(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT. (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats A61K 39/106, 39/02, GO1N 33/569

Transkriptio

1 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT in II 111 PII II F I 000B (10) FI B SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats (51) Kv.lk.7 - Int.kl.7 A61K 39/106, 39/02, GO1N 33/569 (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/EP93/03059 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P US P (73) Haltija - Innehavare 1 OraVax, Inc., 230 Albany Street, Cambridge, MA 02139, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Michetti,Pierre, Division de Gastro-enterologie BH10-CHUV, 1011 Lausanne, SVEITSI, (CH) 2 BIum,Andre, Division de Gastro-enterologie BH10-CHUV, 1011 Lausanne, SVEITSI, (CH) 3 Davin,Catherine, Division de Gastro-enterologie BH10-CHUV, 1011 Lausanne, SVEITSI, (CH) 4 Haas,Rainer, Max Planck Institut Mr Biologie Abteilung Infektionsbiologie, Spemannstrasse 34, TObingen, SAKSA, (DE) 5 Corthesy-Theulaz,Irene, Division de Gastro-enterologie BH10-CHUV, 1011 Lausanne, SVEITSI, (CH) 6 Kraehenbuhl,Jean-Pierre, Institut de Biochimie de l'universite de Lausanne et ISREC, 1066 Epalinges/Lausanne, SVEITSI, (CH) 7 Saraga,Emilia, Institut universitaire de Pathologie, Rue du Bugnon 25, 1011 Lausanne, SVEITSI, (CH) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab Iso Roobertinkatu 23, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä ureaasipohjaisen rokotteen valmistamiseksi Helicobacter-infektiota vastaan Förfarande för framställning av ett ureasbaserad vaccin mot Helicobacter-infektion (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Menetelmä suojaavan immuunivasteen herättämiseksi nisäkäsisännässä Helicobacterinfektioita vastaan antamalla isännälle antigeeninä immunogeenisesti tehokas määrä Helicobacterin ureaasia tai ureaasin alayksikköjä. Tarjotaan käyttöön myös rokotekoostumukset. Förfarande, medelst vilket i en däggdjursvärd framkallas ett skyddande immunogensvar gentemot Helicobacter-infektion genom att värden administreras en immunogeniskt effektiv mängd av ett Helicobacter-ureas eller ureasunderenheter som antigen. Vaccinkompositioner avses även.

2 1 Menetelmä ureaasipohjaisen rokotteen valmistamiseksi Helicobacter-infektiota vastaan Tämä keksintö koskee menetelmää rokotteen valmis- 5 tamiseksi Helicobacter pylori-bakteeria vastaan. Rokote soveltuu käytettäväksi Helicobacter-infektion estämiseen ja hoitoon nisäkkäillä, mukaan luettuna ihminen. Lisäksi tässä esitetään menetelmä mahan infektiosta, sen seurauksista, kuten kroonisesta mahakatarrista tai mahahaavasta kärsivien 10 ihmisten hoitamiseksi, sekä mahasyövän estämiseksi. Keksinnön tausta Ihmisen mahan epiteelin Helicobacter-infektio aiheuttaa mahakatarria, joka on päätekijä mahahaavan ja mahan lymfooman kehittymisessä, ja voi olla riskitekijä mahasyö- 15 vän kehittymisessä (1-3). Yleisin infektion syy on Helicobacter pylori, ja sen jälkeen paljon harvemmin Helicobacter heilmanii. H. pylori on kapea S:n muotoinen gramnegatiivinen mikro-organismi, joka osoitetaan tavanomaisesti mahabiopsioista aikuisilla ja lapsilla, joilla on histo- 20 logisia todisteita mahakatarrista tai mahahaavasta. Todisteet H.pylorin ja mahan-pohjukaissuolen sairauden kausaalisesta suhteesta on saatu tutkimuksista vapaaehtoisilla ihmisillä, potilailla, joilla on mahahaavaa ja mahasyöpää, gnotobiottisilla sioilla ja mikrobeista vapailla jyrsijöil- 25 lä. Kochin olettamukset etiologian suhteen todistettiin luomalla histologisesti varmistettu mahakatarri aikaisemmin infektiottomiin yksilöihin elävien mikro-organismien nauttimisen jälkeen (4-11), ja käsittelyllä H. pylorin täydelliseksi tuhoamiseksi, jonka seurauksena oli mahakatarrin 30 ja mahahaavapotilaiden mahahaavan uusiutumistiheyden vähentyminen (12). Huolimatta H. pylorin herkkyydestä in vitro monille mikrobienvastaisille aineille, vakiintuneiden H. pyloriinfektioiden täydellinen hävitys mikrobienvastaisilla ai- 35 neilla in vitro on usein vaikea saavuttaa (13). Mikro-or-

3 2 ganismia esiintyy mahan epiteeliä ja mahan poimuja päällystävässä limavaipassa. Nämä ovat paikkoja, joissa ei näytetä saavutettavan riittäviä mikrobienvastaisia tasoja edes silloin, kun antibiootteja annetaan oraalisesti suu- 5 rina annoksina. Tällä hetkellä useimmat asiantuntijat suosittelevat "kolmoishoitoa", nimittäin vismuttisuolaa yhdessä lääkkeiden kanssa, kuten tetrasykliinin ja metronidatsolin kanssa 2-4 viikon ajan. Tämän tai muiden kemoterapeuttisten hoito-ohjelmien tehokkuus jää kuitenkin 10 suboptimaaliseksi. Lisäksi tämä hoito saattaa saada aikaan vakavia lääkkeitä vastustavia reaktioita. Nykyisin tiedetään vain vähän limakalvon immuunijärjestelmän roolista mahassa. Immunoglobuliinia (Ig) tuottavien solujen jakauma normaalissa mahaontelossa antaa 15 olettaa, että IgA-plasmasolut muodostavat 80 % piasmasolujen kokonaispopulaatiosta. Lisäksi mahaontelossa olevien plasman IgA-solujen määrä on verrannollinen muiden limakalvojen IgA-solujen määrään (14, 15). Joukko tutkimuksia ihmisillä (16) ja eläinmalleilla (8, 10) ovat osoittaneet 20 spesifisiä IgG- ja IgA-vasteita seerumissa ja mahan eritteissä reaktiona Helicobacter-infektiolle. Havainto, että H. pylori -infektio säilyy kroonisena infektiona vuosia, siitä huolimatta, että se indusoi paikallisen ja systeemisen immuunivasteen, ei kuitenkaan rohkaise immunisointi- 25 strategioiden kehittämiseen. Lee et al. raportoivat mahdollisuudesta infektoida mikrobittomia jyrsijöitä Helicobacter felisillä, bakteerilla, joka on hyvin läheinen H. pylorille, ja toistettavasta histologisesta mahakatarrista (9, 10). Sen jälkeen 30 tämä bakteeri-isäntäpari on hyväksytty hyväksi malliksi Helicobacterin välittömän mahakatarrin ja sen aloitustekijöiden tutkimiseksi (17). Czinn et al. ovat osoittaneet, että toistettu oraalinen immunisaatio H. pylorin raakalysaatilla ja koleratoksiiniadjuvantilla indusoi gastroin- 35 testinaalisen IgA:n voimakkaan anti-h. pylori-vasteen hii-

