1111 1111 II 11111 II II

1111 1111 II 11111 II II F 100008 (B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGN I NG S SKR I FT C (45) Patntti myönntty Patnt mldlat 23 02 1225 (51) Kv.lk.6 Int.c1.6 A 61K 39/215 SUOMI FINLAND (FI) (21) Patnttihakmus Patntansökning 884521 (22) Hakmispäivä Ansökningsdag 30.09.88 (24) Alkupäivä Löpdag 30.09.88 (41) Tullut julkisksi Blivit offntlig 02.04.89 Patntti- ja rkistrihallitus (44) Nähtäväksi panon ja kuul.julkaisun pvm. Patnt- och rgistrstyrlsn Ansökan utlagd och utl.skriftn publicrad 15.06.95 (71) Hakija Sökand (32) (33) (31) Etuoikus Prioritt 01.10.87 US 103144 P 1. Nordn Laboratoris, Inc., 601 W. Cornhuskr Highway, Lincoln, Nbr. 68501, USA, (US) (72) Kksijä Uppfinnar 1. Grbr, Jay Dan, 2435 Stockwll Strt, Lincoln, Nbr. 68502, USA, (US) 2. Ingrsoll, Jrald D, 5901 Lillybridg #2, Lincoln, Nbr. 68506, USA, (US) (74) Asiamis Ombud: Brggrn Oy Ab (54) Kksinnön nimitys Uppfinningns bnämning Mntlmä rokottn, joka suojaa kissoja kissojn tarttuvalta pritoniitilta, valmistamisksi Förfarand för framställning av vaccin för skyddand av kattr mot kattrs smittasam pritonit (56) Viitjulkaisut Anförda publikationr EP A 0011864 (C 12N 7/00), EP A 0027347 (A 61K 39/12), US A 4195130 (C 12N 7/10), WO A 87/04624 (A 61K 39/12) (57) Tiivistlmä Sammandrag Rokot ja mntlmä rokottn valmistamisksi, joka immunoi kissat kissan tarttuvan pritoniittivirukn infktiota vastaan. Vaccin och forfarand for framstallning av vaccint, som immunisrar kattr mot kattns smittsamma pritonitvirusinfktion.

Mntlmä rokottn, joka suojaa kissoja kissojn tarttuvalta pritoniitilta, valmistamisksi 1 Tämä kksintö kosk mntlmää, jonka avulla voidaan valmistaa rokottta, jota voidaan käyttää kissojn immunisointiin kissojn tarttuvaa pritoniitti (FIP) -virusta vastaan. Tarkmmin sanottuna s kosk mntlmlåå hiknntyn, låmpöhrkän rokotttn, joka suojaa thokkaasti kissoja FIP:ltå, valmistamisksi. Kissojn tarttuva pritoniitti (FIP) on skä koti- ttä villikissojn sairaus. Virus isk läimn usimpiin sisälimiin ja on lähs aina tappava. Virus on rittäin tarttuva skä kissanpntuihin ttä täyskasvuisiin kissoihin. FIP-virus on idntifioitu koronaviruksksi, Horzink ja Ostrhaus, Arch. Virol. 59:1 (1979). FIP-virus on sukua tarttuvall sikojn gastrontriittiviruksll (TGEV), koirin lavantautikoronaviruksll ja ihmisn hngityslintn koronaviruksll. On olmassa myös kissojn lavantautikoronavirus (FECV), joka rplikoituu pääasiassa suolistossa ja aihuttaa vain livän ripulitaudin. Lutz t al., J. Small Animal Pract. 27:108 (1986). Vaikka on tunnttua, ttä koronavirus aihuttaa FIP:n, ovat tapa, jolla infktio lviää kissojn joukossa, ja taudin synty vilä hikosti ymmärrttyjå. Sairaudn patognsi on hyvin komplksinn ja tutkimukst osoittavat, ttä isäntäläin, virus ja ympåristötkijät vaikuttavat osaltaan sairaudn muotoon ja sn khittymisn. Pdrsn t al., 34. Annual Symposium, Viral Disass of Small Animals 7:1001 (1985). FIP voi siintyä kandssa ri muodossa: märkä li vuotava muoto, joll on ominaista fibriininn vatsakalvontulhdusnst, ja kuiva li pruskudoksinn muoto, joll on ominaista ri lintn granulomaattinn tulhdus ja vähän tai i ollnkaan tulhdusnstttå. Lutz t al., dllä.

2 Koska on olmassa muita kissojn koronavirusinfktioita, simrkiksi FECV, jotka ovat antignissti sukua FIP-viruksll, on FIP:n patognsi ollut vaika karaktrisoida. Tämän vuoksi on sairaudn diagnoosia vartn thdyistä srologisista tstistä puuttunut spsifisyyttä ja n ovat hämmntänt aikaismpin tutkimustn tulkintaa. Pdrson, Flin Practic 13: 13 (1983). Tähän asti on suojaava aktiivinn immunointi FIP:ä vastaan ollut mandotonta. Päinvastoin ovat rokottut kissat ollt vastaanottavaismpia sairaudll. Pdrsn t al., Am. J. Vt. Rs. 44:229 (1983); Wiss t al., Comp. Immun. Microbiol. Infct. Dis. 4:175 (1981); Wiss t al., Am. J. Vt. Rs. 41:663 (1980). Kissat saavat tartunnan oronasaalista titä. FIP-virus lisääntyy pitlisoluissa ylmmällä hngityslintn alulla ja suolistossa. Kliinissti näkyvä FIP tul siin sn jälkn, kun virus lävistää limakalvostn ja aihuttaa immuunivälittisn sairaudn. Lutz t al., dllä; Wiss t al., Am. J. Vt. Rs. 42:382 (1981). Nnän limakalvon immuunivastn stimulointi saadaan aikaan parhaitn antamalla intranasaalissti rokottta. Binnstock t al., Immunology 41:249 (1980); Murray, Th Vtrinary Rcord, 10. marraskuuta: 500 (1973). Limakalvon B-lymfosyytit, jotka on stimuloitu rittämään anti-fip-viruksn IgA-vasta-aintta, valuvat myös suoln limakalvoon ja aikaansaavat myös paikallista suoln immuunisuutta. Murray, dllä. Kksinnön räs suoritusmuoto on mntlmä oraalissti tai intranasaalissti annttavan FIP-rokottn valmistamisksi, joka pystyy indusoimaan immuunisuudn FIP-virusinfktiota vastaan kissoissa ilman vakavia sivuvaikutuksia. Mntlmän avulla valmistttava rokot käsittää vaikuttavan määrän lämpöhrkkää (ts) FIP-virusta.

