SUOMI FINLAND Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen KUULUTUSjULKAISU UTLÄGGNINGSSKRIFT 409_22 Kv. IkJlnt. Cl. A 61 k 3/60 Uc/KI. 30. 1;), 10 VII 1969 : Pat,3:it IrL3ddelat Patenffihakemus Patentansökning 2303/63 Hakemispäivä Ansökningsdag 25 XI 1963 Alkupäivä Giltighetsdag Tullut julkiseksi Blivit offentlig 1 VII 1968 Pantu nähtäväksi Utlagd 31 III 1969 Pyydetty etuoikeus Begänd prioritet 27 XI 1962 USA 240408 N.V. Philips' Gloeilampenfabrieken, Eindhoven, Hollanti-Holland. Keksijät-Uppfinnare: Eben Arthur Slater, 1, Lindenwood Lane, St. Joseph, Missouri, Carrell John Kucera, 12, Lindenwood Lane, St. Joseph, Missouri, USA Asianies-Ombud: Oft Kolster A/B Tapa valmistaa rokotetta Panleukopenia-viruksen aiheuttamaa, eläimissä esiintyvää tautia vastaan - Sätt att framställa ett vaccin mot av Panleukopenia-virus förorsakad sjukdom hos djur. Keksinnön kohteena on tapa valmistaa rokotetta Pianleukopenia- :viruksen aiheuttamaa, eläimissä, varsinkin kissoissa ja minkeissä esiintyvää tautia vastaan. Lukuisat tutkijat ovat yrittäneet, ilman menestystä, kehittää panleukopenia-virusta kudoskulttuurissa. Vakiomenetelmä, jota kaikki aikaisemmat tutkijat ovat käyttäneet, perustuu siihen, että käytetään panleukopenia-viruksesta vapaan kissan munuaisia kudoskulttuurissa, johon sitten istutetaan elinvoimaista virusta. Joistakin tuntemattomista syistä virus ei kasva kudoskulttuurissa, kun siemenvirus stirretään terveeseen kudoskulttuuriin. Koska panleukopenia-rokotteen kehtittämisellä olisi tärkeä kaupallinen merkitys, on lukuisia kokeita suoritet-
40922 tu yr:ktettäessä keksiä tyydyttävä menetelmä rokotteen valmistamiseksi. Tämän kysymyksen tutkimukset ovat osoittaneet, että kissansa on lukuisia viruksia, jotka helposti voidaan sekoittaa panleukopeniaan. On todettu, että panleukopenian siemenviruksen näytteet ovat saastuneet muilla viruksilla, jotka voivat lisääntyä kudoskulttuurissa, jolloin syntyy se harhavaikutelma, että viljellään panleukopeniavirusta. Vasta hyvin laajojen tutkimusten jälkeen keksittiin aivan odottamatta menetelmä lisätä panleukopeniaa kudoskulttuurissa, niin että saatiin rokote, joka menestyksellisesti immunoi kissoja tätä tautia vastaan. Lisäksi todettiin, että tätä rokotetta myös voidaan käyttää minkin rokottamiseksi vastaavanlaista tautia vastaan. Keksinnön eräänä tarkoituksena on näin ollen aikaansaada rokote panleukopeniaa vastaan. Keksinnön toisena kohteena on tapa viljellä panleukopeniavirusa kudoskulttuurissa. Keksinnölle on pääasiallisesti tunnusomaista se, että elinvoimaisella Panleukopenia-viruksella tartutettu kissankudos trypsiinikäsittelyn jälkeen yhdistetään elatusaineen kanssa kudosviljelyksi, että tästä viljelystä saatua virusta käytetään eläinheraa sisältävästä elatusaineesta sekä tartuntavapaasta kissankudoksesta saadun terveen kudosviljelyn tartuttamiseen, mikä suoritetaan vähintään kuusi kertaa, ja että viimeisestä kudosviljelystä saatua virusta käytetään 'eläinten rokottamiseen. Keksinnön mukaan ruiskutetaan panleukopenia-virusta Felidaesuvun terveeseen jäseneen, esim. kissaan, joka on altis panleukopenialle. Virukselle annetaan tilaisuus kasvaa, ja sen jälkeen kun eläimessä esiintyy taudin patologisia oireita, uhrataan eläin viruksen talteenottamiseksi. Tässä vaiheessa esiintyy keksinnön mukaisen menetelmän uutuus, verrattuna ennestään tunnettuun tekniikkaan. Panleukopenia-viruksella tartutetusta uhratusta eläimestä saatu kudos, sopivasti munu-