4 3 rissä ja freteissä (13). Lisäksi Chen et al. ja Czinn et al. ovat viime aikoina raportoineet, että oraalinen immunisaatio H. felisin raakalysaatilla indusoi suojan H_, felis -infektiota vastaan hiirissä (21, 22). Tämän suojan 5 induktiosta vastuussa olevan antigeenin (antigeenien) täsmällistä luonnetta ei ollut kuitenkaan määritetty, eikä mikään informaatio antanut olettaa, että H. felisin suojaava antigeeni (antigeenit), joka indusoi suojan tätä patogeeniä vastaan, indusoisi ristireaktiivisen suojan, 10 joka ulottuisi toiseen Helicobacter-lajiin. Me olemme esittäneet ensimmäisen kerran H. pylori ja H. felis -sonikaatit, ja osoittaneet, että jotkin näistä vasta-aineista, jotka on suunnattu H. pyloria vastaan, reagoisivat ristiin H. felisin kanssa ja päinvastoin (24, 15 25). Perusteita näille ristireaktiivisuuksille ei tunnettu. Perustuen homologiaan, jota esiintyy ureaasin tunnettujen eri aminohapposekvenssien välillä on esitetty, että ureaasia voitaisiin käyttää rokotteena H. pyloria 20 vastaan (26). Siitä huolimatta ristireaktiivisuus ei ole sääntö. Guo ja Liu ovat osoittaneet vuosia sitten, että Proteus mirabilisin, Proteus vulgarisin ja Providencia rettgerin ureaasit osoittavat ristireaktiivisuutta toistensa suhteen, kun taas jack-pavun ja Morganella morganiin 25 ureaasit ovat immunologisesti erillisiä kolmesta edellä mainitusta ureaasista (23). Vaikka H. pylorin ureaasin antigeeninen ristireaktiivisuus muiden Helicobacter-ureaasien kanssa oli järkevä olettamus, mitään tuloksia ei ollut olemassa osoittamaan, että näin todella olisi, kun- 30 nes me osoitimme, että jotkin H. felisin monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat ristiin H.pylorin ureaasin kanssa (25). J. Pappo on osoittanut lisäksi, että hiiret, jotka on infektoitu H. felisillä, tuottavat vasta-aineita, jotka reagoivat ristiin H. pylorin ureaasin kanssa, mutta eivät

5 4 5 jack-pavun ureaasin kanssa (J. Pappo, julkaisemattomat tulokset, 1993). H. pylorin ureaasin, tai sille läheisten ureaasien käyttöä rokotteena H. pylori -infektiota vastaan on esittänyt aikaisemmin A. Labigne EP-patenttihakemuksessa (28). Tämä hakemus ei kuitenkaan sisällä minkäänlaisia todisteita minkään nisäkkään rokottamisesta mitään Helicobacter-infektiota vastaan ureaasilla. Sen lisäksi, vaikka sekvenssien homologia muiden 10 bakteeriureaasien kanssa saattaisi tukea ureaasin käyttöä 15 rokotekandidaattina H. pylori -infektiota vastaan, tämänhetkinen tieto ihmisen H. pylori -infektiosta ei missään tapauksessa sitä tee. Ensinnäkin, huolimatta tosiseikasta, että infektoiduille yksilöille nousee usein voimakas vasta-ainevaste ureaasille, anti-ureaasi-immuunivaste ei johda infektion poistamiseen tai kontrollointiin. Toiseksi H. pylori kykenee kuljettamaan ureaasia solun ulkopuolelle ja levittämään sitä pinnaltaan (19, 20). Siten ureaasi ei ehkä edusta sopivaa kohdetta limakalvon suojaavan immuuni- 20 vasteen kehittymiselle. Todellakin, limakalvon immuunisuojan ajatellaan olevan pääasiassa erittyvän IgA:n välittä- mää, jonka agglutinoiva aktiivisuus saattaisi huonontua kun kohdepatogeeni voi levittää tunnistettua antigeeniä, ja siten toimia ansana suojaavalle vasta-aineelle. 25 r r : Kolmanneksi ureaasi näyttää olevan toksinen epiteelisoluille viljelmässä, ja sen on epäilty osallistuvan limakalvon rappeutumiseen ja mahahaavan syntyyn in vivo. Siten sen käyttö antigeeninä voi olla toksista. e 30 Siitä huolimatta me järkeilimme, että tämä antigeeni voisi olla mahdollinen tehokas rokote, jos: - ensinnäkin, me antaisimme sitä oraalisesti sopi- van suurena annoksena nostattamaan voimakkaampi immuunivaste kuin luonnollisesti esiintyvä,

6 5 - toiseksi, tuotettujen vasta-aineiden määrä olisi kyllin korkea sitomaan kaiken ureaasin, levitetyn tai ei levitetyn, - kolmanneksi, me käyttäisimme ureaasin alayksiköi- 5 tä tai molekyylilajia, joka ei olisi toksinen. Yhteenvetona voisi sanoa, että on olemassa tarve H. pylorin indusoiman mahan infektion tehokkaalle hoidolle ja estämiselle ihmisissä. Viimeaikaiset tulokset antoivat olettaa, että olisi mahdollista luoda rokote tätä infektio- 10 ta vastaan, mutta eivät ole tarjonneet selvää määrätyn antigeenin (antigeenien) tunnistusta, joka antigeeni (antigeenit) olisi yhteinen kaikille H. pylori -kannoille, ja joka voitaisiin liittää turvalliseen ja tehokkaaseen rokotteeseen. 15 Tässä keksinnössä me olemme tunnistaneet H. pylorin ureaasiantigeenin rokotekandidaatiksi ja osoittaneet sen tehokkuuden eläinmallissa. Nämä tulokset olivat odottamattomia Helicobacter-infektioiden luontaisen historian valossa. 20 Keksinnön yhteenveto Me olemme havainneet, että gastrointestinaaliselle Helicobacter-infektiolle alttiille nisäkkäille voidaan indusoida immuniteetti käyttämällä ureaasiepitooppeja, jotka ovat esillä Helicobacter-organismien pinnalla tai sen lä- 25 heisyydessä, ja käyttämällä niitä rokotteessa kohteena. Immuniteetti voidaan indusoida immunisoimalla luonnollisella ureaasilla, mutta se voidaan myös indusoida rekombinanttisella ureaasin alayksiköllä, joka on tuotettu entsymaattisesti inaktiivisena, ja sen vuoksi ei-toksisena muotona. 30 Keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän rokotteen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että yhdistetään Helicobacter pylori-bakteerin ureaasipolypeptidi, limakalvoadjuvantti ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine tai laimennusaine. Rokote mahdollistaa menetelmän immuniteetin 35 indusoimiseksi Helicobacter-infektiolle antamalla nisäkkään limakalvolle polyaminohappovalmiste, se on peptidien ja/tai

