuna 1 x PBS. Triton huuhdellaan 3 x 5 min PBST:llä. PBST tehdään lisäämällä 0.5ml Tween20 (Sigma, 93773) yhteen litraan 0.01M PBS. Seuraavaksi suoritettiin 0.5% mouse-on-mouse blokkaus. Tämä kestää yhden tunnin ja liuoksessa on 1.25ml PBST:ssä yksi tippa blokkiliuosta (Vector, MKB-2213). Blokkiliuos huuhdellaan 3 x 5 min PBST:ssä. Tämän jälkeen blokkaus 1 tunti 10% NGS, eli vuohen seerumissa (Millipore, s-26) PBST:ssä. Seuraavaksi lisätään primaarivasta-aineet: mouse monoclonal anti-hunu 1:250 (anti-nuclei, clone 3E1.3, Millipore, MAB 4383) ja rabbit polyclonal GFAP 1:500 (Dako Z0334) Laseja inkuboidaan yön yli normaalissa huoneenlämmössä 5 % NGS PBST:ssä. Aamulla jatketaan huuhtelulla 3 x 5 min PBST. Seuraavaksi lisätään sekundaarivasta-aineet: Goat-anti-mouse 568 1:200 (Alexa Fluor, A11004) ja Goat-anti-rabbit 488 1:200 (Alexa Fluor, A11008) Laseja inkuboidaan 2 tuntia normaalissa huoneenlämmössä 5 % NGS PBST:ssä. Lopuksi lasit huuhdellaan vielä kerran 3 x 5min PBST:ssä, ilmakuivataan 15min ja päällystetään mounting mediumilla (Vector, H-1200), jossa on DAPI mukana. DAPI on spesifi kaikkien solujen tumille 18

4.3.2. Ihmisspesifi GFAP värjäys, värjäys B GFAP-HuNu värjäyksen ohella kokeiltiin myös ihmisspesifiä GFAP-vasta-ainetta. Vastaaineen ei kuuluisi reagoida ollenkaan muuhun kuin ihmisperäisten astrosyyttien GFAPproteiiniin. Koska kyseessä ei ollut kaksoisvärjäys, vain yksi negatiivikontrolli oli tarpeen ja värjättäviä laseja ja leikkeitä oli näin ollen kaksi. Leikkeet lasilla kostutetaan 1 x PBS 5 min ja blokataan 0.5% mouse-on-mouse reagenssilla tunnin ajan (1 tippa per 1.25ml PBST). Blokkiliuos huuhdellaan 3 x 5 min PBST:llä. Seuraavaksi lisätään primaarivasta-aine, human-gfap 1:200 (Biolegend, 837201). Laseja inkuboidaan yön yli normaalissa huoneenlämmössä 5 % NGS PBST:ssä. Aamulla jatketaan huuhtelulla 3 x 5 min PBST. Seuraavaksi lisätään sekundaarivasta-aine: goat anti-mouse 568 1:200 (Alexa Fluor, Molecular Probes, A11004). Laseja inkuboidaan 2 tuntia normaalissa huoneenlämmössä 5 % NGS PBST:ssä. Lopuksi lasit huuhdellaan vielä kerran 3 x 5 min PBST:ssä, ilmakuivataan 15 min ja päällystetään mounting mediumilla, jossa on DAPI mukana. 4.3.3. TUJ1 ja HuNu kaksoisvärjäys, värjäys C Tuj1, eli lll beeta-tubuliini on hermosoluissa esiintyvä markkeri. Sille spesifiä vasta-ainetta käytettäessä voidaan selvittää ovatko kyseessä olevat solut hermosoluja. Kun tehdään kaksoisvärjäys HuNu:n kanssa, nähdään ovatko hermosolut hiiren omia vai ihmisperäisiä. Näin saadaan selvitettyä niiden solujen tyyppi, jotka transplantaatiossa hiirelle siirrettiin, mutta jotka eivät ole astrosyytteja. On hyvin mahdollista, että solut ovat erilaistuneet neuronaaliseen suuntaan. Aluksi lasit kostutetaan 5 min 1 x PBS (ph 7.4) ja permeabilisoidaan 30min huoneenlämmössä 0.4% Triton x-100 liuotettuna 1 x PBS. Triton huuhdellaan 3 x 5 min PBST. 0.5% mouse-onmouse blokkaus seuraavaksi, tämä kestää yhden tunnin ja liuoksessa on yksi tippa blokkiliuosta per 1.25ml PBST. Blokkiliuos huuhdellaan 3 x 5 min PBST:ssä. Tämän jälkeen blokkaus 1 tunti 10% NGS PBST:ssä. 19

