MIKROBIOLOGISEEN LAADUNHALLINTAAN LIITTYVIEN ANALYYSIMENETELMIEN KEHITTÄMINEN MEIJERITUOTTEIDEN VALMISTUKSESSA

MIKROBIOLOGISEEN LAADUNHALLINTAAN LIITTYVIEN ANALYYSIMENETELMIEN KEHITTÄMINEN MEIJERITUOTTEIDEN VALMISTUKSESSA Keränen, Maria Pro gradu -tutkielma Ravitsemustiede Lääketieteen laitos Terveystieteiden tiedekunta Itä-Suomen yliopisto Toukokuu 2018

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Kansanterveystieteen ja kliinisen ravitsemustieteen yksikkö Ravitsemustiede KERÄNEN, MARIA L: Mikrobiologiseen laadunhallintaan liittyvien analyysimenetelmien kehittäminen meijerituotteiden valmistuksessa Pro gradu tutkielma, 55 s. Ohjaajat: THM Vuokko Niemitalo ja FT Jenni Korhonen Toukokuu 2018 Asiasanat: meijerituotteet, mikrobiologia, laadunhallinta, validointi, enterobakteerit, koliformiset bakteerit MIKROBIOLOGISEEN LAADUNHALLINTAAN LIITTYVIEN ANALYYSI- MENETELMIEN KEHITTÄMINEN MEIJERITUOTTEIDEN VALMISTUKSESSA Tausta. Elintarvikelainsäädännön tarkoitus on varmistaa elintarvikkeiden turvallisuus ja laatu, ja suojella kuluttajaa terveysvaaroilta. Elintarvikkeiden mikrobiologista laadunhallintaa säädellään Suomen ja EU:n lainsäädännöllä. Teollisuuden toimijoiden omavalvonnalla on laadunhallinnan toteuttamisessa keskeinen merkitys. Maito on hyvä kasvualusta mikrobeille. Meijerissä maito lämpökäsitellään mikrobien tuhoamiseksi, mutta jälkikontaminaatiot ovat mahdollisia. Niitä kontrolloidaan hyvällä tuotantohygienialla ja varmistetaan mikrobiologisilla analyyseilla tuotannon eri vaiheissa. Enterobakteerit ja koliformiset bakteerit ovat tärkeitä kontaminaation indikaattoreita. Mikrobiologisissa analyyseissä käytettävät standardoidut menetelmät eivät sovi sellaisenaan kaikkiin analyyseihin. Jokaisen laboratorion tulee validoida ne käyttöönsä sopiviksi. Validoinnilla varmistetaan, että menetelmä antaa oikeita ja riittävän hyviä tuloksia siinä ympäristössä, missä sitä käytetään. Tavoite. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida kohdemeijerin mikrobiologista laadunhallintaa ja validoida meijerin enterobakteereille ja koliformisille bakteereille käyttämät analyysimenetelmät. Aineisto ja menetelmät. Aineisto kerättiin meijerin laboratorion päivittäistä työskentelyä seuraten. Validointi toteutettiin standardimenetelmillä ISO4832:2006(E) ja ISO21528-2:2004(E) ja työhön valittiin viisi erityyppistä meijerin tuotetta tai prosessin välituotetta. Tulokset. Validoinnissa menetelmien oikeellisuudelle saatiin virherajoiksi ±24 % (koliformiset bakteerit) ja ±19 % (enterobakteerit). Uusittavuuden keskihajonta oli 0,09 0,17 logaritmista yksikköä. Tulokset olivat standardin hyväksymissä rajoissa. Toistettavuuden suhteelliseksi keskihajonnaksi saatiin 8 12 %. Spesifisyys menetelmissä oli hyvä, kun tulkinta tehdään oikein. Maitonäytteellä lineaarisuus toteutui hyvin, mutta raejuuston kastikkeella se oli heikkoa. Johtopäätökset. Elintarvikkeen mikrobiologisen laadun analysoinnissa näytemateriaalin ominaisuuksien tunteminen on tärkeää. Meijeriteollisuuden omavalvontajärjestelmissä on oltava riittävän hyvät mikrobiologisen laadun hallintamenetelmät, jotta kuluttajille ei aiheudu vaaraa meijerituotteiden käytöstä. Analyysimenetelmien tulkinta voi olla meijerikohtaista ja hyväksyttävät virherajat voidaan määrittää säädösten puitteissa meijerikohtaisesti, sillä tulosten tulkintaan vaikuttavat toimintaympäristö ja tutkittavat materiaalit. Kohdemeijerin tuotteille käytetyt enterobakteerien ja koliformisten bakteerien määritysmenetelmät sopivat tämän tutkimuksen mukaan hyvin, joskin lineaarisuus oli toisella matriisilla heikkoa. Koliformisten bakteerien tulkinta ei ollut menetelmän mukaista, mikä tulisi perustella tai korjata vastaamaan menetelmää. Lineaarisuutta voidaan tarvittaessa tutkia uudelleen eri näytematriiseilla.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Public Health and Clinical Nutrition Nutrition Keränen, Maria L: The developing of microbiological quality control analysis in dairy industry Master s thesis, 55 p. Supervisors: MSc Vuokko Niemitalo and PhD Jenni Korhonen May 2018 Keywords: dairy products, microbiology, quality control, validation, enterobacteria, coliforms THE DEVELOPING OF MICROBIOLOCIGAL QUALITY CONTROL ANALYSIS IN DAIRY INDUSTRY Background. The purpose of food legislation is to ensure food safety and quality and protect the consumer from health hazards. Microbiological quality control is monitored by Finnish law and EU regulations. In-house control of the food business operator is essential for carrying out quality control. Milk is a good medium for microbes. In plants, milk is pasteurized to destroy all microorganisms but post-pasteurization contaminations may occur. Post-pasteurization is controlled by good hygiene procedures and ensured by microbiological analyses in different stages of production. Enterobacteria and coliforms are important indicators of contamination. Standardized methods are used for microbiological analyses. These methods cannot be applied to all kinds of analyses as such. Every laboratory has to validate them to their own purposes. The validation ensures that that method gives right and precise results enough to operation environment. Objective. The aim of this study was to assess microbiological quality control in a certain dairy plant and validate methods of analysis for enterobacteria and coliforms used in plant. Materials and methods. Daily routines in laboratory were observed in one dairy factory. The validation process was carried out according to standard methods ISO 4832:2006(E) and ISO 21528-2:2004(E) with five different kinds of dairy products or intermediate products. Results. The trueness analysis showed deviation of coliforms and enterobacteria were ±24 % and ±19 %, respectively. The standard deviation of reproducibility was 0,09 0,17 log units. The results were within the acceptable limits. The relative standard deviation of repeatability was 8 12 %. The specificity of the methods was good when the results were read correctly. The linearity of the method was good for milk samples, but for dressing in cottage cheese it was weak. Conclusions. When analyzing microbiological quality of foodstuffs, it is important to know specifications of sample materials. The dairy industry has to have methods good enough for microbiological quality control in their in-house control systems. Thus consumers will not be in any danger when using dairy products. One dairy plant can interpret methods of analyses in a different way than the other and acceptable limits of deviations or errors can be determined differently in different factories. Every laboratory has its own operation environment and its own specimens and they have influence in the reading of the results. In any case, all regulations by law have to be followed when limits are determined. Methods of analyses used in this study were suitable to products of the dairy plant, although the linearity of one material was weak. Coliform analysis results were not read correctly in the factory and this must be justified or changed. For the linearity analysis, another study can be made with different product, if needed.

SISÄLTÖ 1 JOHDANTO... 7 2 MIKROBIOLOGISET LAATUVAATIMUKSET MEIJERITEOLLISUUDESSA... 8 2.1 Yleinen elintarvikelainsäädäntö... 8 2.3 Euroopan komission mikrobikriteeriasetus... 9 2.4 Maitotuotteiden mikrobiologiset vaatimukset... 11 2.5 Omavalvonta... 12 3 MAITO JA SEN LAATUTEKIJÄT... 14 3.1 Maidon koostumus... 14 3.2 Maidon ja maitovalmisteiden ravitsemuksellinen koostumus... 14 3.3 Maitotuotteet mikrobien kasvuympäristönä... 15 3.3.1 Raakamaito... 15 3.3.2 Lämpökäsitelty maito... 15 3.4 Maitotuotteiden hyötymikrobit... 17 3.5 Lämpökäsitellyissä maitotuotteissa esiintyviä haitallisia mikrobeja... 17 3.5.1 Enterobakteerit... 18 3.5.2 Koliformiset bakteerit... 18 3.5.3 Muita lämpökäsitellyissä maitotuotteissa esiintyviä mikrobiryhmiä... 19 3.5.4 Muita maitotuotteissa esiintyviä patogeeneja... 20 4 MAIDON PROSESSOINTI JA MAITOTUOTTEIDEN VALMISTUS MEIJERISSÄ. 21 4.1 Maidon prosessointi... 21 4.2 Juuston prosessointi... 23 4.3 Voin prosessointi... 25 4.4 Mikrobiologisten näytteiden ottaminen meijerin prosessista... 26 5 MIKROBIOLOGISET MENETELMÄT JA NIIDEN EPÄVARMUUS... 27 5.1 Mikrobiologiset analyysimenetelmät... 27 5.2 Mikrobiologinen analyysi perinteisellä pesäkelaskentamenetelmällä... 27

5.2.1 Elatusaineet... 27 5.2.2 Viljely ja kasvatus... 28 5.2.3 Tulosten tulkinta ja varmistus... 29 5.3 Muita mikrobiologisia analyysimenetelmiä... 30 5.4 Mikrobiologisten menetelmien epävarmuus... 31 5.4.1 Inkubointiolosuhteet... 32 5.4.2 Alhainen pesäkemäärä maljoilla... 33 5.4.3 Rinnakkaisten maljojen käyttö... 33 6 MIKROBIOLOGISTEN MENETELMIEN VALIDOINTI... 35 6.1 Validoinnin tarkoitus... 35 6.2 Validointiin liittyviä suureita... 35 7 TUTKIELMAN TAVOITE... 37 8 VALIDOINTIPROSESSI... 38 8.1 Validoitavat menetelmät... 38 8.2 Käytettävä maljavalumenetelmä... 38 8.3 Validoinnissa käytettävät elatusaineet, kasvatusalustat ja reagenssit... 39 8.4 Valitut näytematriisit... 39 8.5 Validointiprosessi... 40 8.5.1 Bakteerisuspension valmistus... 40 8.5.2 Siirrostettavan bakteerisuspension pitoisuuden määritys... 41 8.5.3 Näytematriisien esikäsittely... 42 8.5.4 Bakteerisuspension siirrostus näytteisiin... 42 8.5.5 Viljely ja kasvatus... 43 8.5.6 Tulosten tulkinta... 43 9 TULOKSET... 44 9.1 Pesäkeluvut työn eri osissa... 44 9.1.1 Oikeellisuus... 45 9.1.2 Täsmällisyys... 46

9.1.3 Spesifisyys... 47 9.1.4 Lineaarisuus... 49 10 POHDINTA... 50 10.1 Oikeellisuus... 50 10.2 Täsmällisyys... 50 10.3 Spesifisyys... 51 10.4 Lineaarisuus... 52 10.5 Validoinnin onnistuminen... 52 LÄHTEET... 53

7 1 JOHDANTO Elintarvikelainsäädännön tarkoituksena on varmistaa elintarvikkeiden turvallisuus ja hyvä terveydellinen laatu, sekä suojella kuluttajaa terveysvaaroilta. Mikrobiologista laadunhallintaa elintarvikelaitoksissa säädellään suomalaisella ja Euroopan unionin lainsäädännöllä. Euroopan unionin asetukset ovat kansallisen lainsäädännön yläpuolella, mikäli ne ovat ristiriidassa keskenään. Teollisuuden toimijoiden omavalvonnalla on laadunhallinnan toteuttamisessa keskeinen merkitys. Laki velvoittaa toimijoita laatimaan näytteenottosuunnitelman ja perustamaan toimintansa HACCP-periaatteisiin mukaiseen menettelyyn. Sillä tarkoitetaan tuotannon kriittisten pisteiden löytämistä ja hallintaa. Maito sisältää monipuolisesti ravinteita, joten se on hyvä kasvualusta mikrobeille. Raakamaito sisältää useita ympäristökontaminaationa tulleita mikrobeja, mutta suurin osa niistä tuhoutuu kun maito pastöroidaan meijerissä. Pastöroinnin jälkeinen kontaminaatio on merkittävä mikrobeihin liittyvä riski, joka meijerin pitää hallita. Jälkikontaminaatiota kontrolloidaan hyvällä tuotantohygienialla ja varmistetaan mikrobiologisilla analyyseilla tuotannon eri vaiheissa. Enterobakteerit ja koliformiset bakteerit ovat tärkeitä jälkikontaminaation indikaattoreita. Mikrobiologisissa analyyseissä käytetään standardoituja menetelmiä. Vaikka valmiiksi standardoituja menetelmiä on elintarvikkeille ja maitotuotteillekin olemassa, eivät menetelmät sovellu suoraan mihin tahansa analyyseihin. Jokaisen laboratorion tulisi validoida menetelmät omaan käyttöönsä sopivaksi. Validoinnilla varmistetaan, että menetelmä antaa oikeita, riittävän tarkkoja ja spesifisiä tuloksia juuri siinä ympäristössä, jossa sitä käytetään. Mikrobiologisten menetelmien haasteena on niiden epävarmuus, jota analyyseissa aiheuttavat useat tekijät. Mikrobeja voidaan tutkia useilla menetelmillä, joista tunnetuin ja yleisin on maljaviljely ja kvantitatiivisissa analyyseissa siihen liittyvä pesäkelaskenta. Tämän tutkielman tavoitteena on validoida meijerin enterobakteereille ja koliformisille bakteereille käyttämät analyysimenetelmät. Näitä menetelmiä ei oltu aiemmin meijerin käyttöön validoitu. Lisäksi tavoitteena oli arvioida meijerin mikrobiologisen laadunhallinnan tasoa ja lakisääteisten vaatimusten toteutumista meijerissä. Validointi auttaa kohdemeijeriä kehittämään toimintaansa, erityisesti mikrobiologisia analyysimenetelmiä, joita myös pro gradu -tutkielman yhteydessä kohdemeijerissä kehitettiin.