40922 aiskudos, poistetaan ja sijoitetaan esikäsittelyn jälkeen kudoskulttuuriin. Keksinnön menestymisen kannalta on tärkeätä, että virusta sisältävä kudos tulee kudosviljelyn osaksi. Munuaiskudosta ja virusta sisältävän kudoskulttuurin mikroskooppinen tutkimus osoittaa, että munuaissolut sopivan ajan kuluessa kehittyvät yksisolukerroksiksi.. Noin 2-10 sen jälkeen, kun kudoskulttuuri valmistettiin, otetaan kudoskulttuurin neste talteen, ja käytetään tätä nestettä uudelleen panleukopenia-viruksesta vapaasta kissasta saadussa munuaiskudoskulttuurissa. Talteenotetun viruksen kaikkia seuraavia sarjakäyttöjä varten voidaan tuore munuaiskudos saada terveistä kissoista, niinkuin edellä selitettiin. Jostain tuntemattomasta syystä on panleukopenia-viruksen kasvun ensin tapanduttava tartutetun eläimen kudoskulttuurissa, esim. munuaiskulttuurissa, minkä jälkeen virus voidaan siirtää muihin kudoskulttuureihin. Viruksesta voidaan valmistaa rokote siirtämällä tämä virus sarjassa peräkkäin vähintään noin 6 kertaa uuteen kudoskulttuuriin, tai sopivasti vähintään 10 kertaa kudoskulttuuriin, joka on valmistettu kissan munuaisista, ja tätä sarjasiirtoa voidaan soveltaa, kunnes virus ei enää kehitä antigeenejä, mikä voidaan todeta siten, että elinvoimaisella panleukopenia-viruksella tartutetaan eläin, joka on rokotettu tällä heikennetyllä viruksella. Yleensä suoritetaan enintään 250 sarjasiirtoa, ja taloudellisista syistä yleensä enintään 50. Sopivasti käytetään noin 10-30 sarjasiirtoa, ja rrikoisen hyvin noin 20-30. Suoritettaessa sarjasiirto noin viidennen kerran kissan munuaisista tehtyyn kudoskulttuuriin huo-
- 4 40922 Jaetaan, ett koe-elkiin jää oloon ponleukopetia-viruksella suoritetun tartuttamisen jälkeen, mutta että se reagoi suhteellisen vakavasti tähän tartuntaan. Tästä syystä on edullista heikentää virusta vielä enemmän, ennen kuin sitä käytetään rokotteen kissojen immunointiin. Keksinnön mukaisella tavalla valmistettu rokote soveltuu käytettäväksi Pelidaesuvun kaikkien lajien immunointiin. Niinpä tämän keksinnön mukaisella rokotteella voidaan suojata kotikissa, otselotti, tiikeri, leopardi, pantteri, jaguaari, jne. Rokotetta voidaan myös käyttää minkin immunointiin. Heikennettyä virusta valmistettaessa poistetaan panleukopenia-virusta sisältäv:j, kudos, yleensä munuaiskudos, kissasta aseptisissa olosuhteissa (munuaiskudosta käytettäessä poistetaan munuaista sisältävä kalvo ja otetaan talteen munuaiskuori). Saastuneet kudokset hienonnetaan ja trypsinoidaan menetelmällä, jonka on selittänyt J.S.Youngher, julkaisussa "Proc. Soo. Exptl. Biol. and Med. 85,202 (1954)". Tämän jälkeen solususpensio sentriugoidaan ja erottunut neste hyljätään. Solut suspendoidaan uudelleen eläinheraan, esim. vasikanheraan