94438 Kksinnön toisssa suoritusmuodossa thdään slkoa mntlmästä, jonka avulla voidaan valmistaa rokottta FIP-virusta vastaan hikntämällä FIP-virus hyvin usilla käynnillä sopivissa soluissa; antamalla mutagnisn ainn vaikuttaa hiknnttyyn FIP-viruksn; viljlmällä hiknnttyä FIPvirusta, joka mutagnisn ainn vaikutuksn jälkn on nyt lämpöhrkkå; ja ottamalla taltn hiknntty ts-fip-virus. 3 Thokkaan FIP-rokottn tulisi stimuloida voimakas limakalvon immuunivast stämään infktion pääsy limakalvostn läpi ja soluvälittinn immuunivast (CMI), joka välittömästi pysäyttää viruksn lviämisn, jos s läpäis limakalvon. Kksinnön mukaisn mntlmän avulla saatu lämpöhrkkä FIP-virus (ts-fip-virus) voidaan antaa intranasaalissti tai oraalissti. Kksinnön parhaana pidtyssä suoritusmuodossa ts-fip-virus anntaan intranasaalissti. Kun s anntaan intranasaalissti, niin ts-fip-virus, joka kykn kasvamaan nasofarynx-alulla vallitsvissa lämpötiloissa, lisääntyy hlposti ja stimuloi CMI-vastn ja paikallisn immuunivastn. Lisäksi ts-fip-virus stimuloi CMI-vastn FIP-viruksll tstauksn jälkn, jota i ol löydtty kissoissa, jotka on rokotttu systmissti tai kissoissa, jotka ovat saant tartunnan virulntista FIP-viruksista. Tämän kksinnön mukaisn rokottn valmistuksn käytttyä FIP-virusta risttään virusinfktion saanidn läintn limistä tai kudoksista, miluimmin maksasta. Elimt tai kudokst jauhtaan ja niitä anntaan oraalissti ko-läimill, miluimmin spsifissti patognivapaill kissoill (SPF). Usidn in vivo käyntin jälkn tartunnan saanissa limissä, miluimmin viidn in vivo käynnin jälkn tartunnan saanissa prnoissa tai maksoissa, FIP-virus risttään. FIP-virus risttään infktoitunista limistä tkniikasta tunnttujn standardimntlmin avulla ja viljllään yhdssä kissan solujn kanssa. FIP-virus kasvaa hlposti kissan solujn kanssa,

4 jotka ovat mistä tahansa lähtstä, simrkiksi prnasta, suolilipn lymfasolmusta, ndotlisoluista tai mbryon soluviljlyistä, kutn on sittty US-patntissa 4 303 644 ja 4 571 386. Kksinnön parhaana pidtyssä suoritusmuodossa FIPvirus risttään sairaan kudoksn soluista ja viljllään yhdssä kissan munuaissolujn kanssa. Sairaista kudoksista uutttu virus viljllään yhdssä kissan solujn kanssa, jotta virus soputuisi lisääntymään in vitro. In vitro lisääntymisn näkyvänä todistna on monitumaistn syncytiumsolujn muodostuminn yhdssä muidn koronaviruksill tyypillistn tunnttujn sytopaattistn vaikutustn <"cp") kanssa. Viruksn käyntjä jatktaan, kunns s hikkn ja sn jälkn saadaan aikaan sn mutaatio, jolloin siitä tul lämpöhrkkä. Hiknntty tarkoittaa tkniikassa virusta, jota on muunnltu sitn, ttä s i nää pysty aihuttamaan sairautta. Lopuksi hiknnttyä, lämpöhrkkää virusta anntaan kissoill joko oraalista tai intranasaalista titä. Parhaana pidtyssä suoritusmuodossa FIP hiknntään runsaidn, simrkiksi ainakin 60 käynnin avulla, miluimmin 95-100 käynnin avulla kissan munuaisoluissa. Lämpöhrkän FIPviruksn khittämisksi tasamäärä viljlynstttä, jolla on korka käyntiluku, saattaan mutagnisn ainn vaikutuksn alaisksi, simrkiksi kmiallisn ainn tai sätilytyksn, miluimmin ultraviolttisätilytyksn vaikutuksn alaisksi, kunns viruksn tiittri lisäännyttyään noin 31 C:ssa on aina- kin 1 x 10 TCID 50, miluimmin noin 1 x 10 TCID 50 suurmpi 0 kuin 39 C:ssa. <TCID 50 on kudosviljlyssä infktion aihuttava annos, joka saa aikaan sytopaattisn vaikutuksn 50 %:ssa viruksn vaikutuksn alaisiksi joutunista viljllyistä soluista.) Viruksn optimaalisn linvoimaiuudn saamista vartn virusnstt kootaan joka viids minuutti ja varastoidaan 0 0-7 -70 C:ssa. Kymmnkrtaist sarjalaimnnukst (10-10 ) kus-