7 6 proteiinien seos, yhdessä sopivan adjuvantin kanssa. Tämä polyaminohappovalmiste edustaa suurta joukkoa epitooppeja, jotka ovat luonteenomaisia ja joita infektoivan Helicobacter-organismin ureaasientsyymi ilmentää. Polyaminohappoval- 5 misteen anto voidaan suorittaa oraalisesti. Valmisteen aktiivinen aineosa voi käsittää luonnollisia tai biosynteettisiä epitooppeja, ja voi ottaa erilaisia muotoja. Ei kattavaan luetteloon mahdollisista valmisteista kuuluvat puhdistetut, luonnossa esiintyvät tai re- 10 kombinanttisesti tuotetut ureaasivalmisteet, jotka ovat bakteerialkuperää tai muuta alkuperää, ureaasin pilkkomistuotteet, fuusioproteiinit, jotka käsittävät ureaasin epitooppeja, ureaasientsyymin typistetyt muodot, tai peptidit, jotka ovat homologisia ureaasin aminohapposekvenssin kans- 15 sa. Koska immuniteetin kehittyminen riippuu infektoivaan Helicobacter-organismiin sitoutuvan humoraalisen ja/tai sellulaarisen immuunivasteen induktiosta, edullisia valmisteita ovat ne, jotka kaikkein läheisimmin jäljittelevät infektoivalle organismille endogeenisen ureaasin epitooppeja. 20 Esimerkiksi valmisteet, jotka ilmentävät H. pylorin ureaasin epitooppeja, ovat edullisia annettavaksi ihmisille, jotka ovat alttiita H. pylorille. Kuitenkin on havaittu, että voidaan käyttää muista lajeista peräisin olevaa ureaasia. Me olemme esimerkiksi osoittaneet, että H. felis 25 -infektio hiirissä voidaan estää antamalla ureaasia H. pylorista. Keksintö mahdollistaa suojaavan immuunivasteen nostattamisen nisäkäsisännässä Helicobacter-infektiota vastaan, jolloin isännän limakalvon pinnalle annetaan immuno- 30 logisesti tehokas määrä ureaasiantigeeniä, joka pystyy herättämään tällaisen suojaavan immuunivasteen, edullisesti H. pylorin ureaasia tai H. pylorin ureaasin B-alayksikköä. Keksinnön mukaisesti valmistettava rokotekoostumus on sopiva Helicobacter-infektion estämiseksi, ja käsittää 35

8 7 tehokkaan määrän ureaasiantigeeniä, edullisesti H. pylorin ureaasia tai H. pylorin ureaasin B-alayksikköä, joka kykenee nostattamaan isännässä suojaavan immuunivasteen Helicobacter-infektiota vastaan, yhdessä farmaseuttisesti hyväk- 5 syttävän kantajan tai laimennusaineen kanssa. Edelleen tässä esitetään menetelmä passiivisen suojan antamiseksi nisäkäsisännälle Helicobacter-infektiota vastaan, jossa menetelmässä annetaan isännän limakalvon pinnalle immunologisesti tehokas määrä ureaasille spesifis- 10 tä vasta-ainetta, joka on tuotettu ureaasilla, edullisesti H. pylorin ureaasilla tai H. pylorin ureaasin B-alayksiköllä immunisoidussa isännässä, ja joka kykenee herättämään suojaavan immuunivasteen Helicobacter-infektiolle. Piirustusten kuvaus 15 Keksintö tullaan nyt lisäksi kuvaamaan viittauksin mukaan liitettyihin piirustuksiin, joista kuviot 1-6 ovat graafisia esityksiä tuloksista, jotka on esitetty taulukoissa 1-6. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 20 Tämän keksinnön keksijät ovat havainneet, että kun annetaan hiirelle oraalisesti polyaminohappovalmisteita, jotka ilmentävät H. pylorin ureaasin epitooppeja, nostattaa se suojaavan immunologisen vasteen H. felistä vastaan hiirissä, yleisesti hyväksytyn arvon saaneessa eläinmal- 25 lissa, jolla tutkitaan immuunivastetta Helicobacter-infektiota vastaan (9). Suojaavan immuunivasteen teho on siinä, että immunisoiduilla eläimillä on patogeenin saatuaan suuresti vähentynyt infektiovaikutus verrattuna ei-immunisoituihin eläimiin. Lisäksi keksijät ovat havainneet, että 30 hiirten oraalinen immunisaatio käyttäen H. pylorin ureaasin B-alayksikköä, tuotettuna entsymaattisesti inaktiivisena rekombinanttiproteiinina, nostattaa suojaavan immunologisen vasteen hiirissä H. felistä vastaan. Suojaavan immuunivasteen teho on siinä, että immunisoiduilla eläi- 35

9 8 millä on patogeenin saatuaan suuresti vähentynyt infektiovaikutus verrattuna ei-immunisoituihin eläimiin jotka infektoituvat. Siten, tässä ensimmäisenä esitetään menetelmä nos- 5 tattaa nisäkäsisännässä suojaava immuunivaste Helicobacterinfektiota vastaan. Menetelmä käsittää vaiheen, jossa annetaan nisäkkään, mukaan luettuna ihminen, limakalvon pinnalle immunologisesti tehokas määrä ureaasiantigeeniä, edullisesti H. pylorin ureaasia, joka kykenee nostattamaan täl- 10 laisen suojaavan immuunivasteen. Toisena näkökohtana esitetään menetelmä nostattaa nisäkäsisännässä suojaava immuunivaste Helicobacterinfektiota vastaan. Menetelmä käsittää vaiheen, jossa annetaan eläimen, mukaan luettuna ihminen, limakalvon pinnalle 15 immunologisesti tehokas määrä rekombinanttista, entsymaattisesti inaktiivista ureaasin B-alayksikköä antigeeninä, edullisesti rekombinanttista H. pylorin ureaasin B:n alayksikköä, joka kykenee nostattamaan tällaisen suojaavan immuunivasteen. 20 Tässä esitetään myöskin nisäkkäiden, mukaan luettuna ihminen, hoito tai profylaksia Helicobacter-infektiolle, jolloin immunologisesti tehokas määrä ureaasia tai sen alayksiköitä, jotka kykenevät nostattamaan suojaavan immuunivasteen Helicobacter-infektiolle, annetaan potilaan 25 limakalvon pinnalle. Edullisesti ureaasi on H. pylorin ureaasia tai H. pylorin ureaasin B-alayksikköä, ja ureaasi voidaan antaa joko yksin tai liitettynä hydroksyloituun kalsiumfosfaattiin, esimerkiksi hydroksiapatiittiin kantajapartikkelina. Lisäksi H. pylorin ureaasi annetaan yhdessä 30 limakalvon adjuvantin kanssa, koleratoksiinin B-alayksikön, muramyylidipeptidin tai muun tällaisen adjuvantin. Olematta sitoutunut mihinkään teoriaan, tämän keksinnön keksijät uskovat, että ureaasiantigeenin anto tai sen B-alayksikön anto limakalvon pintaan stimuloi yleistä 35 limakalvon immuunijärjestelmää ja ehkäpä paikallisia kohtia mahan limakalvossa, johon sisältyy immuunivaste, johon si-

10 9 sältyy mahan eritteissä olevia H. pylorille spesifisiä IgAvasta-aineita, jotka estävät Helicobacter-infektiota. Koska on rutiininomainen asia suorittaa esikliinisiä kokeita ihmisten käyttöön tarkoitetuilla rokote-ehdokkailla eläinmal- 5 leissa, uskotaan, että keksinnön mukaisesti valmistettu rokote on tehokas ihmisissä, erityisesti mahahaavojen, mahakatarrin, mahan pahanlaatuisten sairauksien ja muiden H. pylorin ja/tai H. heilmaniin läsnälolosta seuraavien tilojen estämisessä ja hoidossa. 10 A. Bakteeriviljelmät ja ureaasin puhdistus Tutkimuksessa käytetty H. pylori -kanta on peräisin potilaalta, jolla on pohjukaissuolen haavauma, ja kantaa on jatkoviljelty BHI-agaroosimaljoilla homogeenisyyteen. H. pyloria kasvatetaan sopivalla alustalla, tyypillisesti BHI- 15 (Brain-Heart Infusion, aivo-sydäninfuusio) alustalla, joka sisältää 0,25 % hiivauutetta ja 10 % vasikansikiönseerumia, ja johon on lisätty 0,4 % kampylobakteerille selektiivistä komplementtia (Skirrow supplement, Oxoid 69). Bakteereja inkuboidaan yli yön mikroaerofiilisissä olosuhteissa C:ssa pulloissa, jotka suljetaan sen jälkeen ja joita ravistellaan 37 C:ssa 2-3 vuorokautta, jotta saadaan nesteviljelmä. Viljelmä voidaan valmistaa myös agaroosimaljoilla, jotka sisältävät BHI:ta, jossa on 0,25 % hiivauutetta ja 5 % lampaanverta mikroaerofiilisissä oloissa OC:ssa 3 vuorokautta. Bakteerien määrä määritellään BHIliuoksen optisella tiheydellä 660 nm:ssa, yhden optisen tiheyden yksikön vastatessa 108 bakteeria. Viljelmät agaroosimaljoilla suspendoidaan ensin 154 mm NaCl:iin. Eräs nykyisin mielellään käytetyistä lähteistä po- 30 lyaminohapoille, jotka ilmentävät ureaasin epitooppeja, on puhdistettu ureaasi, esim. H. pylorin ureaasi, joka on saatu seuraamalla Dunnin et al. yleistä menetelmää, J. Biol. Chem. 265, , muunnettuna alla kuvatulla tavalla. Kasvatuksen jälkeen H. pylori kerätään talteen veteen, pyö- 35 ritetään koeputkisekoittajalla ja pyöritetään uudelleen, jotta saadaan supernatantti. H. pylorin ureaasiaktiivisuu-

