( B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT 80601. ' 1 3 17 1 `29.:?, (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 A 61K 39/13, C 07K 7/08

( B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT 80601 ' 1 3 17 1 `29.:?, (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 A 61K 39/13, C 07K 7/08 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 834590 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 14.12.83 (24) Alkupäivä - Löpdag 06.04.83 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 14.12.83 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 30.03.90 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan US83/00477 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 14.04.82 US 368308 25.03.83 US 478847 (71) Hakija - Sökande 1. Scripps Clinic and Research Foundation, 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, Cal., USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Bittle, James L., 5353 Calle Vista, San Diego, Cal., USA, (US) 2. Lerner, Richard A., 7750 East Roseland, La Jolla, Cal., USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä Picornaviruksen synteettisen antigeenin valmistamiseksi Förfarande för framställning av syntetisk Picornavirus antigen (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer FI A 812092 (C 07 K 15/00), Proceeding of the National Academy of Science of the USA, vol. 77, 1980, p. 5197-5200, Nature, vol. 287, 1980, p. 801-805, Journal of General Virology, vol. 59, 1982, p. 295-306, Chemical Abstracts, vol. 97, 1982, 160801t (57) Tiivistelmä - Sammandrag Spesifinen synteettinen antigeeninen peptidi, joka sisältää noin 20 aminohappotäht,,, -.1-1 sekvenssin, joka vastaa Picornaviruksen antigeenisen, kuten suu- ja sorkka- tauti- ja poliomyelitis-virusten VP 1-kuoren tiettyä aluetta. Tämä alue sijaitsee noin 60-75 %:n etäisyydellä aminohappojen kokonaispituudesta mitattuna aminopäätteestä. Esitetään spesifisiä synteettisiä peptidejä sisältäviä rokotteita, jotka synnyttävät vasta-aineita, jotka suojaavat isäntäeläimiä Picornaviruksilta sekä Picornavirusten antigeenien vastaaineita ja diagnostisia järjestelmiä. Specifik syntetisk peptid, som innehåller en sekvens av ca 20 aminosyrarester motsvarande en viss region av ett Picornavirus antigeniskt skalprotein, såsom mul- och klövsjuka- och poliomyelitis-virus VP 1 -skal. Denna region är belägen på ett avstånd av ca 60-75 % av aminosyrornas totallängd räknat från aminoändgruppen. Vacciner innehållande specifika syntetiska peptider, vilka producerar antikroppar, vilka skyddar värddjur mot Picornavirus, ävensom antikroppar till och diagnostiska system för Picornavirus antigener beskrives.

80601 KAHDEKSAN FMDV VP 1 -KUORIPROTEIININ AMINOHAPPOTÄHDE- SEKVENSSI ASEMISSA 130-160 130 140 Olk TyrAsnGlyGluCysArgTyrAsnArgAsnAlaValProAsnLeu Olc TyrAsnGlyGluCysArgTyrSerArgAsnAlaValPrcAsnVal Alo TyrAspGlyThrAsnLysTyrSerAlaSerAspSer - - Arg Al2 TyrAsnGlyThrAsnLysTyrSerAlaSerGlySerGlY - Val A24 TyrAsnGlyThrSerLysTyrAlaValGlyGlySerGly Arg A27 TyrAsnPheThrAsnLysTyrSerAsnGlyGlyGln - - Arg A79 TyrAsnGlyThrSerLysTyrThrValGlyGlySerGlY - Arg C3 TyrThrGlyThrThrThrTyrThrThrSerAla - - - Arg Olk Olc A10 Al2 A24 A27 A79 C3 150 160 ArgGlyAspLeuGlnValLeuA1aGlnLysValAlaArgThrLeuPro ArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysValAlaArgThrLeuPro SerGlyAspLeuGlySerIleAlaAlaArgValAlaThrGlnLeuPro ArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArgValAlaArgG1nLeuPro ArgGlyAspMetGlyThrLeuAlaAlaArgValValLysGlnLeuPro AlaGlyAspMetGlySerLeuAlaAlaArgValAlaLYsGlnLeuPro ArgGlyAspMetGlySerLeuAlaAlaArgValAiaLysGlnLeuPro ArgGlyAspLeuValHisLeuAlaAlaAlallisAlaArgHisLeuPro

1 80601 Menetelmä Picornaviruksen synteettisen antigeenin valmistamiseksi Esillä oleva keksintö kohdistuu rokotteisiin ja antigeeneihin infektiotauteja vastaan ja erityisesti antigeeneihin, jotka ovat käyttökelpoisia heimon Picornavirus virueten aiheuttamien tautien, kuten poliomyelitiksen diagnoeoinniesa ja käsittelyssä. Poliomyelitis- (tästedes polio) ja Hepatitis A-virukset kuuluvat Picornavirus-heimoon, ts. ne ovat sukua niille. 1950- luvulta lähtien on käytetty tehokkaita rokotteita poliovirusten tyyppejä 1, 2 ja 3 vastaan, kun taas ei tunneta mitään tehokasta rokotetta Hepatitis Aita vastaan. Picornavirusten eräs tunnusomainen piirre on, että ne sisältävät neljä kuoriproteiinia. On havaittu, että poliotyyppi 1:n VP 1 :ksi kutsuttu kuoriproteiini sisältää antigeenisen determinanttialueen, joka pystyy saamaan aikaan virusta neutraloivien vasta-aineiden tuottamisen, vaikkakaan VP 1 -kuoren spesifisiä aminohappodeterminanttialueita ei tähän saakka ole löydetty. Ei ole vielä tunnistettu sellaista Hepatitis A- viruksen spesifistä kuorta, joka saisi aikaan neutraloivien vasta-aineiden tuottamisen. Polion vastaisissa rokotteissa käytetään tavallisesti inaktivoituja virustyyppejä 1, 2 ja 3. Joissakin tapauksissa kaikki ne. tapetut virukset eivät ole kuolleet tai virushiukkasia ei ole heikennetty riittävästi, jolloin noin yksi rokotus miljoonasta aiheuttaa kliinisen taudin rokotetussa henkilössä. Näin ollen olisi hyödyllistä jos voitaisiin valmistaa sellainen polion vastainen rokote, joka ei missään tapauksessa sisällä elävää tai edes heikennettyä virusta. Olisi myöskin

2 80601 hyödyllistä jos voitaisiin valmistaa sellainen polion vastainen virus, joka on vapaa solujäännöksistä, bakteeriendotoksiineista ja kasvuväliaineen sivutuotteista, jotka usein esiintyvät jäljempänä kuvatulla yhdistelmä-dna-tekniikalla valmistetuissa rokotevalmisteissa. Olisi edelleen hyödyllistä, jos läydettäisiin sellaisia rokotteita ja diagnostisia tuotteita, jotka ovat turvallisia ja hyvin tehokkaita. Aikaisemmin antigeeneja on saatu useilla tavoin, kuten valmistamalla luonnontuotteista, liittämällä hapteeni kantajaan ja yhdistelmä-dna-tekniikalla. Sela, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 68:1450-1455 (heinäkuu, 1971); Science, 166:1365-1374 (joulukuu 1960); Adv. Immun., 5:29-129 (1966) ovat myöskin kuvanneet tiettyjä synteettisiä antigeeneja. Luonnontuotteista johdettuja antigeeneja edustavat lukemattomat tunnetut luonnossa esiintyvät antigeenit, kuten veriryhmäantigeenit, HLA-antigeenit, erilaistuneet antigeenit, virusja bakteeriantigeenit ja sen kaltaiset. Viime vuosisadan aikana on uhrattu huomattavasti työtä näiden antigeenien tunnistamiseksi ja tutkimiseksi. Tiettyjä "synteettisiä" antigeeneja on valmistettu liittämällä pieniä molekyylejä kantajiin, kuten esim. naudan seerumial-.bumiiniin, tuottaen näin antigeeneja, jotka saavat aikaan pienen liitetyn molekyylin vasta-aineen tuottamisen. Kantajamolekyyli on välttämätön, koska eläimen, johon pieni molekyyli injisoidaan, immuunijärjestelmä ei "tunnistaisi" pelkkää pientä molekyyliä. Tätä tekniikkaa on myöskin käytetty yksittäisissä tapauksissa antigeenien valmistamiseksi liittämällä tunnettujen peptidien peptidifragmentteja kantajiin, kuten on kuvattu Sela et al.:in edellä viitatuissa artikkeleissa. Vaikkakin tämä haptiini-kantaja-tekniikka on palvellut hyvin tutkimistyötä tutkittaessa immuunireaktion luonnetta, niin siitä ei ole ollut huomattavaa käyttöä sellaisten antigeenien valmistuksessa, joilla olisi merkitystä diagnostiikassa tai