jäännöstrypsiinin saattamiseksi tehottomaksi, minkä jälkeen sentrifugoidaan uudelleen. Hera hyljätään ja yhteenkasautuneet solut suspendoidaan kasvuväliaineeseen. Lasvuväliaineena solujen viljelemiseksi voidaan käyttää esim. Parker'in 199, Karzon'in tai Earle'in viljelyväliaineita, joko käyttämällä lisäksi jotain antibioottista ainetta, esim. penisiliiniä, streptomysiiniä, jne., tai käyttämättä tällaisia lisäaineita. Noin yksi osa tartunnan saaneita soluja lisätään
- 5-40922 noin 200-400 osaan kasvuväliainetta. Kasvuväliaineena voidaan myös käyttää eläinheraa. Esimerkkeinä eläimistä, joista tätä heraa voidaan saada mainittakoon vasikka, hevonen, lammas, sika, kuttu, jne. Noin 7-15 %, sopivasti noin 10 % kasvuväliaineesta on eläinheraa. Solut ja virus idätetään lämpötilassa, joka on välillä noin 30 ja 37 0, sopivasti noin 36 O. Kasvuväliaine voidaan korvata uudella noin 24-60 tuntia solujen saastuttamisen jälkeen solujen ja viruksen kasvunopeuden lisäämiseksi. Ennen kuin uusi kasvuväliaine lisätään, voidaan ph säätää rajoihin noin 6,5-7,8. Noin 1,5 vuorokautta tämän jälkeen kasvuväliaine jälleen korvataan uudella, ja tällä kertaa pienennetään eläinheran määrää, niin että lopullinen konsentraatio on noin 3-7 %. Ensimmäisen sarjasiirron jäljellä olevan osan aikana voidaan kasvuväliaine korvata uudella joka kolmas - joka seitsemäs päivä, yhteensä noin 15-25 päivän aikana, laskettuna siitä ajankohdasta, jolloin viruksella tartutetun kudoksen viljely aloitettiin. Sen jälkeen kun virusta sisältävä neste on otettu talteen ensimmäisen sarjasiirron kulttuuriväliaineesta, siirretään se kulttuuriväliaineeseen, joka sisältää panleukopeniatartunnasta vapaan kissan kudosta. Niinkuin ensimmäisen sarjasiirron aikanakin lisätään virus edellä selitettyä kokoomusta olevaan kasvuväliaineeseen, paitsi että panleukopenia-taudista vapaasta kissasta saatu kudos pidetään noin 24-60 tuntia edellä selitetyssä itämislämpötilsssa. Tämän jälkeen kasvuväliaine ensin vaihdetaan 1-5 päivän kuluttua, minkä jälkeen jokaisen sarjasiirron aikana kasvuväliaine aina korvataan 3-7
6 40922 päivän kuluttua, jolloin jokaista sarjasiirtoa varten käytetään 6-20. Sarjasiirron pituus määrätään tartutetun kulttuuriväliaineen solujen degeneroitumisasteen perusteella, joten jokaisen sarjasiirron pituus voi vaihdella edellä selitetystä. Keksinnön mukaista rokotetta voidaan myös käyttää minkin suojaamiseksi enteriitus (suolitulehdus)-tartunnalta. Tässä tarkoituksessa voidaan heikennetty panleukopenia-virus sarjasiirtää edellä selitetyllä tavalla. Yleensä suoritetaan sarjasiirtoja vähintään noin 20 kertaa, tavallisesti vähintään 15 kertaa, ja voidaan käyttää jopa 60 kertaa tai enemmän. Rokote voidaan ruiskuttamalla tai ruokkimalla antaa enteriitukselle alttiille minkille ja noin 4-8 viikon vanhoille pennuille, jolloin annoksen suuruus on noin 10-1000 TOID 50, tavallisesti noin 100-300 TOID 50. Kissojen rokottamiseksi panleukopenia-tautia vastaan voi rokotteen määrä vaihdella rajoissa noin 10 - noin 1000 T0ID 50. (Kulloinkin käytettävät rajat määräytyvät taloudellisista