5 takin 5 minuutin näyttstä tstataan viruksn linvoimaisuudn suhtn toisiinsa yhtyviin kissan munuaissolujn yksikrroslvyihin. Optimaalinn näyt, miluimmin 5 minuutin näyt, 0 valitaan ja sitä lisäännyttään 31 C:ssa usilla ri laimnnuksilla. Kootaan virusnstt kuoppalvyistä, jotka sisältävät yksinkrtaisia plakkja. Taulukko 1 osoittaa ultraviolttisätilytyksn vaikutuksn 0 FIP-viruksn virulnttiin kantaan (DF2-FIP-virus) 31 C:ssa. FIP muuttui täysin inaktiivisksi, kun s oli ollut ultraviolttivalossa 10 minuuttia. Taulukko 1 UV-sätilytysajan vaikutus viruksn tiittriin Viruksn infktoimin kuoppin lukumäärä/laimnnua TCID 50-0 -1-2 -3-4 -5-6 -7 Näyt 10 10 10 10 10 10 10 10 tiittri Ennn a 6,67 UV:ä 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 X10 1,33 5 min 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10 10 min 0/4 0/4 0/4 0/4 0 15 min 0/4 0/4 0/4 0/4 0 a FIPV-infktoitunidn kuoppin lukumäärä/kuoppin kokonaislukumäärä. FIP-virusnstt laimnnukslla 1:16, joill annttiin ultraviolttisätilytystä 5 min ajan, sisälsivät virusplakkja. Yksittäistn plakkin anntaan lisääntyä suurimmassa osassa kuoppia.

6 Yksittäisiä plakkja titrataan riksn kymmnkrtaislla lai- -3-8 o o mnnukslla (10-10 ) 24 kuoppalvyssä 31 C:ssa, 37 C ja 0 39 C:ssa (taulukko 2). Taulukko 2 0 UV-sätilytttyjn virusplakkin titraaminn 31 C:ssa, 0 0 37 C:ssa ja 39 C:ssa Piakin Lämpö- Viruksn infktoimin kuoppin no tila lukumäärä/laimnnus TCID 50 - -3-4 -5-6 -7-8 C 10 10 10 10 10 10 tiittri 1 31 4/4 37 4/4 39 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 7,00 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 6,50 4/4 4/4 2/4 1/4 0/4 6,23 2 31 4/4 37 4/4 39 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 7,50 4/4 4/4 4/4 3/4 0/4 7,33 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 6,00 3 31 4/4 37 4/4 39 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 7,67 4/4 4/4 4/4 1/4 1/4 6,88 4/4 4/4 3/4 0/4 0/4 6,33 4 a 31 4/4 37 4/4 a 39 0/4 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 7,50 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 6,50 b 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 <3,50 Nljässä kuoppalvyn kuopassa näkyi arpia tai mrkkjä aikaismmasta parantunsta infktiosta. b Kolmssa kuoppalvyn kuopassa näkyi arpia tai mrkkjä aikaismmasta parantunsta infktiosta.

7 Viruksn lisääntymisn optimiolosuhtt prustuvat sn kykyyn 0 lisääntyä sallituissa lämpötiloissa. 39 C:ssa TCID 50 on ai- nakin noin 1 x 10 yksikköä alhaismpi kuin TCID 50 31 C:ssa 5 ja s on miluimmin ainakin noin 1 x 10 yksikköä alhaismpi. Taulukko 3 Lämpöhrkän piakista risttyn FIPV:n lisääntymisn vrtailu 0 0 5 in vitro -käyntikrran suhtn lämpötiloissa 31 C ja 39 C. Käynti- krta Lämpö- Viruksn infktoimin kuoppin tila lukumäärä/laimnnus -5 o -1-2 -3-4 -6-7 C 10 10 10 10 10 10 10-8 TCID 50 10 tiittri a 1 31 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 0/4 39 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 6,33 0/4 1,50 2 31 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 39 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 5,67 0/4 1,50 3 31 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 39 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 5,50 0/4.1,50 4 31 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 39 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 5,67 0/4 41,50 31 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 39 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 6,00 0/4 X1,50 FIPV:n infktoimin kuoppin lukumäärä/kuoppin kokonaislukumäärä

- Esillä olvan kksinnön mukaista hiknnttyä lämpöhrkkää FIP-virusta voidaan antaa kissoill suojaamaan läimiä FIPvirukslta. Valitaan annostus, joka on turvallinn, so. i aihuta vakavia sivuvaikutuksia ja on thokas, so. aikaansaa suojaavan solu- ja paikallisn immuunivastn sn antamisn jälkn. FIP-rokottta voidaan antaa intranasaalissti tai oraalissti. Parhaana pidtty ant 7 omuoto on intranasaalissti ja tyypilli- nn annos on 10 2-10 TCID 50 0,5-1,5 ml:n tilavuudssa. Annos voidaan antaa yhtnä annoksna tai usampana laimnnt- 5,5 tuna annoksna jonkin ajanjakson kulussa. Yksittäinn 10 TCID 50 -virusannos 0,5 mi:ssa kantajaa on parhaana pidtty ja puolt siitä li 0,25 ml simrkiksi spray-pullosta tai kokoonpuristttavasta pullosta tai tiputuslaittsta anntaan kumpaankin läimn siraimn. Kotulokst osoittavat, ttä thokas rokotannos voidaan antaa yhtnä annoksna, mutta kahta annosta pidtään parmpana. FIP-rokot voidaan antaa suoraan, so. virus kasvattaan soluviljlynstssä ja viljlynstttä käyttään sittn kantajana rokottta annttassa. Viljlynst voidaan laimntaa tai konsntroida standarditkniikkaa käyttän halutun konsntraation saamisksi hiknntyll ts-fip-viruksll. Vaihtohtoissti voidaan saada aikaan farmasuttissti sopiva ts-fipvalmist uuttamalla hiknntty lämpöhrkkä virus soluviljlystä simrkiksi sakkaroosin tihyssntrifugointi-rotustkniikan avulla ja skoittamalla sopivaan kantajaan simrkiksi vtn, suolaliuoksn, kolratoksoidiin tai ovalbumiiniin tai lisäainsn, kutn simrkiksi Quil A:han, alhydrogliin tai öljymulsioon. Parhaana pidtyssä suoritusmuodossa virus anntaan viljlynstssä ja valmisttaan tasamääriä yksittäisannosmääristä.