2 MIKROBIOLOGISET LAATUVAATIMUKSET MEIJERITEOLLISUUDESSA 8 2.1 Yleinen elintarvikelainsäädäntö Kuten kaikkia elintarvikehuoneistoja, myös meijerien toimintaa säätelee sekä kansallinen että Euroopan unionin lainsäädäntö. Yleistä suomalaista elintarvikelakia (23/2006) tarkentavat valtioneuvoston, maa- ja metsätalousministeriön sekä sosiaali- ja terveysministeriön asetukset (Taulukko 1). Euroopan unionin elintarvikehygieniaan liittyvät asetukset ovat kansallisen elintarvikelainsäädännön yläpuolella, sillä Euroopan unionin lainsäädännössä asetukset sitovat aina jäsenmaita sellaisenaan (Eurooppatiedotus 2015). Mikrobiologiseen laatuun liittyvistä vaatimuksista säädetään erityisesti Euroopan komission (EY) asetuksessa elintarvikkeiden mikrobiologisista laatuvaatimuksista 2073/2005. Taulukko 1. Elintarvikehygieniaan liittyvät tärkeimmät kansallisen lainsäädännön ja Euroopan unionin lait ja asetukset. Suomalainen lainsäädäntö Euroopan unionin asetukset Elintarvikelaki 23/2006 Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus elintarvikelainsäädäntöä koskevista yleisistä periaatteista ja vaatimuksista (EY) N:o 178/2002 STMa 461/2000 Talousveden laatuvaatimukset ja valvontatutkimukset MMMa ilmoitettujen elintarvikehuoneistojen elintarvikehygieniasta 1367/2011 MMMa laitosten elintarvikehygieniasta 795/2014 MMMa 9/EEO/2003 hygienialain mukaisten näytteiden ottamisesta Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus elintarvikehygieniasta N:o 852/2004 Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus eläinperäisiä elintarvikkeita koskevista erityisistä hygieniasäännöistä (EY) N:o 853/2004 Komission asetus (EY) N:o 2073/2005 elintarvikkeiden mikrobiologisista vaatimuksista, muutoksineen ((EY) N:o 1441/2007, (EY) N:o 365/2010) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus rehu- ja elintarvikelainsäädännön sekä eläinten terveyttä ja hyvinvointia koskevien sääntöjen mukaisuuden varmistamiseksi suoritetusta virallisesta valvonnasta (EY) N:o 882/2004

2.3 Euroopan komission mikrobikriteeriasetus 9 Elintarvikealan toimijoiden on noudatettava niitä mikrobiologisia vaatimuksia, joita on säädetty Euroopan komission (EY) asetuksessa N:o 2073/2005. Tämä mikrobikriteeriasetus määrittelee elintarvikeluokittain ne mikrobipitoisuuksien raja-arvot, joiden perusteella tuotetta tai tuotantoprosessia voidaan pitää mikrobiologiselta laadultaan hyväksyttävänä. (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005.) Jokainen elintarvikealan toimija määrittelee itse, kuuluvatko toimijan tuottamat elintarvikkeet mikrobikriteeriasetuksen piiriin (Eviran ohje 10501/2). Mikrobikriteeriasetus jaottelee mikrobiologiset vaatimukset tuotteen turvallisuutta koskeviin ja prosessihygieniaa koskeviin vaatimuksiin. Elintarvikkeen turvallisuutta koskeva vaatimus tarkoittaa vaatimusta, jolla määritetään tuotteen tai elintarvike-erän hyväksyttävyys ja jota sovelletaan markkinoille saatettuihin tuotteisiin (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Elintarvikkeen turvallisuutta koskevan vaatimuksen tarkoituksena on estää elintarvikkeen välityksellä tapahtuva ruokamyrkytysmikrobien tai niiden tuottamien toksiinien leviäminen. Turvallisuusvaatimuksena esitettyä mikrobiraja-arvoa ei siis saa ylittää. Raja-arvon ylittyessä tai sitä epäiltäessä on elintarvikealan toimijan huolehdittava kontaminoituneen elintarvikkeen poistamisesta markkinoilta. Samoin hänen on tiedotettava valvontaviranomaisia ja kuluttajia markkinoilta poistamisen syystä. (Eviran ohje 10501/2.) Prosessin hygieniaa koskeva vaatimus tarkoittaa vaatimusta, joka osoittaa tuotantoprosessin hyväksyttävän toimivuuden. -- Siinä asetetaan viitteellinen kontaminaatioarvo, jonka ylittyessä vaaditaan korjaavia toimia, jotta prosessin hygieniataso säilyy elintarvikelainsäädännön mukaisena (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Prosessihygieniavaatimuksien osalta raja-arvojen ylitykset johtavat korjaaviin toimiin ja mahdollisesti omavalvontasuunnitelman tarkistamiseen. Mainittua indikaattorimikrobia tai toimenpiteitä aiheuttavaa raja-arvoa voidaan muuttaa, mikäli asetuksen vaatimusta vastaava elintarviketurvallisuustaso pystytään takaamaan (Eviran ohje 10501/2). Mikrobikriteeriasetuksen liitteessä on esitetty sekä turvallisuusvaatimusten että prosessihygieniavaatimusten todentamista varten näytteenottosuunnitelma (Eviran ohje 10501/2). Suunnitelmassa jokaiselle vaatimukselle on asetettu standardoitu vertailumenetelmä, jolla saatua tulosta pidetään oikeana. Vaatimuksen kohdalla on annettu hyväksyttävät mikrobipitoisuuksien raja-arvot, jotka perustuvat vertailumenetelmään. Elintarvikealan toimija voi käyttää vertailumenetelmästä poikkeavia analyysimenetelmiä omassa näytteenotossaan, mikäli menetelmät on hyväksytty asetuksessa kuvatulla tavalla. (Eviran ohje 10501/2.)

Taulukko 2. Esimerkki mikrobikriteeriasetuksen mukaisesta kriteeristä ja siihen liittyvästä näytteenottosuunnitelmasta (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005 ). 10 Vaatimuksen soveltamisvaihe Lämpökäsitellystä maidosta ja herasta valmistetut juustot Elintarvikeluokka Mikroorganismit Näytteenottosuunnitelma n c m M E. coli 5 2 100 pmy /g 1000 pmy/g Analyyttinen vertailumenetelmä ISO 16649-1 tai -2 Valmistusprosessin aikana, kun E. coli - bakteerien oletetaan olevan suurimmillaan Toiminta saataessa epätyydyttäviä tuloksia Tuotannon hygieniatason ja raaka-aineiden valinnan parantaminen Esimerkiksi juustoihin liittyvässä prosessihygieniavaatimuksessa (ks. Taulukko 2) määritellään, että lämpökäsitellystä maidosta ja herasta valmistetuista juustoista on tutkittava valmistusprosessin aikana Escherichia coli -bakteerin määrä. Näytteitä tulee ottaa viisi (n = 5), ja E. colia saa olla näytteissä korkeintaan 100 pmy/g (raja-arvo m). Jos E. colia kuitenkin esiintyy, saa niitä olla korkeintaan kahdessa osanäytteessä (c = 2), kunhan bakteeripitoisuus on korkeintaan 1000 pmy/g (raja-arvo M). Yksi näyte koostuu kaikista osanäytteistä (n), jotka tutkitaan erillisinä näytteinä (Eviran ohje 10501/2). Asetuksessa annettua osanäytteiden määrää tulisi pitää vähimmäisvaatimuksena silloin, kun halutaan tutkia erityisesti tietyn elintarvike-erän tai prosessin hyväksyttävyyttä. Osanäytteiden määrää tulee kuitenkin lisätä esimerkiksi tilanteessa, jossa epäillään saastumista. Osanäytteiden määrää voidaan valvontaviranomaisen luvalla myös vähentää, jos voidaan osoittaa, että elintarvikehuoneiston hallintajärjestelmä toimii. (Eviran ohje 10501/2.) Elintarvikealan toimijan on lisäksi seurattava analyysituloksia pitkällä aikavälillä (Eviran ohje 10501/2). Jos tulokset pysyvät pitkään hyväksyttävällä tasolla, voidaan näytteenottoa tietyissä tapauksissa myös harventaa. Mikäli pitkän aikavälin tulokset osoittavat epätyydyttävää kehitystä, on korjaaviin toimenpiteisiin ryhdyttävä välittömästi, vaikka tulokset olisivatkin vielä hyväksyttäviä. Mikrobikriteeriasetuksessa ei anneta maitoalan laitoksille määräyksiä näytteenottotiheyksistä (Eviran ohje 10501/2). Eviran ohje antaa niistä sen sijaan suosituksia, jotka on osin jaoteltu sen mukaan, kuinka paljon raakamaitoa laitos vastaanottaa vuosittain. Mitä enemmän raakamaitoa vastaanotetaan, sitä tiheämmin suositellaan näytteitä otettavan.

11 Näytteenottotiheydet vaihtelevat yhdestä viiteentoista kertaan vuodessa riippuen maitotuotteesta, maitoalan laitoksen koosta ja tutkittavasta mikro-organismista (Eviran ohje 10501/2). Esimerkiksi E. coli tulee tutkia lämpökäsitellystä maidosta valmistetuista juustoista (Taulukko 2) 4 8 kertaa vuodessa, kun maitoalan laitos vastaanottaa yli 2 000 000 litraa raakamaitoa vuodessa. 2.4 Maitotuotteiden mikrobiologiset vaatimukset Maitotuotteissa esiintyvät mikrobit, joille turvallisuusvaatimuksia on esitetty, ovat Listeria monocytogenes, Salmonella, enterotoksigeeniset stafylokokit ja Cronobacter sakazakii (ennen 2007 Enterobacter sakazakii) (Komission asetus (EY) N:o 365/2010). Näissä turvallisuusvaatimuksissa mainitut raja-arvot m ja M ovat samat. Yhdessäkään osanäytteessä annettu raja-arvo M ei siis saa ylittyä. (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005.) Listeriavaatimus koskee kaikkia sellaisenaan syötäviä elintarvikkeita (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005, Eviran ohje 10501/2). Erilliset näytteenottosuunnitelmat on annettu imeväisille tarkoitetuille tuotteille (äidinmaidonkorvikkeet), elintarvikkeille, jotka toimivat kasvualustana listerialle (lähes kaikki maitotuotteet) ja elintarvikkeille, jotka eivät voi toimia kasvualustana listerialle (kovat juustot ja UHT-tuotteet). Salmonellavaatimus koskee raakamaidosta tai pastörointia heikommin lämpökäsitellystä maidosta valmistettua juustoa, voita tai kermaa, maito- ja herajauhetta sekä jäätelöä, jos sen valmistusprosessi tai koostumus ei poista salmonellariskiä (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Lisäksi salmonellavaatimus koskee alle kuuden kuukauden ikäisille tarkoitettuja jauhemaisia äidinmaidonkorvikkeita ja vieroitusvalmisteita. Enterotoksigeenisia stafylokokkeja ei mikrobikriteeriasetuksen turvallisuusvaatimuksen mukaisesti saa esiintyä juustossa, maito- ja herajauheessa (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Cronobacter sakazakii -vaatimus koskee alle kuuden kuukauden ikäisille tarkoitettuja äidinmaidonkorvikkeita tai muita jauhemaisia ruokavaliovalmisteita. Maitotuotteisiin liittyviä prosessihygieniavaatimuksia on säädetty enterobakteereille, Escherichia colille, koagulaasipositiivisille stafylokokeille ja Bacillus cereukselle (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005).

