Histologia http://cc.oulu.fi/~ehohtola/kb/ salasana kbkbkb. Johdanto Kirjallisuus Mikrotekniikka Mikroskopointi 2. Soluvälimateriaali Matrix Säikeet 3. Kudostyypit Epiteelikudos Sidekudos varsinainen sidekudos rusto luu veri Lihaskudos sileä lihaskudos poikkijuovainen lihaskudos sydänlihas Hermokudos 4. Elimet, elinjärjestelmät Verenkiertoelimistö Lymfajärjestelmä Iho Aistinelimet Ruoansulatuskanava + rauhaset Hengityselimet Virtsanerityselimet Umpirauhaset Sukupuolielimet 2. Johdanto Mikrotekniikka (mikroskooppinen tekniikka, erillinen kurssi) kr. HISTOS = kudos, LOGOS = oppi Kirjallisuutta Young & Heath: Wheater s Functional Histology, A text and colour atlas. Edinburgh, London : Churchill Livingston (4. painos, 2000) Lähitieteet Kehitysbiologia Fysiologia Solubiologia (Mikro)anatomia Patologia Oikeuslääketiede Kudosten rakennetta ei voida tarkastella suoraan mikroskoopissa; tarvitaan sopiva preparaatti ja värjäys MIKROTEKNIKKA Preparaattityypit totaalipreparaatti (esim. -soluiset, ohuet kalvot) leikepreparaatti (yleisin) sivelypreparaatti (esim. veri) murskepreparaatti (esim. kromosomipreparaatit) Valmistusvaiheet 3 4
fikseerausvalu leikkaus värjäys mikroskopointi estää kudoksen autolyysin (lysosomit) kovettaa kudos kestää leikkauksen edistää värjäytymistä valu (petaus) parafiiniin tai muoviin blokki leikkausta varten vaatii veden poiston 30 % alkoholi abs. alkoholi ksyleeni (ns. nouseva sarja) formaldehydi, paraformaldehydi, alkoholi, pikriinihappo, etikkahappo seokset valu voidaan tehdä myös jäädyttämällä, jolloin fikseerausta ja veden poistoa ei tarvita esim. Bouin: pikriinihappo (saturoitu vesiliuos) 75 osaa + formaliini (40 % formaldehydi) 25 osaa + jääetikka (00 % etikkahappo) 5 osaa kudospalan oltava pieni 2-3 mm nopea fikseeraus muoviblokki parafiiniblokki 5 6 leikkaus leikkeet/leikenauha valomikroskopia mikrotomilla -5 µm, EM << µm (ultramikrotomi), jääleikkeet kryostaattimikrotomilla (jäähdytys) terä leike blokki 7 8
Leikkeet kiinnitetään objektilasille (EM:ssa kuparihilalle) esim. munanvalkuais-glyseroli-seoksella lämpöpöydällä (nauhojen oikaisu) Jääleikkeet suoraan lasille Värjäystä varten parafiini yleensä poistettava (värit vesiliukoisia) laskeva sarja (ksyleeni abs. alkoholi 30 % alkoholi vesi) 9 0 Värjäys perustuu väriaineisiin yleensä aromaattisia orgaanisia molekyylejä Esimerkki hematoksyliini eosiini molekyylissä kaksi osaa kromofori eli värin kantaja esim. parakinoni, Atso-ryhmiä -N=N-, atsiini, ym. auksokromi: värin sitoutuminen, pysyvyys -COOH, -NH 2, -OH -ryhmät happamat, emäksiset värit (= anioniset ja kationiset värit), neutraalit värit peittaus: värien saostus metallisuoloilla (kangasvärjäyksessä puretus ) EM- värit esim. osmiumtetroksidi 2
Histokemialliset värjäykset (molekyylien spesifinen osoittaminen) Entsyymihistokemia - entsyymien paikallistaminen kudoksissa peitinlasi + peitinaine (esim. kanadanbalsami) entsyymireaktio kytketään värireaktioon Immunohistokemia vasta-aineiden hyväksikäyttö makromolekyylien osoittamisessa leikenauha 3 ATP-aasi, lihas Syöpäspesifinen antigeeni, eturauhanen 4 Valomikroskooppi yleisin, teoreettinen erotuskyky 0.2 µm erotuskyky riippuu: valon aallonpituudesta, väliaineen taitekertoimesta ja objektiivin avautumiskulmasta tärkeimmät rakenteet havaittavissa ihmissilmin 40x suurennoksella! Fluoresenssimikroskooppi UV-heräte kohteeseen fluoresenssi näkyvän valon alueella konfokaali fluoresenssi autofluoresenssi, väriaineilla aikaansaatu fluoresenssi konfokaalimikroskopia: herätevalo = laser sopii paksuille leikkeille, pistemäinen kohteen valaisu skannaus 5 6