Ei-virulntti ts-fip-virus voidaan myös lyofilisoida yksittäisannosmäärissä ja varastoida käyttöön asti. Kun rokot varastoidaan lyofilisoituna jauhna, s rkonstituoidaan nnn antamista vtn, suolaliuoksn, viljlynstsn tai muihin sopiviin kantajiin, joita voidaan antaa suoraan intranasaalissti kissoill. Vata-ainvastn mittaukst suorittaan standardimntlmin avulla, joita ovat ntsyymisido-immunosorbnttiko (ELISA) ja srumin virusnutralointi(vn)-ko ja n suorittaan yksittäistn läintn vrinäyttistä. Mittaukst thdään optimaalissti näyttistä rokottamisn ja tstauksn jälkn. Lymfosyyttiblastognsi-mntlmää, josta on thnyt slkoa Pdrsn t al., Th Compndium on Continuing Education 7: 1001 (1985), käyttään osoittamaan soluvälittinn (lymfosyytti) vaat rokottamisn ja tstauksn jälkn. Tämän kksinnön aspktina on vilä yhdistlmärokottidn valmistus ja käyttö, jotka muodostuvat rokotmääristä ts-fipvirusta ja yhdstä tai usammasta tunntusta kissan virukssta. Esimrkiksi voidaan valmistaa yhdistlmärokottita oraalissti tai intranasaalissti annttaviksi, jotka sisältävät t-fip-viruskomponntin ja yhtä tai usampaa kissan virusta, joidn tidtään olvan hngityslintn infktioidn aihuttajia, simrkiksi kalicivirus, kissan hrps(rhinotrachiti)virus. Myös muita yhdistlmärokottita, jotka pystyvät indusoimaan immuunisuudn kissoissa FIP-viruksn ja yhdn tai usamman muun patognisn organismin tai virustn aihuttaman infktion suhtn voidaan valmistaa käyttämällä ts-fip-viruskomponnttia ja muita viruskomponnttja, jotka ivät liity hngityslintn infktioihin, tai patognisia organismja, simrkiksi kissan panlukopnia, klamydia, kissan lukmia.

10 Voidaan valmistaa myös alayksikkörokottitta. t-fip-virus voidaan yhdistää tapttujn tai hiknnttyjn patognin alayksikön kanssa kutn kissan panlukopniavirus-, kalicivirus-, kissan hrpsvirus- tai muun sllaisn alayksikkökomponntin kanssa parntraalissti tai intranasaalissti annttavaksi. ts-fip-virus voidaan yhdistää myös kissan lukmiavirusrokottn kanssa parntraalissti annttavaksi. Tällaistn yhdistlmärokottidn valmistus ja käyttö tapahtuvat dllä slostttujn mntlmin mukaissti tai rokottidn valmistus- ja käyttötkniikan asiantuntijoidn titämin mntlmin mukaissti. Suraavat simrkit ovat asiaa valaisvia ivätkä rajoita kksintöä. Esimrkki 1: Thokkuuststi 1 Käytttiin nljäätoista SPF koiraskissaa (26 kk ikäisiä) Librty Labsista (Librty, Nw Jrsy) nsimmäisssä rokotuststauskokssa. Rokotttuja kissoja pidttiin yhdssä risttyssä huonssa, i-rokotttuja toisssa. Kymmnn kissaa rokotttiin 3 krtaa intranasaalissti (IN) 3 viikon välin ts-fip-viruksn avulla. Viisi kissaa rokott- 5,5 tiin ts-fip-virustiittrillä 10 TCID 50 /ml 31 C:ssa ja vii- 3,5 si kissaa virustiittrillä 10 TCID 50 /m1 31 C:ssa. Kymmntä rokotttua ja nljää vrtailukissaa tstattiin oraalissti käyttän 1 ml laimnnukslla 1:600 virulnttia FIP-virusta 2,68 (FIP-virus-DF2, 10 käyntikrtaa, tstaustiittri = 10 TCID 50 /ml) kaksi viikkoa myöhmmin. Srologinn IgG-vast FIP-viruksll määrättiin ELISAn avulla, Ostrhaus t al., Vtrinary Quartrly 1:59 (1979). VNtiittrit (Pdrsn t al., Am. J. Vt. Rs. 44:229 (1983) määrättiin myös.

11 ts-fip-virukslla rokotttujn IgG-ELISA-tiittrit on sittty taulukossa 4. Rokotttujn kissojn tiittrit nnn rokotuta otttiin sinä päivänä, kun n siirrttiin risttyistä häkistä. Vrtailukissojn nnn rokotusta ottut ELISA-tiittrit otttiin 15 päivää sn jälkn, kun n siirrttiin pois ristyshäkistä. Vrtailukissojn IgG-vast FIP-viruksll johtuu vasta-ainista ristiin ragoivall kissan lavantautikoronaviruksll (FECV), joka oli kokissa käyttyll SPFkissakoloniall ominainn tauti. Rokotttujn kissojn IgGvaat johtuu siis skä FECV:stä ttä rokotvirukssta. Virusta nutraloivat tiittrit, jotka olivat päin vastoin kuin IgG-ELISA-tiittrit ngatiivisia nnn rokottamista (taulukko 5) kasvoivat jokaisn rokotuksn jälkn. Srumia i koottu tstaamisn jälkn vasta-ainidn titraamisn. Rokotttujn ja vrtailukissojn saattaminn tukätn FECV:n vaikutuksn alaisiksi vaikutti vain vähän tai i laisinkaan tstaamisn, koska molmmat ryhmät olivat khittänt ristiin ragoivan vasta-ainvastn FIP-viruksll. Kolm nljästä i-rokottusta vrtailukissasta khitti FIP:ä ja kuoli. Nljäs kissa, LK2, sai kliinisn arvosanan 13 (mitä korkampi luku, sitä vakavampi symptomi, ja kuolma luokitltiin numrolla 50), kolm krtaa niin korkan kuin yksikään yhdksästä suojarokottusta. Esimrkki 2: Thokkuuststi 2 Käytttiin kaksitoista koronavirus-ngatiivista SPF-koiraskissaa (12 kk ikäisiä) Librty Labsista toisssa rokotuststauskoksa. Kaikki kissat oli pantu rityshäkkihin (kolm kissaa pr häkki). Kuusi kissaa rokotttiin kolm krtaa IN kolmn viikon välin ts-fip-virukslla. Kolm kissaa rokotttiin kaksi krtaa ts- FIP-virukslla IN ja krran oraalissti. t-fip-virustiittri 5,5 oli 10 TCID 50 /ml. Kolm i-rokotttua vrtailukissaa pidttiin häkissä rillään rokottuita.