12 Enterobakteerivaatimus on annettu pastöroidulle maidolle ja muille pastöroiduille nestemäisille maitotuotteille, maito- ja herajauheelle, jäätelölle ja maitopohjaisille jäädytetyille jälkiruoille sekä imeväisikäisten äidinmaidonkorvikejauheille ja jauhemaisille vieroitusvalmisteille (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Kuitenkaan vaatimus ei koske sellaisia pastöroituja nestemäisiä maitotuotteita tai maito- ja herajauhetta, jotka jatkojalostetaan teollisuudessa. Enterobakteerivaatimusta on muutettu vuonna 2010 komission asetuksella (EY) N:o 365/2010. E. coli -vaatimus koskee lämpökäsitellystä maidosta ja herasta valmistettua juustoa (ks. Taulukko 2), raakamaidosta tai pastörointia heikommin lämpökäsitellyistä maidoista valmistettua voita ja kermaa (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Vaatimusta käytetään valmistusprosessin hygieniatason osoittamiseen. Juuston kohdalla vaatimusta tulee soveltaa siihen prosessin kohtaan, jolloin E. coli -pitoisuuden voi olettaa olevan suurimmillaan. Koagulaasipositiivisten stafylokokkien vaatimus koskee kypsennettyjä juustoja, tuorejuustoja sekä maito- ja herajauhetta (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Bacillus cereus tutkitaan prosessihygieniavaatimusten mukaan jauhemaisista äidinmaidonkorvikkeista ja imeväisikäisten muista jauhemaisista ruokavaliovalmisteista (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). Koliformisia bakteereja ei EU:n mikrobikriteeriasetuksen mukaan tarvitse maitotuotteista tutkia, mutta Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkeviranomainen FDA (Food and Drug Administration) suosittelee koliformisten bakteerien tutkimista pastöroiduista maidoista ja maitotuotteista prosessin hygienian osoittamiseksi (FDA 2015). Raja-arvoina koliformisille bakteereille FDA (2015) suosittelee 10 pmy/ml nestemäisille ja 10 pmy/g kiinteille näytteille. Mikrobikriteeriasetuksessa raja-arvoiksi E. coli -bakteerille on annettu 100 pmy/g juustoille ja pastörointia heikommin lämpökäsitellylle voille ja kermalle 10 pmy/g (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005). 2.5 Omavalvonta Omavalvonta tai siihen viittaavat käsitteet esiintyvät kaikessa elintarvikelaitosten toimintaa määrittelevässä lainsäädännössä. Elintarvikelain (23/2006) mukaan omavalvonnalla tarkoitetaan elintarvikealan toimijan omaa järjestelmää, jolla toimija pyrkii varmistamaan, että elintarvike, alkutuotantopaikka ja elintarvikehuoneisto sekä siellä harjoitettava toiminta täyttävät niille elintarvikemääräyksissä asetetut vaatimukset. Elintarvikealan toimijalla on

13 oltava kirjallinen omavalvontasuunnitelma, jota toimija noudattaa, päivittää ja pitää toteutumisesta kirjaa (Elintarvikelaki 23/2006). Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen elintarvikehygieniasta (852/2004) mukaan vastuu elintarvikkeiden turvallisuudesta on ensisijaisesti elintarvikealan toimijalla (EPNAs N:o 852/2004). Elintarvikealan toimijalta edellytetään elintarviketurvallisuuden takaamiseksi HACCP-periaatteisiin (Hazard Analysis and Critical Control Points) pohjautuvaa pysyvää menettelyä. Tällä tarkoitetaan tuotannon kriittisten valvontapisteiden löytämistä ja hallintaa. Maa- ja metsätalousministeriön asetuksen mukaan omavalvonta on sellainen kokonaisuus, jossa huomioidaan EU:n elintarvikehygienia-asetuksen (852/2004) ja yleisen elintarvikeasetuksen (178/2002) toteutuminen, ja jonka osaksi HACCP-periaatteiden mukainen ohjelma voidaan tarvittaessa liittää. (MMMa 1367/2011.) Mikrobikriteeriasetuksen määrittelemiä mikrobiologisia vaatimuksia tulee Eviran ohjeen (10501/2) mukaan käyttää todentamaan omavalvontajärjestelmän toimivuutta. Sitä varten elintarvikealan toimijan omavalvontasuunnitelmassa tulee tarvittaessa olla mukana näytteenotto- ja tutkimussuunnitelmat. Omavalvonnassa voidaan tutkia muitakin kuin mikrobikriteeriasetuksen säätämiä mikrobeja, kuten elintarvikkeiden mikrobiologista laatua kuvaavia indikaattoribakteereita (Eviran ohje 10501/2).

3 MAITO JA SEN LAATUTEKIJÄT 14 3.1 Maidon koostumus Ihmiset käyttävät ravintonaan eläinten, pääasiassa lehmän maitoa. Tässä työssä maidosta puhuttaessa tarkoitetaan vain lehmän maitoa. Maito on nisäkkäiden maitorauhasten tuottama neste, jonka alkuperäinen tarkoitus on toimia vastasyntyneen jälkeläisen ravintona ja tarjota poikaselle kaikki kasvuun tarvittavat ravintoaineet (Fernandes 2009). Maidosta suurin osa (87 %) on vettä (Fernandes 2009, Nsofor ja Frank 2013). Käsittelemättömässä maidossa energiaravintoaineista rasvaa on 3,7 3,9 %, proteiinia 3,2 3,5 % ja hiilihydraatteja (lähinnä laktoosia) 4,8 4,9 %. Lisäksi maito sisältää kivennäisaineita ja proteiineihin kuulumattomia typpiyhdisteitä. Lehmänmaidon koostumus vaihtelee esimerkiksi vuodenajan, lehmien ruokinnan ja niiden yksilöllisten erojen mukaan. 3.2 Maidon ja maitovalmisteiden ravitsemuksellinen koostumus Ravitsemuksellisesti maito ja maitovalmisteet ovat hyviä proteiinin, kalsiumin, jodin ja D- vitamiinin lähteitä (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2014). Maitoproteiinin biologinen hyödynnettävyys on hyvä, sillä se sisältää kaikkia välttämättömiä aminohappoja (Weder ja Belitz 2003). Maitovalmisteet ovat suomalaisen ruokavalion merkittävin kalsiumin lähde; noin kaksi kolmasosaa suomalaisten saamasta kalsiumista tulee maitovalmisteista (Terveyden ja hyvinvoinnin laitos 2013). D-vitamiinin ruokalähteistä kolmen tärkeimmän joukossa ovat D-vitaminoidut maitovalmisteet (Terveyden ja hyvinvoinnin laitos 2013). Nuoremmilla aikuisilla (25 44 -vuotiaat) maitovalmisteet kattavat 40 % D-vitamiinin saannista, kun vanhemmilla (55 74 -vuotiaat) noin kolmasosa D-vitamiinista saadaan maidosta. Maito mainitaan Finravinto 2012 -tutkimuksessa myös A-vitamiinin, riboflaviinin, niasiinin, pyridoksiinin, B12-vitamiinin, folaatin sekä kaliumin ja fosforin lähteenä suomalaisessa ruokavaliossa (Terveyden ja hyvinvoinnin laitos 2013).

15 Maitovalmisteet kuuluvat rasvan tärkeimpiin lähteisiin suomalaisessa ruokavaliossa (Terveyden ja hyvinvoinnin laitos 2013). Maidon rasvasta kaksi kolmasosaa on tyydyttynyttä, ja maitotuotteet suositellaan valitsemaan rasvattomina tai vähärasvaisina, sillä tyydyttyneen rasvan runsas saanti lisää sairastuvuutta (Valtion ravitsemusneuvottelukunta 2013). 3.3 Maitotuotteet mikrobien kasvuympäristönä Maidon korkea vesipitoisuus, lähellä neutraalia oleva ph-arvo ja monipuolinen ravintoainekoostumus tarjoavat erilaisille mikrobeille hyvän kasvualustan (Nsofor ja Frank 2013). Maidon hyvä säilyvyys perustuu tehokkaaseen hygieniaan, lämpökäsittelyihin, kylmäsäilytykseen ja riittävän nopeaan markkinoille saattamiseen. 3.3.1 Raakamaito Käsittelemätön maito eli raakamaito on lehmän maitorauhasissa syntyessään steriiliä, mutta se kontaminoituu mikrobeilla, joita on utareen sisä- ja ulkopuolella, lehmän iholla ja lypsyvälineissä sekä millä tahansa ympäristön mikrobeilla, joita maitoon on mahdollista lypsyn yhteydessä päästä (Fernandes 2009). Maito jäähdytetään välittömästi lypsyn jälkeen, pidetään kylmässä lämpökäsittelyihin asti ja myös sen jälkeen, kunnes se päätyy kulutukseen. (Nsofor ja Frank 2013.) Kylmäsäilytys minimoi mikrobien kasvun, mutta mahdolliset psykrotrofiset organismit maidossa voivat lisääntyä säilytyksen aikana (Fernandes 2009). Psykrotrofiset organismit ovat mikrobeja, jotka kykenevät kasvamaan myös viileissä lämpötiloissa, esimerkiksi Pseudomonas-suvun bakteerit ja Listeria monocytogenes (Bell ym. 2005). EU:n alueella lypsyhygieniasta, maidon säilyttämisestä, kuljetuksesta ja käsittelystä annetaan asetuksissa yksityiskohtaisia määräyksiä (EPNAs N:o 853/2004). Niissä esimerkiksi säädetään, että maito on jäähdytettävä lypsyn jälkeen lämpötilaan 8 C, jos maidonkeräys on päivittäistä, ja lämpötilaan 6 C, jos keräystä ei toimiteta päivittäin. 3.3.2 Lämpökäsitelty maito Pastörointi on yleisesti hyväksytty maidon lämpökäsittelytapa (Fernandes 2009). Pastöroinnin tarkoitus on taata maidon turvallisuus ja lisätä maidon säilyvyyttä. Pastöroinnin lämpötila ja aika saattavat vaihdella maakohtaisesti (Fernandes 2009), mutta esimerkiksi Yhdysvaltain

16 elintarvike- ja lääkevirasto FDA on määritellyt ne pastörointiolosuhteet (Taulukko 3), jotka ovat riittävät mikrobien tuhoutumiseksi ja jotka ovat Yhdysvalloissa vaatimuksena ns. A- luokan maidolle (FDA 2015). Suomalaisissa meijereissä käytetään pastöroinnissa pääsääntöisesti 15 sekunnin käsittelyä vähintään lämpötilassa 72 C. Taulukko 3. Vaihtoehtoisia pastörointiolosuhteita (FDA 2015). Lämpötila ( C) Aika 63 30 min 72 15 s 89 1 s 90 0,5 s 94 0,1 s 96 0,05 s 100 0,01 s Pastörointi tuhoaa kaikki maidosta peräisin olevat taudinaiheuttajamikrobit (FDA 2015), myös lähes kaikki psykrotrofiset organismit (Fernandes 2009). Pastörointi ei kuitenkaan tuhoa joidenkin mikrobien tuottamia toksiineja (FDA 2015) eikä itiöivien bakteerien itiöitä, jos niitä on ennen pastörointia maitoon muodostunut (Jay ym. 2005). Termoduriset ja termofiiliset mikrobit sen sijaan voivat selvitä pastöroinnista. Termoduriset mikrobit eivät välttämättä kasva pastörointilämpötiloissa, mutta termofiilisten mikrobien kasvuun tarvitaan korkea lämpötila (optimilämpötila 55 65 C). (Jay ym. 2005.) Pääosa pastöroitujen maitotuotteiden sisältämistä mikrobeista on peräisin pastöroinnin jälkeisestä kontaminaatiosta (psykrotrofiset organismit) (Schmidt 2016, Fernandes 2009). Lisäksi pastöroinnista selvinneet termoduriset psykrotrofiset organismit voivat pilata maitotuotteen (Fernandes 2009). Maidolle voidaan tehdä UHT (Ultra High Temperature) -käsittely tai sterilointi, jotka ovat pastörointia tehokkaampia lämpökäsittelyjä ja tuhoavat lähes kaikki taudinaiheuttajamikrobit ja itiöt, ainoastaan erittäin lämmönkestävien Bacillus-sukuun kuuluvien bakteerien itiöt saattavat selvitä näistä käsittelyistä vahingoittumatta (Fernandes 2009). Eri lähteiden mukaan

17 sterilointi tarkoittaa 20 30 minuutin käsittelyä lämpötilassa 115 120 C (Fernandes 2009, Chandan 2016) ja UHT-käsittely 1 15 sekunnin käsittelyä lämpötilassa 135 150 C. (Jay ym. 2005, Fernandes 2009, Chandan 2016.) Näihin käsittelyihin kuuluu yleensä aseptinen pakkaaminen ja siten tuotteet säilyvät huoneenlämpötilassa pitkään (Fernandes 2009). Muut maitotuotteet poikkeavat mikrobien kasvuympäristönä nestemäisistä maitotuotteista esimerkiksi alhaisemman ph-arvon (hapatetut maitotuotteet), suuremman suolapitoisuuden (suolattu voi), alhaisen vesiaktiivisuuden (maitojauhe) tai hyödyllisen mikrobisisällön (hapatebakteerit jogurtissa tai juustossa, homeella kypsytetyt juustot) vuoksi. (Nsofor ja Frank 2013, Fernandes 2009, Chandan 2016.) 3.4 Maitotuotteiden hyötymikrobit Maitoon liittyvistä mikrobeista kaikki eivät ole haitallisia. Maitohappobakteereita, jotka ovat alun perin ympäristöperäisiä, käytetään fermentoitujen maitotuotteiden, kuten jogurtin ja juuston valmistuksessa (Schmidt 2016). Maitohappobakteerit ovat määritelmän mukaan bakteereita, jotka pystyvät fermentoimaan maitotuotteiden laktoosia maitohapoksi. Niitä esiintyy useissa bakteerisuvuissa, ja osalla niistä on myös probioottisia ominaisuuksia. Myös hiivoja ja homeita hyödynnetään maitotuotteiden valmistuksessa (kefiiri, viili, juustot). (Schmidt 2016, Fernandes 2009.) 3.5 Lämpökäsitellyissä maitotuotteissa esiintyviä haitallisia mikrobeja Eviran ohjeen (10501/2) mukaan mikrobikriteeriasetuksessa mainitut mikro-organismit voidaan jakaa kolmeen ryhmään: 1. Patogeeniset mikro-organismit, enterotoksiinit ja aineenvaihduntatuotteet. 2. Patogeenisten bakteerien esiintymisen ja ulostesaastutuksen indikaattorina käytettävät bakteerit. 3. Hygienian arvioinnin indikaattorina käytettävät bakteerit. Tämän tutkielman kannalta merkityksellisimpiä ovat kohdissa 2 ja 3 mainitut indikaattoribakteerit, joten niiden esittelyyn paneudutaan yksityiskohtaisemmin. Muut tutkimuksen kohteena olleen meijerin käyttämät mikrobitutkimukset esitellään lyhyemmin.