3 80601 terapiassa. Tämän puutteellisuuden syyt ovat monet. Ensiksi, jotta tällä tekniikalla voitaisiin valita ja rakentaa hyödyllinen antigeeninen determinantti patogeenista, niin on määritettävä patogeenin koko proteiinisekvenssi, jotta onnistumisen mandollisuus olisi kohtuullinen. Tämän tehtävän vaikeuksista johtuen se on harvoin, jos koskaan, toteutettu. Rokotteet valmistetaan klassisesti viemällä tapettuja tai heikennettyjä organismeja isäntään yhdessä sopivien apuaineiden kanssa organismien vastaisen normaalin immuunireaktion alulle panemiseksi, samalla kun toivottavasti vältytään organismin patogeenisilta vaikutuksilta isännässä. Tämä tapa kärsii hyvin tunnetuista rajoituksista, jotka ilmenevät siinä, että on tuskin mandollista välttää patogeenista reagointia rokotteen kompleksisuudesta johtuen, joka rokote ei ainoastaan sisällä kiinnostuksen kohteena olevaa antigeenista determinanttia vaan useita samantapaisia tai erilaisia vahingollisia aineita, jotka voivat, joissakin tai kaikissa yksilöissä, saada aikaan ei-toivotun reaktion isännässä. Klassisella tavalla valmistetut rokotteet voivat esimerkiksi sisältää kilpailevia antigeeneja, jotka ovat haitallisia toivotulle immuunireaktiolle, antigeeneja, jotka johtavat erilaisiin immuunireaktioihin, organismista tai viljelystä peräisin olevia nukleiinihappoja, endotoksiineja ja aineosia, joilla on tuntematon koostumus ja alkuperä. Näiåtä kompleksisista aineista aikaansaaduilla rokotteilla on luonnostaan suhteellisen suuri todennäköisyys synnyttää kilpailevia reaktioita, jopa kiinnostuksen kohteena olevasta antigeenista. Lisäksi tällaiset tunnetut rokotteet FMDV:tä vastaan on pidettävä kylmässä ennen käyttöäja jäähdyttäminen on yleensä vaikea toteuttaa syrjäisillä alueilla, joissa rokotteita käytetään. Yhdistelmä- DNA-teknologia on avannut uusia mandollisuuksia rokotusteknologialle, jonka etuna on, että valmistus lähtee

4 80601 monospesifisestä geenistä, mutta suurin osa tästä edusta menetetään kuitenkin antigeenin varsinaisessa valmistuksessa Escherichia colissa tai muissa mikro-organismeissa. Tämän menetelmän mukaan geenimateriaali viedään plasmidiin, joka sen jälkeen viedään E. coliin, joka tuottaa halutun proteiinin yhdessä muiden aineenvaihduntatuotteiden kanssa, jotka kaikki ovat seoksena ravintoaineen kanssa. Tämä tapa kompiisoituu, koska on epävarmaa jos haluttu proteiini ekspressoituu transformoidussa E. colissa. Lisäksi vaikkakin haluttua proteiinia saattaa muodostua on epävarmaa voidaanko se saada talteen tai ei tuhoutuuko se E. colin kasvuprosessin aikana. On esimerkiksi hyvin tunnettua, että E. coli hajottaa vieraita tai muuttuneita proteiineja. Vaikkakin proteiinia esiintyy riittävä määrä, jotta se olisi mielenkiinnon kohteena, se on kuitenkin vielä erotettava kaikista muista E. colin aineenvaihduntatuotteista, joihin sisältyvät sellaiset vahingolliset aineet kuten ei-toivotut proteiinit, endotoksiinit, nukleiinihapot, geenit ja tuntemattomat tai arvaamattomat aineet. Lopuksi vaikkakin olisi mandollista tai tulisi kehityksen myötä mandolliseksi jollakin tekniikalla, joka pakostakin olisi hyvin kallis, erottaa haluttu proteiini E. colin muista aineenvaihduntatuotteista, niin rokote sisältää yhä kokonaisen.proteiinin, joka saattaa sisältää ei-haluttuja antigeenisia determinantteja, joista, kuten on tunnettua, muutamat - synnyttävät hyvin merkittäviä, haitallisia reaktioita. On todellakin tunnettuai -että tietyt proteiinit, joita muuten voitaisiin pitää rokotteina, sisältävät antigeenisen determinantin, joka synnyttää niin vakavia poikkireaktioita tai sivureaktioita, ettei näitä aineita voida käyttää rokotteena. On myöskin mandollista hybridooma-tekniikkaa käyttäen tuottaa vasta-aineita virusgeenituotteille. Pohjimmiltaan voidaan hybridomitekniikassa lähteä antigeenien kompleksisesta seok- sesta ja valmistaa prosessin myöhemmässä vaiheessa monospesifisiä vasta-aineita. Vastakohtana tälle esillä oleva keksintö

5 80601 edustaa päinvastaista prosessia, koska siinä lähdetään korkean puhtauden omaavasta antigeenideterminantista ja näin ollen vältytään välttämättömyydestä puhdistaa haluttua antigeenituotetta. On tunnettua, että hybridoomavasta-aineilla on alhainen aktiivisuus ja alhainen sitomisvakio ja tämän vuoksi niillä on vähäistä arvoa. Hybridoomatekniikassa on viime kädessä luotettava pahanlaatuisten solujen tuottamaan vasta-aineeseen kaikkine siihen liittyvine huolineen mitä tulee erottamistekniikkaan, puhtauteen ja varmuuteen. Hybridoomatuotanto perustuu kudosviljelyn tai aineen viemisen hiireen, jonka seurauksena tuotanto on kallista ja esiintyy myöskin luontaisia variaatioita erästä erään. Lisäksi on vaikeata valmistaa hybridi sellaisille molekyyleille, jotka muodostavat vain pienen osuuden siitä kompleksisesta seoksesta, josta on lähdettävä. Aikaisempia tutkimuksia, Arnon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 68:1450 (1971), Atassi, Immunochemistry 12:423 (1975) ja Vyas et al., Science 178:1300 (1972) on tulkittu näiden kirjoittajien toimesta osoittaen, että lyhyet lineaariset aminohapposekvenssit ovat epätodennäköisiä synnyttämään vasta-aineita, jotka ovat reaktiivisia luonnon proteiinirakenteiden kanssa. Ajå'teltiin, että useimpien molekyylien useimpien alueiden kohdalla, aminohappotähteistä saadut antigeenideterminantit erottuvat hyvin lineaarisessa sekvenssissä, mutta vasta-aineiden synnyttämiseen käytettyjen peptidien rakenteen uskottiin olevan kriittinen useimmissa tapauksissa, jopa niille antigeeneille, joissa aminohapot ovat lähellä toisiaan sekvenssissä. Lerner et al., Cell 23;109-110, (1931); Nature 287:801-805 (1980), havaitsivat, että lineaaristen peptidien vasta-aineet reagoivat luonnon molekyylien