12 Yhdksän rokotttua ja kolm vrtailukissaa tstattiin oraalissti käyttän 1 ml laimnnukslla 1:600 virulnttia FIP- virusta (FIP-virus-DF2, 10 käyntikrtaa, tstaustiittri = 2,15 10 TCID 50 /ml). Taulukossa 6 on sittty ELISAn avulla rokotttujn ja irokotttujn kissojn srumin IgG anti-fip-viruksn vastaainvast. IgG-vasta-aintiittrin suurin kasvu nähtiin nsimmäisn ja toisn rokotuksn jälkn. Tiittrin kasvua i ilmnnyt niissä kissoissa, jotka rokotttiin IN kolmannn krran, mikä vahvisti sn ttä yksi tai korkintaan kaksi annosta riittää tuomaan suojauksn. IgG-vasta-aintiittrit kohosivat jyrkästi tstaamisn jälkn. Virusta nutraloivat vasta-aintiittrit kohosivat kunkin kolmn rokotuksn ja tstaamisn jälkn. Kaksi kolmsta i-rokottusta vrtailukissasta khitti FIP:ä ja kuoli. Kaikki rokottut kissat jäivät loon. Kandlla rokottulla kissalla, SN1 ja SY1 oli tilapäinn vridyskrasia, tupäässä ns. Dohl Bodis, alhaisksi puristunut solun tilavuus ja kohonnut ruumiinlämpö. Niissä i kuitnkaan ollut mitään mrkkiä iktrukssta, mikä on hyvä lähstyvän kuolman ilmaisija. Esimrkki 3: Thokkuuststi 3 Käytttiin kandksaatoista koronavirus-ngatiivista SPFkoiraskissaa (12 kuukaudn ikäisiä) Librty Labsista. Kaikki kissat pantiin ristyshäkkihin (kaksi kissaa pr häkki). Kuusi kissaa rokotttiin kandsti IN kolmn viikon välin ts- FIP-virukslla. Kuusi kissaa rokotttiin krran IN. ts-fip- 5,5 virustiittri oli 10 TCID 50 /ml. Vilä kuusi kissaa rokotttiin subkutaanissti ts-fip-virukslla, jossa oli apuna (SC) Concanavalin A (Con A) ja pidttiin ristyshäkissä rillään IN rokottuista. Kuusi i-rokotttua vrtailukissaa pidttiin häkissä rillään rokottuista.

13 Kaksitoista rokotttua ja kuusi vrtailukissaa tstattiin oraalissti kolm viikkoa myöhmmin käyttän 1 ml 1:600-laimnnukslla virulnttia FIP-virusta (FIP-virus-DF2, 10 käynti- 2,61 krtaa, tstaustiittri = 10 TCID 50 /ml). Taulukossa 8 ovat IN ja subkutaanissti ts-fip-virukslla rokotttujn ja i-rokotttujn kissojn ELISA-IgG-tiittrit. Kissoilla, jotka oli rokotttu kandsti IN ja jopa krran IN, oli korkammat kskimääräist tiittrit kuin kissoilla, jotka oli rokotttu SC-ttauksn aikoihin. Kissoilla, jotka saivat kaksi IN-annosta t-fip-virusrokottta oli myös korkammat VNtiittrit kuin kissoilla, jotka saivat yhdn ainoan INannoksn nnn tstaamista (taulukko 9). Viläpä yksi annos ts-fip-virusta annttuna IN stimuloi korkammat VN-tiittrit kuin kaksi annosta annttuna SC. Viidn kissan kuudsta, jotka oli rokotttu kandsti IN, prifrist vrn lymfosyytit ragoivat FIP-viruksll lymfosyyttiblastognsitstissä nnn tstaamista. Kolm kissaa, jotka oli rokotttu krran IN ja ainoastaan yksi kissa, joka oli rokotttu kandsti subkutaanissti, sittivät samanlaisn vartn. Kaksi viidstä, 2 annosta IN-rokottta saanutta, jotka sittivät lymfosyyttiblastognsivastn nnn tstaamista skä yksi 2 annosta rokottta IN saanut, jolla i siintynyt vaattta, sittivät voimakkaan blastognsivastn tstaamisn jälkn. Ainoastaan yhdn kissan lymfosyytit, joka oli rokotttu krran IN, mutta i yhdnkään kissan lymfosyytit, jotka oli rokotttu kandsti SC, sittivät vartn FIP-viruksll tstaamisn jälkn. Kaikki kuusi kissaa, jotka oli rokotttu kandsti IN, olivat hyvin suojattuja FIP-viruststauksn suhtn. Yhdllä kuudsta kissasta (UX6), jotka oli rokotttu krran IN, oli vrn

