Aineensiirto ja siihen vaikuttavat tekijät bioreaktorikasvatuksissa

Aineensiirto ja siihen vaikuttavat tekijät bioreaktorikasvatuksissa Fermentorissa on tärkeää varmistaa prosessin homogeenisuus, hapen saanti (aerobiset ja mikroaerobiset fermentoinnit) sekä lämpötilan säätö Hapen saanti hapen aineensiirto ilmastuksen kaasukuplista nesteeseen Lämpötilan säätö lämmönsiirto panossteriloinnissa ja fermentoinnissa Happi on aerobisen fermentoinnin ravinteista erikoisasemassa, koska se on erittäin niukkaliukoinen veteen ja vielä niukkaliukoisempi kasvuliemiin: Liukoisuus (kuten yleensäkin kaasujen liukoisuus) noudattaa Henryn lakia: C * = P C tot gas. i i = H Pi H C i * : i:n kyllästyspitoisuus nesteessä [mg L -1 ] P tot : kaasun absoluuttinen paine [bar] C gas,i : i:n pitoisuus kaasussa [til.- tai mooliosuus] H : Henryn vakio i:lle ko. olosuhteissa [L bar mg -1 ] P i : i:n osapaine kaasussa H:n arvoja löytyy käsikirjoista eri olosuhteissa eri kaasukomponenteille eri liuoksissa (happi veteen 25 o C: H = n. 0,026 L bar mg -1 ; 35 o C: n. 0,03 L bar mg -1 ); lämpötilan vaikutus: esim. C*=468/(31,6+T); C* [mg L -1 ] T [ o C] 1

Boylen laki ja Henryn laki sukellusfysiologiassa http://personal.fimnet.fi/laaketiede/kaisu.tapiovaara/korva-sukellus.htm Paineen kasvaessa ilmaa täytyy lisätä paineilmalaitteen avulla, jotta tilavuus voitaisiin säilyttää alkuperäisenä. Toisaalta ylös noustaessa ilma laajenee paineen pienentyessä. Ylimääräisen ilman on päästävä tällöin purkautumaan esim. keuhkoista, jotta ei syntyisi kudosvaurioita. Laitesukelluksessa ei koskaan saa pidättää hengitystä keuhkovaurion vaaran vuoksi. Sukelluslaite antaa ilmaa ympäristönsä paineella. Siksi kymmenen metrin syvyydessä ilmankulutus on kaksinkertainen pintaan verrattuna. Mitä syvemmälle sukelletaan, sen nopeammin säiliöiden ilma kuluu. Ilman vastus kasvaa ilman tihentyessä ja syvällä vaaditaan enemmän hengitystyötä. Erikoisilla heliumpitoisilla kaasuseoksilla voidaan hengitysvastusta vähentää suurissa syvyyksissä sukellettaessa. Paine aiheuttaa myös muutoksen kaasujen ominaisuuteen liueta nesteisiin. Henryn lain mukaan vakioisessa lämpötilassa tiettyyn nestemäärään liuenneen kaasun määrä on suorassa suhteessa paineeseen. Esimerkkinä voisi käyttää vaikka virvoitusjuomapulloa. Nesteeseen liuennut hiilidioksidi alkaa kuplia kun paineistetun pullon korkki aukaistaan. Sukellettaessa paineilman typpi liukenee kudoksen nesteisiin. Liuenneen typen määrä on riippuvainen syvyyden aiheuttamasta paineesta ja sukellusajasta. Liian nopeassa nousussa typpi saattaa alkaa kuplia verenkierrossa ja kudosnesteissä aiheuttaen ongelmia. Tilaa kutsutaan sukeltajantaudiksi eli dekompressiotaudiksi. 2

Hapen aineensiirto Hapen siirtyminen kaasukuplista kasvuliemeen ja soluille solut pystyvät nesteessä käyttämään vain liuennutta happea Tarkasteltaessa sarjassa olevia aineensiirtovastuksia hapelle (tai muulle niukkaliukoiselle kaasulle) todetaan, että suurin vastus vallitsee kaasukuplaa ympäröivässä nestefilmissä dc OTR = dt L = k L a ( C* CL ) OTR: oxygen transfer rate [g L -1 h -1 ] k L : hapen aineensiirtokerroin [m h -1 ] a: spesifinen aineensiirtopinta [m 2 m -3 ] C*: hapen kyllästyspitoisuus [g L -1 ] C L : hapen pitoisuus nesteessä [g L -1 ] a:n arvoa on vaikea mitata => k L ja a yhdistetään hapen volumetriseksi aineensiirtokertoimeksi [h -1 ] ja k L a:n arvoja voidaan määrittää kokeellisesti esim. sekoitusnopeuden, ilmastuksen, sekoitusjärjestelyjen (esim. sekoituselementtien lkm ja laatu), fermentorin geometrian jne. funktiona k L a:lle on löydettävissä myös erilaisia kokeellisia riippuvuuksia tyyliin: k L a = K (P/V) b v s c P: sekoitusteho v s : kaasun lineaarivirtausnopeus K,b,c: vakioita kokeellisella mittausalueella V: kasvuliemen tilavuus 3

