Mikroskooppisten preparaattien valmistus Valomikroskopia Parafiinitekniikka 1. fikseeraus: tappaa, kovettaa, säilyttää rakenteen (alkoholi, formaldehydi, etikkahappo) 2. veden poisto: alkoholisarja 70 % absoluuttinen ksyleeni 3. imeyttäminen parafiiniin (+65 C) 4. valu parafiiniblokkiin 5. leikkaus mikrotomilla 6. kiinnitys objektilasille 7. parafiinin poisto: ksyleeni alkoholi 8. värjäys Valomikroskopia 2 Parafiinileikkeiden leikkaaminen parafiini voidaan korvata muovilla denaturaatio: entsyymit eivät toimi leikkeessä jääleiketekniikka - kudos jäädytetään metallilieriöön nestetypen (-193 C) avulla -leikkaus kryostaattimikrotomilla (-20 30 C) -värjäys substraatti (entsyymit toimivat), taustaväri entsyymien histokemiallinen osoittaminen EM-näyte hilalla Muita preparaattien valmistusmenetelmiä 3 mm Ohuet leikkeet (50-100 nm) otetaan kuparihilalle (ø 2-3 mm) (100 mesh reikäkoko) värjäys Sivelypreparaatti esim. veripisara levitys objektilasille fikseeraus kuivaamalla, alkoholilla Murskepreparaatti (squash) näyte obj.lasille painetaan peitinlasilla murskaksi imeytys EtOH (60-70 %) värjäys TUTKIMUSMENETELMIÄ 1
Värjäysmenetelmät Värjäysmenetelmät 2 Parafiinileikkeet värjäämätön leike ei yleensä erotu valomikroskoopissa (ei absorptioeroja) faasikontrasti-, interferenssimikroskoopissa ilman värjäystä biologiset väriaineet orgaanisia molekyylejä molekyyli sisältää: kromoforin (= värin kantaja) auksokromin (kiinnittää värin soluun, määrää vain kiinnittymiskohteen) auksokromi esim. COO - + H + karboksyyliryhmä on hapan kiinnittyy emäksisiin molekyyleihin (esim. tumassa) väri syntyy valkoisen valon eri aallonpituuksien erilaisesta absorboitumisesta solun eri osien välillä Värjäysmenetelmät 3 EM-värjäys perustuu elektronien erilaiseen absorboitumiseen näytteen eri osissa epäorgaaninen komponentti värissä väriaineet: fikseeraus OsO 4 jo värjää lyijysitraatti uranyyliasetaatti Histokemia Entsyymien histokemia entsyymejä tuhansia, joista 60 voidaan osoittaa histokemiallisesti keinotekoinen entsyymi värin substraatti esiaste epäorg. suola + diatsosuola VÄRI + värin esiaste Histokemia 1 Histokemia 2 Kyyhkyn (40 vrk) rintalihaksen sukkinaattidehydrogenaasin, aktiivisuus 1.25x10 (Ahti Pyörnilä) Rotan m. soleuksen ATPaasiaktiivisuus, ph 10.4, 10x40x0.8 (Ahti Pyörnilä) TUTKIMUSMENETELMIÄ 2
Histokemia 3 Histokemia 4 Viiriäisen m. supracoracoideus, fosforylaasi-aktiivisuus, 0.8x40 (Ahti Pyörnilä) Rotta m. soleus ATPaasi, ph 4.6, 10x40x0.8 (Ahti Pyörnilä) Histokemia 5 Varpusen m. pectoralis SDH, 0.8x40 (Ahti Pyörnilä) Immunohistokemia kaniin injisoidaan tutkittavaa makromolekyyliä (proteiini, glykoproteiini) toimii antigeenina valkosolut tuottavat vasta-ainetta (antibody) vereen suora histokemiallinen värjäys: vasta-aine eristetään ja merkitään - esim. fluoreskeiini fluoresenssimikroskopia Immunohistokemia 2 - peroksidaasi histokemiall. osoitus - kolloidinen kulta, ferritiini EM epäsuora immunokemiallinen värjäys: prim. vasta-ainetta ei merkitä, vaan sille kehitetään oma vasta-aine (esim. lampaassa tai vuohessa; ns. antikaniini-igg) - anti-kaniini-igg merkitään kuten edellä - etu: voidaan paikantaa mikä tahansa kanissa kehitetty vasta-aine Spesifisen proteiinin lokalisointi EM:n avulla Peroxisomes Leikkeessä näkyy kultasaostuma TUTKIMUSMENETELMIÄ 3