11 10 den sisältävä liuos (määritetty nopealla ureaasitestillä, katso jäljempää) ajetaan sitten kromatografialla C1-6B koon mukaan lajittelevassa pylväässä, ja ne fraktiot, jotka sisältävät voimakkasti ureaasiaktiivisuutta, yhdistetään ja 5 niitä dialysoidaan yli yön, ja ajetaan taas kromatografialla anioninvaihtogeelissä. Fraktiot eluoidaan nousevassa NaCl-puskurissa ja kerätyt fraktiot, joissa on voimakkasti ureaasiaktiivisuutta, ajetaan yksittäin SDS-geelissä, mitä seuraa Coomassie-värjäys. Kaksi erillistä juovaa, jotka 10 vastaavat molekyylipainoltaan noin 63 ja noin 29 kd:ia, tunnistetaan ureaasiksi. Ureaasin sisältävät fraktiot yhdistetään, jotta saadaan puhdistettu H. pylorin ureaasi, jonka puhtaus on alueella %. B. Oraalinen immunisaatio H. ovlorista puhdistetul- 15 la ureaasilla Vaikka on edullista käyttää puhdistettua H. pylorin ureaasia, joka on saatu, kuten on kuvattu, antigeenisenä materiaalina, tulee ymmärtää, että on mahdollista käyttää antigeenisenä materiaalina myös mitä tahansa ureaasia tai 20 ureaasin alayksikköä, joko luonnossa esiintyvää, tai rekombinantti-dna-tekniikalla saatua, samoin kuin sen pilkottua fragmenttia, fragmentteja käsittäviä fuusioproteiineja tai koko ureaasia, typistettyjä ureaasirakenteita tai muita peptidi- tai proteiinivalmisteita, jotka ilmentävät ureaa- 25 sin epitooppeja, jotka kykenevät nostattamaan suojaavan immuunivasteen Helicobacter-infektiolle (katso jäljempää). Siten on mahdollista käyttää ureaasia, joka on olennaisesti homologinen H. pylorin ureaasin kanssa, ja joka on tehokas nostattamaan ristisuojaavan immuunivasteen Helicobacteril- 30 le. Esimerkki tällaisesta ureaasista on jack-pavun ureaasi, jonka homologia H. pylorin ureaasin kanssa on noin 70 %. Keksintö ei siten rajoitu intaktin ureaasin käyttöön, ja kattaa minkä tahansa polyaminohappovalmisteen käytön, joka ilmentää ureaasin epitooppeja, ja joka on tehokas luomaan 35 isännässä suojaavan immuunivasteen Helicobacter-infektiolle. Keksinnössä voidaan ureaasiantigeeninä käyttää tyy-

12 11 pillisesti ureaasia, jonka homologia on %, esimerkiksi %, H. pylorin ureaasin kanssa. Ei-rajoittava luettelo mahdollisesti käyttökelpoisten ureaasivalmisteiden lähteistä sisältää eri Helicobac- 5 ter-lajien endogeeniset ureaasientsyymit, ureaasin muista bakteereista, kuten Klebsiella pneumoniaesta tai Proteus mirabilisista, ja vastaavasti minkä tahansa muun ureaasin, sillä ehdolla, että näillä ureaaseilla on ristireaktiivisia epitooppeja H. pylorin ureaasin kanssa. Kaikkien edellä 10 mainittujen organismien ureaasigeenit edustavat mahdollista välinettä rekombinantti-ureaasituotteiden ekspressoimiseksi koko proteiinina tai sen osana. Ei-rajoittava luettelo mahdollisesti käyttökelpoisista valmisteista käsittää peptidit, jotka on tehty puh- 15 distetusta ureaasista (lähteet on mainittu edellä) käyttäen fysikaalisia ja/tai kemiallisia pilkkomismenettelyjä (se on CnBr) ja/tai proteolyyttistä pilkkomista (käyttäen proteaaseja, esim. V8-proteaasia, trypsiiniä tai muita); tai peptidit, jotka on syntetoitu kemiallisesti ja joilla on 20 yhdenmukaisia epitooppeja ureaasin kanssa. Muihin mahdollisesti hyödyllisten epitooppien lähteisiin kuuluvat epitoopit, jotka voidaan tunnistaa niiden ristireaktiivisuudesta ureaasin kanssa, seulonnan seurauksena anti-ureaasi vasta-aineiden kanssa. Nämä peptidit voi- 25 vat olla luonnossa esiintyviä peptideitä, tai peptideitä, jotka ovat tuloksia kemiallisesta synteesistä. Lisäksi tällaiset peptidit voivat olla tuloksena rekombinanttisen satunnaisen oligonukleotidin ekspressiosta. Toinen mahdolisesti käyttökelpoisten epitooppien 30 lähde sisältää epitoopit, jotka ovat samanlaisia ureaasin kanssa tuloksena anti-idiotyyppisten vasta-aineiden luomisesta ureaasille. Tällaisia anti-idiotyyppisiä vastaaineita, jotka on tehty missä tahansa immunokompetentissa isännässä, saadaan immunisoimalla tämä isäntä anti-ureaasi 35 vasta-aineilla, päämääränä tuottaa vasta-aineita, jotka on