14 dyskrasia, joka ilmais FIP:n, mutta jäi loon. Päinvastoin kaksi nljästä i-rokottusta kissasta ja viisi kuudsta subkutaanissti rokottusta kissasta khitti FIP:ä ja kuoli. Toislla kandsta loon jäänstä vrtailukissasta (HI2) oli vrn dyskrasia, joka viittasi FIP:hn. Usimmat subkutaanissti rokottut kissat khittivät FIP:ä nopammin kuin irokottut kissat. Esimrkki 4: Yhdistlmärokottn valmistaminn Yhdistlmärokottta, joka sisältää ts-fip-viruksn yhdistttynä kaliciviruksn ja kissan hrpsviruksn (rhinotrachitis) kanssa intranasaalissti annttavaksi, voidaan valmistaa. Yhdistlmärokot voidaan kokoonpanna suraavasti: 0,5 ml kissan hrpsvirusta (TCID 50 = 7,9 0,50 ml kalicivirusta (TCID 50 = 10 ) 0,5 ml ts-fip-virusta (TCID 50 = 10 5,5 ) 0,8 ml stabiloivaa aintta (NZ-amiini, sakkaroosi) 7,2 10 ) glatiini tai Yhdistlmärokot voidaan lyofilisoida laivausta ja varastointia vartn. Ennn käyttämistä yhdistlmärokottsn liittään uudlln vttä 1,0 ml:aan asti simrkiksi vttä, suolaliuosta tai muuta sopivaa laimnnusaintta oraalista tai intranasaalista antamista vartn. Esimrkki 5: Alavksikkörokottn valmistaminn Immunogninn ts-fip-viruksn alayksikkö voidaan yhdistää kissan panlukopniavirus-, kalicivirus-, kissan hrpsvirus-, kissan lukmiavirus- ja klamydiarokottn kokovirustai alayksikkökomponnttiin ja antaa parntraalissti tai intranasaalissti. Tämän tyyppinn alayksikkö-yhdistlmärokot voidaan kokoonpanna suraavasti:

15 5,5 0,2 ml ts-fip-virusta (TCID 50 = 10 ) 7,2 2 0,5 ml kissan hrpsvirusta (TCID 50 = 10 ) 0,25 ml kissan panlukopniavirusta 7 (TCID 5 0 = 0,25 ml kalicivirusta (TCID 50 = 10 ) 0,5 ml kissan lukmiavirusta (500-3000 / ug nia 6,5 0,25 ml klamydiaa (TCID 50 = 10 ) 6,0 10 ) gp 70 protii- Eri kissan virustn konsntraatio on s määrä, jonka tidtään aikaansaavan thokkaan immuunivastn. Konsntroitu virus valmisttaan miluimmin dllä suositlluissa tilavuuksissa, jotta komponntit saadaan pinssä tilavuudssa, joka sovltuu annttavaksi. Esimrkki 6: Kaksikomponnttinn alavksikkörokot Kaksikomponnttinn alayksikkörokot parntraalista antoa vartn voidaan valmistaa käyttän ts-fip-viruksn immunognistä alayksikköä yhdistttynä immunognisn kissan lukmiavirusrokottn kanssa. Alayksikkö-yhdistlmärokot voidaan kokoonpanna suraavalla tavalla: 5,5 0,4 ml (TCID 50 = 10 ) ts-fip-virusta 0,4 ml (25-1000 / ug) kissan lukmiavirus-alayksikköä 0,2 ml apuaintta (aluminiumhydroksidia, saponiinia) Esimrkki 7: Rokottidn antaminn kahtn kohtaan ts-fip-virusrokottta voidaan antaa intranasaalissti (0,5 ml pr sirain) samanaikaissti kuin anntaan parntraalissti kalicivirus-, kissan hrpsvirus-, kissan panlukopniavirus-, kissan lukmiavirus- ja klamydia-(kissan pnumonitis) yhdistlmärokottta. Eri komponnttin konsntraatiot voisivat olla kutn on slostttu simrkissä 4, mutta ts-fip tulisi antaa intranasaalissti rillään muista viruskomponntista.

16 Taulukko 4 t-fip-virukslla rokotttujn ja i-rokotttujn kissojn srumin IgG-anti - FIP-virus-vasta-ainvastt thokkuuststissä 1. ELISA-tiittri viikkoa rokottamisn iälkn Kissan Rokottn a b c no tiittri 0 3 6 8 5,5 d, KU4 10 TCID 50 /ml >1,50 >1,50 1,260 >1,50 KV4 0,145 0,748 0,806 1,183 LZ4 0,080 0,590 0,719 1,201 M35 0,040 0,557 0,747 1,075 MM5 0,070 0.449 0.787 1.015 Aritmttinn kskiarvo 0.367 0.769 0.864 1.195 3,5 KT4 10 TCID 50 /ml 0,074 0,602 0,787 1,420 KU2 0,129 0,439 0,650 1,179 LC5 0,095 0,505 0,788 0,914 LR7 0,364 0,698 0,676 1,024 MG2 0.095 0.676 0.845 1.298 Aritmttinn kskiarvo 0.151 0,584 0.749 1.167 f KT3 Ei mitään 0,483 0,881 0,823 1,031 KV2 0,392 0,715 0,827 1,202 LD4 0,348 0,702 0,842 0,973 LK2 0,499 0,724 0.903 0.925 Aritmttinn kskiarvo a Ensimmäinn rokotus b Toinn rokotus c dkolmas rokotus 0,430 0,755 0,849 1,033 Absorboitumisarvot mitattu aallonpituudlla 405 nm. Arvot..,k300 ovat positiivisia Srumi koottu nsimmäisnä rokotuspäivänä Srumi koottu 15 päivän kuluttua nsimmäisstä rokotukssta

Taulukko 5 17 ts-fip-virukslla rokotttujn ja i-rokotttujn kissojn srumin viruksn nutraloinnin anti-fip-viruksn vasta-aintiittrit thokkuuststissä 1 Kissan no Rokottn tiittri Vastaava tiittri a 0 viruksn nutralointiviikkoa rokotuksn lälkn b 3 c 6 8 5,5 d KU4 10 TCID 50 /ml <2 d 64 192 NT KV4 <2 24 128 512 LZ4 NT d 16 128 256 1435 <2 d 192 192 384 MM5 <2 16 48 512 Gomtrinn kskiarvo <2 38 124 401 3,5 d KT4 10 TCID 50 /ml <2 d 96 192 384 KU2 <2 48 96 512 LC5 NT d 96 384 NT LR7 <2 d 64 96 192 MG2 <2 96 256 768 Gomtrinn kskiarvo 2 77 177 413 KT3 0 <2 <2 <2 <2 KV2 <2 <2 <2 <2 LD4 <2 <2 <2 <2 LK2 <2 <2 <2 <-2 Gomtrinn kskiarvo <2 <2 <2 < 2 a Ensimmäinn rokotus b Toinn rokotus c dkolmas rokotus Srumi otttu nsimmäisnä rokotuspäivänä Srumi otttu 15 päivän kuluttua nsimmäisstä rokotuk- ssta

