Valomikroskopia. Mikroskooppisten preparaattien valmistus. Valomikroskopia 2. Parafiinileikkeiden leikkaaminen

Transkriptio

1 Valomikroskopia Mikroskooppisten preparaattien valmistus Parafiinitekniikka 1. fikseeraus: tappaa, kovettaa, säilyttää rakenteen (alkoholi, formaldehydi, etikkahappo) 2. veden poisto: alkoholisarja 70 % absoluuttinen ksyleeni 3. imeyttäminen parafiiniin (+65 C) 4. valu parafiiniblokkiin 5. leikkaus mikrotomilla 6. kiinnitys objektilasille 7. parafiinin poisto: ksyleeni alkoholi 8. värjäys Valomikroskopia 2 Parafiinileikkeiden leikkaaminen parafiini voidaan korvata muovilla denaturaatio: entsyymit eivät toimi leikkeessä jääleiketekniikka - kudos jäädytetään metallilieriöön nestetypen (-193 C) avulla - leikkaus kryostaattimikrotomilla ( C) -värjäys substraatti (entsyymit toimivat), taustaväri entsyymien histokemiallinen osoittaminen

2 EM-näyte hilalla Muita preparaattien valmistusmenetelmiä Ohuet leikkeet ( nm) otetaan kuparihilalle (ø 2-3 mm) (100 mesh reikäkoko) värjäys Sivelypreparaatti esim. veripisara levitys objektilasille fikseeraus kuivaamalla, alkoholilla Murskepreparaatti (squash) näyte obj.lasille painetaan peitinlasilla murskaksi imeytys EtOH (60-70 %) värjäys 3 mm Värjäysmenetelmät Värjäysmenetelmät 2 Parafiinileikkeet värjäämätön leike ei yleensä erotu valomikroskoopissa (ei absorptioeroja) faasikontrasti-, interferenssimikroskoopissa ilman värjäystä biologiset väriaineet orgaanisia molekyylejä molekyyli sisältää: kromoforin (= värin kantaja) auksokromin (kiinnittää värin soluun, määrää vain kiinnittymiskohteen) auksokromi esim. COO - + H + karboksyyliryhmä on hapan kiinnittyy emäksisiin molekyyleihin (esim. tumassa) väri syntyy valkoisen valon eri aallonpituuksien erilaisesta absorboitumisesta solun eri osien välillä

3 Värjäysmenetelmät 3 Histokemia EM-värjäys perustuu elektronien erilaiseen absorboitumiseen näytteen eri osissa epäorgaaninen komponentti värissä väriaineet: fikseeraus OsO 4 jo värjää lyijysitraatti uranyyliasetaatti Entsyymien histokemia entsyymejä tuhansia, joista 60 voidaan osoittaa histokemiallisesti keinotekoinen entsyymi värin substraatti esiaste epäorg. suola + diatsosuola VÄRI + värin esiaste Histokemia 1 Histokemia 2 Kyyhkyn (40 vrk) rintalihaksen sukkinaattidehydrogenaasin, aktiivisuus 1.25x10 (Ahti Pyörnilä) Rotan m. soleuksen ATPaasiaktiivisuus, ph 10.4, 10x40x0.8 (Ahti Pyörnilä)

4 Histokemia 3 Histokemia 4 Viiriäisen m. supracoracoideus, fosforylaasi-aktiivisuus, 0.8x40 (Ahti Pyörnilä) Rotta m. soleus ATPaasi, ph 4.6, 10x40x0.8 (Ahti Pyörnilä) Histokemia 5 Immunohistokemia 1 kaniin injisoidaan tutkittavaa makromolekyyliä (proteiini, glykoproteiini) toimii antigeenina valkosolut tuottavat vasta-ainetta (antibody) vereen suora histokemiallinen värjäys: vasta-aine eristetään ja merkitään - esim. fluoreskeiini fluoresenssimikroskopia Varpusen m. pectoralis SDH, 0.8x40 (Ahti Pyörnilä)