näkökohdista ja näihin liittyvästä tehokkaasta immunoinnista). Annoksen suuruus on tavallisesti noin 100-300 TOID50. Kissat voidaan rokottaa milloin tahansa, alkaen vähintään 6-8 viikon ikäisistä mihinkä tahansa myöhempään ikään, jolloin ne vielä ovat alttiit tartunnalle. Jotta keksintö paremmin ymmärrettäisiin, esitetään seuraavassa eräitä erikoisesimerkkejä. Kaksi kotikissaa, jotka olivat herkkiä panleukopenia-taudille (mikä määrättiin serologisesti), tartutettiin ruiskuttamalla viruksella. Sen
- 7-40922 jälkeen kun kissoissa näkyi taudin selviä kliinisiä ja patologisia merkkejä, uhrattiin kissat kudoskulttuurin valmistamiseksi. Kissojen ikä oli noin 4 kuukautta. Seuraavassa taulukossa on esitetty päivittäiset lämpötilat ja valkosolujen lukumäärät, joista käytetään lyhennystä "vs1". Kissa A Taulukko 1. istutuksen jälkeen 2 3 4 5 6 7 8 9 lämpötila "0 39,4 39,2 38,9 39,7 38,9 39,3 39,4 40,5 vsl 16950 17750 13350 14400 12400 5850 1300 300 tapet4 tu Kissa B istutuksen 2 3 4 5 6 7 8 jälkeen, lämpötila '0 38,7 38,9 39,0 39,8 391.2 39,8 39,0 vel 11950 9350 7400 13850 2500 1700 550 9 tapettu Kumpikin kissa tapettiin natriumpentobarbitaaliruiskeella. Kumpaakin kissaa käsiteltiin erikseen, vaikkakin samalla tavalla, jotta voitaisiin todeta, oliko virus jotain erikoista luonnetta tai liittyikö se erikoisesti käytettyyn kissaan, tai perustuiko viruksen lisäys todella keksinnön mukaiseen menetelmään. Kummankin kissan munuaiset poistettiin aseptisissa olosuhteissa. Kissojen muita elimiä tutkimalla todettiin, että molemmat kissat kärsivät panleukopenia-tartunnasta. Kliiniset oireet ja kuolemanjälkeiset näytteet vastasivat niitä, jotka Hammon ja Endens ovat selittäneet julkaisussa "J. Exptl. Medt 62,327 (1939). Jokaista munuaista ympäröivä kalvo
- 8 40922 poistettiin, munuaiskuorikudokset otettiin talteen ja hiennonnettiin ja trypsinoitiin soveltamalla Youngher'in edellä selitettyä menetelmää. Solususpensio sentrifugoitiin nopeudella 600 kierr/min, ja jäännösneste hyljättiin. Solut suspendoitiin uudelleen 15 millilitraan vasikanheraa jäljellä olevan trypsiinin vaikuttamisen hävittämiseksi, ennen kuin sentrifugoitiin uudelleen, niinkuin edellä on selitetty. Hera hyljättiin ja kokoonkasautuneet solut suspendoitiin kasvuväliaineeseen suhteessa 1 osa tiivistettyjä soluja 250 osaan kasvuväliainetta. Kasvuväliaineena oli Earle'in suolaliuos, johon lisättiin 0,5 % laktalbumiini-hydrolysaattia ja 10 % vasikanheraa. Kudoskulttuurisuspensio si4oitettiin vakiomittaisiin kudoskulttuuriputkiin, 1 ml jokaiseen putkeen, Putket idä- + tettiin pystyasennossa lämpötilassa 36,5-0,5 0. 48 tunnin kuluttua useimmat solut olivat tarttuneet lasiin ja osoittivat kasvun oireita. Vanha kasvuväliaine hyljättiin ja korvattiin uudella kasvuväliaineella, joka oli samaa kuin aluksi käytettiin. Ennen kuin uusi kasvuväliaine lisättiin, säädettiin ph arvoon noin 7,4. Kudoskulttuurit pidettiin tässä tilassa viisi viljelyksen aloittamisesta. Tällöin ph oli laskenut arvoon noin 6,8. Vanha väliaine korvattiin jälleen uudella kasvuväliaineella, jolla oli sama kokoomus kuin alkuperäisellä, paitsi että uuden kasvuväliaineen herapitoisuus vähennettiin arvosta 10 % arvoon 5% vasikanheraa. Sarjasiirron jäljellä olevan osan aikana kasvuväliaine korvattiin uudella väliaineella 5 päivän välein. Sarjasiirron tässä osassa oli ph laskenut arvoon noin 6,8. Kasvuväliaineen vaihtoa jatkettiin 18-20