18 3.5.1 Enterobakteerit Enterobakteerit ovat Enterobacteriaceae-heimoon kuuluvia bakteereita, joita löytyy yleisesti ympäristöstä, mutta joista monet ovat suolistoperäisiä (Bell ym. 2005). Heimoon kuuluvia sukuja ovat muun muassa Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella ja Yersinia (Jay ym. 2005). Enterobakteerit ovat gramnegatiivisia ja fakultatiivisesti anaerobisia sauvabakteereja. Ne eivät muodosta itiöitä, fermentoivat glukoosia, ovat oksidaasinegatiivisia ja katalaasipositiivisia sekä resistenttejä sappisuoloille. (Bell ym. 2005.) Pastörointikäsittely tuhoaa enterobakteerit, joten niiden esiintyminen elintarvikkeessa kuumennuksen jälkeen on merkki joko epäonnistuneesta lämpökäsittelystä tai sen jälkeen tapahtuneesta kontaminaatiosta (Bell ym. 2005). Enterobakteereja pidetäänkin elintarviketeollisuudessa niin sanottuna indikaattorina prosessin hygienian arvioinnissa (Eviran ohje 10501/2). Enterobakteerien esiintyminen elintarvikkeessa voi olla merkki myös patogeenisen salmonellan esiintymisestä (Cordier 2013), mutta toisaalta jo vuonna 2007 päivitetty komission asetus (EY) N:o 1441/2007 toteaa, että salmonellabakteerin ja enterobakteerien esiintymisen välillä ei ole mahdollista havaita korrelaatiota (EY 1441/2007). Mikrobikriteeriasetuksessa enterobakteerit edellytetään tutkittavaksi osasta maitotuotteista prosessin hygienian osoittamiseksi, kuten aiemmin tässä tutkielmassa on esitetty (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005, katso kappale 2.4). 3.5.2 Koliformiset bakteerit Useimmat koliformiset bakteerit ovat Enterobacteriaceae-heimon bakteereita, jotka fermentoivat laktoosia (Bell ym. 2005, Jay ym. 2005, Schmidt 2016). Näihin kuuluvat ainakin suvut Citrobacter, Enterobacter, Escherichia ja Klebsiella. Myös Aeromonadaceae-heimon Aeromonas-bakteeri on joissakin lähteissä luokiteltu koliformiseksi (Martin ym. 2016). Ulosteperäiset koliformit pystyvät kasvamaan hieman muita koliformeja korkeammissa lämpötiloissa (43 45 C) (Bell ym. 2005). Mikäli elintarvikkeesta pystytään eristämään ulosteperäistä koliformia, se viittaa siihen, että elintarvike on ollut kosketuksissa suoraan tai välillisesti eläimen tai ihmisen ulosteen kanssa. (Bell ym. 2005.) Nykyiset tutkimukset kuitenkin osoittavat, että suurempi osa koliformeista on peräisin ympäristöstä eikä ulosteista (Martin ym. 2016).

19 Koliformisista bakteereista Escherichia coli -bakteeria käytetään yleisimmin ulosteperäisen saastumisen ja patogeenisten bakteereiden esiintymisen indikaattorina (Eviran ohje 10501/2). Mikrobikriteeriasetuksessa edellytetään E. colin tutkimista tietyistä maitotuotteista prosessin hygienian osoittamiseksi (Komission asetus (EY) N:o 2073/2005, katso kappale 2.4). Useat E. coli -bakteerin alatyypit ovat patogeenisia ja liittyvät elintarvikevälitteisiin sairastumisiin (Schmidt 2016). Näistä enterohemorraaginen E. coli (EHEC) on patogeenina erityisen merkityksellinen: sen infektiivinen annos on hyvin pieni (alle 100 solua) ja sen aiheuttamat sairaudet vakavia, varsinkin korkean riskin yksilöille (Schmidt 2016, Fernandes 2009). Lisäksi EHEC on E. colin alatyypeistä useimmin liittynyt elintarvikevälitteisiin epidemioihin, erityisesti serotyyppi O157:H7 (Meng ym. 2016, Schmidt 2016). E. coli tuhoutuu pastöroinnissa eikä kasva hyvin jääkaappilämpötiloissa (Schmidt 2016). Siten sen esiintyvyys ja lisääntyminen maitotuotteissa on seurausta epäonnistuneesta pastöroinnista tai jälkikontaminaatiosta sekä väärästä säilytyslämpötilasta. EHEC-serotyypin O157 tarttuminen ihmisiin on liittynyt erityisesti pastöroimattoman maidon ja siitä valmistettujen tuotteiden käyttöön, mutta myös tuotteisiin, joissa pastörointi on epäonnistunut tai joihin bakteeri on tullut jälkikontaminaation seurauksena (Schmidt 2016). EHEC elää yleisesti naudan suolistossa ja sitä on eristetty eri puolilta maailmaa naudan ulosteesta. Esimerkiksi vuonna 2002 FDA:n Yhdysvalloissa tekemässä tutkimuksessa ilmeni, että 38,5 % lypsykarjatiloista esiintyy EHEC-bakteeria ja 4,3 % lehmistä kantaa E. coli O157 - serotyyppiä. (Meng ym. 2016.) Suomessa tämän verotoksigeenisen E. colin serotyyppiä O157 on vuonna 2003 eristetty ulosteesta 0,4 prosentilla naudoista ja ei-o157-serotyyppiä 30 prosentilla naudoista (EFSA 2016). Suomalaisissa teurastamoissa on vuodesta 2004 lähtien tarkkailtu EHEC-serotyypin O157 esiintyvyyttä naudoissa. (EFSA 2016.) 3.5.3 Muita lämpökäsitellyissä maitotuotteissa esiintyviä mikrobiryhmiä Yleisenä elintarvikehygieniaindikaattorina käytetään myös aerobisten mikro-organismien eli mesofiilisten aerobisten bakteerien määrää (Eviran ohje 10501/2, Cordier 2013). Kun tutkitaan aerobiset mikro-organismit, saadaan selville laajasti eri mikrobeja, jotka kasvavat tietyissä olosuhteissa yleisellä kasvualustalla (Bell ym. 2005). Tätä indikaattoria voidaan käyttää hyvän hygienian toteamisen lisäksi myös raakamaidon kokonaislaadun selvittämiseen (Schmidt 2016). Kasvatusolosuhteista johtuen indikaattorilla ei

20 saada selville esimerkiksi psykrotrofisten organismien määrää, eikä esimerkiksi patogeenien esiintymistä voi täysin sulkea pois aerobisten mikro-organismien tutkimisen avulla. Aerobisten mikro-organismien määrää ei voi käyttää indikaattorina fermentoitujen elintarvikkeiden kohdalla, koska niissä mikro-organismit ovat toivottuna osana valmistusprosessia (Bell ym. 2005). Hapatemikrobeja sisältäville maitotuotteille voidaan soveltaa menetelmää vieraiden mikrobien tutkimisesta (ISO 13559:2002(E), Meijerin ohje vieraista mikrobeista 2014). Menetelmässä käytetään sellaista kasvualustaa, jolla maitohappobakteerit eivät kasva. Hiivat ja homeet voivat pilata hapatettuja maitotuotteita, sillä ne voivat kasvaa happamissa olosuhteissa (Nsofor ja Frank 2013). Hiivat ja homeet ovat usein merkkinä jälkikontaminaatiosta (Fernandes 2009, Schmidt 2016). Ne kasvavat hitaammin kuin bakteerit, joten ne ovat erityisenä riskinä tuotteille, joilla on pitkä säilytysaika (Bell ym. 2005). 3.5.4 Muita maitotuotteissa esiintyviä patogeeneja Maitotuotteissa esiintyviä muita patogeenisia bakteereja ovat Listeria monocytogenes, Salmonella-lajit, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ja Cronobacter-lajit (Schmidt 2016). Näistä L. monocytogenes, Salmonella-lajit, B. cereus ja S. aureus tuhoutuvat pastöroinnissa, samoin osa Cronobacter-lajeista. Näitä mikrobeja voi esiintyä raakamaidossa, mutta myös pastöroidussa maidossa puutteellisen lämpökäsittelyn tai jälkikontaminaation seurauksena. Listeria monocytogenes on psykrotrofinen organismi eli se voi kasvaa jääkaappilämpötiloissa (Schmidt 2016). Bakteerin aiheuttama listerioosi aiheuttaa vakavan vaaran riskiryhmille. Salmonella-lajit eivät ole psykrotrofeja, mutta jotkut lajeista voivat kasvaa hitaasti jääkaappilämpötiloissa (Fernandes 2009, Schmidt 2016). Salmonella-lajit kestävät lämpökäsittelyjä paremmin, jos tuotteessa on alhainen vesiaktiivisuus (maitojauheet) tai korkea rasvapitoisuus (Fernandes 2009). Staphylococcus aureus ei ole psykrotrofinen organismi, mutta se tuottaa lämmönkestävää enterotoksiinia (Schmidt 2016). Cronobacter-kantoja on löytynyt erityisesti äidinmaidonkorvikejauheista ja kannat ovat aiheuttaneet vastasyntyneille erittäin vakavia seurauksia, jopa kuolemia. Bacillus cereus -bakteeri on aerobinen psykrotrofi, joten se voi kasvaa pastöroiduissa maitotuotteissa. Sen itiöt selviävät pastöroinnista.

4 MAIDON PROSESSOINTI JA MAITOTUOTTEIDEN VALMISTUS MEIJERISSÄ 21 4.1 Maidon prosessointi Tiloilta tuleva maito saapuu jäähdytettynä meijeriin ja siellä se siirretään säiliöihin (Kuva 1, Chandan 2016). EU:n alueella maito täytyy jäähdyttää jalostuslaitokseen saapuessaan välittömästi korkeintaan lämpötilaan 6 C ja säilyttää tässä lämpötilassa jalostukseen asti, ellei jalostusta aloiteta neljän tunnin kuluessa meijeriin saapumisesta, tai ellei korkeampi lämpötila ole hyväksyttyä teknisistä syistä tiettyjen meijerituotteiden valmistuksessa (EPNAs N:o 853/2004). Käsittelyn aluksi maito separoidaan: kerma ja rasvaton maito erotetaan toisistaan sentrifugoimalla (Kuva 1, Chandan 2016). Vakioinnilla valmistetaan maitoa erilaisilla rasvapitoisuuksilla sekoittamalla kermaa ja rasvatonta maitoa keskenään sopivassa suhteessa. Sen jälkeen maitoon voidaan lisätä mahdolliset lisäaineet, kuten vitamiinitäydennykset. (Chandan 2016.) Vakioidulle maidolle tehdään pastörointi (tai muu lämpökäsittely) ja homogenointi (Chandan 2016). Homogenoinnissa rasva pilkotaan pienempään kokoon, jolloin kerma ei enää erotu maidon pinnalle. Pastöroinnilla tuhotaan taudinaiheuttajat ja pilaajamikrobit. Tämän jälkeen nestemäisiksi maitotuotteiksi päätyvä maito jäähdytetään, pakataan ja siirretään varastoon odottamaan kuljetusta kuluttajien käyttöön. (Chandan 2016.)

22 Kuva 1. Maidon prosessointi meijerissä (mukaillen Chandan 2016).

23 4.2 Juuston prosessointi Juuston valmistus perustuu maidon kaseiiniproteiinin koagulointiin juustomassaksi, jossa maidon mahdollinen rasva on myös mukana (Fernandes 2009). Lämmitettyyn maitoon lisätään koagulointia varten juoksute ja hapate. Koaguloitunut juustomassa leikataan ja massaa keitetään. Hera erottuu prosessissa juustomassasta. (Kuva 2.) Kuva 2. Esimerkki juustonvalmistusprosessista (mukaillen Fernandes 2009).

24 Juustoja voidaan luokitella niiden kosteuden, kypsytysmenetelmän ja kypsytysasteen mukaan (Fernandes 2009). Heran erotuksen jälkeiset toimenpiteet vaihtelevat juustotyypin mukaan. Esimerkiksi Cheddar-juuston valmistuksessa tarvitaan suolaus, puristaminen ja kypsyttäminen (Kuva 2) ja raejuustoa ei kypsytetä ollenkaan, vaan juustomassaan lisätään kastike (Kuva 3). Kuva 3. Esimerkki juustonvalmistusprosessista (mukaillen Chandan 2016).