Ilmastus Ilmastus Aerobiset organismit tarvitsevat happea aineenvaihduntaansa Hapen liukoisuus (9 mg/l H 2 O) Hiilidioksidin poisto Hapensiirtoon voidaan vaikuttaa Ilmastus Sekoitus Paine Hapella rikastus k L a kertoo hapensiirron tehokkuuden

Rajapintojen ylityksiä Kaasumolekyylin liukeneminen kasvatusliuokseen ja siirtyminen solun sisälle tapahtuu monen välivaiheen kautta 1. kaasumolekyyli siirtyy kaasun ja nesteen väliselle rajapinnalle (diffuusio) 2. rajapinnan lävitse ja rajapinnan ulkopuolelta nestefaasiin (diffuusio ja konvektio) 3. siirtyminen solun/entsyymin luokse (konvektio ja diffuusio) 4. biokatalyytin pintakerroksen lävitse (diffuusio) 5. siirtyminen sytoplasmisen membraanin läpi (diffuusio tai kuljetusmekanismit) Samat vaiheet liittyvät myös kiinteästä partikkelista liukeneviin ravinnekomponentteihin

Figure 10.8 1. Transfer from the interior of the bubble to the gas liquid-interface 2. Movement across the gas liquid-interface 3. Diffusion through the relatively stagnant liquid film surrounding the bubble 4. Transport through the bulk liquid 5. Diffusion through the relatively stagnant liquid film surrounding the cells 6. Movement across the liquid-cell interface 7. Diffusion through the solid to the individual cell (in a flocc, clump or solid particle) 8. Transport through the cytoplasm to the site of reaction

Hapen siirtoon vaikuttavia tekijöitä Substraattiin liuenneet komponentit (suolat, sokerit, hapot) usein pienentävät 5-25 % hapen liukoisuutta Pinta-aktiiviset aineet pienentävät liukoisuutta Laboratorio/tehdas suuri ero Hapen liukoisuus suurempi reaktorin pohjalla k L a :n mittaus Dynaaminen menetelmä Suora Sulfiittimenetelmä

Tässä on siis ioniyhdisteiden ja ei-ionisten yhdisteiden konsentraation vaikutus. Huom! ero siis alkuperäiseen kasvaa kun lisätään suolakomponentteja. Usein +ionin vaikutus on suurempi kuin ionin (kts. esim. Na+ ja Cl-)

Vaahdonesto ja k L a Vaahdonestoaineet alentavat paikallisesti nesteen pintajännitystä => kaasukuplien koko pienenee (= a kasvaa), mutta samalla k L pienenee (vaahdonestoaine kasvattaa filmikerroksen paksuutta kaasukuplan ulkopuolella, alentaa hapen diffuusiokerrointa sekä voi lisätä filmin viskositeettia; yhteisvaikutus k L a:han on siis yleensä negatiivinen 10

k L a kasvatuksen aikana Muutokset solujen, substraatin ja tuotteen konsentraatiossa muutokset viskositeetissa ja koalesenssissä (kuplat yhdistyvät) muutokset k L a:ssa 11

Ilmastus ja aineensiirto Ilmastus ilmoitetaan yksikössä vvm = volume per volume per minute; esim. ilmavirtaus 2 L min -1 5 L:n kasvuliemeen = 0,4 vvm; laboratoriofermentoinneissa usein yli-ilmastus (> 1 vvm); isommassa mittakaavassa tyypillisesti 0,2 0,6 vvm Kaasukuplan kokoon kasvuliemessä vaikuttaa useita tekijöitä: Ilmastusrenkaan toteutus (putki; rengas, jossa pieniä reikiä; sintteri tai membraani) Nesteen pintajännitys Sekoituksen aiheuttamien leikkausvoimien kuplia hajottava vaikutus Kaasukuplien yhteenliittyminen (ns. coalescence) Kasvatusalustat ja kasvuliemet ovat yleensä vaahtoavia ilmastuksen ja sekoituksen vaikutuksesta (pinta-aktiiviset aineet) => fermentointiin lisätään jotakin vaahdonestoainetta (antifoam agent), joka tuhoaa vaahdon 12