5 Immunohistokemia 2 Spesifisen proteiinin lokalisointi EM:n avulla - peroksidaasi histokemiall. osoitus - kolloidinen kulta, ferritiini EM epäsuora immunokemiallinen värjäys: prim. vasta-ainetta ei merkitä, vaan sille kehitetään oma vasta-aine (esim. lampaassa tai vuohessa; ns. antikaniini-igg) - anti-kaniini-igg merkitään kuten edellä - etu: voidaan paikantaa mikä tahansa kanissa kehitetty vasta-aine Peroxisomes Leikkeessä näkyy kultasaostuma Lokalisointi 2 Autoradiografia Antibody reagoi ensin spesifisen antigeenin kanssa (esim. katalaasi) Sitten leike käsitellään proteiini A kompleksilla, joka saadaan esim. bakteerista (Staphylococcus aureus), ja kultapartikkeleilla Sidotaan antibodyn FC-domainiin Saadaan näkymään EM:ssä molekyylin kulku ja reaktiot solussa kudokselle, leikkeelle, soluviljelmälle tms. annetaan lähtöainetta, jonka jokin atomi on vaihdettu radioaktiiviseksi isotoopikseen esim. 3 H tritium, 14 C radiohiili, 32 P jne. tutkittavaa ainetta annetaan näytteelle lyhyen ajan pulssi

6 Autoradiografia 2 Autoradiografia 3 merkattu kuuma molekyyli käyttäytyy solussa kuten normaali kylmä molekyyli voidaan paikantaa radioaktiivisuuden perusteella leike tms. (yl. lasilla) kastetaan filmiemulsioon radioaktiivinen säteily valottaa filmin (yl. kestää päiviä tai viikkoja) radioakt. solut ja solun osat näkyvät tummina pisteinä (AgBr-kiteet) yleensä lisäksi normaali histologinen värjäys esim. halutaan tutkia DNA-synteesiä: käytetään 3 H- tymidiiniä paikantaminen AgBr-kiteiden määrä osoittaa DNAsynteesin aktiivisuuden! Yksittäisen molekyylin monitorointi Soluviljely 1885 Roux osoitti, että kanan alkion soluja voidaan elättää liuoksessa putkissa, maljoissa = in vitro organismissa itsessään = in vivo monet solun ominaisuudet säilyvät, esim. - fibroblastit erittävät kollageenia - lihassolut liittyvät yhteen lihas, supistukset - hermosolut kasvattavat haarakkeita Figure 8-26 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

7 Soluviljely 2 Soluviljely 3 primaariviljelmä: suoraan kudoksissa sekundaariviljelmä: aliviljelmät edellisestä yleensä voidaan viljellä ohuita suikaleita (eksplantteja); keskusta kuolee usein solut kiinni viljelymaljan pohjaan, vain syöpäsolut voivat kasvaa vapaana suspensiona kasvualustat spesifisiä aluksi plasmahyytymissä, 1970-luvulla keinotekoiset alustat, kasvutekijät (esim. NGF = nerve growth factor) tavallisesti solulinja kuolee rajallisen jakautumismäärän jälkeen (tiheysinhibiitio) on tuotettu useita solulinjoja, jotka jakautuvat loputtomasti Soluviljely 4 yleensä kasvainperäisiä esim. HeLa-solulinja (ihmisen epiteeli), 3T3 (hiiren fibroblasti jne. soluviljelyn etuna mm. solujen homogeenisuus soluja voidaan edelleen lisätä kloonaamalla kantasolut identtiset solut Henrietta Lacks - 31-vuotias kohdunkaulasyöpäpotilas v v kloonattu solulinja (sitkeä, kasvaa myös suspensioviljelmissä Published by AAAS Henrietta and David Lacks L. K. Boerner Science 327, (2010) Henrietta and David Lacks. She died in 1951, while the cancer that killed her lives on in HeLa. CREDIT: COURTESY THE LACKS FAMILY AND CROWN