13 12 suunnattu anti-ureaasi vasta-aineita vastaan, joilla on rakenteellista homologiaa ureaasin kanssa. Pohdinta tässä tähtää H. pylorin luontaisesti tuottaman ureaasin käyttöön (osa B). On kuitenkin ymmärrettävä, 5 että ureaasia, tai sen edellä mainittuja alayksiköitä tai rakenteita, jotka kykenevät nostattamaan halutun suojaavan immuunivasteen, voidaan tuottaa alalla hyvin tunnetulla rekombinantti-dna-tekniikalla. Tiettyjen valmisteiden tehokkuus voidaan määrittää rutiinikokeella käyttäen eläinmalle- 10 ja, rokotekandidaatin oraalista antoa ja altistamista patogeenille käyttäen protokollaa, joka on olennaisesti samanlainen tai identtinen alla kuvatun menettelytavan kanssa. Taulukossa 1 ja 2 jäljempänä ja kuvioissa 1-5 kuvataan tulokset, jotka on saatu, kun hiiret immunisoitiin 15 oraalisesti puhdistetulla H. pylorin ureaasilla. Tässä ensimmäisessä kokeessa H. pylorin antigeenin anto toteutettiin antamalla oraalisesti hiirille H. pylorin ureaasia, joka oli puhdistettu kuten osassa A on kuvattu, ja kytketty hydroksiapatiittikiteisiin, joita käytettiin kantajana 20 edistämään M-solujen sitoutumista ja ottoa. Koleratoksiinia (Sigma) annettiin limakalvoadjuvanttina. Tässä kokeessa ryhmät kuusi viikkoa vanhoja naaraspuolisia SPF BALB/c -hiiriä immunisoitiin kukin oraalisesti 30 µg:lla puhdistettua H. pylorin ureaasia, joka oli kytketty 1 mg:aan hyd- 25 roksiapatiittia plus 10 µg koleratoksiiniadjuvanttia päivinä 0, 7, 14 ja 21. Hiiret altistettiin sitten kahdesti 108 H. felisillä, päivinä 28 ja 30. Vertailutarkoituksessa samanlaiset kuusiviikkoiset naaraspuoliset SPF BALB/c -hiiret immunisoitiin oraalisesti kokonaisella H. pylori -lysaatil- 30 la (sonikaatti) ja 10 µg:lla koleratoksiinia päivinä 0, 7, 14 ja 21. Hiiret altistettiin päivänä 28 ja 30 H. felisillä. H. pylori -sonikaatti valmistettiin keräämällä H. pylori soluviljelmistä, pelletoimalla sentrifugoimalla ja suspendoimalla pelletti uudelleen 0,9-prosenttiseen natrium- 35 kloridiin, mitä seurasi sonikointi.

14 13 Kontrollina kuusiviikkoiset naaraspuoliset SPF BALB/c -hiiret valeimmunisoitiin 10 µg:lla koleratoksiinia ja 1 mg:lla hydroksiapatiittia päivinä 0, 7, 14 ja 21. Kaikkia hiiriä pidettiin suojissa, immunisoitiin ja altis- 5 tettiin yhtäläisesti. Kaikki tutkimuksessa olevat hiiret tapettiin 35. päivänä. C. Oraalinen immunisaatio H. pylorin rekombinanttisilla ureaasin alayksiköillä H. pylorin ureaasin rakenteellisia A- ja B- 10 alayksik-köjä koodaavat geenit saatiin polymeraasiketjureaktio- (PCR) kloonauksella tavanomaisten menettelytapojen mukaisesti aikaisemmin julkaistujen sekvenssien perusteella (29). Nämä geenit sisällytettiin vektoriin (nimetty pev40:ksi), joka oli suunniteltu vieraiden geenien korkean 15 tason ekspressiota ja helppoa puhdistusta varten E. colissa. Lyhyesti, vieras geeni liitetään alavirtaan lämpörepressoituvasta promoottorista ja lukukehyksessä kuuden histidiinin toistoa koodaavan sekvenssin kanssa. Tässä vektorissa on ampr-geeni transformanttien selektiota varten. So- 20 pivissa lämpötilaoloissa saatu rekombinanttiproteiini on varustettu kuudella histidiinillä N-päästään, mikä tekee mahdolliseksi yksivaiheisen affiniteettipuhdistuksen nikkelipylväässä. H. pylorin ureaasin rekombinanttiset sekä A- että B-alayksikkö ekspressoitiin erikseen E. colissa ja 25 puhdistettiin nikkelipylväässä 95 %:n puhtauteen. Vaikka on edullista käyttää edellä kuvatulla tavalla saatua H. pylorin rekombinantti-ureaasia antigeenisenä materiaalina, tulee ymmärtää, että on mahdollista myöskin käyttää antigeenisenä materiaalina mitä tahansa ureaasin 30 antigeenisiä kohtia ekspressoivaa ureaasia tai ureaasin alayksikköä, joka on saatu rekombinanttitekniikoilla (esim. fuusioproteiinia), ja joka kykenee nostattamaan suojaavan immuunivasteen Helicobacter-infektiolle. Siten on mahdollista käyttää rakenteessa ureaasigeeniä, joka on olennai- 35 sesti homologinen H. pylorin ureaasin kanssa, ja joka on tehokas nostattamaan ristisuojaavan immuunivasteen Helico-

15 14 bacterille. Esimerkki tällaisesta ureaasista on jack-pavun ureaasi, joka on noin 70-prosenttisesti homologinen H. pylorin ureaasin kanssa, tai H. felisin ureaasi, joka on noin 88-prosenttisesti homologinen H. pylorin ureaasin kanssa. 5 Keksintö ei näin ollen rajoitu H. pylorin ureaasigeenien ja niiden geenituotteiden käyttöön, ja kattaa minkä tahansa rekombinanttisen ureaasin tai sen alayksiköiden käytön, joka on tehokas luomaan suojaavan immunologisen vasteen isännässä Helicobacter-infektiolle. Tyypillisesti rekombinant- 10 tiureaasia, joka on prosenttisesti homologinen, esimerkiksi prosenttisesti homologinen H. pylorin ureaasin kanssa, voidaan käyttää keksinnössä rekombinanttisena ureaasiantigeeninä. Pohdiskelu tässä kohdistuu E. colin tuottamien H. 15 pylorin rekombinanttisen A- ja B-alayksikön käyttöön (osa C). Tulee kuitenkin ymmärtää, että edellä mainitut rekombinantti-ureaasi tai sen alayksiköt tai rakenteet, jotka kykenevät nostattamaan halutun suojaavan immuunivasteen, voidaan tuottaa käyttäen muita alalla hyvin tunnettuja rekom- 20 binantti-dna-tekniikoita ja muita eukaryoottisia ja prokaryoottisia ekspressiovektoreita. Taulukoissa 3, 4 ja 5 jäljempänä ja kuviossa 6 kuvataan saadut tulokset, kun hiiret immunisoitiin oraalisesti H. pylorin rekombinanttisilla alayksiköillä, jotka oli 25 tuotettu E. colissa. Tässä kokeessa H. pylorin antigeenin anto toteutettiin antamalla hiirille oraalisesti H. pylorin rekombinanttisia ureaasin A- tai B-alayksiköitä, jotka oli tuotettu E. colissa ja puhdistettu edellä kuvatulla tavalla, ja liitetty hydroksiapatiittikiteisiin, joita käytet- 30 tiin kantajana edistämään M-solujen sitoutumista ja ottoa. Koleratoksiinia (Sigma) annettiin limakalvoadjuvanttina. Tässä kokeessa immunisoitiin ryhmät kuusiviikkoisia naaraspuolisia SPF BALB/c -hiiriä oraalisesti, kukin 30 µg:lla H. pylorin rekombinanttista ureaasin A- ja B-alayksikköä, jot- 35 ka oli kytketty 1 mg:aan hydroksiapatiittia plus 10 µg koleratoksiiniadjuvanttia päivinä 0, 8, 14 ja 21. Hiiret al-