Hapen aineensiirto Ilmastuksen käytännön toteutus: Ilmastusilmassa vaadittava paine > (painehäviöt steriilisuodattimissa + kasvuliemen hydrostaattinen paine + painehäviö linjassa => puhallin (blower) vai kompressori Hydrostaattinen paine: 10 m vesipatsasta = n. 1 bar; fermentorin geometria vaikuttaa: 2 T V = π H Geometria: esim. H/T = 4 4 jos V = 100 m 3 => T =? ja H =? P hydrost =? Ilma esisuodatetaan ennen steriilisuodatinta Usein linjassa myös veden ja öljyn erottimet Mikroaerobisissa fermentoinneissa (varsinkin tutkimustyössä) ilmaan voidaan sekoittaa typpeä happipitoisuuden alentamiseksi (esim. 1-10 til-% happea) Aerobisissa fermentoinneissa hapen saatavuus on usein prosessin nopeutta (kapasiteettia) rajoittava tekijä => voidaan lisätä ilman happipitoisuutta OTR vaikuttavat tekijät: Ilman happipitoisuus (vol-% tai mol-%; ideaalikaasu) C* Fermentorin paine (kaasufaasin paine + hydrostaattinen paine C* (vaikuttaa myös C* CO2 ) Sekoitus (rpm, sekoituselementtien laatu ja määrä) ja ilmastus k L ja a Liuenneen hapen pitoisuus kasvuliemessä (C) C*-C (driving force) 13

Happitase Tyypillisiä k L a arvoja : Mikrotiitterilevyt 300 h -1 (eli n. 0,08 s -1 ) Mikrotiitterilevyt sekoitushaitoilla 500 Ravistelupullot 300 Ravistelupullot sekoitushaitoilla 600 Laboratoriofermentorit (CSTR) 1000 Tuotantofermentorit (>20 m 3 ) (CSTR) 600 Tuotantofermentorit (kuplakolonni) 300 Mikrobeilla ja fermentointiprosesseilla voidaan ilmoittaa kriittiset liuenneen hapen pitoisuudet C crit kun C > C crit esim. µ tai r P eivät ole C:n arvosta riippuvaisia; kun C < C crit niin µ, r P = f(c) C:tä fermentointien yhteydessä merkitään yleensä DO (dissolved oxygen) ja se ilmoitetaan % kyllästysarvosta ko. olosuhteissa (0 100 %) Kun fermentori siirrostetaan C = 100 % (esim. 6 mg/l). Kasvualustassa driving force (C*-C) on itse asiassa hyvin pieni => C laskee nopeasti. Solumassan kasvun myötä jossain vaiheessa C = C crit. Tällöin voidaan aloittaa liuenneen hapen säätö esimerkiksi lisäämällä sekoitusnopeutta => kun OUR=OTR on C = vakio dc dt = OTR OUR 14

DO-mittaus Tavallisin anturi on ns. polarografinen DO-anturi, jossa Pt-katodi on eristetty kasvuliemestä vain kaasuja läpäisevällä hydrofobisella kalvolla (esim. teflon); katodi on elektrolyyttinesteessä (kylläinen KCl); happimolekyylit pelkistyvät katodilla (ottavat vastaan elektroneja), kun katodin ja anodin välillä vallitsee sopiva polarisaatiojännite (500 800 mv); muodostuva virta (na luokkaa) on verrannollinen hapen virtaukselle katodille eli liuennen hapen pitoisuudelle kasvuliemessä Pt-katodi: O 2 + 2 H 2 O + 4 e - 4 OH - Ag-anodi: 4 Ag + 4 Cl - 4 AgCl + 4 e - YHT: O 2 + 2 H 2 O + 4 Ag + 4 Cl - 4 AgCl + 4 OH - DO- mittaukseen perustuen voidaan DO säätää halutulle tasolle sekoituksen ja ilmastuksen avulla (ns. kaskadi-säätö: liuenneen hapen säädin lähettää asetusarvoa esim. sekoituksen säätimelle) DO-mittauksen avulla voidaan myös määrittää arvoja k L a:lle 15