8 Soluviljely 5 It is hard to imagine a scientist who hasn't heard of HeLa cells. Rapidly reproducing and amazingly robust, these cervical cancer cells have become indispensable in modern biomedical research. Their nearly ubiquitous cell line has been used in innumerable experiments that required a human cell culture. It has served in work ranging from the creation of a polio vaccine, to the development of leukemia treatments, to discoveries in cloning and gene mapping. periaatteessa mikä tahansa solu voidaan saada jakautumaan loputtomasti ns. neoplastisella transformaatiolla aiheutetaan yl. viruksella, esim. Rousin sarkooma -virus soluhybridisaatio, esim. hiiren kasvainsolu + virus, PEG ihmisen fibroblasti ns. heterokaryon mitoosit hybridisoluja Soluviljely 6 Solujen, soluorganellien ja makromolekyylien jaottelu hybridilinjat menettävät usein kromosomeja (syy tuntematon) etu: geenejä voidaan paikantaa kromosomeihin hybridoimalla yksittäisiä lymfosyyttejä voidaan tuottaa tarkkoja vasta-aineita lähes rajattomasti monoklonaaliset vasta-aineet - käytetään histokemiassa soluosien jaottelu ultrasentrifuugilla kiihtyvyys (keskipakovoima) jopa g (1 g = n. 980 cm/s 2 ) aluksi kudoksen homogenointi Jaottelu- eli differentiaali-sentrifugaatio erottelu perustuu sentrifugaatiovoimaan ja aikaan partikkelin koko määräävä (ks. taulukko)

9 g/aika 1000/5-20 min Jaottelutaulukko sakan sisältö kokonaiset solut, tumat Sample is layered on top of gradient Larger particle Smaller particle Sakkaroosigradientti /20 min mitokondriot, lysosomit /1-2 h vapaat ribosomit, mikrosomit Centrifuge Centrifugal force sytosoli (liuos) (molekyylikoon hiukkaset) Sucrose gradient Swing-out sentrifugointi 600 rpm Homogenointi Tube is moved slowly up and down as pestle rotates Teflon pestle Extract Particles settle according to mass Tissue-sucrose homogenate

10 Sentrifugointi 1 Sentrifugointi 2 Supernatant 2 Pellet 2 Supernatant 1 Pellet 1 Unbroken cells, nuclei, cytoskeletons Low speed centrufugation 1000g x 10 min Mitochondria, lysosomes, and microbodies Medium speed centrifugation g x 20 min. Sentrifugointi 3 Sentrifugointi 4 Supernatant 3 Soluble fraction of sytoplasm (cytosol) Pellet 3 Microsomes, consisting of smooth and rough endoplasmic reticulum, Golgi, small vesicles High speed centrifugation g x 60 min Supernatant 4 Pellet 4 Ribosomes, viruses, macromolecular complexes Very high speed centrifugation g x 3 hrs

11 Tiheysgradienttien muodostaminen Gradientin muodostaminen Tiheysgradientti-sentrifugaatio sentrifugiputkeen raskaan suolan (esim. CsCl, cesiumkloridi) tai keinotekoisten partikkelien väkevä liuos partikkelit asettuvat ajon aikana putken pohjaa kohti ominaispainoa vastaaviin väkevöityihin vyöhykkeisiin perustuu siis partikkelien tiheyteen gradientti voidaan muodostaa myös etukäteen esim. kerrostamalla erivahvuisia sakkaroosiliuoksia Fraktionti tiheysgradientin mukaan Collect fractions and do assay Hole Increasing mass of particles

12 Makromolekyylien analysointi Röntgensädekristallografia yl. proteiinit, nukleiinihapot Röntgendiffraktio aallonpituus n. 0,1 nm erinomainen resoluutio soveltuu kiteisiin, eristettyjen makromolekyylien tutkimiseen (esim. virukset) yksittäisten atomien sijainti molekyylissä erittäin aikaa vievä metodi Perutz & Kendrew luvulla Voidaan määrittää proteiinien kolmiulotteisia rakenteita Nykyisin tunnetaan yli 8000 proteiinin 3D-rakenne = nm, atomit erottuvat proteiinikiteestä Proteeinikiteen atomit lähettävät x-säteitä Siroava säteily detektorille tai filmille Kapea yhdensuuntainen rtg-sädekimppu ohjataan puhdistettuun proteiiniin. Suurin osa menee sellaisenaan läpi, mutta osa siroaa näytteen sisältämien atomien mukaan. Jos näyte on järjestäytyneenä kiteenä diffraktiopisteet. Kuvassa ribuloosibifosfaattikarboksylaasi, merkitystä CO 2 kiinnittymiseen fotosynteesissä Difraktiomallin ja ah-sekvenssin avulla saadaan molekyylimalli (D) Table 8-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