Seuraavaksi lisätään primaarivasta-aineet: mouse monoclonal anti-hunu 1:250 (anti-nuclei, clone 3E1.3, Millipore, MAB 4383) ja rabbit polyclonal anti-beta-iii Tubulin 1:300 (Abcam ab24629). Laseja inkuboidaan yön yli normaalissa huoneenlämmössä 5 % NGS PBST:ssä. Aamulla jatketaan huuhtelulla 3 x 5 min PBST. Seuraavaksi lisätään sekundaarivasta-aineet: goat-antimouse 568 1:200 (Alexa Fluor, A11004) ja goat-anti-rabbit 488 1:200 (Alexa Fluor, A11008). Laseja inkuboidaan 2 tuntia normaalissa huoneenlämmössä 5 % NGS PBST:ssä. Lopuksi lasit huuhdellaan vielä kerran 3 x 5min PBST:ssä, ilmakuivataan 15min ja päällystetään mounting mediumilla, jossa on DAPI mukana. Valitettavasti TUJ1 värjäys epäonnistui. Kiinnittyminen oli epäspesifiä eikä analysoitavaa materiaalia saatu. 4.3.4. Doublecortin ja HuNu kaksoisvärjäys. värjäys D Tuj1-värjäyksen epäonnistuttua jäi yhä selvittämättä, ovatko humaanisolut, jotka eivät ole astrosyytteja, hermosoluja. Doublecortin on toinen hermosoluissa esiintyvä markkeri. Kuten Tuj1-värjäys, myös doublecortin-värjäys suoritettiin kaksoisvärjäyksenä, jotta nähdään nimenomaan mahdolliset humaaniperäiset hermosolut. Aluksi lasit kostutetaan 5 min 1 x PBS ja permeabilisoidaan 30min huoneenlämmössä 0.4% Triton x-100 liuotettuna 1 x PBS. Triton huuhdellaan 3 x 5 min PBST. 0.5% mouse-on-mouse blokkaus seuraavaksi, tämä kestää yhden tunnin ja liuoksessa on yksi tippa blokkiliuosta per 1.25ml PBST. Blokkiliuos huuhdellaan 3 x 5 min PBST:ssä. Tämän jälkeen blokkaus 1 tunti 10% NGS PBST:ssä. Seuraavaksi lisätään primaarivasta-aineet: rabbit polyclonal anti-doublecortin 1:200 (Cell Signaling, 0003) ja mouse monoclonal anti-hunu 1:250. Laseja inkuboidaan yön yli normaalissa huoneenlämmössä 5 % NGS PBST:ssä. Aamulla jatketaan huuhtelulla 3 x 5 min PBST. Seuraavaksi lisätään sekundaarivasta-aineet: goat-anti-rabbit 568 1:200 (Alexa Fluor, A11011) ja goat-anti-mouse 488 1:200 (Alexa Fluor, A11001). Laseja inkuboidaan 2 tuntia normaalissa huoneenlämmössä 5 % NGS PBST:ssä. Lopuksi lasit huuhdellaan vielä kerran 3 x 5min PBST:ssä, ilmakuivataan 15min ja päällystetään mounting mediumilla, jossa on DAPI mukana. 20

4.4. Tulokset Kuva 1. Vihreänä kuvassa B näkyy GFAP-vasta-ainevärjäys ja punaisena HuNu-vastaainevärjäys kuvassa D. Sinisenä taas on DAPI kuvassa C, jossa näkyvät kaikkien eri tyyppisten solujen tumat. Kuvassa a on yhdistettynä kuvat b ja d. Kuva 2. Kuva on otettu aivokammioiden välittömästä läheisyydestä. DAPI-vasta-ainevärjäys näyttää aivokammioiden muodon hyvin kuvassa C. Vihreänä näkyy GFAP-vasta-aine kuvassa B ja punaisena HuNu kuvassa D. 21