Valomikroskoopin sovellutuksia Elektronimikroskopia pimeäkenttämikroskooppi läpivalaisu-em (transmission-em, TEM) faasikontrastimikroskooppi, värjäystä ei tarvita pyyhkäisy-em (Scanning-EM, SEM) pintakuva interferenssikontrastimikroskooppi omat leike- ja värjäystekniikat polarisaatiomikroskooppi elektronien läpäisevyys (elektroni-opaakkisuus) väri TEM SEM 7 8 Historiaa 2. Soluvälimateriaali Mikroskooppi Leeuwenhook 700-luku Kudos = solut + soluvälimateriaali (matrix, matriksi) Tuma: Brown 83 Matrix ei varsinaisesti elävää materiaalia Soluteoria: Schwann & Schleiden 838/39 Aina solujen tuottamaa Ihmisen histologian oppikirja: Henle 84 Kudosten ja tukirangan kovuus ja lujuus Kudostyypit: Wirchow 863 luu > rusto > verkkomainen sidekudos Mikrotomit, leikkeiden valmistus: 800-luvun loppu Toimii diffuusiotienä Elektronimikroskopia: 940/50-luku Väliaineen 2 perustyyppiä Entsyymihistokemia: 950-luku amorfinen eli homogeeninen Immunohistokemia: 960/70-luku säikeinen In situ mrna-hybridisaatio: 980-luku 9 20
2.. Amorfinen väliaine GAG:t jaetaan ei-esteröityneisiin ja esteröityneisiin Joko suhteellisen jäykkiä (geeli) tai juoksevampia (sooli). Ei-esteröityneet Päätehtävä diffundoitumistie, adheesio Erotetaan kaksi komponenttia: perusaine + sementti Yleensä seoksia glykoproteiinit + kollageeni (molekyylimuodossa) hiilihydraatit lipidit vesi heksosamiinien ja heksuronihappojen polymeereja = glykosaminoglykaanit (GAG) = mukopolysakkaridit 2 hyaluronihappo: glukuronihapon ja asetyyliglukosamiinin polymeeri M 000 000 kondroitiini: glukuronihappo + N-asetyyligalaktosamiini M 25 000 2. Esteröityneet (-OSO 3 H) kondroitiinisulfaatti (galaktosamiinin, glukuronihapon ja sulfaatin polymeeri), dermataanisulfaatti keratohyaliini ihon keratiini sulfatoituneet muodot jäykempiä geelit (sementtiaine) liittyvät sulfaatin avulla proteiineihin proteoglykaanit (vanh. mukoproteiinit), runkona hyaluronihappo 22 hyaluronihappo kondroitiinisulfaatti proteoglykaani M 0 8 EM-kuva Esiintyminen: hyaluronihappo useimpien elinten sidekudos-osassa lisäksi nivelpussit, napanuora, silmän lasiainen viskoosinen fluidi, sitoo helposti vettä, joka voi poistua viskositeettia säätelee hyaluronidaasi-entsyymi (hydrolysoi) kondroitiinisulfaatti rusto, luu, aorta, sydänläpät, sarveiskalvo, napanuora kondro = rusto (kr. chondro-) hyalo = kr. lasi muko = lima (lat. mucus) Väliaineen valontaitto yleensä sama kuin vedellä! 23 24
2.. Säikeet Huom: Biologiassa syy = solu, säie = fibrilli (lääketieteessä eri käytäntö, esim. lihassäie = lihassolu) A. Kollageenisäikeet tavataan kaikissa sidekudostyypeissä, eläinkudosten yleisin proteiini, jopa 25 % kaikista proteiineista luun proteiini on pääosin kollageenia ainakin 27 eri tyyppiä: tyyppi I 70 % koko elimistön kollageenista, 90 % luun kollageenista Kollageeni + raskasmetallisuolat tai tanniini erittäin vaikealiukoinen yhdiste (nahan parkitseminen!) Tanner = parkitsija Lat. collum = liima, kollageeni = liimaa tuottava 25 26 perusrakenne 3 peptidiketjun helix, joka kolmas ah = glysiini GLY-X-Y X usein proliini, Y hydroksiproliini n. 000 ah:n -kertainen helix 3-kertainen helix = tropokollageeni, gly helixin sisällä pituus 280 nm, läpimitta.4 nm tropokollageeni mikrosäikeet (micofibrils) tropokollageeni (+telopeptidit) mikrofibrilli ¼ limittäisyys pituus useita µm, läpimitta 0.3 µm mikrosäikeet + ristisidokset kollageenisäikeet kollageenisäie läpimitta -2 µm 27 28
Kollageenisäikeet B. Retikuliinisäikeet iho verkkomaisia, haaroittuvia muodostavat pieniä verkostoja verisuonten, lihassolujen, rasvasolujen ym. ympärille epäkypsää kollageenia, muodostuu tropokollageenista suolilieve C. Elastiset säikeet paljon mm. löyhässä sidekudoksessa valtimoiden ympärillä, keuhkoissa joustavia, kumimaisia elastiini-proteiini, M 70 000, 8 ah, random-coil, 3-ulotteinen rakenne oskilloi SEM joustavuus molekyylisillat lysiinin muodostamia (lysyylioksidaasi-entsyymi) 29 retikukulaarisäikeet (imusolmuke) elastiset säikeet (valtimon seinämä) 3 30