1. Dynaaminen gassing out gassing in: Kalibroidaan DO-anturi halutulla sekoitusnopeudella ja ilmastuksella (100 %) Happi huuhdotaan liuoksesta typpikaasun avulla (anturin nollaus) Aloitetaan ilmastus ja kerätään DO-arvoja = f(t) dc dt dc C * C = OTR = k L dc dt a dt C * ln( ) = C * C( t) k L = k a t C L a ( C * C) dc C * C = k a L 0 0 t dt Sovitetaan koepisteisiin suoran yhtälö: ln(c*/(c*-c)) = kk x t Kulmakerroin kk = k L a Tehdään mittauksia eri sekoitus/ilmastusolosuhteissa Ei fermentoinnin aikana 16

2. Dynaaminen määritys fermentoinnin aikana Oletus: lyhyellä aikavälillä (kasvusta huolimatta) vakio-olosuhteissa DO on vakio (C = C 0 ) Lopetetaan ilmastus (tai typetetään) ja tauon jälkeen aloitetaan ilmastus uudelleen (ennen kuin DO = DO crit ) Kerätään DO dataa (C(t)) Kun C AL saavuttaa vakioarvon; tällöin OUR = OTR (dc AL /dt = 0) 17

2. Dynaaminen määritys fermentoinnin aikana dc AL dt = 0 Sovitetaan koepisteet yo. yhtälöön suora, jonka kulmakerroin on k L a. Määritys kahden pisteen avulla, tai useammasta pisteestä graafisesti 18

3. Poistokaasun koostumusmittaukseen perustuva menetelmä. OUR (oxygen uptake rate) määritetään mittausten avulla fermentoinnin aikana. Tasapainotilanteessa OTR=OUR. Happitaseen avulla saadaan k L a ratkaistua: dc OTR = dt Ulosmenevä ilmavirtaus F out voidaan määrittää pitoisuuksien ja inerttikaasun avulla OUR määritetään sisään tulevan ilmavirtauksen ja sen happipitoisuuden sekä ulosmenevän ilmavirtauksen happija hiilidioksidipitoisuuden (mitatut) avulla. L = k L a ( C* CL ) F F in out C N OUR= 2 = F in in ( F OUR= F in dc dt = F in out 1 C C = OTR OUR C O out 2 O in N V out 0,79 C 2 F L CO out out (0,21 1 C 2 2 F O out V out C 2 L = F O out 2 0,79 C in ) = CO out OTR C C 2 N N 2 ( F 2 in out in C = p O out 2 dc dt O in T ) 2 in + OUR F R V out L p O out T 2 out ) 19

Poistokaasumittaus Fermentorin poistokaasusta usein pumpataan pieni sivuvirta poistokaasuanalysaattorille Tärkeimmät kaasukomponentit ovat tyypillisesti happi ja hiillidioksidi Happipitoisuus voidaan edullisimmin mitata elektrokemiallisesti (esim. lyijyanodilla hapettuminen PbO tai zirkonium dioksidi) ja hiilidioksidipitoisuus perustuen valon absorptioon infrapuna-alueella Massaspektrometrilla voidaan mitata muidenkin kaasumaisten komponenttien pitoisuuksia (esim. etanoli, metanoli, butanoli ) Analysaattorille menevä virta suodatetaan ja kuivataan Ilmavirtauksen mittaus termisellä massavirtausmittarilla 20

https://www.youtube.com/watch?v=faxyppmgnmu BlueSens https://www.youtube.com/watch?v=hqt8sqfbh80 BlueSens https://www.youtube.com/watch?v=js4i2pdxcvi Vaisala https://www.bluesens.com/fileadmin/daten-redaktion/pdf/downloads/bluesens_report_01_web.pdf 21

Fermentorin mekaaninen sekoitus Hapen liuotuksen kannalta edullisin sekoituselementti on Rushton -turbiini Rushton -turbiini on tehokas kaasun dispergoinnissa, mutta radiaalisekoittimena huono kasvuliemen homogeenisuuden kannalta Sekoitinakselille laitetaan useita sekoituselementtejä; elementtien etäisyys toisistaan > D i (= elementin halkaisija); alin elementti lähelle ilmastusrengasta Homogeenisuuden kannalta pumppaavat, vertikaalilementit ovat parempia Sekoittimen kierrosnopeus (N i, [rpm]) ei ole kovin informatiivinen tieto; parempi ns. tip speed eli sekoituselementin kehänopeus (tip speed = π x N i x D i /60 [m s -1 ] ) Sekoituksen tehtävät: hapen liuotus k L a (aerobinen fermentointi), lämmönsiirto, homogeenisuus Mekaanisen sekoituksen vaatima teho voidaan laskea sekoituksen teholuvun (N p = Po = Ne; jos n sekoituselementtiä Po = n x Po yhdelle) avulla, kun virtausolosuhteet ovat turbulentit (sekoittimen Reynoldsin luku Re i > 10 4 ) [yleisin tilanne ellei kasvuliemen viskositeetti ole erittäin korkea] N P P = Re 3 5 i ρ N D L i i 2 ρ Di N = µ i 22