25 4.3 Voin prosessointi Voi kirnutaan maidosta erotetusta pastöroidusta kermasta (Kuva 4, Chandan 2016). Voita voidaan valmistaa joko hapatetusta tai hapattamattomasta kermasta. Hapatebakteerit voidaan lisätä kermaan myös vasta kirnuamisen yhteydessä. Kirnuamisessa muodostuvasta voimassasta eroaa kirnumaito. Mahdollinen suolaus tehdään kirnumaidon erottumisen jälkeen, kun voimassaa vielä työstetään. (Chandan 2016, Patel, Sharma ja Patel 2016.) Kuva 4. Voin prosessikaavio (mukaillen Chandan 2016).

4.4 Mikrobiologisten näytteiden ottaminen meijerin prosessista 26 Edellä kuvatuissa prosesseissa elintarvikkeen tai prosessin mikrobiologista laatua tutkitaan asetusten ja elintarviketoimijan omavalvontasuunnitelman mukaan. EU:n asetuksen (EPNAs N:o 853/2004) mukaan tiloilta tulevan raakamaidon mikrobiologinen laatu tulee olla sellainen, että siinä oleva pesäkemäärä lämpötilassa 30 C ei ylitä 100 000 pesäkettä millilitrassa. Samoin asetuksen mukaan on varmistettava, että tuotteiden valmistukseen käytettävän raakamaidon pesäkemäärä on ennen lämpökäsittelyä alle 300 000 pmy/ml ja lämpökäsittelyn jälkeen alle 100 000 pmy/ml. (EPNAs N:o 853/2004.) Meijerin prosesseista tehdään kaikki komission asetuksen (EY) N:o 2073/2005 säätämät mikrobitutkimukset. Asetuksessa mainitut turvallisuusvaatimukset koskevat markkinoille saatettuja tuotteita eli valmiita tuotteita, ja prosessihygieniavaatimuksia maitoalan laitokselle on annettu sekä valmiille tuotteille että puolivalmisteille (Eviran ohje 10501/2). Jos prosesseissa käytetään talousvettä, määrää sosiaali- ja terveysministeriön asetus (STMa 461/2000) tutkimaan myös sen mikrobiologisen laadun. Elintarviketurvallisuus varmistetaan yleensä ennaltaehkäisevästi hyviä hygieniakäytäntöjä toteuttaen (Eviran ohje 10501/2). Asetusten säätämien tutkimusten lisäksi omavalvontaan voi kuulua myös muita mikrobiologisia tutkimuksia. Nämä tutkimukset ja niihin liittyvät raja-arvot määrittelee toimija itse.

5 MIKROBIOLOGISET MENETELMÄT JA NIIDEN EPÄVARMUUS 27 5.1 Mikrobiologiset analyysimenetelmät Mikrobiologiassa voidaan tutkia näytteen mikrobeja kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti (Bell ym. 2005). Kvalitatiivisissa tutkimuksissa selvitetään, sisältääkö näyte ja tietty näytemäärä kyseistä tutkimuksen kohteena olevaa mikrobia vai ei. Tätä menetelmää käytetään yleensä patogeenisten organismien toteamiseen. Kvantitatiivisissa menetelmissä selvitetään, kuinka paljon mikrobia näyte sisältää tiettyä näytemäärää kohti. Mikrobimäärän laskemisessa voidaan käyttää esimerkiksi pesäkelaskentaa tai MPN-menetelmää. Pesäkelaskennassa tulos ilmoitetaan yksikössä pmy/ml tai pmy/g (pmy = pesäkettä muodostava yksikkö) ja MPN-menetelmässä yksikössä most probably number eli todennäköisin määrä organismia. MPN-menetelmässä tuloksen laskemiseen käytetään tilastollista menetelmää ja se on herkempi menetelmä varsinkin vähäisten mikrobimäärien toteamiseen. (Bell ym. 2005.) 5.2 Mikrobiologinen analyysi perinteisellä pesäkelaskentamenetelmällä Maljaviljely ja pesäkelaskenta ovat perinteinen menetelmä näytteen elävien mikrobien pitoisuuden selvittämiseen (Jay ym. 2005). Menetelmä on käytössä tutkimuksen kohteena olleessa meijerissä, joten sen tekemistä kuvaillaan tarkemmin. Esimerkkinä käytetään tässä työssä validoitavia menetelmiä enterobakteerien (ISO 21528 2:2004(E)) ja koliformien (ISO4832:2006(E)) tutkimisesta. Kaikki analyyseihin liittyvät tekijät koskevat aerobisten mikro-organismien kasvatusta, anaerobeille menettelyohjeet ovat erityisesti kasvatusolosuhteiden osalta erilaiset. 5.2.1 Elatusaineet Elatusaineet sisältävät mikrobeille sopivia energiaravintoaineita, tärkeimpänä niistä typpeä sisältävät yhdisteet (Bell ym. 2005). Energianlähteen lisäksi elatusaine sisältää kivennäisaineita, vitamiineja ja sopivan ph-arvon säilyttämiseen tarvittavia puskureita. Elatusaineet voivat olla kaikkien mikrobien kasvatukseen tarkoitettuja yleisiä elatusaineita tai selektiivisiä elatusaineita. Selektiiviset elatusaineet sisältävät komponentteja, jotka suosivat tietyn mikrobin kasvua tai ehkäisevät häiritsevän mikrobin kasvua ja helpottavat näin kohdemikrobin havaitsemista.

28 Enterobakteerien määrityksessä selektiivinen elatusaine sisältää muun muassa glukoosia ja sappisuoloja (ISO 21528 2:2004(E)). Koliformisten bakteerien kasvatuksessa selektiivinen elatusaine sisältää muun muassa laktoosia (ISO4832:2006(E)). Yleisessä elatusaineessa voidaan kasvattaa laajasti erilaisia mikrobeja (Bell ym. 2005). Kasvatusolosuhteet kuitenkin määräävät, mitkä mikrobit voivat yhtä aikaa yleisessä elatusaineessa kasvaa, sillä eri mikrobilajeilla on erilaiset kasvuvaatimukset. Yleisiä elatusaineita käytetäänkin tiettyjen mikrobiryhmien kasvattamiseen, esimerkiksi aerobisten mikrobien tai hiivojen ja homeiden kasvatukseen, ja kasvatusolosuhteet valitaan halutun mikrobiryhmän mukaan. Mikrobien kasvatuksessa käytetään sekä nestemäisiä että geelimuodossa olevia elatusaineita (Bell ym. 2005). Nestemäisiä elatusaineita käytetään useimmiten kasvattamaan mikrobipitoisuutta niin, että mikrobia voidaan siirrostaa muihin näytteisiin tai mikrobia itseään voidaan tarkemmin tutkia. Kun elatusaineeseen lisätään agaria (levästä eristetty polysakkaridi), saadaan kasvatusalustasta kiinteä. Tällaista kasvatusalustaa käytetään mikrobien kvantitatiiviseen määritykseen. 5.2.2 Viljely ja kasvatus Kvantitatiivisessa mikrobimäärityksessä käytetään tavallisesti maljaviljelyä (Bell ym. 2005). Maljaviljelyssä petrimaljalle annostellaan agaria sisältävää elatusainetta. Kaadettaessa sulana oleva agar jähmettyy pian huoneenlämmössä hyytelömäiseksi. Agar on mikrobien kvantitatiivista määrittämistä varten hyvä kasvualusta, sillä se pysyy kiinteänä myös lämpökaapissa mikrobikasvulle optimaalisessa lämpötilassa. Mikrobit eivät myöskään käytä agaria ravinnokseen. Maljaviljelymenetelmänä voidaan käyttää maljavalua tai pintaviljelyä (Bell ym. 2005). Maljavalussa petrimaljalle siirrostetaan ensin näytettä tietty tilavuus ja sen jälkeen kaadetaan sulaa agaria näytteen päälle. Ennen agarin jähmettymistä näyte sekoitetaan siihen homogeeniseksi seokseksi. Joissakin analyyseissä voidaan valaa jähmettyneen agarin päälle vielä ns. peittokerros, muutama millilitra agarliuosta tasaiseksi pinnaksi. Pintaviljelyssä jähmetetään maljalle ensin agar ja sen jälkeen viljelysauvan avulla levitetään agarin pinnalle pieni määrä näytettä (Bell ym. 2005).

29 Mikrobien kasvattaminen tapahtuu lämpökaapissa, jossa maljoja inkuboidaan kullekin mikrobityypille sopivissa olosuhteissa ja riittävän kauan (Bell ym. 2005). Kasvatusolosuhteita säätelemällä voidaan rajata mikrobikasvua niin, että vain haluttu mikrobi tai mikrobiryhmä pystyy maljalla kasvamaan. Esimerkiksi psykrotrofiset mikrobit kasvavat matalassa lämpötilassa (7 C) hyvin, kun taas termofiiliset kannat suosivat korkeaa lämpötilaa (55 C). Enterobakteerit kasvavat parhaiten lämpötilassa 37 C (ISO 21528 2:2004(E)). 5.2.3 Tulosten tulkinta ja varmistus Maljaviljelyn tuloksena saadaan maljoja, joissa näytteen mahdollisesti sisältämät mikrobit ovat kasvaneet näkyviksi toisistaan erottuviksi pesäkkeiksi (Bell ym. 2005). Näiden pesäkkeiden määrän perusteella pystytään laskemaan alkuperäisen näytteen mikrobipitoisuus. Pesäkemäärä ilmoitetaan yksikössä pmy/ml tai pmy/g (pmy = pesäkettä muodostava yksikkö). Pesäkkeet voidaan yleensä luotettavasti tulkita silloin, kun niitä yhdellä maljalla on 1 100 kappaletta (myös 30 300 tai 15 150), riippuen käytettävän menetelmän tarkkuudesta. Menetelmän ohjetta pesäkelaskennasta tulee noudattaa. (Bell ym. 2005.) Maljalta voidaan tehdä myös kvalitatiivisia havaintoja, esimerkiksi kaasunmuodostuksesta tai epätyypillisistä pesäkkeistä (Bell ym. 2005). Pesäkkeiden varmistukseen käytetään erilaisia testejä, jotka voivat perustua esimerkiksi kohdemikrobin morfologiaan, biokemiallisiin testeihin tai kasvatukseen erilaisella kasvatusalustalla. Kasvatusalustat ovat harvoin täysin selektiivisiä (Bell ym. 2005). Toisinaan tutkittava mikrobi voi kasvaa menetelmälle epätyypillisenä pesäkkeenä, toisinaan maljalla kasvaa muita kuin kohdemikrobeja joko samalla tai erilaisella tavalla kuin kohdemikrobi. Tämä voi aiheuttaa vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia tuloksia. Siksi saatua menetelmälle tyypillistä tulosta yleensä pidetään ns. oletettuna positiivisena tuloksena ja saadut pesäkkeet pitäisi varmistaa. Myös epätyypillisiä pesäkkeitä voidaan varmistaa. Enterobakteerien tutkimisessa elintarvikkeista pelkästä maljaviljelystä saadaan tulokseksi oletettu enterobakteeri, ja tyypilliset pesäkkeet varmistetaan oksidaasikokeella ja glukoosin fermentointitestillä (ISO 21582 2:2004(E)). Koliformisten bakteerien tutkimiseen käytetty menetelmä taas hyväksyy maljalta lasketut tyypilliset pesäkkeet koliformisiksi bakteereiksi, ja vain epätyypilliset pesäkkeet tulisi varmistaa laktoosin hyödyntämiskokeella (ISO 4832:2006(E)).

30 5.3 Muita mikrobiologisia analyysimenetelmiä Maljaviljelyn lisäksi mikrobien kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen määritykseen voidaan käyttää useita muita menetelmiä. Etenkin uudemmat genotyypitykseen perustuvat menetelmät ovat entistä suositumpia (Jay ym. 2005). Mikrobeja tunnistetaan tai lasketaan myös niiden metabolisen aktiivisuuden, immunologisten tai fysikaalisten ominaisuuksien perusteella. Nämä menetelmät ovat usein nopeampia ja herkempiä kuin tavalliset viljelyyn perustuvat menetelmät. Mikrobien kvantitatiivisen määrityksen voi tehdä esimerkiksi mikroskoopin avulla (Jay ym. 2005). Tähän sopii kalvosuodatusmenetelmä, jossa nestemäinen näyte suodatetaan tiheän kalvon läpi, ja mikrobit jäävät kalvolle. Mikrobit voidaan kerätä kalvolta talteen, värjätä ja käsitellä niin, että ne voidaan laskea mikroskoopilla. Vaihtoehtoisesti kalvo voidaan asettaa sopivalle kasvatusalustalle, jolla mikrobeja kasvatetaan ja lasketaan pesäkkeitä muodostavat yksiköt. Kalvosuodatusmenetelmä on nopea, ellei se sisällä kasvatusvaihetta. Mikroskoopilla laskettaessa myös elinkyvyttömät mikrobit tulevat laskentaan mukaan. (Jay ym. 2005.) Kemialliset menetelmät mikrobimäärityksissä perustuvat mikrobien metabolisen aktiivisuuden mittaamiseen (Jay ym. 2005). Esimerkiksi patogeenin Staphylococcus aureus -kantojen esiintymistä voidaan mitata sen tuottamaa lämpöstabiilia nukleaasia mittaamalla. Gramnegatiiviset bakteerit voidaan tunnistaa niiden tuottamien endotoksiinien avulla käyttämällä hyväksi endotoksiineille erityisen herkkää lysaattiproteiinia, joka geeliytyy endotoksiinien läsnä ollessa. Tätä menetelmää on käytetty esimerkiksi maitotuotteiden hygieenisen laadun mittaamiseen koliformisten bakteerien tutkimisen sijaan. (Jay ym. 2005.) Kemiallisiin menetelmiin kuuluu myös solujen tarvitseman ATP-molekyylin mittaaminen (Jay ym. 2005). ATP-molekyylin määrä on elävissä soluissa yleensä vakio, ja sen määrän mittaaminen tuottaa kvantitatiivista tietoa näytteen mikrobeista (Jay ym. 2005). Radiometriassa mikrobien kasvatusalustaan laitetaan radioaktiivista hiiltä sisältävää metaboliittia, jota mikrobit hyödyntävät tuottaen mitattavaa radioaktiivista hiilidioksidia. Immunologiset menetelmät mikrobimäärityksissä perustuvat mikrobien antigeenien tunnistamiseen ja sopivien vasta-aineiden käyttöön (Jay ym. 2005). Menetelmiä voidaan käyttää mikrobin tunnistamiseen ja kvantitatiivisiin määrityksiin. Genotyypin tunnistamiseen perustuvissa menetelmissä tehdään usein ensin polymeraasiketjureaktio (PCR) DNA:n monistamiseksi (Jay ym. 2005). Monistettuja DNApätkiä voi sen jälkeen tutkia usealla eri tavalla, kuten erityyppisillä geelielektroforeeseilla. PCR-menetelmillä on hyvä herkkyys ja spesifisyys, sekä hyvä kaupallinen sovellettavuus.