16 15 8 :. 0 91: e tt a 0 t t tistettiin sitten kahdesti 108:11a H. felisiä, päivinä 32, 34 ja 36. Vertailutarkoituksessa samanlaiset kuusi viikkoa vanhat naaraspuoliset SPF BALB/c -hiiret immunisoitiin oraalisesti 30 µg:lla H. pylorin rekombinanttista ureaasin 5 B-alayksikköä kytkettynä hydroksiapatiittiin plus 10 µg koleratoksiinia päivinä 0, 8, 14 ja 21. Hiiret altistettiin H. felisille kolme kertaa, päivinä 32, 34 ja 36. Kontrollina, kuusi viikkoa vanhat naaraspuoliset SPF BALB/c -hiiret valeimmunisoitiin kukin oraalisesti 10 µg:lla koleratoksii- 10 nia ja 1 mg:lla hydroksiapatiittia päivinä 0, 8, 14 ja 21. Hiiret altistettiin sitten päivinä 32, 34 ja 36 H. felisille. Kaikki kokeeseen kuuluvat hiiret immunisoitiin ja altistettiin yhtäläisesti. Eläimet tapettiin 48. päivänä (12 vuorokautta altistuksen jälkeen) tai 10 viikkoa altistuksen 15 jälkeen. analyysit D. Mahan biopsioiden, veren ja suoliston eritteiden Mahasta otettiin biopsioita ja verta otettiin sydämestä. Suolisto poistettiin ja pestiin 1 mm PMSF:llä (Boe- 20 ringer) PBS-puskurissa, jotta saatiin suoliston eritteet ELISA-analyysiin. t 35 Jotta arvioitaisiin suoja H. felis -kolonisaatiota vastaan, mahan biopsiat kustakin eläimestä seulottiin H. felisin läsnäolon suhteen määrittämällä nopea ureaasiaktii- 25 visuus Jatrox HP -testillä (Rohm, Pharma) valmistajan ohjeiden mukaisesti Lyhyesti esitettynä mahan biopsiat upotetaan 0,5 ml:aan valmistajan seosta ureaa ja fenolipunaista, ph-indikaattoria. Ureaasiaktiivisuus tuottaa ammoniakkia ja bikarbonaattia ureasta, mitä seurataan liuoksen ko- 30 lorimetrisellä muutoksella korkeampaa absorbanssia kohti 550 nm:ssa. Ureaasiaktiivisuus kvantifioidaan spektrofotometrisellä analyysillä. Mahan biopsioita kustakin osassa B kuvatusta kokeeseen kuuluvasta eläimestä viljeltiin BHI-agaroosimaljoilla, jotka oli varustettu edellä kuvatulla tavalla, H. felisin osoittamiseksi vuorokauden inkuboinnin jälkeen mik-

17 16 roaerofiilisissä oloissa H. felisin läsnäolo varmistettiin Gram-värjäyksellä ja ureaasiaktiivisuuden määrityksellä. Koska saatiin hyvin merkitsevä korrelaatio H. felis -viljelmien osoittamisessa ensimmäisen koe-erän aikana 5 (katso taulukosta 3), vain mahabiopsioiden ureaasitestit tehtiin H. felisin havaitsemiseksi osassa C kuvatussa kokeessa. Kahden itsenäisesti työskentelevän tutkijan mikroskopoinnilla varmistettiin H. felis -havainnot käyttäen kahta eri värjäystä (akridiinioranssi ja kresyylivioletti). 10 Verinäytteiden annettiin hyytyä 3 tuntia RT:ssä ja seerumi kerättiin talteen ja jäädytettiin -20 C:ssa analysointiin saakka. Suoliston eritteitä sentrifugoitiin 5 min 4 C:ssa jätteiden poistamiseksi ja pidettiin jäädytettyinä -20 C:ssa. Kunkin eläimen seerumi- ja suolistonäyt- 15 teet analysoitiin ELISA:lla anti-helicobacter-aktiivisuuden arvioimiseksi, tavanomaisten menetelmien mukaisesti. Lyhyesti esitettynä 96-kaivoiset levyt päällystettiin H. pylorin sonikaatilla, mitä seurasi saturointi 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla. Näytteet laimennettiin sarjassa 20 1:1:stä 1:1 000:een ja niitä inkuboitiin yli yön 4 C:ssa ELISA-levyillä. Vasta-ainetasojen määrittämiseen käytettiin biotinyloitua anti-hiiri-igg:tä (seerumia) ja anti-hiiri- IgA:ta, mitä seurasi streptavidiini-piparjuuriperoksidaasi. Tulokset altistuksesta H. felisille immunisaation 25 jälkeen puhdistetulla H. pylorin ureaasilla on esitetty taulukoissa 1-3 ja kuvioissa 1-4, ja tulokset H. felis -altistuksista immunisaation jälkeen H. pylorin rekombinanttisilla ureaasin A- ja B-alayksiköillä on esitetty taulukoissa 4-6 ja kuvioissa 5 ja 6. 30

18 17 Taulukko 1 i[1.iri ureaasi viljelmän Immunoglobuliinit 5 Lumero immunisaatio testi Gram Seerumi suoliston erite 12 h Ig IgG Ig IgA 1 Ureaasi+HF + N felis Ureaasi+HF Ureaasi+HF Ureaasi+HF + H felis Ureaasi+HF Ureaasi+HF ) 7 Ureaasi+HF Ureaasi+HF Ureaasi+HF 0 0 N.D. N.D k 10 Ureaasi+HF Ureaasi Ureaasi 0 13 lureaasi., Ureaasi Ureaasi Ureaasi Ureaasi Ureaasi 0 0 N.D. N.D Ureaasi Ureaasi CT+HF CT+HF + H felis CT+HF + K felis 90 0 N.D. N.D CT+HF + H felis CT+HF + H felis

19 18 26 CT+HY + 14 felis CT+HF + H felis CT+HF J 29 CT+HP + U felis CT+HF + H talin N.D..D. N.D. N.D.,.. 31 HP sonikaattl+hf + H felis HP sonikaatti+hf + H felis HP sonikaatti+hf + K felis HP sonikaatti+hf , 35 HP sonikaatti+hf + H felis HP sonikaatti+hf + 1 felis HP sonikaatti+hf HP sonikaatti+hf + H felis HP sonikaatti+hf HP sonikaatti HP sonikaatti : HP sonikaatti HP sonikaatti HP sonikaatti m HP sonikaatti HP sonikaatti HP sonikaatti HP sonikaatti

20 19 1 :. Taulukossa 1, joka koskee osassa B kuvattua koetta, "h" tarkoittaa tunteja, "Ig" tarkoittaa immunoglobuliinia, "ND" tarkoittaa ei määritettyä, "ureaasi + HF" tarkoittaa, 5 että hiiret oli immunisoitu ureaasilla (kytketty hydroksiapatiittiin koleratoksiinilla) ja sitten altistettu H. felisille, "ureaasi" tarkoittaa, että hiiret oli immunisoitu ureaasilla (kytketty hydroksiapatiittiin, koleratoksiinin kanssa), eikä altistusta, "CT + HF" tarkoittaa, että 10 hiiret oli valeimmunisoitu koleratoksiinilla ja altistettu H. felisille, "HP sonikaatti + HF" tarkoittaa, että hiiret oli immunisoitu H. pylori -sonikaatilla koleratoksiinin kera ja altistettu H. felisille ja "HP-sonikaatti" tarkoittaa, että hiiret oli immunisoitu H. pylori -sonikaatilla 15 koleratoksiinin kera, eikä altistettu. Taulukossa 1 luvut vasta-ainetuloksista on annettu absorbanssimäärityksinä 595 nm, kerrottuna 1 000:11a. Tausta, joka määritettiin vastaaineiden puuttuessa, vähennettiin. Osassa B kuvatun kokeen tulokset, jotka on saatu 20 mahabiopsioiden ureaasitestien ja H. felis -viljelmien Gram-värjäysten perusteella on esitetty taulukossa 2. Infektio määriteltiin olevan hiirillä, joilla oli yksi tai useampi merkki H. felis -kolonisaatiosta, mukaan luettuna ureaasitesti tai viljelmien Gram-värjäys. 25