6 80601 kanssa. Monimutkaiset biosynteesit tulivat näin ollen tarpeettomiksi, epätaloudellisiksi ja vanhanaikaisiksi. Kloonattuun virueproteiinirokotteeseen perustuvalla tavalla on useita luontaisia haittapuolia, rajoituksia ja riskejä. Biosynteesisysteemin vaihtelut voivat sinänsä aiheuttaa vaihteluita proteiinien ekspreeeoitumisessa ja näin vaikuttaa antigeenien puhtauteen, saantoihin, tehoon jne. Lisäksi muiden proteiinien läsnäolo ja vaikeat ja tehottomat erottamiset viittaavat siihen, että kloonatulla virusproteiinimenetelmällä valmistetut rokotteet eivät todennäköisesti ole monospesifisiä. Näin ollen tällä tekniikalla valmistettujen tuotteiden päähuolenaiheena on puhtaus, tehokkuus ja varmuus. Vaikkakin synteettisten antigeenien valmistuksen yleiset periaatteet, lähtien joko tunnetusta peptidisekvenssistä tai genomista, on kuvattu ja vaikkakin sellaisten sopivan pituuden omaavien peptidien valmistus, joita voidaan käyttää antigeenisissä materiaaleisea, on nykyään aika hyvin tunnettu, on olemassa hyvin laaja antigeeni-vasta-aine-teknologian ala, jota edelleen on mandotonta hallita. Vaikkakin tunnetaan joitakin suuntaviivoja ja ehdotuksia koskien mandollisia antigeenisekvenssejä, on tälle alueelle kuitenkin edelleen ominaista spekulaatiot, yritykset ja erehdykset. Vaikkakin tiedetään, että pitkä sekvenssi saattaa sisältää antigeenisesti aktiivisia aineosia, esiintyy suurta epävarmuutta ja arvailua siitä, tarvitaanko koko sekvensei vai vain osa siitä antigeenieyyden saavuttamiseksi ja siitä onko sekvenssin pienemmällä osalla suurempi tai pienempi antigeenisyys. Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään spesifisen synteettisen, antigeenieen peptidin valmistamiseksi, joka sisältää noin kandenkymmenen aminohappotähteen sekvenesin. Tähän antigeeniseen peptidiin sisältyy aminohappotähteen sekvenesi, joka vastaa antigeenisen Picornaviruksen kuoriproteiinin tiettyä aluetta. Tämä alue sijaitsee etäisyydellä, joka on

7 80601 noin 60 - noin 75 % antigeenisen kuoriproteiinin aminohappojäännössekvensein koko pituudesta laskettuna sen aminopäätteestä. Tämä peptidi kykenee, kun se on sidottu avaimenreikämaljakotilo-hemosyaniinikantajaan konjugaattina ja viety tehokkaana määränä rokotteena isäntåeläimeen, synnyttämään vasta-aineiden tuotannon ieäntäeläimessä, jotka vasta-aineet immuunireagoivat Picornavirukeen kanssa suojaten isäntäeläintä Picornaviruksen aiheuttamalta infektiolta. Peptidillä on edullisesti positivinen nettoionivaraus, lukuunottamatta päätteinä olevien peptidien amino- ja/tai karboksyyliryhmien ionivaraukeet. Erään suoritusmuodon mukaan tällä keksinnöllä aikaansaadaan synteettisiä, antigeenisiä peptidejä, joista kukin sisältää noin kandenkymmenen aminohapon sekvenesin, joka vastaa polioviruksen VP 1 -kuoriproteiinin aminohapposekvenssejä, jotka sijaitsevat asemassa noin 182:sta noin 201:een aminopäätteeetä. Jokainen näistä peptideistä kykenee, kun ne on yksitellen sidottu avaimenreikämaljakotilo-hemosyaniinikantajaan konjugaattina ja viety tehokkaassa määrässä eri isäntäeläimiin, synnyttämään vasta-aineiden tuotannon, jotka vasta-aineet immuunireagoivat polioviruksen kanssa suojaten näitä eläimiä polioinfektioilta. Tämän keksinnön mukaisia synteettisiä antigeenieiä peptidejä voidaan käyttää yhdessä fysiologisesti hyväksyttävien laimetimien, kuten veden ja/tai lieäaineiden kanssa sellaisissa rokotteisea, jotka kykenevät suojaamaan eläimiä Picornaviruksen aiheuttamia tauteja vastaan, tai kasvattamaan vastaaineita, jotka ovat käyttökelpoisia sellaisten antigeenisten proteiinien läsnäolon havaitsemiseksi, jotka liittyvät Picornaviruksen aiheuttamiin tauteihin. Polion VP 1 -kuoreen liittyvien synteettisten peptidien erityisen edullinen noin kandenkymmenen aminohappotähteen eekveneei vastaa VP 1 -kuoren aminohappotähteen alueita, jotka sijaitse-

8 80601 vat asemassa noin 181:stä noin 201:een aminopäätteeetä. Näiden sekvenseien aminohappotähteet, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäätteestä karbokeipäätettä kohti, on esitetty seuraavassa: (181) SerIlePheTyrThrTyrGlyThr(Ala)AlaProAlaArgIle (201) SerValProTyrValGlyIle joissa jokainen suluissa esitetty aminohappotähde sekvenseissä voi itsenäisesti korvata välittömästi sulkujen vasemmalla puolella olevan viereisen aminohappotähteen, ja suluissa olevat numerot määrättyjen aminohappojäännösten yläpuolella yllä olevassa sekvenesissa ilmaisevat poliotyyppi 1-viruksen VP kuoriproteiinin aminohappotähteen asemat aminopäätteen suhteen. Nämä numerot on esitetty vain vertailumieleseä. Esillä olevalla keksinnöllä saavutetaan huomattavaa hyötyä ja etua, erityisesti kun tämän keksinnön mukaisia peptidejä käytetään rokotteissa Picornaviruksen aiheuttamia tauteja vastaan ja diagnostiikaesa, jossa määritetään näiden tautien tai virusten esiintymistä eläimissä, ihminen mukaanluettuna. Näin ollen yksi huomattava etu on se, että synteettiset peptidit voivat muodostaa osan sellaisesta rokotteesta, joka suojaa eläimiä näiltä taudeilta. Kekeinnöllä saavutettava erityinen hyöty on siinä, ettei rokotteita, jotka on valmistettu käyttäen synteettistä peptidiä, tarvitse tehokkaan rokotuksen aikaansaamiseksi säilyttää kylmässä ennen käyttöä. Esillä olevan keksinnön eräs toinen etu saavutetaan diagnostiikan alueella, jossa synteettisen peptidin antiseerumissa tuotetut vasta-aineet immuunireagoivat Picornaviruksiin, ku-

9 80601 ten polioon, liittyvien antigeenisten proteiinien ja vastaaineiden kanssa ja niitä voidaan käyttää näiden läsnäolon havaitsemiseksi. Lisähyödyt ja -edut ovat alan ammattilaiselle ilmeiset seuraavan yksityiskohtaisen selityksen, esimerkkien ja patenttivaatimusten perusteella. Piiruetukeesea, joka muodostaa tämän selityksen osan kuvio esittää polion tyyppi 1 Mahoney- ja Sabin-viruskannat ja tyyppi 3 Leon-polioviruskanta, VP 1 -kuoren aminohappotähdesekvenesejä aminohappotähteen asemassa 182-201, käyttäen tavallista kolmekirjainkoodia jokaiselle aminohappotähteelle. Sekvenssit luetaan vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäätteestä karbokeipäätettä kohti. Numerot 182 ja 201 esittävät aminohappotähteen asemat Mahoney tyyppi 1 polioviruksen VP 1 -kuoriproteiinin aminopäätteen suhteen. Esillä olevan keksinnön mukaan on hyvin odottamattomaeti ja hyvin yllätyksellisesti keksitty, että erityinen, suhteellisen lyhyt synteettinen peptidisekvensei on antigeeniseeti erittäin aktiivinen. Synteettinen peptidi sisältää aminohappotähdesekvenssin, jonka pituus on noin 20 happoa. Peptidin aminohappotähdesekvenssi vastaa ainakin antigeenisen Picornaviruksen proteiinin sen alueen aminohappotähdesekvenssiä, joka sijaitsee etäisyydellä joka on noin 60 - noin 75 % antigeenisen kuoriproteiinin aminohappotähdesekvensein kokonaispituudesta, mitattuna sen aminotähteeetä. Synteettisellä peptidillä on nettoionivaraus, joka on nolla tai positiivinen, lukuunottamatta ionivarauksia, jotka aiheutuvat amino- ja/tai karbokeyylipääteryhmien läsnäolosta. Lisäksi ovat synteettieet antigeenit, jotka sisältävät jäljempänä kuvatut peptidisekvenseit, monospeeifisiä Picornavirusten tiettyjen serotyyppien, alatyyppien ja kantojen suhteen ja ne ovat myöskin polyspeeifieiä, vaikkakin pienemmässä määrin useiden näiden virusten serotyyppien, alatyyppien ja kantojen suhteen.