. 9. 40922 viruksen istuttamisen jälkeen. Kulttuurien nestefaasit poistettiin ja otettiin talteen. Tätä nestettä käytettiin tartunmalle alttiiden kissojen tartuttamiseksi viruksen mandollisen tehokkuuden määräämiseksi. 1 ml nestettä molemmista niistä kudoskulttuureista, jotka eri sarjasiirtojen yhteydessä saatiin kissoista A ja B, istutettiin tartunnalle alttiisiin kissoihin vaikuttksen määräämiseksi, mikäli vaikutusta esiintyi. Seuraavassa taulukossa 2 kirjaimet A tai B ilmaisetat, että virus saatiin kissasta A tai B; kirjaimen jälkeinen numero tarkoittaa sen koe-eläimen numeroa, johon koottu neste ruiskutettiin. Kissa A-1 Taulukko 2. Päivää _. 2 3 4 5 6 7 8 lämpöt,'c 39,0 38,6 39,2 39,0 40,6 40,7 kuollut vai 13800 13100 9300 3350 950 850 Kissa A-2 Päivää 2 3 4 5 6 7 8 lämpötila 39,1 38,6 38,7 39,2 40,0 40,4 39,4 vsl 13450 13300 6650 16650 900 450 1000 tapettu Kissa B- 1 Päivää 2 3 4 5 6 7 8 lämpötila 39,1 39,0 38,7 3 8,9 39, 6 39,6 tapettu vsl 11700 18500 14400 13450 9700 900 Kissa B- 2 Päivää 2 3 4 5 6 7 8 lämpötila 38,7 39,0 38,9 39,7 40,4 40,6 kuollut vsl 17750 16950 13850 9350 2500 350 Taulukossa 2 esitetyt 4 kissaa saivat ruiskutuksen jälkeen selvän kuumeen, ja niiden vsl pieneni sangen huomatta-
40922 vaati. Kaksi kissaa ]ydettiin kuolleina kandeksantena päivänä viruksen istutuksen jälkeen, kun taas molemmat muut kissat tapettiin kuolemaisillaan olevina. Näissä neljässä kissassa todetut oireet olivat käytännöllisesti katsoen samanlaiset kuin kissoissa A ja B todetut oireet, mikä vahvistaa sen, että kissat olivat sairastuneet panleukopeniaan. Ensimmäisestä kudoskulttuurista talteenotettu neste käytettiin toisen sarjasiirron tuoreen kudoskulttuuriväliaineen istuttamiseksi, mikä valmistettiin käyttämällä tavallisen terveen kissan munuaisia. Kudoskulttuuria näiden kissojen munuaisista valmistettaessa meneteltiin samalla tavalla kuin selitettiin viruksella istutettujen kissojen A ja B munuaisten käsittelyn yhteydessä. Neste, joka oli otettu talteen ensimmäisen kudoskulttuurin sarjasiirrosta, lisättiin solususpensioon, joka oli valmistettu terveen kissan munuaiststa,jolloin konsentraatio oli 1 ml koottua nestettä solususpension 10 ml kohden.,solut sijoitettiin putkiin, 1 ml/putki, j:a idä- C - + tettiin lämpötilassa 36,5 0,5 0. 48 tunnin kuluttua kasvuväliaine korvattiin tuoreella kasvuväliaineella, jolla oli sama kokoomus kuin alkuperäisellä. Viidennen päivän päättyessä ilmestyi täysi soluvaippa, ja kasvuväliaine korvattiin jälleen tuoreella väliaineella, paitsi että vasikanheran konsentraatio pienennettiin arvoon 5 %. Tämän jälkeen kasvuväliaine korvattiin 4-5 päivän väliajoin. Viidennentoista päivän lopussa solut olivat huonossa tilassa, mikä pakotti nesteen keräämiseen käytettäväksi seuraavan sarjasiirron tuoreessa kudoskulttuurissa.