31 DNA-koettimet sisältävät tutkittavan organismin DNA-sekvenssiä, ja haluttu organismi tunnistetaan sen perusteella, että koettimen DNA hybridisoituu halutun organismin DNA:n kanssa (Jay ym. 2005). Tutkittavaa organismia voidaan muunnella siirtämällä sen perimään spesifisen bakteriofaagin avulla uusia geenejä. Tätä menetelmää käytetään esimerkiksi luminesenssin aikaansaamiseksi kohdemikrobiin. Fingerprinting-menetelmien tarkoitus mikrobitutkimuksissa on karakterisoida ja erotella mikrobilajeja ja -kantoja niiden DNA-profiilien perusteella (Jay ym. 2005). Fysikaalisiksi luokiteltuja mikrobien analysointimenetelmiä ovat esimerkiksi biosensorit, impedanssimittaus, mikrokalorimetria ja virtaussytometria (Jay ym. 2005). Biosensorit ovat laitteita tai menetelmiä, jotka tunnistavat näytteen mikrobin tai sen aktiivisuuden ja muuntavat havaintonsa mitattavaksi signaaliksi. Impedanssimittaus perustuu siihen, että mikrobien metabolinen aktiivisuus tuottaa johtokykyisiä metaboliitteja ja kasvuliuoksen impedanssiarvo samalla vähenee. (Jay ym. 2005.) Virtaussytometriassa voidaan mitata yksittäisten solujen ominaisuuksia ja luokitella solut yhden tai useamman ominaisuuden perusteella (Jay ym. 2005). Soluista voidaan tutkia esimerkiksi fluoresenssia, absorbanssia ja valon hajontaa. 5.4 Mikrobiologisten menetelmien epävarmuus Epävarmuus kuvaa mittaustulokseen liittyvää todennäköisintä hajontaa (Corry ym. 2007). Se ei tarkoita samaa kuin mittausvirhe, joka kuvaa mitatun tuloksen ja todellisen arvon välistä eroa, ja jota ei voida oikeastaan edes saada selville. Mikrobiologisissa analyyseissa epävarmuutta voi aiheutua esimerkiksi näytteenotossa tai sen käsittelyssä tulleista virheistä, analyysien aikana tulleista viivästyksistä, mikrobien elatusaineen koostumuksen ja valmistustavan vaihtelusta, inkubaatio-olosuhteiden vaihtelusta ja näytteen mikrobiston kokonaisuudesta. Virhe voi olla satunnainen, systemaattinen virhe analyysin tekemisessä tai analyysimenetelmän soveltamisvirhe vaikkapa tietyn laboratorion sisällä. (Corry ym. 2007, Jarvis ym. 2007.) Mikrobin esiintyminen tai mikrobipitoisuus näytteessä selvitetään yleensä kasvattamalla mikrobia sopivalla kasvatusalustalla. Kohdemikrobia sisältävä näyte otetaan analyysiin mukaan sellaisenaan tai sopivana laimennoksena, ja yksittäisessä viljelyssä mukana on vain pieni määrä näytettä tai sen laimennosta. Kvantitatiivista määritystä varten näytettä yleensä laimennetaan sellaiseen pitoisuuteen, että yksittäisten solujen muodostamat pesäkkeet on mahdollista laskea. Tämä tarkoittaa sitä, että yksittäisessä analyysissä on mukana muutamia kymmeniä,

32 korkeintaan muutamia satoja soluja. Siksi rinnakkaisten näytteiden analyyseissä tulokset voivat poiketa toisistaan paljonkin ilman, että voidaan puhua virheestä. (Elintarvikevirasto 1997.) Tutkittavan näytemateriaalin kemiallinen koostumus ja sen sisältämät häiritsevät mikrobit voivat aiheuttaa analyysituloksiin vaihtelevuutta. Sama analyysimenetelmä ei anna samanlaisia tuloksia, kun mikrobia tutkitaan erilaisissa kasvuympäristöissä. (Elintarvikevirasto 1997.) Mikrobiologit ovat yleensä arvioineet kvantitatiivisten määritysten virherajaksi ±0,5 logaritmista yksikköä eli noin ±3,16 pesäkettä muodostavaa yksikköä (Corry ym. 2007). Mikrobiologisten analyysien tuloksilla tai määritetyillä raja-arvoilla ei kuitenkaan ole mitään merkitystä sinänsä, ellei niitä liitetä johonkin tiettyyn käyttötarkoitukseen, esimerkiksi lainsäädännön vaatimuksiin tai merkitykseen kansanterveydelle. Näitä tarkoituksia varten tarvitaan myös tuloksen epävarmuuden arviointia. (Corry ym. 2007.) Maljaviljelyyn liittyvistä epävarmuustekijöistä perehdytään tässä tarkemmin inkubointiolosuhteisiin, rinnakkaisten maljojen käyttöön ja alhaisen pesäkemäärän aiheuttamaan epävarmuuteen, ja joitakin tutkimustuloksia epävarmuudesta esitetään. 5.4.1 Inkubointiolosuhteet Bell ym. (2005) mukaan lämpökaappiin saisi pinota maljoja enintään kuuden maljan pinoihin. Samoin määrittelevät yleiset ohjeet mikrobiologisista analyyseistä (ISO 7218:2007(E)). Eräissä tutkimuksissa on havaittu, että esimerkiksi 10 maljan pinoissa keskimmäisillä maljoilla kesti 13,5 tuntia saavuttaa tavoitelämpötila 37 C, kun reunimmaisilla maljoilla meni 2,7 tuntia (Corry ym. 2007). Lämpökaapissa ei ollut tuuletinta, mutta tutkimuksessa jossa sellainen oli, E. coli -pitoisuudet olivat huomattavasti suuremmat maljapinon keskellä. Tutkimus osoitti myös, että kun maljoja oli pinossa yli kuusi, 44 C tavoitelämpötilan saavuttaminen siirtyi niin paljon, että tässä tilanteessa maljoilla kasvoi bakteeri, jonka ei pitänyt kasvaa tarkoitetussa lämpötilassa. (Corry ym. 2007.) Inkubointiaika on standardimenetelmissä yleensä aika tarkkaan ilmaistu ja niissä on usein virherajana ±2 tuntia (Corry ym. 2007). Tästä inkubointiajasta poikkeaminen aiheuttaa harvoin häiriötä tuloksiin, mutta tietyissä tapauksissa se on mahdollista. Esimerkiksi kromogeenisillä alustoilla tai VRB-alustalla (koliformisten bakteerien määrityksessä (ISO4832:2006(E)) tyypilliset pesäkkeet ilmaantuvat vasta menetelmässä ilmoitetun minimiajan jälkeen. Toisaalta joissakin tapauksissa pesäkkeet haalenevat ajan myötä ja joskus epätoivotut organismit kasvavat liian pitkän inkuboinnin seurauksena. (Corry ym. 2007).

33 5.4.2 Alhainen pesäkemäärä maljoilla Tuloksen epävarmuudesta on vaikea antaa arviota myös siinä tapauksessa, kun saatu pesäkemäärä on hyvin matala tai pesäkkeitä ei ole (Forster 2009). Joissakin analyyseissa tai joillekin näytteille tämä voi olla normaali tilanne. Forster (2009) raportoi tutkimusta, jossa selvitettiin pesäkelaskentamenetelmässä tulosten hajontaa erilaisilla pesäkemäärillä, ja totesi, että alhaisilla pesäkemäärillä (alle 20 pesäkettä) hajonta on huomattavasti suurempaa kuin suuremmilla pesäkemäärillä. Tutkimuksessa oli mukana viittä erilaista mikrobiryhmää ja näytteitä tutkittiin yhteensä 92 kappaletta. Standardimenetelmä enterobakteerien määrittämiseksi elintarvikkeista (ISO 21528 2:2004) esimerkiksi sallii kaikkien pesäkkeiden laskemisen maljoilta, joilla niitä on alle 150 kappaletta, mutta antaa lisäksi 95 % luottamusvälin pesäkemäärille 1 15. (ISO 21528 2:2004.) Koliformien tutkimiseen tarkoitettu menetelmä taas sallii niiden maljojen laskemisen, joilla pesäkkeitä on 10 150 (ISO 4832:2006(E)). 5.4.3 Rinnakkaisten maljojen käyttö Kaikissa tämän tutkimuksen lähteinä olleissa standardimenetelmissä ohjeistetaan viljelemään näytteistä kaksi rinnakkaista maljaa, tai jos käytetään samasta näytteestä kahta eri laimennosta, riittää yksi malja laimennosta kohti. Bell ym. (2005) mukaan ihannetapauksissa rinnakkaisia maljoja tulee käyttää, mutta rutiinityössä käytetään usein vain yhtä maljaa yhtä laimennosta kohti. Tämä ohje on kuitenkin ilmaistu yhteydessä, jossa samasta näytteestä oletetaan tehtävän useita eri laimennoksia. (Bell ym. 2005). Myös Corry ym. (2007) mukaan rinnakkaisiin maljoihin perustuva laadunhallinta kuuluu laboratorion rutiinityöskentelyyn ja se on yksi keino, jolla voidaan varmistaa laboratorion pätevyys ja pitää tulosten epävarmuutta hyväksyttävällä tasolla. Standardissa ISO 7218:2007(E) suositellaan myös käyttämään rinnakkaisia maljoja.

34 Niemelä (2002) on arvioinut tilastollisesti pesäkelaskennan hajontaa, kun käytetään yhtä maljaa näytettä kohti tai kun käytetään useampaa maljaa. Hajonnan arvio perustuu siihen, että mikrobien oletetaan noudattavan Poissonin jakaumaa näytteessä. Keskihajontaa voidaan arvioida käyttämällä kaavaa s = 1 c, Kaava 1. Suhteellinen keskihajonta. jossa c = maljalla tai maljoilla olevat pesäkkeet yhteensä. (Niemelä 2002.) Kun hajontaa arvioidaan esimerkiksi tilanteessa, jossa yhdellä maljalla on pesäkkeitä 10 ja kahdella maljalla samassa analyysissä yhteensä 25, hajonnat olisivat 0,32 ja 0,2, tässä järjestyksessä. Jos pesäkemäärät ovat hyvin pieniä (alle kymmenen), hajonta on suurempaa.

6 MIKROBIOLOGISTEN MENETELMIEN VALIDOINTI 35 6.1 Validoinnin tarkoitus Mikrobiologisen analyysimenetelmän validoinnilla pyritään osoittamaan, että menetelmä on käyttökelpoinen juuri siihen tarkoitukseen, mihin sitä käytetään. Validoitu menetelmä antaa luotettavia tuloksia tutkittavasta aiheesta. Laajasti käytössä olevat standardisoidut mikrobiologiset menetelmät validoidaan yleensä laajoilla laboratorioiden välisillä tutkimuksilla. Laboratoriokohtaisesti validointi tarkoittaa yleensä standardoidun tai muun yleisesti käytössä olevan menetelmän käyttöönottoa ja validoinnilla osoitetaan, että laboratorio hallitsee menetelmän. (Elintarvikevirasto 1997.) 6.2 Validointiin liittyviä suureita Oikeellisuudella tarkoitetaan sitä, kuinka hyvin validoitava menetelmä antaa oikean tuloksen. Tämän tutkimiseksi tarvitaan tietoa mikrobin todellisesta pitoisuudesta. Todellista mikrobipitoisuutta on vaikea määrittää elävästä materiaalista, joten oikeellisuuden toteamiseksi voidaan käyttää sertifioituja referenssi- eli vertailumateriaaleja, joille ilmoitettuja pitoisuuksia pidetään oikeina. Tällaiset referenssimateriaalit ovat kalliita ja niitä ei aina ole saatavilla, joten referenssinä voidaan käyttää joko sertifioimattomia referenssimateriaaleja tai näytteitä, joihin on siirrostettu tutkittavaa mikrobia. (Elintarvikevirasto 1997.) Menetelmän suhteellinen oikeellisuus tarkoittaa sitä, kuinka hyvin referenssimenetelmä ja validoitava menetelmä vastaavat toisiaan tai kuinka lähekkäiset tulokset niillä saadaan, kun tutkitaan samoja näytteitä. Validoitavalla menetelmällä saatu positiivinen tulos on virhepositiivinen, jos referenssinäyte ei sisällä tutkittavaa mikrobia. Virhenegatiivisuudella tarkoitetaan validoitavan menetelmän antamaa negatiivista tulosta silloin, kun referenssinäyte sisältää tutkittavaa mikrobia. (Elintarvikevirasto 1997.) Menetelmän täsmällisyyttä kuvaavat sen toistettavuus ja uusittavuus. Toistettavuudella tarkoitetaan sitä, kuinka lähellä toisiaan lyhyellä aikavälillä tehtyjen peräkkäisten toistojen antamat tulokset ovat, kun tutkitaan identtisiä näytteitä samalla menetelmällä, samoissa olosuhteissa ja samojen henkilöiden toimesta. (Elintarvikevirasto 1997.)