1 0 80601 Keksinnön mukaiset synteettiset antigeenieet peptidit kykenevät yksinään suoraketjuisessa tai syklisessä muodossa, polymeerinä, jossa viereiset toistuvat peptidiyksiköt on sidottu yhteen hapotetuilla eysteiinitähteillä, tai kantajaan sidottuna kojugaattina, annettuna tehokkaassa määrässä rokotteena, synnyttämään vasta-aineiden tuotannon isäntäeläimessä, jotka vasta-aineet immuunireagoivat sen sukuisen Picornaviruksen kanssa suojaten isäntäeläintä Picornaviruksen aiheuttamalta infektioita. Tämän keksinnön mukaista peptidiä voidaan kuitenkin lisämääritellä sen antigeenisiä ominaisuuksia kuvaavalla yksikkökokeella, joka on riippumaton siitä muodosta, jossa peptidiä lopullisesti käytetään, eli suoraketjuisena, eyklieenä renkaana, polymeerinä tai sidottuna konjugaattina. Tämän yksikkökokeen mukaan keksinnön mukainen peptidi kykenee suoraketjuisessa muodossa, kun se on sidottu avaimenreikämaljakotilo-hemosyaniinikantajaan konjugaattina ja viety tehokkaana määränä rokotteena isäntäeläimeen, synnyttämään vastaaineiden tuotannon, jotka vasta-aineet immuunireagoivat sen sukuisen Picornaviruksen kanssa suojaten tätä isäntäeläintä tältä virukeelta. Peptidin ja kantajan määrät ja konjugointireaktion spesifieet reaktio-olosuhteet ja rokotevalmieteet on esitetty aikakausjulkaisussa Bittle et al., Nature, 298: 30-33 (heinäkuu, 1982). Rokotteena esillä oleva keksintö käsittää tehokkaan määrän peptidiantigeeniä, joka saattaa yksinään soveltua rokotteeksi, kun läsnä on fysiologisesti hyväksyttävä laimennin, kuten vesi tai suolaliuos. Rokote voi sisältää kantajan, joka voi olla mikä tahansa useista kantajista, kuten avaimenreikämaljakotilo-hemoeyaniini (KLH), jäykkäkouristustoksoidi, poly-l- (Lys:Glu), maapähkinäagglutiniini, ovalbumiini, soijapapuagglutiniini, nautaseerumialbumiini (BSA) ja sentapainen, johon monospesifinen, synteettinen determinanttipeptidi on sidottu. Polymeeri, joka on valmistettu sitomalla useita tämän keksin-

11 80601 nön mukaisia peptidejä hapetettujen systeiinipääteryhmien päästä-päähän-sidosten välityksellä, saattaa myös käsittää eksogeenisen, kantajaeta vapaan rokotteen yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän laimentimen kanssa. Kaikissa tapauksissa tämän keksinnön mukainen peptidi toimii spesifisenä antigeenisenä determinanttina. Antigeenisen peptidin "tehokas määrä" riippuu useista tekijöistä. Näihin tekijöihin sisältyy suojattavan isäntäeläimen ruumiinpaino ja laji, kantaja, kun sitä käytetään, apuaine, kun sitä käytetään, se lukumäärä rokotuksia, jota halutaan käyttää, ja eläimelle halutun suojan kestoaika. Yksittäiset rokotteet sisältävät yleensä noin 20 mikrogramma - noin 2 milligrammaa synteettistä antigeenistä peptidiä, lukuunottamatta kantajaa, johon peptidi voi olla sidottu. Kun tämän keksinnön mukainen antigeeninen rokote viedään haluttuun ieäntåeläimeen, se panee alulle vasta-aineiden tuotannon isäntäeläimeseä edellä mainitulle antigeeniselle peptidille ja sen sukuiselle Picornavirukeelle, kuten poliolle. Rokotteet, jotka sisältävät tehokkaita määriä tämän keksinnön mukaisia peptidejä, eivät ainoastaan pane alulle vastaaineiden tuotantoa isäntäeläimessä, vaan näitä vasta-aineita tuotetaan riittävässä määräesä suojaamaan isäntäeläintä polion tai jonkin toisen Picornaviruksen aiheuttamalta infektiolta. Isäntäeläimen suoja voidaan määrätä kasvatettujen vasta-aineiden neutralointitason avulla ja/tai neutralointiindekein avulla, kuten jäljempänä tarkemmin esitetään. Keksintö käsittää myöskin sellaisia antigeenejä, joissa koko tai osa kokonaisesta kantajaeta on antigeeninen. Näin ollen voidaan käyttää, tai olla käyttämättä, erillistä kantajaosaa. Synteettinen antigeeni, joka on valmistettu sitomalla polion monospesifinen, synteettinen, antigeeninen determinanttipeptidi antigeenikantajaan, sekä myöskin menetelmät tällaisten synteettisten antigeenien valmistamiseksi, ovat esillä olevan keksinnön spesifisiä aspekteja.

12 80601 Yleensä voidaan muodostaa eynteettinen antigeeni seuraavilla vaiheilla: valmistetaan Picornaviruesukuinen peptidi, joka immunologieesti vastaa tai vastaa olennaisesti polion antigeenisiä determinantteja, ja liitetään eynteettinen determinantti farmaeeuttiseeti hyväkeyttävään kantajaan erillisella synteettisellä vaiheelle. Menetelmä rokotteiden valmistamiseksi käsittää polion monospeeifisen, synteettisen antigeenisen determinanttipeptidin syntetisoinnin, joka peptidi antigeenisesti on polion VP 1 - proteiinin tarkoin määrätyn determinanttiosan kaksoiskappale tai olennaisesti sen kaksoiskappale. Synteettinen peptidi voi olla, muttei aina tarvitse olla, sidottu kantajaan, jotta saataisiin antigeeni, jonka antigeenisyys on sama kuin polion monospesifisen antigeenisen determinanttipeptidin, ja joka vietynä isäntäeläimeen yhdessä fysiologisesti siedettävän laimentimen kanssa, panee alulle vasta-aineiden tuotannon popoliovirukselle. Menetelmässä vasta-aineiden valmistamiseksi, edellä kuvattua rokotetta injieoidaan isäntäeläimeen ja proteiiniantigeenia vastaan, isäntäeläimessä kasvatetut vasta-aineet otetaan talteen ieäntäeläimen nesteistä, joita vasta-aineita käytetään tavanomaisissa diagnostisissa menetelmiesä proteiinin vastaaineiden esiintymisen osoittamiseksi tai terapeuttisina aineina passiivista immuuniprofylakeiaa varten. On ymmärrettävä, että vaikkakin keksinnön mukaisten rokotteiden ja vasta-ainevalmieteiden valmistukseen sisältyy useita menetelmävaiheita, kuten jäljempänä esitetään yksityiskohtaisesti, niin keksintö ei ole rajoitettu minkään erityisen vaiheen tai reagenesin tai olosuhteen käyttöön, vaan keksintö on pikemminkin käsitettävä sellaiseksi kuin ee on esitetty edellä ja määritelty yksityiskohtaisesti oheisissa patenttivaatimukeisea.