21 20 Taulukko 2 Immunisaatio Altistus % infektoitunut % suojattu Ureaasi H. felis 3/10 (30 %) 7/10 (70 %) * Sonikaatti H. felis 6/9 (66 %) 3/9 (33 %) ** CT H. felis 9/10 (90 %) 1/10 (10 %) 5 *p = 0,0198 (kaksisuuntainen Fisherin testi) verrattuna CT kontrolliin **p = 0,303 (kaksisuuntainen Fisherin testi) verrattuna CT kontrolliin Taulukoissa 1 ja 2 esitetyistä tuloksista voidaan nähdä, että tilastollisesti merkitsevä suoja H-felis 10 -altistusta vastaan saadaan oraalisella immunisaatiolla käyttäen H. pylorin ureaasia verrattuna siihen, joka saadaan käyttämällä joko H. pylori -sonikaattia tai koleratoksiinia. Viitaten taulukkoon 2, voidaan nähdä, että yhteensä 10:stä immunisoidusta eläimestä vain 3 infektoitui, verrat- 15 tuna 6:een eläimistä, jotka oli immunisoitu H. pylori -sonikaatilla ja 9:ään eläimistä, jotka oli immunisoitu koleratoksiinilla. Taulukko 2 osoittaa, että 70 % eläimistä oli suojattu altistumasta H. felisille verrattuna 33- prosenttiin eläimistä, jotka oli immunisoitu H. pylori 20 -sonikaatilla ja 10 eläimistä, jotka oli immunisoitu koleratoksiinilla ja altistettu sitten H. felisille. Toisin sanoen 90 % kontrollihiiristä, jotka oli altistettu H. felisille, infektoituivat tällä patogeenillä, kun taas H. pylorin ureaasilla 28 vuorokautta ennen altistusta H. felisille 25 immunisoidissa hiirissä infektiotaso oli vain 30 %. Tämä edustaa merkitsevää infektion vähenemistä (p = 0,0198 Fisherin testillä, verrattuna kontrollihiiriin). Kun hiiret immunisoitiin oraalisesti H. pylori -sonikaatilla, infektiotaso oli 67 % (ei merkitsevä verrattuna kontrolliin).

22 21 H. pylorin ureaasia käyttämällä saatu suoja on odottamaton, eikä sitä olisi voitu ennustaa H. pylori -sonikaattia käyttämällä havaittujen tulosten perusteella. Viitaten kuvioihin 1-4, kuviossa 1 esitetään 5 graafisesti testitulokset vasta-aineista seerumissa (IgG) ja suoliston eritteissä (IgA) hiirissä, jotka eivät olleet suojattuja ureaasilla immunisaation jälkeen. Nämä ovat hiiret numerot 1, 4 ja 6 taulukosta 1 ja ne muodostavat ryhmän A. Kuviossa 2 esitetään niiden hiirten vasta-ainevaste, 10 jotka olivat suojattuja ureaasilla immunisaation jälkeen (ryhmä B), se on hiiret 2, 3, 5 ja Kuviot 3 ja 4 koskevat tuloksia, jotka on saatu hiirillä numerot Kuvio 3 (ryhmä C) esittää niiden hiirten vasta-ainevasteet, jotka eivät olleet suojattuja 15 immunisaation jälkeen H. pylori -sonikaatilla (hiiret numerot 31, 32, 33, 35, 36 ja 38) ja kuvio 4 (ryhmä D) esittää niiden hiirten vasta-ainevasteet, jotka olivat suojattuja immunisaation jälkeen H. pylori -sonikaatilla (hiiret numerot 34, 37 ja 39). On kiinnostavaa huomata kuvien 3 ja 4 20 suhteen, että IgA-vasta-ainevasteet (mutta ei IgG) ovat korkeammat hiirillä, joilla esiintyy suojaa kuin hiirillä, jotka eivät ole suojattuja, antaen olettaa korrelaatiota suojan ja IgA-vasteen välillä. Seerumin IgG-vasteet eivät osoittaneet korrelaatiota. Limakalvon IgA-, mutta ei seeru- 25 min IgG-vasta-aineiden tiedetään näyttelevän roolia suojauksessa bakteeri-infektioita vastaan suolessa (3). Tulokset korrelaatiosta H. felisin havaitsemisen välillä mahabiopsioista ureaasitestillä sekä viljelmissä on esitetty taulukossa 3. 30

23 22 Taulukko 3 Ureaasitesti + Ureaasitesti - Yh- teen- sä H. feli,s 16 0 viljely H. felis 2 30 viljely - 32 Yhteensä Kaksisuuntainen Fisherin testi: p < 0, Taulukko 3 osoittaa, että erittäin merkitsevä korrelaatio esiintyy mahabiopsioista tehtyjen ureaasitestien tulosten ja H. felis -infektion tunnistuksen välillä, ureaasitestejä pidettiin ensisijaisina H. felis -infekti- 15 on diagnoosissa hiiristä seuraavissa kokeissa, johtuen sen paremmasta herkkyydestä. Tämä sovellutus teki mahdol- : liseksi ureaasitestien duplikaation suuremmilla mahan osilla kustakin hiirestä, ja siten ureaasitestin herkkyyden lisääntymisen entisestään. Lisäksi menetelmän käyttö «: 1B 20 suurimmalla herkkyydellä estää testatulla rokotevalmisteella saavutetun suojauksen yliarvioinnin. Kun positiivista viljelmää käytetään standardina infektiolle, osassa B kuvatun kokeen aikana tehdyn ureaasi-immunisaation jälkeen indusoitunut suojaus on yhtä merkitsevä kuin ure- 25 aasitestin ja viljelyn yhdistetyllä käytöllä saatu (p = 0,021 verrattuna p = 0,019). Osassa C esitettyjen kokeiden tulokset (rekombinanttiset ureaasin alayksiköt), jotka on saatu mahabiopsioiden ureaasitestien perusteella, on esitetty tau- 30 lukoissa 4, 5 ja 6, ja kuviossa 6.

24 23 Taulukko 4 Immunisaatio Hiiri Ureaasitesti Infektio nro CT 20 0, , , , , , , , , ,32 + urea+hap+ct 40 0, , , , , , , , , ,37 + ureb+hap+ct 25 0, , , , , , , ,00 -

25 24 urea+hap+ct ,00 0,07 0,42 0,00 0, ureb+hap+ct 73 0, , , , , , , , , ,00 - Taulukossa 4 "CT" tarkoittaa koleratoksiinia, 5 "UreA" tarkoittaa n. pylorin rekombinanttista ureaasi A:n alayksikköä, "UreB" tarkoittaa H. pylorin rekombinanttista ureaasi B:n alayksikköä ja "HAP" tarkoittaa hydroksiapatiittikiteitä. Hiiret tapettiin 12 vuorokauden jälkeen altistuksesta ja hiiret viikkoa 10 (106 vuorokautta) altistuksen jälkeen. Tulokset ureaasitestistä, joka suoritettiin kunkin eläimen mahabiopsioista, on ilmaistu OD-arvoina 550 nm:ssa. Positiiviset ja negatiiviset merkit osoittavat kunkin eläimen infektion lopullista tilannetta, H. felisin osoittamiseksi teh- 15 dyn ureaasitestin positiivisuuden tai negatiiviuuden mukaan. Positiivisuus: OD550 arvot > 0,2.