Radiaali- vs. aksiaalisekoitus Flow pattern produced by a radialflow impeller in a baffled tank. Flow pattern produced by an axialflow impeller in a baffled tank. 23

P on ilmastamaton teho µ c : kasvuliemen dynaaminen viskositeetti Ilmastus pienentää tehonkulutusta Ilmastettu teho : P a Kts. käyrästö alla (N a : ilmastusluku) Fermentorin sekoitus N a = D Vair 3 i N i 26

Homogeenisuus fermentorissa Laboratoriomittakaavan fermentoinneissa voidaan yleensä olettaa kasvuliemi homogeeniseksi (ellei viskositeetti ole hyvin korkea), vaikka fermentoriin syötettäisiin ph-säätökemikaaleja, vaahdonestoainetta, ravinteita, ilmaa Pilot- ja tuotantomittakaavassa olosuhteet vaihtelevat syöttöjen takia fermentorissa paikallisesti Sekoituksen intensiteettiä (eli vaikutusta) kuvaa hyvin termi sekoitusaika: t m,95 : se aika, jonka kuluessa pulssimaisen lisäyksen vaikutus pitoisuuteen on 95 %:sti tasoittunut hitaimmin reagoivassa fermentorin paikassa Sekoitusaika laboratoriofermentoreissa voi olla joitakin sekunteja, tuotantomittakaavassa (esim. 50 m 3 ) kymmeniä sekunteja/jopa joitakin minuutteja Solut siis kohtaavat toistuvasti erilaisia olosuhteita => stressi? Epähomogeenisuuden vaikutuksia voidaan tutkia simuloimalla kokeellisesti isoja fermentoreita labramittakaavassa (ns. scale-down): esim. CSTR + PFR (plug flow reactor) yhdistelmällä, jossa kasvulientä kierrätetään fermentorista tulppavirtausreaktorin läpi ja tähän syötetään happo/emäs/ravinne liuosta 27

Homogeenisuus fermentorissa - reologiaa Sekoitusolosuhteetkin vaihtelevat isossa fermentorissa (kuvassa kasvuliemen lineaarivirtausnopeuksia eri kohdissa; sekoituselementtinä Rushton turbiini) Virtausolosuhteiden paikalliset vaihtelut ovat erityisen suuria rihmamaisten mikrobien fermentoinneissa, sillä nämä liemet ovat yleensä pseudoplastisia (siis ei- Newtonisia); yksisoluisilla organismeilla kasvuliemet ovat Newtonisia (so. viskositeetti ei riipu leikkausnopeudesta (~sekoitusnopeudesta) ellei jokin aineenvaihduntatuote vaikuta reologiaan 28

Reologiaa dv/dy on leikkausnopeus τ on leikkausjännitys µ on viskositeetti 29

Reologiaa Newtonisten fluidien viskositeetti ei riipu leikkausnopeudesta (µ dynaaminen viskositeetti kuvaa leikkausjännityksen τ xy ja leikkausnopeuden dv x /dy välistä suhdetta) τ = µ xy dv ( x dy ) Ei-Newtonisten fluidien (esim. paksunnosaineliuokset) viskositeetti riippuu leikkausnopeudesta (joillakin fluideilla myös leikkausajasta; esim. tiksotrooppiset fluidit) τ dv K ( dy x n 1 xy = ) dv ( dy K : konsistenssi-indeksi n : ns. power law index; x ) µ = K dvx ( dy Newtoninen fluidi: n = 1 Pseudoplastinen fluidi: n < 1 (leikkauksella oheneva fluidi) Dilatantti fluidi: n > 1 (leikkauksella paksuuntuva fluidi, ei biopr.) Bingham plastinen fluidi: n = 1/<1/>1 vaaditaan τ 0, jotta lähtee liikkeelle ) n 1 30