13 80601 Peptidievnteesi Jäljempänä esitetyt peptidit syntetisoitiin käyttäen tunnettuja menetelmiä [ks. eeim. Marglin, A, ja Merrifield, R.B., Ann. Rev. Biochem., 39:841-866 (1970)7. Peptidit liitettiin proteiinikantajan KLH eysteiinitähteen välityksellä, joka systeiinitähde tavallisesti liitettiin peptidin karboksipäätteeseen, ellei toisin mainita. Synteettinen sitomisvaihe, jossa peptidi sidottiin proteiinikantajaan, suoritettiin, ellei toisin esitetä, liittämällä syeteiinin rikkiatomi kantajan ja N-maleimidobentsoyyli-N-hydroksi-sukkiini-imidieeterin <MBS) välisen reaktiotuotteen kaksoissidokeeen, noudattaen yleistä menetelmää, joka on esitetty aikakausjulkaisuesa Liu et al., Biochemietry, 18:690-697 <1979). Synteesi tapahtuu siten, että a) aikaansaadaan liukenematon hartsi, jossa on suuri määrä kloorimetyyliryhmiä; b) esteröidään hartsiin Boc-(MeoBz1)-Cys-OH; c) poistetaan Boc-ryhmä vapaan aminoryhmän muodostamiseksi Cys-tähteeseen, d) saatetaan vapaa aminoryhmä reagoimaan toisen aminohapon ylimäärän kanssa, jolla toisella aminohapolla on seuraavat ominaisuudet: <i) siinä on vapaa karboksyyliryhmä, (ii) sen aminoryhmä on sidottu Boc-ryhmään ja <iii) siinä on mandollisesti reaktiivieia sivuryhmiä, jotka on sidottu suojaryhmään ja muodostavat amidiryhmän; e) poistetaan mainitun toisen aminohapon ylimäärä; f) poistetaan viimeksi mainittu Boc-ryhmä vapaan aminoryhmän muodostamiseksi, g) toistetaan vaiheet d), e) ja f) käyttäen aminohappoja sekvenesien <1)-<4) mukaisesti kunnes hartsiin on syntetisoitu vastaava suojattu peptidi; ja h) poistetaan syntetisoitu, suojattu peptidi harteista ja poistetaan peptidistä mandolliset suojaryhmät.

14 80601 Esimerkki 1 Peptidin <1) SerllePheTyrThrTyrGlyThrAlaProAlaArglleSerVal- ProTyrValGlylle synteesi Peptidejä syntetisoitiin Marglinin ja Merrifieldin, jne. (Marglin, A., Merrifield, R.B.A., Rev. Biochem, 39 (1970), 841-866; Houghten, R.A., Chang, W.C., Li, C.H., Int. J. Peptide Protein Ree., 16 (1980) 311-320, Sutcliffe, J.G., et al., Nature, 287 (1980) 801-805) kiinteän faasin menetelmän avulla käyttäen peptidisyntetisaattoria mallia Beckmar Model 990B. Alkuperäinen aminohappohartsi valmistettiin esteröimällä Boc-(MeoBzl)-Cye-OH (2 g sen vedetöntä keeiumsuolaa, 4,3 milliekvivalenttia) ja kloorimetyloitua harteia (polystyreeniä- 1 % divinyylibenteeeniä, bio-helmiä, koko 1200-400 meeh, 0,7 mmol g ) 25 ml:sea vedetöntä dimetyyliformamidia (DMF) se- 0 koittamalla 24 h 50 C:eea. Kolminkertaisen ylimäärän kesium- suolaa aktiiviseen kloridipolymeeriin nähden todettiin anta- van melkein täydellisen substituution. Substituution todet- 1 tiin olevan 0,55 milliekvivalenttia x g pikriinihappokokeen ja aminohappoanalyysin - avulla ja sen todettiin olevan 0,53 milliekvivalenttia x g HC1-propionihappohydrolyysin jälkeen. Jokaista synteesiä varten käytettiin 1,0 g (0,53 milliekvivalenttia) Boc-(MeoBz1)-Cye-hartsia. Synteesissä käytettiin seuraavia sivuketjujen suojaryhmiä; tyrosiiniile käytettiin 0-Bri; treoniinille ja seriinille 0-bentsyyli ja arginiinille toeyyli. Suojatut aminohapot (Vega Biochemicaleiita ja Peninsula Laboratoriesilta) kiteytettiin uudelleen sopivasta liuottimeeta kunnes niistä saatiin TLC:lla yksittäiset piikit (kloroformi/etikkahappo = 15:1 tai kloroformi/metanoli = 10:1). Kaikki liittymiset suoritettiin kymmenkertaisella ylimäärällä Boc-AAOH:a. Pikriinihappotestin mukaan kaikki liittymiereaktiot saatettiin 99-prosenttisesti päätökseen. Suojatut peptidipolymeerit <500 mg - 2,5 g, 0,12-0,60 milli-

15 80601 ekvivalenttia) käsiteltiin kaksinkertaisella painomäärällä anisolia ja 40-kertaisella tilavuudella (suhteessa painoon) 0 vedetöntä fluorivetyä 4 C:esa 1 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun fluorivety oli haihdutettu pois typpivirran avulla, punainen jäännös sekoitettiin vedettömään eetteriin <50 x, paino/tilavuus) ja sekoitettiin voimakkaasti 15 minuuttia: tämän eetteriuuton kolminkertaisen toiston jälkeen valkoinen jäännös suodatettiin ja kuivattiin vakuumissa. Tämä kuivattu hartsipeptidiseos eketrahoitiin yleensä 5 %:11a etikkahappoa, lyofilisoitiin ja analysoitiin aminohappojen suhteen (tällä tavalla harteista poistettiin suunnilleen 90 % peptidistä). Mikäli aminohappoanalyysi oli tyydyttävä (+ 5 % teoreettitisesta) edellä kuvatulla tavalla valmistetut peptidit käytettiin suoraan; ellei, ne puhdietettiin toivottuun puhtauteen tarvittaessa CMC-kromatografian, partitiokromatografian tai HPLC-kromatografian avulla. Saannot olivat välillä 20-60 % riippuen peptidistä ja halutusta puhtausasteesta. Peptidit liitettiin tarvittaessa proteiinikantajaan, KLH, peptidin kysteiinin kautta, jolloin käytettiin N-maleimidobentsoyyli-Nhydrokeimeripihkahappoesteriä <MBS) liittämisaineena kuten Liu et al. <Liu, F., Zinnecker, M., Hamaoka, T., Katz. D.H., Biochemietry, 18 (1979) 690-697) ovat kuvanneet. Synteeeistä saatiin peptidi (1), joka mandollisesti oli liitetty proteiinikantajaan. Esimerkki 2 Peptidin (2) SerIlePheTyrThrTyrGlyAlaAlaProAlaArgIleSerVal- ProTyrValGlyIle synteesi Peptidi (2) syntetisoitiin samalla tavalla kuin peptidi (1) esimerkissä 1 paitsi, että aminohappojen lisäysjärjestys vastasi peptidin (2) aminohappotähdeeekvenesiä.