36 Uusittavuudella tarkoitetaan eri henkilöiden tekemien analyysitulosten lähekkäisyyttä, kun tutkitaan identtisiä näytteitä samoilla menetelmillä joko samassa tai eri laboratoriossa. (Elintarvikevirasto 1997.) Validoitavan menetelmän toteamisrajalla tarkoitetaan pienintä mahdollista mikrobipitoisuutta, joka voidaan luotettavasti menetelmällä todeta. Toteamisrajaan vaikuttavat menetelmän spesifisyys, selektiivisyys ja näytematriisi. (Elintarvikevirasto 1997.) Määritysraja on kvantitatiivisen menetelmän validointiin liittyvä suure. Sillä tarkoitetaan alhaisinta mikrobipitoisuutta, joka menetelmällä voidaan luotettavasti määrittää. Nestemäisillä näytteillä määritysraja on yleensä alle 1 pmy/ml maljavalussa tai alle 10 pmy/ml pintalevityksessä. Kiinteillä näytteillä vastaavat määritysrajat ovat yleensä alle 10 pmy/g tai alle 100 pmy/g. Määritysrajaan vaikuttavat menetelmän spesifisyys, selektiivisyys ja näytematriisi mikrobistoineen. (Elintarvikevirasto 1997.) Standardin ISO 7218:2007(E) mukaan mikrobiologisille analyyseille tyypillinen luotettava määritysraja on 4 pesäkettä määritystä kohti. Jos pesäkkeitä on vähemmän, tulosta voidaan pitää vain osoituksena mikro-organismin esiintymisestä näytteessä. (ISO 7218:2007(E).) Spesifisyys kuvaa menetelmän kykyä havaita tutkittava mikrobi tai mikrobit näytteessä olevista häiritsevistä tekijöistä huolimatta (Elintarvikevirasto 1997). Häiritsevinä tekijöinä ovat yleensä muut näytteen mikrobit, jotka voivat tulla analyysissä esille esimerkiksi epätyypillisinä pesäkkeinä. Menetelmän spesifisyyttä voidaan tutkia lisäämällä näytematriisiin tunnettu määrä sellaista häiritsevää mikrobia tai mikrobityyppiä, jota kyseisessä matriisissa on mahdollista esiintyä. Tämän jälkeen viljelemällä näytettä selvitetään, vaikuttaako häiritsevä mikrobi tuloksen tulkintaan. (Elintarvikevirasto 1997.) Herkkyys eli sensitiivisyys kuvaa validoitavan menetelmän kykyä todeta vähäiset vaihtelut tutkittavien mikrobien pitoisuuksissa. Tämä on tärkeä suure etenkin silloin, kun verrataan kahta eri menetelmää toisiinsa. (Elintarvikevirasto 1997.) Lineaarisuus on menetelmän kyky antaa sellaisia tuloksia, jotka ovat suoraan verrannollisia näytteen mikrobipitoisuuteen. Todellisen mikrobipitoisuuden muuttuessa lineaarisen menetelmän antama tulos muuttuu samassa suhteessa. (Elintarvikevirasto 1997.) Lineaarisuutta tutkitaan viljelemällä näytteestä erilaisia laimennoksia, joista löytyy sopivalla laskenta-alueella oleva mikrobipitoisuus.

37 7 TUTKIELMAN TAVOITE Tämän tutkielman tavoitteena on selvittää, mitä vaatimuksia ja suosituksia meijeriteollisuuden tulee ottaa huomioon mikrobiologisen laadun hallinnassa. Tavoitteena on lisäksi selvittää, onko meijerin mikrobiologinen laadunvalvonta sellaisella tasolla, että meijeri voi laadunvalvonnan menetelmillään osoittaa tuotteidensa olevan mikrobiologiselta laadultaan hyväksyttäviä. Mahdolliset laatupoikkeamat tulisi saada laadunvalvonnan menetelmillä selville riittävällä varmuudella. Tutkielmassa raportoidaan lisäksi enterobakteerien ja koliformisten bakteerien määritysmenetelmille tehty validointiprosessi.

38 8 VALIDOINTIPROSESSI 8.1 Validoitavat menetelmät Tutkimuksessa validointiprosessiin valittiin laboratoriossa käytettävät standardoidut menetelmät ISO 4832 (koliformisten bakteerien kvantitatiivinen määritys elintarvikkeista ja rehuista) sekä ISO 21528-2 (enterobakteerien määritys elintarvikkeista ja rehuista). Menetelmiä ei oltu laboratorion tarkoituksiin aiemmin validoitu. 8.2 Käytettävä maljavalumenetelmä Sekä koliformisten että enterobakteerien määrittäminen tehdään maljavalumenetelmällä, jossa petrimaljalle pipetoidaan ensin näytettä tai sen laimennosta (1 ml tai 0,1 ml), jonka jälkeen kaadetaan nestemäistä agarliuosta näytteen päälle noin 15 ml sekoittaen. Kun agar on jähmettynyt, päälle kaadetaan noin 4 ml peittokerros agaria. Peittokerroksen annetaan jähmettyä ja malja siirretään ylösalaisin lämpökaappiin. Koliformisten bakteerien määrittäminen tehdään käyttäen spesifistä VRB (Violet Red Bile) agaria, jolle koliformiset bakteerit muodostavat tyypillisiä vaaleanpunaisia pesäkkeitä. Viljeltyjä maljoja inkuboidaan 24 tuntia ± 2 tuntia. Koska tutkittavat näytteet ovat maitotuotteita, kasvatuslämpötila on 30 C ± 1 C. Menetelmän mukaisesti tyypillisiä pesäkkeitä ei tarvitse varmistaa, mutta epätyypilliset pesäkkeet voidaan varmistaa tutkimalla niiden laktoosin hajotuskykyä. Tätä ei validoinnissa kuitenkaan tehty. Enterobakteerien määrityksessä käytetään glukoosia sisältävää VRBG-agaria (Violet Red Bile Glucose), jolle enterobakteerit muodostavat tyypillisiä vaaleanpunaisia, punaisia tai violetteja pesäkkeitä, kun maljoja inkuboidaan 24 tuntia ± 2 tuntia lämpötilassa 37 C ± 1 C. Pesäkkeiden ympärille voi muodostua saostumavyöhyke. Pesäkkeet voidaan varmistaa biokemiallisilla testeillä. Tässä validointityössä varmistusta varten yksittäisistä pesäkkeistä tehdään puhdasviljelmä yleisalustalle ja vuorokauden inkuboinnin jälkeen pesäkkeille tehdään oksidaasikoe, joka on negatiivinen enterobakteereille.

8.3 Validoinnissa käytettävät elatusaineet, kasvatusalustat ja reagenssit 39 Tavanomaisten laboratoriossa käytettävien tarvikkeiden lisäksi validointityössä tarvittiin tutkittavien mikrobien kasvattamiseksi BHI (Brain Heart Infusion, Labema) -elatusainelientä ja yleiskasvatusmaljaksi verimaljoja. Varmistustesteihin käytettiin Baird-Parker-maljoja, DNAasi-maljoja sekä TSA-maljoja. (Ks. Taulukko 4.) Taulukko 4.Validoinnissa käytettävät aineet ja kasvatusalustat. Käytettävä tarvike BHI (Brain Heart Infusion Broth), Labema Peptonijauhe Trinatriumsitraatti-dihydraatti Natriumhydroksidi Oksidaasikokeen reagenssi MPC (milk plate count) VRBA (Violet red bile agar) VRBGA (Violet red bile glucose agar) Verimalja TSA-malja Baird-Parker-malja DNAasi-malja Käyttötarkoitus Elatusaine Laimennokset Laimennokset ph-arvon säätely laimennoksissa Oksidaasikoe Yleiskasvatusalusta Selektiivinen kasvatusalusta Selektiivinen kasvatusalusta Yleiskasvatusalusta Yleiskasvatusalusta Selektiivinen kasvatusalusta Selektiivinen kasvatusalusta 8.4 Valitut näytematriisit Lopulliseen validointiprosessiin valittiin näytematriiseiksi viisi erilaista elintarvikematriisia, joista laboratoriossa päivittäin tutkitaan mikrobipitoisuuksia. Taulukko 5 esittelee näytematriisit ja niiden koodaukset.

40 Taulukko 5. Näytteiden koodaus. Näytemateriaali Säiliömaito, rasvaa 1,5 %, ennen pakkaamista Raejuusto, rasvaa 2 %, valmis tuote Raejuuston kastike (kurri), rasvaa 0 %, lisätty suola ja K-sorbaatti Raejuuston kastike (kerma), rasvaa 10 %, lisätty suola ja K-sorbaatti Voi, normaalisuolainen Koodaus M J KU KE V 8.5 Validointiprosessi Validointiprosessi tehtiin kahdessa osassa: ensimmäisessä osassa (osa 1) tarkoituksena oli tutkia menetelmien oikeellisuutta, täsmällisyyttä, spesifisyyttä ja lineaarisuutta. Toisessa osassa (osa 2) tutkittiin myös menetelmien täsmällisyyttä selvittämällä, poikkeavatko laboratorion eri työntekijöiden tekemien analyysien tulokset toisistaan. Kolme eri työntekijää osallistui osan 2 toteuttamiseen. Toteamis- ja määritysrajoja ei tutkittu. Osassa 1 käytettiin näytteinä kaikkia viittä näytematriisia. Osan 2 tutkimus toteutettiin vain kahdella näytteellä, juustolla ja maidolla. Molemmissa osissa tehtiin validoitavan menetelmän mukaisesti jokaisesta viljelystä kaksi rinnakkaista maljaa, paitsi nollanäytemaljoista vain satunnaisesti. Jokaisesta näytteestä valmistettiin maljat kahdella eri pitoisuudella. Molempia työn osia varten valmistettiin ensin sopivalla pitoisuudella olevat kontrollibakteerisuspensiot, joita näytteisiin oli tarkoitus siirrostaa. Sopiva pitoisuus varmistettiin tekemällä bakteerisuspensiosta laimennossarja, jota kasvatettiin 37 C lämpötilassa. 8.5.1 Bakteerisuspension valmistus Positiivisena kontrollibakteerina käytettiin Escherichia coli -kantaa ATCC 25922 ja häiritsevänä negatiivisena kontrollina Staphylococcus epidermidis -kantaa ATCC 12228. Kylmäkuivatut kontrollikannat herätettiin rikkomalla kylmäkuivattu solupelletti säilytysputkessa olevaan peptonisuolaliuokseen. Bakteerit siirrostettiin suspensiosta verimaljalle ja inkuboitiin lämpötilassa 37 C noin 22 tuntia. Tämän jälkeen verimaljalta

41 siirrostettiin 1 µl viljelysilmukalla molempien kantojen bakteerimassaa 15 millilitraan BHI (Brain Heart Infusion Broth, Labema) -elatusainelientä ja inkuboitiin liemiputkia lämpötilassa 37 C noin 21 tuntia. 8.5.2 Siirrostettavan bakteerisuspension pitoisuuden määritys Validointiprosessissa haluttiin, että maljoilla oleva pesäkemäärä olisi muutamia kymmeniä, mutta alle 100, jotta se olisi helposti laskettavissa. Tätä varten tehtiin alustava tutkimus BHIliemen bakteeripitoisuuden selvittämiseksi, minkä perusteella bakteeripitoisuus oli noin 10 8 10 9 pmy/ml. Sopivan mikrobimäärän siirrostamiseksi näytematriiseihin valmistettiin laimennossarjat molemmista bakteerisuspensioista. Laimennossarja pitoisuudesta 10-1 pitoisuuteen 10-9 valmistettiin peptonisuolaliuosputkiin (Maximum recovery diluent, Labema), joissa oli 9 ml steriloitua peptonisuolaliuosta. Nämä laimennosputket valmistettiin ja steriloitiin itse laboratoriossa. Laimennossarjan laimennoksista 10-5 10-9 tehtiin tarkan mikrobipitoisuuden määrittämiseksi viljelyt MPC (Milk Plate Count) -maljoille inkuboiden niitä vuorokausi lämpötilassa 37 C. Laimennosten 10-7 ja 10-8 pesäkemäärien (Taulukko 6) perusteella laskettiin kontrolliliuosten mikrobipitoisuudet. Tulosten perusteella näytteisiin siirrostettiin positiivista kontrollia (E. coli) laimennoksesta 10-5 ja negatiivista kontrollia (S. epidermidis) laimennoksesta 10-4. Negatiivisen kontrollin kasvu osoittautui hieman heikommaksi kuin positiivisen kontrollin kasvu. Taulukko 6. Mikrobipitoisuudet kontrollibakteerien suspensioissa. Pesäkkeet E. coli S. epidermidis Laimennos 10-7 79 65 30 33 Laimennos 10-8 11 16 4 3 Mikrobipitoisuus (pmy/ml) 7,32 10 8 4,82 10 8