Kuva 3. Kuvassa A on DAPI-vasta-ainevärjäys ja kuvassa B ihmisen GFAP:lle spesifi vastaainevärjäys. Kuva 4. Vihreä sekundaarivasta-aine on HuNulle, punainen doublecortinille ja kuvassa C oleva sininen on DAPI-positiivisille soluille. Kuvat A ja B ovat samasta kohdasta. Toisesta kohdasta ovat kuvat C, D ja E. Kolmannesta kohdasta ovat kuvat F ja G ja niistä tehty fuusiokuva H. 22

5. JOHTOPÄÄTÖKSET 5.1. Transplantaation onnistuminen Hiirelle saatiin siirtymään ihmisperäisiä astrosyytteja. Hiirten aivoista löytyy soluja, jotka ovat positiivisia sekä GFAP:lle, että HuNu:lle (Kuva 1a). Käytettäessä vain ihmisen GFAP:lle spesifiä vasta-ainetta, saatiin positiivinen värjäystulos (Kuva 3b). Nämä ovat siis hiiren keskushermostoon onnistuneesti siirtyneitä eläviä ihmisperäisiä astrosyytteja. Hiiren aivoissa on myös soluja, jotka ovat reagoineet GFAP-vasta-aineelle, mutta eivät ole reagoineet HuNuvasta-aineelle (Kuva 1a). Nämä solut ovat hiiren omia astrosyytteja, eivät ihmisperäisiä. Ihmisen astrosyytit eivät siis ole ainakaan tässä vaiheessa vielä syrjäyttäneet hiiren astrosyytteja kokonaan, vaan hiiren aivoissa elää sekä ihmis- että hiiriperäisiä astrosyytteja mosaiikkina. Suurin osa soluista oli kuitenkin aivokammioiden välittömässä läheisyydessä, jonne astrosyyttien esiasteiden siirto suoritettiin. Kuva 2 on otettu aivokammion yläreunasta ja aivokammio näkyy kuvan alaosassa. Mitä kauemmas aivokammiosta kuljetaan, sitä vähemmän sekä GFAP:lle, että HuNulle positiivisia soluja on (kuva 2a). Syvällä aivokudoksessa ihmisperäisiä soluja ei ole. Hiirien iän myötä astrosyytit luultavasti jakaantuvat ja leviävät kautta keskushermoston. Eräässä tutkimuksessa hiiriä humanisoitiin ihmisen gliasolujen esiastesoluilla, ja 13kk aikapisteessä todettiin valtaosan hiiren gliasoluista olevan ihmisperäisiä ja toimivan tarkoituksenmukaisesti tehtävässään 35. Toisessa tutkimuksessa taas 4-5kk iässä humaanisolujen todettiin levinneen hiiren hippokampukseen ja neokorteksin syvempiin osiin ja vasta 12-20kk iässä korteksin syvempiin osiin ja esimerkiksi amygdalaan ja talamukseen 40. Pilottikokeessa käytetyt hiiret olivat kahden kuukauden ikäisiä, mutta tulevat hiiret otetaan analysoitavaksi vasta myöhemmässä vaiheessa. Osa ihmisperäisistä soluista ei myöskään ollut astrosyytteja. Hiiren aivoista löytyi myös soluja, jotka ovat HuNu-spesifisiä, mutta eivät GFAP-spesifisiä( Kuva 1a). Värjäysten avulla pyrittiin selvittämään, voisivatko ne olla hermosoluja. Asiaa selvitettiin Tuj1-värjäyksellä, joka kuitenkin epäonnistui. Vasta-aine oli kuitenkin sangen vanhaa, mikä saattoi vaikuttaa. Blokkaus saattoi epäonnistua tai sekundäärivasta-aineet sitoutua väärin, ja tämä johtaa epäspesifiin sitoutumiseen. Voi myös olla, että leikkeet altistuivat jostain syystä liikaa valolle, mikä pilaa fluoresoivat merkkiaineet. Ylimääräinen yön yli suoritettava huuhtelu olisi voinut parantaa laatua. Tarkkaa syytä epäonnistumiselle ei löytynyt. 23