16 80601 Esimerkit 3 ia 4 Peptidien <3) SerllePheTyrThrTyrGlyThrAlaProAlaArglleSerVal- ProTyrValGlyLeu ja <4) SerIlePheTyrThrTyrGlyAlaAlaProAlaArgIleSerValProTyrVal- GlyLeu synteesi suoritettiin samalla tavalla kuin esimerkissä 1 paitsi, että aminohappojen lisäysjärjestys vastasi peptidien (3) ja (4) aminohappotähdeeekveneeiä. Poliovirusta koskevat synteettiset peptidit On valmistettu useita synteettisiä peptidejä, joista jokainen sisältää noin kandenkymmenen aminohappotähteen sekvensein. Neljä näistä sekvensseietä vastaa pääasiassa Mahoney'n ja Sabin'in tyyppiä 1 olevien ja Leon'in tyyppiä 3 olevan polioviruksen VP 1 -kuoriproteeiinien aminohapposekveneeiä aminohappoasemien alueella noin 182:sta noin 201:een. Mahoney'n ja Sabin'in tyyppiä 1 olevien poliovirusten VP 1 -aminohappotähdesekvenseit ovat identtisiä eeitetyillä alueilla. Nämä neljä eekvenssiä on esitetty jäljempänä PP2-merkityn tämän kekeinnön mukaisen synteettisen peptidin sekvenssinä vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäätteestä karbokeipäätettä kohti seuraavasti: PP2: SerIlePheTryThrTyrGlyThr<A1a)AlaProAlaArgIleSer ValProTyrValGlyIle<Leu), jossa suluissa esitetyt aminohappotähteet kummassakin edellä esitetyseä sekvenesiseä voi riippumattomasti korvata välittömästi sulusta vasemmalla olevan viereisen aminohappotähteen, siis lähempänä aminopäätettä olevan aminohappotähteen. Vertailua varten voidaan nähdä, että PP2-aminohappotähdesekveneei vastaa pääasiassa tyyppiä 1 ja 3 olevien poliovirusten VP 1 - kuoren aminohappotähdeeekvenseiä alueella noin 182:sta noin 201:een. Edellä esitetty PP2-aminohappotähdesekvensei edustaa vähintään neljää keksinnön mukaista peptidiä. Alueen neljällä synteettisellä peptidillä on seuraavassa esitetty aminohappoeekvensei, joka on merkitty PP2a, PP2b, PP2c ja PP2d:

17 80601 PP2a: SerIlePheTyrThrTyrGlyThrAlaProAlaArgIleSer ValProTyrValGlyIle PP2b: SerIlePheTyrThrTyrGlyAlaAlaProAlaArgIleSer ValProTyrValGlyIle PP2c: SerIlePheTyrThrTyrGlyThrAlaProAlaArgIleSer ValProTyrValGlyLeu PP2d: SerIlePheTyrThrTyrGlyAlaAlaProAlaArgIleSer ValProTyrValGlyLeu Koemenetelmät ia rokotukset Jokainen kuvassa esitetyistä neljästä synteettiseetä peptidistä syntetisoitiin, samoin kuin useita muita peptidejä, jotka vastasivat tyyppiä 1 olevan polioviruksen VP 1 -kuoren muita asemia, käyttämällä edellä esitettyä menetelmää, jotka on selostettu artikkelissa Bittle et.al., Nature, 298; 30-33 (heinäkuu 1982). Lisättiin karboksi-pääte-cys-tähteitä kytkentää varten N-maleimidobentsoyyli-N-hydroksieukkiiniimidiesterin (MBS) ja avaimenreikämaljakotilo-hemosyaniinin välityksellä kantajina konjugaattien muodostamiseksi, käyttämällä edellä esitettyä menetelmää. Konjugaateista, joiden sekvenssit vastasivat tyyppi 1:n kuoriproteiineja, tehtiin rokotteita käyttäen niitä peptidimääriä annosta kohti ja niitä kolmea apuainejärjeatelmää, jotka on esitetty mainitun Bittle et al:in taulukon 1 alla. Rokotettuina isäntäeläiminä käytettiin kaneja. Tehokkuusmäärityksiä tehtiin määrittämällä ne vasta-aineseerumin laimennukset, jotka saivat aikaan 50 %:esa kiinteistä viljelyputkista, jotka sisälsivät yksikerrokeisia soluviljelmiä, euojauksen tartunnalta lisättäeseä tyyppi 1 poliovirusta. BSC-1-soluja kasvatettiin L-15-väliaineesea 5 % naudaneikiön seerumissa. Kun viljellyt solukerrokset olivat muodostuneet, istutettiin putkiin ennalta määrätty määrä eläviä Sabin'in tyyppi 1 polioviruspartikkeleita ja rokotettujen kanien seerumia. Istutettuja

18 80601 viljeltyjä soluja tarkastettiin sopivien vertailujen kanssa 2-8 päivää tämän jälkeen. Polioviruspartikkeleita istutettiin kudosviljelmän tartunta-annoksen (TCID) kerrannaisina, jolloin yksinkertainen annosmäärä on riittävä tartuttamaan ja tappamaan 50 % samanlaisista yksikerroksisista viljellyistä soluista (TCID ), kuten määritettiin ennen jokaisen määrityssarjan suorittamista. 50 Näiden määritysten vähimmäis-tcid 50 oli 50, siis istutukseen käytettiin 50 kertaa TCID 50 polioviruspartikkeleita. Käytettiin kerrannaisia 50, 100, 900 ja 1000 TCID 50 seerumlaimennuksen ollessa 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 ja 1:256 vastaseerumin tiitteriarvojen saamiseksi tavanomaista tekniikkaa käyttämällä. Kutakin seerumi-virus-laimennusta varten käytettiin ainakin neljää yksikerroksista viljelmää sisältävää astiaa tai putkea. Yksi tai kaksi kania rokotettiin eri kantajaan kytketyillä peptideillä noudattamalla edellä esitettyä rokotusjärjestystä. Näiden määritysten tulokset on esitetty alla olevassa taulukos- sa 10. Tyyppi 1 polion vasta-aine-neutralointitiitterit soluissa eri peptideillä Taulukko 10 viljellyissä KLHL-peptidi Polioviruksen istutus TCID :n kerrannaisina 50 Antigeeni 1 50 2 100 2 900 2 1000 2 12-40 8-3 - - 61-80 48 27 18 86-103 - - - - 121-140 - - - - 161-180 -, 14 -,- -,- -,- 182-201 40, 32 27, 25 13, 20 11, 13 202-222 -,- -,- -,- -,- 244-264 13,- -,- -,- -,- 265-285 -,- -,- -,-, -,- 286-301 16, 13 10, 8 -,- -,-

19 80601 1 Numerot tarkoittavat aminohappotähteiden asemaa aminopäätteestä laskien Mahoney-tyyppiä VP 1 olevassa kuoressa, jota keksinnön mukaisten synteettisten peptidien aminohappotähteiden sekvenssi pääasiassa vastaa. 2 Tiitterit on esitetty seerumin niinä laimennuksina, joita tarvitaan 50 % suojauksen aikaansaamiseksi kullakin TCID 50 - kerrannaisella. Tiitteri 8 tarkoittaa täten, että seerumin 1-8 laimennusta sai aikaan halutun suojauksen jne. Tässä taulukossa tarkoittavat viivat että tiitteri oli alle 1:8. Kaksi tiitteriarvoa osoittaa, että kaksi kania rokotettiin esitettyä peptidiä sisältävänä rokotteella. Edellä esitetyt arvot osoittavat, että poliotyypin 1 VP 1 -kuoressa on kaksi antigeenideterminanttialuetta. Nämä determinanttialueet sijaitsevat aminohappotähdeasemissa noin 61-80 ja asemissa noin 182-201. Arvot osoittavat myös, että peptidi, joka vastasi pääasiassa asemia noin 182-201, sai aikaan suojauksen suuremmalla viruskonsentraatiolla kuin toinen peptidi. Picornavirusta koskevat synteettiset Peptidit Edellä esitetyt polioviruksen antigeeniaillä kuoriproteiineilla saadut tulokset edustavat laajemman keksinnön kahta spesifistä sovellutuemuotoa, joka keksintö kohdistuu yleisesti Picornavirusten heimoon eikä poliovirukseen. Tämä laajempi keksintö koskee synteettisiä antigeenisiä peptidejä, joista jokainen sisältää noin 20 aminohappotähteen sekvensein, joka ainakin aminohappotähteiden sekvenssin osalta vastaa Picornaviruksen antigeenisen kuoriproteiinin aluetta, joka löytyy noin 60-75 %:n päässä aminohappotähteiden sekvenssin pituu-