40922 Kolmatta sarjasiirtoa varten saatiin terveen kissan munuaiset edellä toisen sarjasiirron yhteydessä selitotyllä tavalla, ja solususpensio valmistettiin samaa menetelmää soveltaen. Sen sijaan että olisi odotettu 15 nesteen ottamiseksi talteen, kerättiin neste jo seitsemännen päivän lopussa. Kaikissa seuraavissa sarjasiirroissa toistettiin sama menettely, kunnes viruksella oli suoritettu kaikkiaan '16 sarjasiirtoa. Tämän jälkeen panleukopenialle alttiit terveet kotikissat tartutettiin, jotta saataisiin selville mikä vaikutus tällä heikennetyllä viruksella oli kissoihin, mikäli vaikutusta oli havaittavissa. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 3. Kissa A.-3 Taulukko 3. (kolmas virusa te) Päivää 2 3 4 5 6 7 8 9 lämpötila 39,3 39,6 39,5 39,7 38,6 40,2 41,2 39,4 vsl 17550 8000 7500 8300 3300 1800 950 7600 Päivää 10 11 lämpötila 39,4 38,4 Sairastunut - lämpötila ja vsl jäivät vsl 9000 11100 normaaleiksi Kissa B- 3 Päivää 2 3 4 5 6 7 8 9 lämpötila 38,3 39,6 38,9 39,2 40,1 41,4 41,3 41,3 vsl 18050 6100 5250 9000 2150 2200 4450 21400 Päivää 19 11 lämpötila 40,0 39,5 vsl 17100 13300 kuollut
- 12 4. 40922 Kissa B-4 Päivää lämpötila vsl 2 37,8 13050 3 38,9 9150 4 5 6 7 8 9 38,7 38,6 38,6 38,6 38,9 39,4 10150 5500 4150 5100 3050 5250 Päivää lämpötila vsl 10 39,1 8950 11 39,1 15550 12 13 14 15 39,1 38,1 38,5 38,0 sairastunut 32000 25100 20150 15950 normaali Kissa Bum5 lämpötila vsl 2 38,3 11950 3 38,9 9050 4 5 6 7 8 9 39,0 39,1 40,2 38,3 38,6 38,5 7250 7100 1300 6850 6850 10200 lämpötila vsl 10 38,6 10850 11 37,8 15900 12 13 14 15 16 38,4 38,3 38,7 38,6 38,7 sair. 22250 33800 30900 3450 20300 norm. Kissa B-6 (neljäs virusaste) lämpötila 781 2 39, 8 20500 3 39,1 5050 4 5 6 7 8 9 38,9 38,3 39,1 40,6 40,4 37,7 9800 15800 1000 1400 2800 9700 lämpötila vsl Kissa A-4 10 40,5 24000 11 39,1 13450 12 ilman lämpöä (viides virusaste) vsl 1 39,2 23900 2 39,8 10500 3 4 5 6 7 39,7 39,2 38,5 39,0 39,8 8600 6500 3450 2700 2100 vsl 8 40,0 3500 9 39,1 10250 10 38,3 sair. norm. 14700 Kissa A-5 vsl 1 38,4 12000 2 39,2 7900 3 4 5 6 7 8 sair. 39,2 38,5 38,5 38,5 38,4 38,5 norm. 8300 6400 6050 7450 8850 12000
- 13-40922 Taulukosta 3 nähdään, että ensimmäisen, toisen ja aina viidennen sarjasiirron yhteydessä saatu virus aiheutti vakavia reaktioita kaikissa kotikissoissa, joihin tätä virusta oli istutettu. Huomataan myös, että viidennen sarjasiirron jälkeen voitiin kissoja A-4 jaa-5tartuttaa elinvoimaisella panleukopenia-viruksella kuolemaa aiheuttamatta. Näiden kissojen A-4 ja A- 5 vsl-luvuista nähdään, että kissojen reaktio yhä oli jonkin verran vakava. kisooje.tariltattiin Muita panleukopenia-tartunnalle alttiita terve:_tä on esitetty taulukossa 4. Kissa 375 kymmenennen sarjasiirron viruksella. Tulokset Taulukko 4. 