42 8.5.3 Näytematriisien esikäsittely Maito ja juuston kastikkeet otettiin validointiin ilman esikäsittelyä. Raejuusto punnittiin steriiliin Lab Blender -pussiin, homogenoitiin ja sekoitettiin laimennosveteen (trinatriumsitraattiliuos). Bakteerisuspensio siirrostettiin pussissa olevaan näytteeseen. Voita punnittiin dekantterilasiin ja siirrostettiin mahdolliset bakteerisuspensiot ennen sulattamista. Sulatus tehtiin vesihauteessa (lämpötila 47 C) laimennosveden (peptonisuolaliuos) kanssa. Tutkittava näyte otettiin sulamisessa erottuneesta vesifaasista. 8.5.4 Bakteerisuspension siirrostus näytteisiin Jokaiseen näytematriisiin siirrostettiin kontrollibakteeria tai -bakteereita kolmella tai neljällä tavalla (Taulukko 7). Nollanäytteeseen ei siirrostettu bakteereita, yhteen näytteeseen siirrostettiin vain positiivista kontrollia, ja kahteen sekä positiivista että negatiivista kontrollia niin, että positiivista kontrollia oli näissä näytteissä eri pitoisuudet. Kaksi eri pitoisuutta valmistettiin osassa 1 vain maito- ja kurrinäytteille ja osassa 2 molemmille näytteille. Taulukko 7. Näytteisiin siirrostetut bakteerisuspensiomäärät. Näyte Näytemäärä g (punnittu) E. coli (ml 10-5 ) S. epid. (ml 10-4 ) M1 100,73 0 0 M2 100,20 0,4 0 M3 100,57 0,4 0,4 M4 101,82 0,2 0,4 KE1 99,99 0 0 KE2 102,76 0,4 0 KE3 100,52 0,4 0,4 KU1 99,95 0 0 KU2 100,08 0,4 0 KU3 100,17 0,4 0,4 KU4 101,90 0,2 0,4 V1 50,33 0 0 V2 50,31 0,2 0 V3 50,57 0,2 0,2 J1 10,21 0 0 J2 10,45 0,4 0 J3 10,37 0,4 0,4

43 Siirrostuksien perusteella viljellyistä näytteistä laskettiin teoreettiset pesäkeluvut (Taulukko 8). Nollanäytteissä (koodit M1, KE1, KU1, V1 ja J1) kasvua ei tulisi olla. Näytteenotto tehtiin kaikissa tapauksissa noin 10 minuutin jälkeen bakteerisuspension siirrostamisesta. Taulukko 8. Teoreettiset pesäkeluvut näytteissä, pmy/ml tai pmy/g. Näyte M2 M3 M4 KE2 KE3 KU2 KU3 KU4 V2 V3 J2 J3 E. coli 29 29 14 28 28 29 29 14 29 29 280 282 S. epidermidis 0 192 189 0 192 0 192 189 0 189 0 1859 8.5.5 Viljely ja kasvatus Kaikista tutkittavista näytteistä tehtiin enterobakteerimääritys sekä koliformisten bakteerien määritys kappaleessa 8.2 kuvatulla tavalla. Jokaisesta näytteestä viljeltiin kaksi eri laimennosta vähintään kahdella rinnakkaisella maljalla. Menetelmän toistettavuutta tutkittaessa rinnakkaisia maljoja tehtiin neljä. Inkubointi suoritettiin menetelmien mukaan enterobakteereille lämpötilassa 37 C ± 1 C ja koliformisille bakteereille lämpötilassa 30 C ± 1 C, molemmissa tapauksissa inkubointiaika oli 24 tuntia ± 2 tuntia. 8.5.6 Tulosten tulkinta Inkuboinnin jälkeen enterobakteerien ja koliformisten bakteerien maljoilta laskettiin tyypilliset pesäkkeet. Epätyypilliset pesäkkeet varmistettiin tekemällä niistä puhdasviljelmä kaupalliselle yleisalustalle (TSA-malja, Tryptic Soy Agar), inkuboitiin vuorokausi lämpötilassa 37 C ± 1 C ja varmistettiin pesäkkeet oksidaasikokeella. Kaupallisella oksidaasireagenssilla (TestOxidase Reagent, Labema) kostutettuun suodatinpaperiin hierotaan silmukallinen puhdasviljelmää, ja mikäli paperi ei muutu tummansiniseksi kymmenen sekunnin sisällä, tulos on negatiivinen ja tutkittu pesäke kuuluu enterobakteereihin. Validoinnissa varmistus tehtiin vain satunnaisesti, ei kaikkien näytteiden kohdalla.

44 9 TULOKSET 9.1 Pesäkeluvut työn eri osissa Koska Escherichia coli -bakteeri havaitaan molemmilla validoitavilla menetelmillä (koliformiset bakteerit ja enterobakteerit), tulisi pesäkelaskennan tulokset olla eri menetelmillä samat. Negatiivinen kontrollibakteeri Staphylococcus epidermidis kasvoi menetelmissä käytetyillä selektiivisillä maljoilla epätyypillisellä tavalla yhtenäisenä massana (Kuva 5), joten pesäkelaskenta ei ollut tälle bakteerille mahdollista. Verimaljalla bakteeri kasvoi selvästi erottuvina pesäkkeinä (Kuva 6). Kuva 5. Staphylococcus epidermidis enteromaljalla. Kuva 6. Staphylococcus epidermidis verimaljalla. Pesäkelaskennan tulokset löytyvät seuraavista taulukoista (Taulukko 9, Taulukko 10 ja Taulukko 11). Tulokset on laskettu yhteensä 4 8 rinnakkaisen ja eri laimennosten painotettuna keskiarvona siten, että alle kymmenen pesäkkeen maljoja painotetaan vähemmän kuin kymmeniä pesäkkeitä sisältäviä maljoja. Tulos on ilmoitettu yksikössä pmy/ml.

45 Taulukko 9. Pesäkeluvut maidossa, kermassa ja kurrissa (pmy/ml). Näyte M1 M2 M3 M4 KE1 KE2 KE3 KU1 KU2 KU3 KU4 Koliformiset bakteerit 0 36 40 19 0 33 33 0 45 47 9 Enterobakteerit 0 37 39 17 0 35 32 0 40 40 12 Taulukko 10. Pesäkeluvut voissa ja juustossa (pmy/g). Näyte V1 V2 V3 J1 J2 J3 Koliformiset bakteerit 0 45 29 0 455 323 Enterobakteerit 0 34 29 0 432 432 Taulukko 11. Pesäkeluvut työn osassa 2. Näyte M1 M2 M3 M4 J1 J2 J3 J4 Koliformiset bakteerit N 0 33 46 18 0 477 390 291 R 0 30 38 19 0 500 527 241 M - 30 35 17-495 559 382 Keskiarvo 0 31 40 18 0 491 492 305 Enterobakteerit N 0 44 42 17 0 505 600 250 R 0 39 47 25 0 609 464 223 M - 38 47 17-641 632 338 Keskiarvo 0 40 45 20 0 585 565 270 9.1.1 Oikeellisuus Suhteellisen oikeellisuuden arviointiin käytetään validoinnin osan 1 tuloksia. Suhteellista oikeellisuutta arvioidaan teoreettisten pesäkelukujen ja analyysissa kokeellisesti saatujen pesäkelukujen avulla. Niemelän (2002) mukaan suhteellisen virheen laskemiseen voidaan käyttää logaritmimuunnosta, koska mittaustulosten suhteellinen virhe on likimain yhtä suuri kuin logaritmimuunnettujen mittaustulosten absoluuttinen virhe. (Niemelä 2002.) Menetelmän suhteellisen epävarmuuden laskemiseksi teoreettisille pesäkeluvuille ja kokeellisille pesäkeluvuille tehtiin logaritminen muunnos luonnollista logaritmia käyttäen.

46 Suhteellinen epävarmuus laskettiin seuraavasti: Kaikista näytteistä laskettiin logaritmimuunnettujen pesäkelukujen erotusten neliöt (Kaava 2) ja näistä neliöistä laskettiin vielä keskiarvo. (ln z 1 ln z 2 ) 2 Kaava 2: z 1 = teoreettinen pesäkeluku, z 2 =kokeellinen pesäkeluku. Keskiarvoksi saatiin koliformisten organismien määritysmenetelmälle 0,11 ja enterobakteerien määritysmenetelmälle 0,07. Keskimääräinen suhteellinen menetelmän epävarmuus saatiin, kun keskiarvo jaettiin vielä kahdella ja otettiin siitä neliöjuuri. Tulokseksi saatiin samassa järjestyksessä 0,24 ja 0,19. Nämä arvot kuvaavat teoreettisten ja kokeellisten tulosten välillä olevaa suhteellista virhettä ja tulkitaan niin, että koliformisten bakteerien pesäkelaskennan virhetulos voi olla ±24 % ja enterobakteerien ±19 %. Tuloksissa ei esiintynyt virhepositiivisuutta tai virhenegatiivisuutta. Jokainen näyte, johon bakteeria oli lisätty, tuotti positiivisen tuloksen, ja jokainen nollanäyte negatiivisen tuloksen. Lisäksi häiritseväksi bakteerikannaksi lisätty kontrollikanta ei tuottanut validoitavan menetelmän mukaisia positiivisia tuloksia eikä siten aiheuttanut virhenegatiivisuutta. 9.1.2 Täsmällisyys Validoitavan menetelmän täsmällisyyttä arvioitiin sekä osan 1 että osan 2 tulosten avulla. Toistettavuutta arvioitiin osan 1 tulosten avulla. Toistettavuutta tutkittiin tekemällä kahdesta eri maitonäytteestä neljä rinnakkaista viljelyä kahtena erilaisena laimennoksena. Toistettavuus tarkistettiin erikseen kullekin näytetyypille laskemalla niistä suhteellinen hiukkastilastollinen keskihajonta (Kaava 3). Kaikkien näytteiden hajonnat olivat välillä 8-12 %. u C = 1 C, Kaava 3. Suhteellinen keskihajonta. C = yhden näytetyypin pesäkelukujen summa.

47 Uusittavuuden arviointi tehtiin osassa 2. Kolme laboratorion työntekijää teki analyysit samoista näytteistä. Kaikki viljelyt tehtiin samassa laboratoriossa kolmen tunnin sisällä näytteiden käsittelyn ja siirrostuksen jälkeen. Uusittavuutta arvioitiin laskemalla kunkin työntekijän pesäkelukemat jokaisesta näytetyypistä ja sen jälkeen laskemalla logaritmimuunnettujen pesäkelukemien keskihajonnoista keskiarvo (Taulukko 12). Taulukko 12. Hajonta uusittavuuskokeessa, logaritmista yksikköä. Koliformiset bakteerit Enterobakteerit Maitonäytteet 0,09 0,13 Juustonäytteet 0,15 0,17 9.1.3 Spesifisyys Validoitavat menetelmät olivat suhteellisen spesifejä, sillä niillä löydettiin näytteisiin siirrostettu bakteeri molemmissa validoitavissa menetelmissä. Siirrostettu Escherichia coli kasvoi maljoilla tyypillisinä pesäkkeinä. Häiritseväksi tekijäksi siirrostettiin Staphylococcus epidermidis -kantaa, ja se kasvoi epätyypillisenä muodostelmana maljoilla. Häiritsevä bakteeri ei siis voinut aiheuttaa virhepositiivisuutta. Häiritseväksi tekijäksi siirrostettu mikrobi kasvoi epätyypillisenä sekä koliformisten bakteerien että enterobakteerien kasvatusalustoilla. Se ei estänyt haluttujen bakteerien löytämistä menetelmällä, mutta saattoi vaikeuttaa maljojen lukemista, jos E. coli -pesäkkeet jäivät voimakkaan S. epidermidis -kasvuston alle tai reunoille. Tyypilliset E. coli -pesäkkeet voidaan yleensä erottaa S. epidermidis -kasvuston alta (Kuva 7), koska ne kasvavat selvinä vaaleanpunaisina pesäkkeinä joko agarin pinnassa tai sisässä.

48 Kuva 7. Tyypillistä ja epätyypillistä bakteerikasvustoa enterobakteerimaljalla. Kaikissa tilanteissa ei kuitenkaan ollut täysin selvää, mitkä pesäkkeet S. epidermidis -kasvuston reunoilla ovat menetelmälle tyypillisiä pesäkkeitä (Kuva 8). Kuva 8. Vaikeatulkintainen enterobakteerimalja.