Taulukko 6 ts-fip-virukslla rokotttujn ja i-rokotttujn kissojn srumin IgG-anti-FIP-viruksn vasta-ainvast thokkuuststissä 2. Kissan no IN-rokotusa krtotn no -1 ELISA-tiittri viikkoa rokottamisn lälkn b 3 c 3 d 3 12 18 SD1 0,110 0,348 0,689 0,633 1,078 1,249 SL2 0,135 0,346 0,669 0,482 1,089 1,264 SN1 3 0,086 0,483 0,812 0,776 1,094 1,397 SO2 0,196 0,321 0,573 0,620 1,095 1,094 ST2 0,164 0,268 0,609 0,532 1,275 1,229 SY3 0,147 0.532 1.013 0,768 1,232 1,424 Aritmttinn kskiarvo0,140 0,383 0.726 0,635 1,144 1.273 RY5 0,106 0,383 0,740 0,725 0,987 1,003 SI2 2 0,282 0,299 0,718 0,738 1,130 1,054 SY1 0,106 0.383 0.868 0.792 1.271 1 421 Aritmttinn kskiarvo0.165 0,355 0,775 0.752 1,129 1,162 RZ3 0,123 0,052 0,063 0,073 0,589 Kuollut SH4 0 0,074 0,030 0,047 0,049 0,417 Kuollut SL5 0.155 0,051 0.074 0.040 0,291 0,609 Aritmttinn kskiarvo0,117 0,044 0,061 0,054 0,432 0,609 a Ensimmäinn rokotus b Toinn rokotus c dkolmas rokotus Tstattu 4 viikkoa kolmannn rokotuksn jälkn Absorboitumisarvot mitattuna aallonpituudlla 405 mm. Ar- vot >300 ovat positiivisia. Kolmannn krran rokotttu oraalissti.

19 Taulukko 7 ts-fip-virukslla rokotttujn ja i-rokotttujn kissojn srumin viruksn nutralointi-anti-fip-viruksn vasta-ainn tiittrit thokkuuststissä 2 Kissan no IN-rokotuskr- tojn no Vastaava viruksn nutralointitiittri viikkoa rokotuksn iälkn a -1 3 b 6 c 9 d 12 18 SD1 1 0 64 384 NT 192 96 SL2 0 96 1024 240 7200 9600 SN1 0 48 256 360 4800 9600 SO2 0 48 192 NT 900 192 ST2 0 192 768 120 NT 64 SY3 0 48 768 360 7200 7200 Gomtrinn kskiarvo 0 71 474 247 2122 960 RY5 2 0 48 192 NT 192 600 SI2 0 48 256 120 128 64 SY1 0 96 1024 360 900 9600 Gomtrinn kskiarvo 0 60 369 208 281 717 RZ3 0 0 0 8 0 900 Kuollut SH4 0 0 1 0 600 Kuollut SL5 0 0 1 0 2 3 Gomtrinn kskiarvo 0 0 2 0 81 3 a Ensimmäinn rokotus b Toinn rokotus c Kolmas rokotus d Tstattu 4 viikkoa kolmannn rokotuksn jälkn Kolmannn krran rokotttu oraalissti

20 Taulukko 8 ts-fip-virukslla intranasaalissti ja subkutaanissti rokotttujn ja i-rokotttujn kissojn srumin IgG-anti-FIPviruksn vasta-ainvast thokkuuststissä 3 Kissan Rokotusti/ Viikkoa rokotuksn jälkn a b 0 3 c 8 11 14 16 no rokotuksn no d SU4 IN/1 0,028 0,012 0,399 0,476 0,334 0,474 TR3 0,017 0,007 0,603 0,552 0,428 0,697 TT2 0,018 0,011 0,592 1,153 0,745 1,321 UN3 0,012 0,010 0,674 0,948 0,673 1,400 UO4 0,064 0,021 0,329 0,414 0,397 0,269 UX6 0.035 0.020 0.683 1,116 0,856 1,475 Aritmtt.kskiarvo 0.029 0,014 0.547 0,776 0,574 0,939 OH2 IN/2 0,016 0,351 0,858 0,537 0,443 0,878 PQ4 0,104 0,095 0,578 0,682 0,610 0,704 QK4 0,013 0,191 0,660 0,502 0,498 0,727 UE1 0,029 0,223 0,881 1,193 0,885 1,543 US1 0,018 0,151 0,796 1,212 0,934 1,629 US2 0.016 0,176 0,773 0.731 0,514 0.886 Aritmtt.kakiarvo 0,033 0,198 0,758 0.809 0.647 1,061 QG2 SC/2 0,030 0,021 0,229 Kuollut Kuollut Kuollut QJ1 0,125 0,142 0,235 0,828 Kuollut Kuollut QY3 0,189 0,108 0,603 1,034 Kuollut Kuollut RG3 0,017 0,150 0,516 0,981 1,37 Kuollut TU4 0,031 0,042 0,235 0,495 0,135 0,121 UG1 0.018 0.243 0.507 1,388 Kuollut Kuollut Aritmtt.kskiarvo 0,068 0.118 0.388 0,945 0,752 0,121 HH5 vrtailu NT 0,041 0,042 0,403 Kuollut Kuollut HJ4 NT 0,015 0,062 0,561 NT 1,205 HG2 NT 0,030 0,059 0,744 0,743 Kuollut HI2 NT 0,007 0,048 0.298 0,514 1,225 Aritmtt.kskiarvo 0,023 0,053 0,501 0,629 1,215

21 a b2 annosta saavin kissojn nsimmäinn rokotus. 2 annosta saavin kissojn toinn rokotus ja yhdn annoksn saavin kissojn nsimmäinn rokotus. Tiittrit yksi viikko nnn tstausta. Absorboitumisarvot mitattu aallonpituudlla 405 nm. Arvot 300 ovat positiivisia. Ei tstattu.