Lokalisointi 2 Autoradiografia Antibody reagoi ensin spesifisen antigeenin kanssa (esim. katalaasi) Sitten leike käsitellään proteiini A kompleksilla, joka saadaan esim. bakteerista (Staphylococcus aureus), ja kultapartikkeleilla Sidotaan antibodyn FCdomainiin Saadaan näkymään EM:ssä molekyylin kulku ja reaktiot solussa kudokselle, leikkeelle, soluviljelmälle tms. annetaan lähtöainetta, jonka jokin atomi on vaihdettu radioaktiiviseksi isotoopikseen esim. 3 H tritium, 14 C radiohiili, 32 P jne. tutkittavaa ainetta annetaan näytteelle lyhyen ajan pulssi Autoradiografia 2 Autoradiografia 3 merkattu kuuma molekyyli käyttäytyy solussa kuten normaali kylmä molekyyli voidaan paikantaa radioaktiivisuuden perusteella leike tms. (yl. lasilla) kastetaan filmiemulsioon radioaktiivinen säteily valottaa filmin (yl. kestää päiviä tai viikkoja) radioakt. solut ja solun osat näkyvät tummina pisteinä (AgBr-kiteet) yleensä lisäksi normaali histologinen värjäys esim. halutaan tutkia DNAsynteesiä: käytetään 3 H-tymidiiniä paikantaminen AgBr-kiteiden määrä osoittaa DNAsynteesin aktiivisuuden! Soluviljely Soluviljely 2 1885 Roux osoitti, että kanan alkion soluja voidaan elättää liuoksessa putkissa, maljoissa = in vitro organismissa itsessään = in vivo monet solun ominaisuudet säilyvät, esim. - fibroblastit erittävät kollageenia - lihassolut liittyvät yhteen lihas, supistukset - hermosolut kasvattavat haarakkeita primaariviljelmä: suoraan kudoksissa sekundaariviljelmä: aliviljelmät edellisestä yleensä voidaan viljellä ohuita suikaleita (eksplantteja); keskusta kuolee usein solut kiinni viljelymaljan pohjaan, vain syöpäsolut voivat kasvaa vapaana suspensiona TUTKIMUSMENETELMIÄ 4
Soluviljely 3 kasvualustat spesifisiä aluksi plasmahyytymissä, 1970-luvulla keinotekoiset alustat, kasvutekijät (esim. NGF = nerve growth factor) tavallisesti solulinja kuolee rajallisen jakautumismäärän jälkeen (tiheysinhibiitio) on tuotettu useita solulinjoja, jotka jakautuvat loputtomasti Soluviljely 4 yleensä kasvainperäisiä esim. HeLa-solulinja (ihmisen epiteeli), 3T3 (hiiren fibroblasti jne. soluviljelyn etuna mm. solujen homogeenisuus soluja voidaan edelleen lisätä kloonaamalla kantasolut identtiset solut Henrietta Lacks - 31-vuotias kohdunkaulasyöpäpotilas v. 1951 - v. 1955 kloonattu solulinja (sitkeä, kasvaa myös suspensioviljelmissä Soluviljely 5 Soluviljely 6 periaatteessa mikä tahansa solu voidaan saada jakautumaan loputtomasti ns. neoplastisella transformaatiolla aiheutetaan yl. viruksella, esim. Rousin sarkooma -virus soluhybridisaatio, esim. hiiren kasvainsolu + virus, PEG ihmisen fibroblasti ns. heterokaryon mitoosit hybridisoluja hybridilinjat menettävät usein kromosomeja (syy tuntematon) etu: geenejä voidaan paikantaa kromosomeihin hybridoimalla yksittäisiä lymfosyyttejä voidaan tuottaa tarkkoja vasta-aineita lähes rajattomasti monoklonaaliset vasta-aineet - käytetään histokemiassa Solujen, soluorganellien ja makromolekyylien jaottelu Jaottelutaulukko soluosien jaottelu ultrasentrifuugilla kiihtyvyys (keskipakovoima) jopa 100 000 g (1 g = n. 980 cm/s 2 ) aluksi kudoksen homogenointi Jaottelu- eli differentiaalisentrifugaatio erottelu perustuu sentrifugaatiovoimaan ja aikaan partikkelin koko määräävä (ks. taulukko) g/aika 1000/5-20 min 10 000/20 min 100 000/1-2 h sytosoli (liuos) sakan sisältö kokonaiset solut, tumat mitokondriot, lysosomit vapaat ribosomit, mikrosomit (molekyylikoon hiukkaset) TUTKIMUSMENETELMIÄ 5