0 5 6 7 8 9 10 11 12 --- 38,3 37,9 38,2 38,2 38,1 38,2 37,2 38,3 vsl 16700 10800 8950 9800 9200 21900 15950 18500 16100 Kissa 376 --- 39,0 38,3 38,7 38,7 39,2 38,0 38,3 38,7 vsl 35400 18400 10950 17750 24100 28550 22900 24000 20600 Kissa 377 40,1 3812 39,0 39,1 38,7 3711 37,2 39,1 vsl 18000 11950 201 00 14600 35400 36850 30400 30500 27100 Kissa 378 39,0 38,6 39,3 39,1 38,9 38,3 38,2 39,3 vsl 32900 24100 14600 10950 13400 17850 19050 18500 10200 Kissa 379 --- 38,1 38,1 38,2 38,7 38,5 38,9 38,1 38,7 vsl 13900 6250 6200 5800 9300 3900 8500 14100 15600 Kissa 380 39,2 38,9 39,2 38,4 38,7 39,3 vsl 14800 --- 14600 20950 36450 23950 25050 14600 Kissa 381 39,3 39,0 39,1 38,5 38,4 38,9 vsl 19600 --- 20100 22950 23100 28150 26250 26250 Kissa 382 vsl 12450 --- --- 38,9-11950 38,6 13250 39,0 28050 38,3 21900 38,, 20550 38,9 19550
-14-40922 Taulukosta 4 nähhän, että viruksen istuttaminen kotikissoihin kymmenennestä sarjasiirrosta ei aiheuttanut mitään reaktiota tai aiheutti vain suhteellisen lievän reaktion. Kaikkiin taulukossa 4 lueteltuihin kissoihin yritettiin tartuttaa elinvoimaista panleukopenia-virusta ilman mitään osoitusta haitallisesta vaikutuksesta. Vertailun vuoksi tartutettiin elinvoimaisella viruksella muita kissoja, jotka kuuluivat samoihin pentueisiin kuin taulukossa 4 esitetyt kissat. Näiden kokeiden tulokset on esitetty taulukossa 5. Taulukko 5. (Vertailukissat.) Virus tartutetusta kissanpernasta. Kissa 359 0 5 6 7 8 9 10 ist. jälk. lämpötila -- 39,2 39,0 39,0 40,1 kuollut vsl 11400 5750 6450 7500 450 Kissa 360 lämpötila -- 39,0 39,0 40,6 39,8 kuollut vsl 21650 16600 20450 17150 3850 Kissa 361 lämpötila -- 39,2 39,3 35,5 kuollut vsl 14350 12600 13550 200 11 12 Kissa 362 lämpötila -- 38,9 38,9 38,3 39,0 38,4 38,4 38,5 38,7 vsl 10200 12750 9000 6700 3750 8100 4500 7350 6800 jäi eloon Kissa 363 lämpötila -- 4e vsl 14050 effini cm* 41,5 850 41,2 700 40,3 2850 40,5 kuol. 7250 Kissa 364 lämpötila --.- 39,3 39,1 kuollut vsl 17150 -- -- 23550 1150
- 15-40922 Taulukko 5 (jatk.) Kissa 365 0 5 6 7 8 9 10 11 12 lämpötila --...... -- 39,4 40,1 38,9 38,3 38,4 vei 12500 ~Immo -- ''"" 15150 18200 20550 15500 2700 jäi eloon Kissa 366 lämpötila --. o... erom. 38,9 40,5 41,2 38,3 38,5 0.0. I 1 vei 13050 -- 3050 900 3300 6300 10350 jäi eloon Tästä taulukosta nähdään, että puolet niistä kissoista, jotka tartutettiin elinvoimaisella panleukopenia-viruksella, kuolivat, ja että kaikissa niissä esiintyi tyypillisen panleukopenia-taudin vakavia reaktioita. Vaikka edellisissä esimerkeissä on käytetty munuaiskudoksia, niin voidaan samanlaisia tuloksia saada käyttämällä sisälmys-, kitarisa-, kives-, sydän- ja muita tämänkaltaisia kudoksia. keuhko-, maksa-, perna-,