Taulukko 9 ts-fip-virukslla intranasaalissti tttujn ja i-rokotttujn loinnin anti-fip-viruksn tissä 3 Kissan no Rokotusti/ rokotuksn no a -0 ja subkutaanissti roko- kissojn srumin viruksn nutravasta-aintiittrit thokkuusts- Vastaava viruksn nutralointitiittri viikkoa rokotuksn jälkn b 3 8 c 11 14 16 SU4 IN/1 <4 <8 64 30 20 20 TR3 <2 <8 256 120 120 40 TT2 <2 <8 96 1920 640 480 UN3 <2 <8 512 320 3840 1280 UO4 3 8 48 40 30 20 UX6 4 8 192 960 960 1920 Gomtrinn kskiarvo <2 <8 140 210 235 163 OH2 IN/2 <2 48 256 120 60 80 PQ4,42 96 512 120 60 60 QK4 <2 96 192 80 40 120 UE1 <2 128 768 1920 2560 2560 US1 <2 96 512 160 640 960 US2 <2 64 512 120 240 80 Gomtrinn kskiarvo <2 84 414 187 196 220 QG2 ' SC <2 G8 8 Kuollut Kuollut Kuollut QJ1 <2 <8 <8 1280 Kuollut Kuollut QY3 <2 <:8 128 640 Kuollut Kuollut RG3 24 8 64 1920 Kuollut Kuollut TU4 <2 <8 12 <20 20 <20 UG1 <2 12 32 640 Kuollut Kuollut Gomtrinn kskiarvo <2 <8 24 399 20 (20 d HH5 kontrolli NT NT <2 120 Kuollut Kuollut HJ4 NT NT <2 120 480 480 HG2 NT NT <2 960 Kuollut Kuollut HI2 NT NT <2 240 3480 640 Gomtrinn kskiarvo <2 240 1292 554

23 a b 2 annosta saavin kissojn nsimmäinn rokotus 2 annosta saavin kissojn toinn rokotus ja yhdn annok- sn saavin kissojn nsimmäinn rokotus c Tiittrit yksi viikko nnn tstausta d Ei tstattu Kksintö ja sn parhaina pidtyt totutusmuodot tulvat täydllissti siin dllä olvasta slostukssta ja simrkistä. Slostttujn mntlmin muunnlmat, jotka ovat pinläintn käyttöön tarkoitttujn rokottidn valmistustkniikkaan prhtynill ilmisiä, ovat mukana suraavin patnttivaatimustn piiriin kuuluvia.

24 Patnttivaatimukst 1. Mntlmä, jonka avulla voidaan valmistaa rokottta FIPvirusta vastaan, tunnttu siitä, ttä: 1) hiknntään FIP-virus käyttämällä usita krtoja sopivissa kissan soluissa, 2) saattaan hiknntty FIP-virus mutagnisn ainn, simrkiksi kmiallisn ainn tai sätilytyksn vaikutuksn alaisksi, 3) viljllään hiknntty vaihsta 2 saatua FIP-virusta, joka on lämpöhrkkää, ja 4) kootaan taltn hiknntty ts-fip-virus. 2. Patnttivaatimuksn 1 mukainn mntlmä, tunnttu siitä, ttä FIP-virus risttään virulntin FIP:n kanssa in-fktoidun kissan kudokssta tai limistä nnn hikntämistä. 3. Patnttivaatimuksn 1 mukainn mntlmä, tunnttu siitä, ttä FIP-virus hiknntään käyttämällä präkkäin ai-nakin noin 60 krtaa kissan munuaissoluissa. 4. Patnttivaatimuksn 1 mukainn mntlmä, tunnttu siitä, ttä FIP-virus thdään lämpöhrkåksi saattamalla usita krtoja soluissa käyttty FIP-virus mutagnisn ainn vaikutuksn alaisksi. 5. Patnttivaatimuksn 1 mukainn mntlmä, tunnttu siitä, ttä FIP-virus thdään lämpöhrkäksi antamalla ultra-violttivalon vaikuttaa usita krtoja soluissa käytttyyn FIP-viruksn 3-5 min ajan.

Patntkrav 25 1. Förfarand för framstållning av tt vaccin mot FIP-virus, känntcknat av att 1) FIP-virus försvagas gnom att passra dt flra gångr i lämpliga kattcllr, 2) dt försvagad FIP-virust omsätts md tt mutagniskt ämn, t.x. md tt kmiskt ämn llr strålning, 3) dt försvagad trmosnsitiva FIP-virust, som rhållits från stg 2, odlas, och 4) dt försvagad ts-fip-virust utvinns. 2. Förfarand nligt patntkrav 1, känntcknat av att för försvagning FIP-virust isolras md tt virulnt FIP från kattns, som har infktrats, vävnad llr organ. 3. Förfarand nligt patntkrav 1, känntcknat av att FIPvirust försvagas gnom att passra dt succssiv minst cirka 60 gångr i kattns njurcllr. 4. Förfarand nligt patntkrav 1, känntcknat av att FIP- virust görs trmosnsitiv gnom utsättning av FIP-virust, som passrats flra gångr i cllr, för tt mutagniskt ämn. 5. Förfarand nligt patntkrav 1, känntcknat av att FIPvirust görs trmosnsitiv gnom utsättning av FIP-virust, som passrats flra gångr i cllr, för ultraviolttljus för 3-5 minutr.