20 80601 desta antigeenisen kuoriproteiinin aminopäätteestä. Nämä synteettiset peptidit ovat neutraaleja ja niissä on neutraali tai mieluummin positiivinen nettoionivaraus fysiologisissa pharvoissa, lukuunottamatta mandollista karboksyyli- tai alfaaminopääteryhmistä johtuvaa varausta. Neutraalin tai positiivisen nettovarauksen olemassaolo voidaan helposti määrittää elektroforeesimääritykeellä fysiologisissa ph-arvoissa tai tutkimalla aminohappotähdesekvenseiä ja tuntien erillisten aminohappotähteiden pk a -arvot. Edellä esitettyjä oynteettieiä peptidejä voidaan käyttää yksin polymeerinä, jossa peptidiyksiköt on kytketty yhteen hapetetuilla systeiinitähteillä, tai kytketty kantajaan konjugaattina yhdessä fysiologisesti siedettävien laimentimien, kuten veden tai apuaineen kanssa rokotteen muodostamiseksi, joka annettuna isäntäeläimeen tehokkaana määränä kykenee synnyttämään vasta-aineiden tuotannon, jotka reagoivat sen Picornaviruksen kanssa, jonka kuoriproteiinin sekvenssiä peptidi vastaa tai pääasiassa vastaa, suojaten täten isäntää tältä Picornavirukselta. Tätä eynteettistä peptidiä, joko yksin polymeerinä tai konjugaattina, voidaan myös käyttää edellä esitetyllä tai jäljempänä esitettävällä tavalla niitä noin 20 aminohappotähdettä sisältäviä peptidejä varten, joiden sekvenesit vastaavat tai pääasiassa vastaavat edellä esitettyä aminohappotähdesekvenssiä. Tutkittaessa edellä esitetyn tyyppiä 1 olevan poliovirukeen arvoja huomataan, että peptidit, joiden eekvenesit vastaavat pääasiassa kuoren aminohappotähdeasemia noin 182:sta noin 201: een aminopäätteestä laskien, ovat huomattavia neutraloivien vasta-aineiden tuottajia tätä virusta vastaan. Synteettinen peptidi määrittelee tällöin tyyppiä 1 olevan poliovirukeen neutraloivia vasta-aineita tuottavan determinanttialueen.

21 80601 Tyyppiä 1 olevan polioviruksen antigeeninen kuori sisältää yhteensä 302 aminohappotähdettä sekvenesissään. Tyyppiä 1 olevan polioviruksen neutraloivia vasta-aineita tuottava determinantti sijaitsee täten alueella noin 60-66 %:n etäisyydellä tämän antigeenisen kuoren aminohappotähdesekvenssin aminopäätteestä, laskettuna edellä esitetyllä tavalla. Kuvassa esitettyjä aminohappotähdesekvenssejä ja helposti saatavia asiaan kuuluvia pka -arvoja tutkittaessa huomataan, että kunkin sekvensein niiden tähteiden, joilla on positiivinen ionivaraus fysiologisissa ph-arvoissa (Arg, Lys ja His), lukumäärä on suurempi kuin niiden tähteiden, joilla on negatiivinen ionivaraus näissä ph-arvoissa <Asp ja Glu), lukumäärä kaikissa sekvenseeissä paitsi yhdessä. Tämän keksinnön mukaisilla synteettisillä antigeenisillä peptideillä on tyypillisesti neutraali tai positiivinen nettovaraus, lukuunottamatta amino- ja/tai karboksyylipääteryhmien aiheuttamia mandollisia ionivarauksia. Mieluimmin näillä peptideillä on positiivinen nettoionivaraus. Nämä peptidit ovat myös mieluimmin

22 80601 vesiliukoisia. Näyttää kuitenkin siltä, että synteettisen antigeenisen peptidin neutraali tai positiivinen nettoionivaraus ei ole yhtä tärkeä peptidin antigeenisyyteen nähden-kuin se seikka, että peptidin aminohappotähdesekvenssi vastaa ainakin neutraloivia vasta-aineita tuottavan antigeenisen kuoren aminohappotähdesekvenssiä, joka sijaitsee alueella noin 60-75 % sekvenssin pituudesta aminopäätteestä. Diagnostiikka Keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää diagnoosikokeiden, kuten immuunikokeiden, valmistamiseen, joissa on välttämätöntä, että on käytettävissä löydettävän organismin vasta-aine tai synteettinen antigeeni, joka jäljentää löydettävän organismin determinanttia. Tällainen diagnostiikka käsittää esimerkiksi entsyymi-immuunikokeet, fluoresenssi-immuunikokeet ja muun tekniikan, jossa joko vasta-aine tai antigeeni on merkitty todettavalla merkkiaineella. Käytettäessä esimerkiksi Voller et al:in, "Enzyme Immune Assays in Diagnostic Medicine", Bulletin of the World Health Organization, Vol. 53, s. 55-65 (1976), esittämää kaksoisvasta-ainetekniikkaa voidaan käyttää ELISA-koetta diagnoosikokeen aikaansaamiseksi. Edellä esitetyt vasta-peptidin vasta-ainetiitteriarvot saatiin käyttämällä kaksoisvasta-aine-elisa:a samoin kuin edellä esitetyn Bittle et al:in taulukossa 1 esitetyt arvot. Tiedot tästä ELISA:sta on esitetty Bittle et al:in taulukon 1 alla. Tämän keksinnön mukainen diagnostinen järjestelmä Picornaviruksen antigeenin läsnäolon toteamiseksi sisältää keksinnön mukaisen peptidin avulla muodostettuja vasta-aineita biologisesti aktiivisessa muodossa yhdessä välineen kanssa immuunireaktion toteamiseksi. Sekoitettaessa ruumiinkomponenttiin, kuten seerumiin, virtsaan tai kudosuutteeseen, vasta-aineet immuunireagoivat Picornaviruksen antigeenin kanssa muodostaen immuunireaktantin, ja indikaatioväline ilmaisee tämän immuunireaktion.

23 80601 Ruumiinkomponentti voidaan esimerkiksi päällystää ELISA-koeputkelle ja inkuboida keksinnön mukaisilla vasta-aineilla, kuten kaneissa synnytetyillä, käyttämällä hyvin tunnettua tekniikkaa. Kun kaikki mandollisesti ei-immuunireagoineet vasta-aineet on puhdistamalla poistettu, lisätään toinen entsyymisidottu vasta-aine, joka on muodostettu ensin mainittua tyyppiä olevan vasta-aineen avulla, kuten vuohi-vastakanivasta-aineita, jotka sisältävät sidottua alkaalista fosfataasia, ja inkuboidaan ELISA-putkessa. Toisten vasta-aineiden mandollinen ylimäärä poistetaan puhdistamalla jättäen kaikki ne fosfataasisidotut vuohi-vastakani-vasta-aineet, jotka sitoutuvat keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen, ELISA-putkeen. Entsyymisubstraatin, kuten p-nitrofenyylifosfaatin myöhempi sekoittaminen saa aikaan merkin immuunireaktantin muodostumisesta ja täten että ruumiinkomponenttiin sisältyi Picornaviruksen antigeeni. Keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen voidaan sitoa radioaktiivinen alkuaine, kuten 125 J, inkubointivälineen muodostamiseksi. Tällöin voidaan esimerkiksi ruumiinkomponentti esipäällystää koeputkelle, minkä jälkeen inkuboidaan radioaktiivisilla vasta-aineilla ja vasta-aineiden ylimäärä poistetaan puhdistamalla putkesta. Putkeen puhdistuksen jälkeen jäävä radioaktiivisuus muodostaa merkin immuunireaktantin syntymisestä. Tämän keksinnön eräs toinen sovellutusmuoto koskee diagnostista järjestelmää Picornaviruksen antigeenin läsnäolon toteamiseksi edellä esitetyn tapaisessa ruumiinkomponentissa. Tämä järjestelmä on erikoisen edullinen kilpailevissa kokeissa ja se käsittää eri säiliöissä olevan ensimmäisen reagenssin ja toisen reagenssin. Ensimmäinen reagenssi sisältää keksinnön mukaisen synteettisen antigeenisen peptidin biologisesti aktiivisessa muodossa. Toinen reagenssi sisältää biologisesti aktiivisessa muodossa olevia vasta-aineita, jotka reagoivat tällaisen peptidin kanssa, kuten peptidin avulla muodostettujen vasta-aineiden kanssa. Järjestelmään sisältyy myös väline peptidin ja vasta-aineiden välisen