Sakkaroosigradientti Sample is layered on top of gradient Swing-out sentrifugointi Larger particle Smaller particle Centrifuge Centrifugal force Particles settle according to mass Sucrose gradient Homogenointi Sentrifugointi 1 600 rpm Tube is moved slowly up and down as pestle rotates Teflon pestle Tissue-sucrose homogenate Extract Supernatant 1 Pellet 1 Unbroken cells, nuclei, cytoskeletons Low speed centrufugatio 1000g x 10 min Sentrifugointi 2 Sentrifugointi 3 Supernatant 2 Pellet 2 Medium speed centrifugation 15 000 g x 20 min. Supernatant 3 Soluble fraction of sytoplasm (cytosol) Pellet 3 High speed centrifugation 100 000 g x 60 min Mitochondria, lysosomes, and microbodies Microsomes, consisting of smooth and rough endoplasmic reticulum, Golgi, small vesicles TUTKIMUSMENETELMIÄ 6
Sentrifugointi 4 Tiheysgradienttien muodostaminen Supernatant 4 Pellet 4 Ribosomes, viruses, macromolecular complexes Very high speed centrifugation 150 000 g x 3 hrs Tiheysgradientti-sentrifugaatio sentrifugiputkeen raskaan suolan (esim. CsCl, cesiumkloridi) tai keinotekoisten partikkelien väkevä liuos partikkelit asettuvat ajon aikana putken pohjaa kohti ominaispainoa vastaaviin väkevöityihin vyöhykkeisiin perustuu siis partikkelien tiheyteen gradientti voidaan muodostaa myös etukäteen esim. kerrostamalla erivahvuisia sakkaroosiliuoksia Gradientin muodostaminen Fraktionti tiheysgradientin mukaan Collect fractions and do assay Hole Increasing mass of particles Makromolekyylien analysointi yl. proteiinit, nukleiinihapot Röntgendiffraktio aallonpituus n. 0,1 nm erinomainen resoluutio soveltuu kiteisiin, eristettyjen makromolekyylien tutkimiseen (esim. virukset) yksittäisten atomien sijainti molekyylissä erittäin aikaa vievä metodi Röntgensädekristallografia Perutz & Kendrew 1950- luvulla Voidaan määrittää proteiinien kolmiulotteisia rakenteita Nykyisin tunnetaan yli 8000 proteiinin 3D-rakenne λ = 0.1-0.2 nm, atomit erottuvat proteiinikiteestä Proteeinikiteen atomit lähettävät x-säteitä Siroava säteily detektorille tai filmille TUTKIMUSMENETELMIÄ 7
Elektroforeesi Elektroforeesi (+kromatografia) perustuu molekyylien liikkumiseen sähkökentässä molekyylien koko, varaus ja väliaine vaikuttavat kulkeutumiseen paperielektroforeesi: RNA selluloosa-asetaattikalvo (veren valk.aineet) SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) erottelee aina 10 ng:aan asti Molekyylibiologisia menetelmiä Sekvensointi ja yhdistelmä-dna-tekniikka sekvensointi: proteiinien aminohappojärj. ja nukleiinihappojen emäsjärj. määritys tietoa molekyylien osuudesta solun tapahtumissa DNA:n hybridisaatio-tekniikat: Southern blotting DNA-fragmentit Northern blotting RNA Western blotting (immunoblotting) proteiinit Southern blottaus Northern blottaus määritys tehdään us. solun kokonais RNA:na denaturointi esim. formaldehydilla estää vetysidosten muodostumisen emäsparien välille näin kaikki RNA on lineaarista, kiertymätöntä eristys koon mukaan geelielektroforeesilla siirretään nitroselluloosasuodattimelle käsitellään merkatulla RNA probilla, autoradiografiaan Tekniikka, jolla havaitaan tietty DNA-sekvenssi geelielektroforeesin jälkeen. Vastaavalla tekniikalla löydetään RNA-sekvenssi (Northern blotting) Valitun DNA-segmentin monistaminen koeputkessa polymeraasi ketjureaktiolla Step 1 1. DNA kaksoisketju avataan kuumentamalla (95ºC), jäähdytetään 60ºC:seen 2. Lisätään primeri 1 ja 2 Step 2 3. DNA-oligonukleotidit antavat primerien hybridisoitua DNA:n komplementaariseksi sekvenssiksi (cdna) molemmissa ketjuissa Step 3 4. Lisätään DNA polymeraasi (Taq) 5. Lisätään deoksiribonukleosidi trifosfaatit: datp, dgtp, dctp, dttp) 6. DNA syntetisoidaan alkaen primerista TUTKIMUSMENETELMIÄ 8