13 Elektroforeesi SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide-gel-electrophoresis) Elektroforeesi (+kromatografia) perustuu molekyylien liikkumiseen sähkökentässä molekyylien koko, varaus ja väliaine vaikuttavat kulkeutumiseen paperielektroforeesi: RNA selluloosa-asetaattikalvo (veren valk.aineet) SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS- PAGE) erottelee aina 10 ng:aan asti Molekyylibiologisia menetelmiä Sekvensointi ja yhdistelmä-dna-tekniikka sekvensointi: proteiinien aminohappojärj. ja nukleiinihappojen emäsjärj. määritys tietoa molekyylien osuudesta solun tapahtumissa DNA:n hybridisaatio-tekniikat: Southern blotting DNA-fragmentit Northern blotting RNA Western blotting (immunoblotting) proteiinit

14 Southern blottaus Western blottaus Tekniikka, jolla havaitaan tietty DNA-sekvenssi geelielektroforeesin jälkeen. Vastaavalla tekniikalla löydetään RNA-sekvenssi (Northern blotting) Proteiinien tunnistusmenetelmä, jossa elektroforeesin avulla erotetut proteiinit siirretään kalvolle paikannettavaksi. Proteiinit paikannetaan kalvolta yleensä tiettyyn proteiiniin sitoutuvalla, leimatulla vasta-aineella. Proteiinien tunnistuksen lisäksi proteiinituotannon suhteellista osuutta voidaan mitata densitometrisesti. Quantitative analysis Western blot 45 kd encephalopsin Animals: 10 Balb/c mice, 8 wk, m= 23.7 ± 1.1 g Nissilä et al. (2012) J Comp Physiol A Figure 2. Representative Western blot from different tissues of the mouse. Primary antibody: Rabbit polyclonal to encephalopsin. Secondary antibody: blotting grade affinity purified, AP-conjugated goat anti-rabbit.

15 Mean values of encephalopsin expression Northern blottaus Figure 3. Mean values ( SEM) of encephalopsin expression in mouse tissues. N = 10. Optical density detection: FluorS MultiImagerTM program. Note: expression in rectus femoris detected in two samples. Nissilä et al. (2012) J Comp Physiol A määritys tehdään us. solun kokonais RNA:na denaturointi esim. formaldehydilla estää vetysidosten muodostumisen emäsparien välille näin kaikki RNA on lineaarista, kiertymätöntä eristys koon mukaan geelielektroforeesilla siirretään nitroselluloosasuodattimelle käsitellään merkatulla RNA probilla, autoradiografiaan Northern blot and in situ hybridization (mouse) Blackshaw and Snyder (1999) J Neurosci 19: Polymeraasi ketjureaktio (PCR) Valitun DNA-segmentin monistaminen koeputkessa Note: Poor correlation between level of mrna and level of protein (Greenbaum et al. 2003, Genome Biology 4:117) Variation in post-transcriptional mechanisms RNA protein Differences in vivo half lives Protein localization by Western blotting and immunoblotting more reliable, Step 1 1. DNA kaksoisketju avataan kuumentamalla (95ºC), jäähdytetään 60ºC:seen 2. Lisätään primeri 1 ja 2 Step 2 3. DNA-oligonukleotidit antavat primerien hybridisoitua DNA:n komplementaariseksi sekvenssiksi (cdna) molemmissa ketjuissa