24 80601 immuunireaktion osoittamiseksi, joko eri säiliössä, kun käytetään fosfataasisidottuja vuohi-vastakani-vasta-aineita ja tämän substraattia, tai yhdessä vasta-aineiden kanssa, kun radioaktiivisia alkuaineita on sidottu vasta-aineisiin. Ennalta määrättyjen ensimmäisen ja toisen reagenssin määrien sekoittaminen koestettavan ruumiinkomponentin ennalta määrätyn määrän läsnäollessa saa aikaan tietyn laajuisen immuunireaktion, jonka ilmaisuväline osoittaa. Immuunireaktion määrä on erilainen kuin tunnetun immuunireaktion määrä, kun ruumiin komponenttiin sisältyy Picornaviruksen antigeeni. Tavanomaisessa käytännön suorituksessa ruumiinkomponentti esiinkuboidaan vasta-aineella ja tämä koostumus inkuboidaan sitten ELISA-putken seinään sidotulla peptidillä. Putken puhdistaminen vasta-aine-picornavirusantigeenikompleksin poistamiseksi jättää peptidin ja vasta-aineen immuunireaktantin, jonka läsnäolo ja määrä voidaan osoittaa ilmaisuvälineen avulla. Kokonaisten, koskemattomien, biologisesti aktiivisten vastaaineiden käyttö ei ole välttämätön monessa diagnostisessa järjestelmässä, kuten edellä esitetyssä kilpailevassa kokeessa. Pikemmin tarvitaan vain vasta-ainemolekyylin biologisesti aktiivista idiotyyppiä sisältävää, antigeeniä sitovaa tunnustusosaa. Idiotyyppiä sisältäviä vasta-aineosia havainnollistavat Fab:na ja F(ab') 2 :na tunnetut vasta-aineosat, joita valmistetaan tyypillisesti kokonaisilla vasta-aineilla suoritetuilla hyvin tunnetuilla entsymaattisilla reaktioilla. Kokonaisia, vahingoittumattomia vasta-aineita, Fab-, F(ab') 2 - osia ja sen tapaisia, jotka sisältävät vasta-aineiden idiotyyppisiä alueita, kutsutaan tässä idiotyyppiä sisältäviksi polyamideiksi. Sanontaa "idiotyyppiä sisältävä polyamidin käytetään oheisissa patenttivaatimuksissa kattamaan tällaisten diagnostisissa tuotteissa tai menetelmissä hyödyllisten molekyylien ryhmän. Vaikkakin Fab- tai F(ab') 2 -vasta-aineosia voidaan käyttää diagnostisen menetelmän tai tuotteen idiotyyppiä sisältä-

25 80601 vässä polyamidissa, käytetään tavallisesti mieluummin kokonaisia, koskemattomia vasta-aineita, senkin takia, että vasta-aineen Fab- tai F(ab') -osan valmistaminen edellyttää lisäreaktioita 2 ja seerumien puhdistusta. Menetelmät ja kirjallisuus Tälle keksinnölle ainutlaatuisia menetelmiä ja aineita selostetaan viittaamalla kulloinkin kyseiseen menettelyyn. Yleensä ovat kuitenkin laboratoriotekniikka, menetelmät ja käytetyt aineet samoja kuin molekyylibiologiassa ja biokemiassa yleisesti käytetyt. Viitataan erityisesti seuraaviin teoksiin METHODS IN ENZYMOLOGY, Colowick, S.P. ja Kaplan, N.O., Editors, Academic Press, New York; METHODS IN IMMUNOLOGY AND WH=OCHEMISTRY, Academic Press, HANDBOOK OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Chemical Rubber Publishing Company, ja CELL BIOLOGY: A COMPREHENSIVE TREATISE, Goldstein ja Prescott, Academic Press, N.Y., N.Y. mielenkiintoa olevien yleisten aineiden ja menetelmien selostamiseen nähden. Seuraavat julkaisut esittävät erityisiä tunnettuja vaiheita ja menetelmiä samoin kuin tekniikan nykyistä tasoa:

26 80601-1. Kirjallisuus Baltimore, D., Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biol. 39, 1187-1200 (1974). 2. Oskarsson, M.K., Eider, J.H., Gautsch, J.W., Lerner, R.A. and Vande Woude, G.F., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 75, 4694-4698 (1978). 3. Gautsch, J.W., Eider, J.H., Schindler, J., Jensen, F.C., ja Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 75, 4170-4174 (1978). 4. Jamjoon, G.A., Naso, R.B. ja Arlinghaus, R.B., Virol. 78, 11-34 (1977). 5. Famulari, N.C., Buchhagen, D.L., Klenk, H.D., ja Fleissner, E., J. Virol. 20, 501-508 (1976). 6. Witte, O.N., Tsukamoto-Adey, A. ja Weissman, L.L., Virol. 76, 539-553 (1977). 7. Fan, H. and Verma, I.M., J. Virol. 26, 468-478 (1978). 8. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Lerner, R.A., Johnson, P. ja Verma, I.M., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, in press (1979). 9. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Verma, I.M. ja Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. in press (1980). 10. Xarglin, A. ja Merrifield, R.B., Ann. Rev. Biochem. 39, 841-866 (1970). 11. Pederson, F.S. ja Haseltine, W.A., J. Virol. 33, 349-365 (1980). 12. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Sup. 3, M.O. Dayhoff, ed., Natl. Biomed, Res. Found., pub. Washington, D.C. (1978). 13. Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. ja Orcutt, B.C., pp. 352, op. cit. 14. Fisher, R.A., The General Theory of Natural Selection, Clarendon Press, Oxfore (1930). 15. Eider, J.H., Gautsch, J.W., Jensen, F.C., Lerner, R.A., Harley, J.W. ja Rowe, W.P., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 74, 4676-4680 (1977).

27 80601 16. Lerner, R.A., Jensen, F.C., Kennel, S.J., Dixon, F.J., Roches, G.D. ja Francke, U., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 69, 2965-2969 (1972). 17. Niman, H.L. ja Elder, J.H., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., in press (1980). 18. Edwards, S.A. ja Fan, H., J. Virol. 30, 551-563 (1979). 19. Kitagawa, T. ja Ailawa, T., J. Biochem. (Tokyo) 79, 233 (1976). 20. Liu, F., Zinnecker, M., Hamaoka, T. ja Katz, D.H. Biochem. 18, 690 (1979). 21. Katz, David H., U.S. Patent No. 4,191,668, March 4, 1980. 22. J. Exp. Med., 134: 201-203 (1971). 23. J. Exp. Med., 136: 426-438,.1404-1429 (1972). 24. J. Exp. Med., 138: 312-317 (1973). 25. J. Exp. Med., 139: 1446-1463 (1974). 26. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 71: 3111-3114. 27. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 73: 2091-2095 (1976). 28. J. Immunol. 144: 872-876 (1975). 29. J. Immunol. 120: 1824-1827 (1978). 30. J. Exp. Med., 139: 1464-1472 (1974). 31. Humphrey, J.H. ja White, R.G., Immunology for Students of Medicine, Blackwell, Oxford (1970). 32. Katz, David H. and Benacerraf, Baruj, Immunological Tolerance, Mechanisms and Potential Therapeutic Applications, Academic Press (1974). 33. Newsweek, March 17, 1980, pp. 62-71. 34. Chemical & Engineering News, June 23, 1980, p. 10. 35. Milstein, C., Differentiation 13: 55 (1979). 36. Howard, J.C., Butcher, G.W., Galfre', G., Milstein, C. ja Miistein, C.P., Immunol. Rev. 47: 139 (1979). 37. Hammerling, G.J., Hammerling, U., ja Lemke, H., Immunogenetics 8: 433 (1978). 38. Shulman, M., Wilde, C.D., ja Kohler, G., Nature 276: 269 (1978).