DNA-monistuksen vaiheet Tuotteen fraktiointi PCR:n käyttö genomin kloonin saamiseksi. 1. Kromosomaalinen DNA puhdistetaan 2. Primeri lisätään 3. Useita PCR-syklejä 4. Vain DNA:ta monistetaan selektiivisesti vain puhdasta kromosomaalista DNA:ta saaliina cdna-kloonauksessa 1. RNA:n puhdistaminen 2. Lisätään primeri 3. Käänteistranskriptaasi 4. Lisätään kakkosprimeri 5. Yksijuosteinen DNA monistuu monen PCR-syklin avulla Molemmissa tapauksissa nukleotidin sekvenssi pitää ainakin osittain tuntea etukäteen. PCR jatkuu Erottelu geelielektroforeesilla 7. Sykli aloitetaan uudelleen. Kuumennus 95ºC:seen, jäähdytys 60ºC:seen 8. Äsken syntetisoitu toimii uuden templaattina jne. TUTKIMUSMENETELMIÄ 9
Solubiologia (eläintieteen osuus) cdna:n synteesi 1. kokonais-rna eristetään ja puhdistetaan 2. Valmistetaan DNA:n kopio mrna:sta TUTKIMUSMENETELMIÄ Geeninsiirto geeninsiirto: 1. eristetään DNA solusta 2. pilkotaan restriktioentsyymillä 3. DNA:n eristäminen elektroforeettisesti 4. plasmidin aukaiseminen restriktioentsyymillä 5. halutut DNA:n palaset aukaistuun plasmidiin (tarttuvat vapaisiin emäsryhmiin) 6. plasmidin siirto bakteeriin 10
Geenisiru (gene chip) Geenilastu eli DNA-siru (aiemmin piialustalla) (DNA-microarray) Käytössä USA:ssa 1990-luvun puolivälissä Siru on leikelasi (25 mm x 75 mm), johon voidaan pieninä pisaroina sijoittaa jopa 10 000 geenin dna-pätkää noin 150 µm etäisyydelle toisistaan. Pisara vastaa siis yhtä geeniä. TUTKIMUSMENETELMIÄ 11
Geenisiru 2 Tämän geenipisaran päälle pudotetaan sitten tutkittavia näytteitä, ja syntyvästä reaktiosta tehdään johtopäätöksiä. Edeltää kymmenien tuhansien geenien monistaminen DNA (sis. komennon, mitä tehdään) mrna (tieto siirtyy lähettirna:lle Geenisiru 3 Laitteet Robotti ja siihen yhdistetty pienen pieni nestettä siirtävä teräskynä Lasertekniikkaan perustuva lukija. Tulosten analysointi vaatii lisäksi huomattavaa laskentakapasiteettia proteiini (valmiste l. tuote) Oivallus: mrna voidaan koodata takaisin cdna:ksi, jota otetaan sirulle Geenisiru 4 Varsinainen tutkittava näyte ja referenssinäyte Tutkittava näyte esim. syöpäsolu ja referenssinäyte normaalisolu. Toinen näytteistä värjätään fluorisoivalla värillä vihreäksi ja toinen punaiseksi. Sirulle lisätään molempia näytteitä ja annetaan niiden reagoida sirulle kiinnitettyjen geenien kanssa. Geenisiru 5 Osa pisaroista muuttuu punaisiksi ja osa vihreiksi Värien perusteella voidaan päätellä, onko geenin aktiivisuus näytteen vaikutuksesta lisääntynyt tai vähentynyt. Jos jokin geeni esimerkiksi on hyvin aktiivinen syöpäsolussa, voidaan tutkia, mikä tämän geenin merkitys on syövän puhkeamiselle. Geenisiru 6 Sirutekniikan avulla voidaan myös tutkia geenien vuorovaikutuksia - geenien välisiä viestintäreittejä ja verkkoja. - yhteyksien syy-seuraus -suhteita Matemaattinen mallintaminen (bioinformatiikka) TUTKIMUSMENETELMIÄ 12