16 Step 3 4. Lisätään DNA polymeraasi (Taq) 5. Lisätään deoksiribonukleosidi trifosfaatit: datp, dgtp, dctp, dttp) 6. DNA syntetisoidaan alkaen primerista Figure 8-45a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 8-45b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Molemmissa tapauksissa nukleotidin sekvenssi pitää ainakin osittain tuntea etukäteen. Figure 8-46 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

17 PCR:n käyttö genomin kloonin saamiseksi. 1. Kromosomaalinen DNA puhdistetaan 2. Primeri lisätään 3. Useita PCR-syklejä 4. Vain DNA:ta monistetaan selektiivisesti vain puhdasta kromosomaalista DNA:ta saaliina Erottelu geelielektroforeesilla cdna-kloonauksessa 1. RNA:n puhdistaminen 2. Lisätään primeri 3. Käänteistranskriptaasi 4. Lisätään kakkosprimeri 5. Yksijuosteinen DNA monistuu monen PCR-syklin avulla 6. Sykli aloitetaan uudelleen. Kuumennus 95ºC:seen, jäähdytys 60ºC:seen 7. Äsken syntetisoitu toimii uuden templaattina jne.

18 cdna:n synteesi 1. kokonais-rna eristetään ja puhdistetaan 2. Valmistetaan DNA:n kopio mrna:sta Geeninsiirto geeninsiirto: 1. eristetään DNA solusta 2. pilkotaan restriktioentsyymillä 3. DNA:n eristäminen elektroforeettisesti 4. plasmidin aukaiseminen restriktioentsyymillä 5. halutut DNA:n palaset aukaistuun plasmidiin (tarttuvat vapaisiin emäsryhmiin) 6. plasmidin siirto bakteeriin

19

20 Transgeeninen hiirimalli KO = knock out Microarray, Geenisiru (gene chip) Geenilastu eli DNA-siru (aiemmin piialustalla) (DNA-microarray) Käytössä USA:ssa 1990-luvun puolivälissä Siru on leikelasi (25 mm x 75 mm), johon voidaan pieninä pisaroina sijoittaa jopa geenin dna-pätkää noin 150 m etäisyydelle toisistaan. Pisara vastaa siis yhtä geeniä.

21 Geenisiru 2 Tämän geenipisaran päälle pudotetaan sitten tutkittavia näytteitä, ja syntyvästä reaktiosta tehdään johtopäätöksiä. Edeltää kymmenien tuhansien geenien monistaminen DNA (sis. komennon, mitä tehdään) mrna (tieto siirtyy lähettirna:lle proteiini (valmiste l. tuote) Oivallus: mrna voidaan koodata takaisin cdna:ksi, jota otetaan sirulle Geenisiru 3 Geenisiru 4 Laitteet Robotti ja siihen yhdistetty pienen pieni nestettä siirtävä teräskynä Lasertekniikkaan perustuva lukija. Tulosten analysointi vaatii lisäksi huomattavaa laskentakapasiteettia Varsinainen tutkittava näyte ja referenssinäyte Tutkittava näyte esim. syöpäsolu ja referenssinäyte normaalisolu. Toinen näytteistä värjätään fluorisoivalla värillä vihreäksi ja toinen punaiseksi. Sirulle lisätään molempia näytteitä ja annetaan niiden reagoida sirulle kiinnitettyjen geenien kanssa.

22 Geenisiru 5 Geenisiru 6 Osa pisaroista muuttuu punaisiksi ja osa vihreiksi Värien perusteella voidaan päätellä, onko geenin aktiivisuus näytteen vaikutuksesta lisääntynyt tai vähentynyt. Jos jokin geeni esimerkiksi on hyvin aktiivinen syöpäsolussa, voidaan tutkia, mikä tämän geenin merkitys on syövän puhkeamiselle. Sirutekniikan avulla voidaan myös tutkia geenien vuorovaikutuksia - geenien välisiä viestintäreittejä ja verkkoja. - yhteyksien syy-seuraus-suhteita Matemaattinen mallintaminen (bioinformatiikka) GS Junior Summary The power of next-generation sequencing Proven. 454 Sequencing Chemistry, performance similar to GS FLX System