40922 Patenttivaatimukset: 1. Tapa valmistaa uutta rokotetta. Panleukopenia-viruksen aiheuttamaa, eläimissä, varsinkin kissoissa ja minkeissä esiintyvää tautia vastaan, tunnettu siitä, että elinvoimaisella Panleukopenia-viruksella tartutettu kissankudos trypsiinikäsittelyn jälkeen yhdistetään elatusaineen kanssa kudosviljelyksi, että tästä viljelystä saatua virusta käytetään eläinheraa sisältävästä elatusaineesta sekä tartuntavapaasta kissankudoksesta saadun terveen kudosviljelyn tartuttamiseen, mikä suoritetaan vähintään kuusi kertaa, ja että viimeisestä kudosviljelystä saatua virus t a käytetään eläinten rokottamiseen. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tapa, tunnettu siitä, että virus siirretään sarjassa noin 10-30 kertaa kissan kudoksen kudosviljelyn kautta. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen tapa, tunnettu siitä, että kissan kudoksena on kissasta saatu munuaiskudos. 4. Jonkin edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen tapa, tunnettu siitä, että elatusaine jokaisessa kudosviljelyssä uudistetaan vähintään kuusi kertaa, ja että jokainen kudosviljely uusitaan, kun soluissa näkyy selviä degeneroitumisen oireita.
17 Patentkrav: 40922 1. Sätt att framstäila ett nytt vaccin mot av Panleukopeniavirus förorsakad sjukdom hos djur, i synnerhet hos katter och minkar, k ä n n e t e c k n a t därav, att med levande Panleukopeniavirus infekterad kattvävnad efter en trypsinbehandling kombineras med ett näringsmedium till en vävnadskultur, att det från denna kultur erhållna virus utnyttjas för ympning av en färsk vävnadskultur erhållen av ett djurserum innehållande näringsmedium och en ej infekterad kattvävnad, vilket upprepas minst sex gånger, och att viruset från den sista vävnadskulturen utvinnes för vaccinering av djur. 2. Sätt enligt patentkravet 1,kännetecknat därav, att viru et i serieföljd föres 10 till 30 gånger genom vävnadskulturer av kattvävnad. 3. Sätt enligt patentkravet 1 eller 2,kännetecknat därav, att som kattvävnad användes kattnjurar. 4. Sätt enligt ett eller flera av de föregående patentkraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att näringsmediet förnyas minst 6 ~- ger 1. varje kultur och att varje vävnadskultur förnyas när cellerna uppvisa märkbar dngeneration. Viitejulkaisuja-Anförda publikationer