26 25 Taulukko 5: suoja mitattuna 12 päivää altistuksen jälkeen Immunisaatio Altistus % infektoitunut % suojattu Ureaasialayksikkö H. felis 10/10 (100 %) 0/10 (0 %) 5 A Ureaasialayksikkö H. felis 3/10 (30 %) 7/10 (70 %)* B CT H. felis 10/10 (100 %) 0//10 (0 %) *p = 0,0031 (kaksisuuntainen Fisherin testi) verrattuna 10 kontrolliin CT Taulukko 6: suoja mitattuna 10 viikkoa altistuksen jälkeen 15 Immunisaatio Altistus % infektoitunut % suojattu Ureaasi- H. felis 1/5 (20 %) 4/5 (80 %) * alayksikkö A Ureaasi- H. felis 4/10 (40 %) 6/10 (60 %)** alayksikkö B 20 *p = 0,003 (kaksisuuntainen Fisherin testi) verrattuna kontrolliin CT **p = 0,01 (kaksisuuntainen Fisherin testi) verrattuna kontrolliin CT 25 Taulukoissa 4, 5 ja 6 esitetyistä tuloksista voidaan nähdä, että tilastollisesti merkitsevä suoja H. felis altistusta vastaan saavutetaan oraalisella immunisaatiolla käyttäen joko H. pylorin rekombinanttista ureaasin B-alayksikköä verrattuna suojaan, joka saavutetaan käyt- 30 tämällä joko H. pylorin rekombinanttista ureaasin A-alayksikköä tai koleratoksiinia. Taulukosta 4 voidaan nähdä, että 12 vuorokautta altistuksen jälkeen, yhteensä 10 eläimestä vain 3:n havaittiin olevan infektoitu ureaasin B-alayksikköryhmässä, verrattuna kaikkiin 10 eläimeen, 35 jotka oli immunisoitu H. pylorin ureaasin A-alayksiköllä

27 T : t : ja 10:een 10:stä eläimestä, jotka oli immunisoitu koleratoksiinilla. Taulukko 4 osoittaa, että 70 % eläimistä olivat suojattuja H. felis -altistukselta verrattuna 0-prosenttiin eläimistä, jotka oli immunisoitu H. pylorin 5 ureaasin A-alayksiköllä ja 0-prosenttiin eläimistä, jotka oli immunisoitu koleratoksiinilla, ja sitten altistettu H. felisille. Toisin sanoen 100 % kontrollihiiristä, jotka oli altistettu H. felisille, infektoitui, kun taas sitä vastoin hiirillä, jotka oli immunisoitu H. pylorin 10 rekombinanttisella ueaasin B-alayksiköllä, infektiotaso oli vain 30 %. Tämä osoittaa infektion vähenemistä merkitsevästi (p = 0,0031, Fisherin testi) verrattuna kontrollihiiriin. Se tosiseikka, että H. pylorin ureaasin yhteydessä 15 havaittu suojaus on yksinomaan immunisaation ureaasin B- alayksiköllä suomaa, ja että A-alayksiköllä ei ole tällaista tehoa, ei ollut odotettua kokeemme perusteella puhdistetulla ureaasilla. Tämä määritelmä ureaasin kahden rakenteellisen alayksikön rooleista suojaavan immuunivas- 20 teen kehittymisestsä on sen vuoksi uusi. Rekombinanttista ureaasin B-alayksikköä, joka on entsymaattisesti inaktiivinen, käyttämällä saatu suoja kertoo myös, että ureaasin ei-toksisia muotoja voidaan käyttää oraalisena rokotteena Helicobacter-infektiota vastaan. Lisäksi nämä tulokset 25 voimakkaasti antavat olettaa, että aktiivisen kohdan tunnistusta ei vaadita suojaukseen, koska inaktiivinen ureaasin B-alayksikkö hyvin epätodennäköisesti indusoi vasta-aineita, jotka tunnistavat ja inhiboivat natiivin ureaasin katalyyttistä kohtaa. 30 Taulukosta 6 voidaan nähdä, että kun hiiret tapetaan 10 viikkoa infektion jälkeen, 60 % (6 hiirtä 10:stä) ureaasin B-alayksiköllä immunisoiduista eläimistä ja 80 % (4 hiirtä 5:stä) H. pylorin ureaasin B-alayksiköllä immunisoiduista eläimistä oli suojattu H. felis -infektiota 35 vastaan. Sitä tosiseikkaa, että ureaasin B-alayksiköllä

28 27 immunisoimalla saatu suoja kestää pitkän aikaa, ja että immunisaatio ureaasin A-alayksiköllä indusoi suojan, joka on syrjäytyvä verrattuna ureaasin B-alayksikön indusoimaan, ei voitu odottaa puhdistetulla ureaasilla tehdyn kokeemme pe- 5 rusteella tai aikaisemmin tehtyjen muiden kokeiden perusteella. Se tosiseikka, että ureaasin B-alayksikön immunisaatio saa aikaan suojauksen, todistaa vääjäämättä, että aktiivisen kohdan tunnistusta ei tarvita suojaa varten. Kuviossa 6 on yhteenveto tuloksista, jotka on saatu oraalisen 10 immunisaation jälkeen rekombinanttisella ureaasin A- ja B- alayksiköllä (kuvattu taulukoissa 5 ja 6). Tämä keksintö tarjoaa menetelmän rokotekoostumusten valmistamiseksi, jotka ovat sopivia Helicobacter-infektion estämiseen. Koostumukset käsittävät tehokkaan määrän ure- 15 aasiantigeeniä, edullisesti H. pylorin ureaasia tai H. pylorin rekombinanttisia ureaasin alayksiköitä, jotka kykenevät nostattamaan isännässä suojaavan immuunivasteen Helicobacter-infektiolle, yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimennusaineen kanssa. 20 Kyseiset rokotteet annetaan määrinä, jotka alan tavanomaiset ammattimiehet voivat helposti määritellä. Siten aikuisille sopiva annos on alueella 10 gg mg, esimerkiksi 50 gg - 50 mg. Samanlaiset annosalueet ovat käyttökelpoisia lapsille. Kantajajärjestelmät ihmisille voivat 25 sisältää suolessa aineet vapauttavat kapselit, jotka suojaavat antigeeniä mahan happamalta ympäristöltä, ja jotka sisältävät ureaasiantigeenin liukenemattomassa muodossa fuusioproteiinina. Rokote voidaan antaa primaarisena profylaktisena aineena aikuisille tai lapsille, sekundaarisena 30 estoaineena H. pylorin onnistuneen hävittämisen jälkeen infektoidusta isännästä tai terapeuttisena aineena, tarkoituksena indusoida immuunivaste altistuneessa isännässä, avustamaan H. pylorin hävittämistä.

29 28 Kuten edellä on mainittu, sopiva limakalvoadjuvantti on koleratoksiini. Muita käyttökelpoisia ovat muramyylidipeptidit tai sen johdannaiset, koleratoksiinin eitoksiset johdannaiset, mukaan luettuna sen B-alayksikkö 5 ja/tai ureaasiantigeenin konjugaatit tai geenitekniikan avulla tuotetut fuusiot plus koleratoksiini tai sen B- alayksikkö. Muihin soveltuviin antojärjestelmiin kuuluvat biologisesti hajoavat mikrokapselit tai immuunijärjestelmää stimuloivat kompleksit (ISCOM:it) tai liposomit, geenitek- 10 niikan avulla tuotetut heikennetyt elävät vektorit, kuten virukset tai bakteerit ja rekombinanttiset (kimeeriset) viruksen kaltaiset partikkelit, esim. bluetongue. Käytetyn limakalvoadjuvantin määrä riippuu limakalvoadjuvantin tyypistä. Esimerkiksi kun limakalvoadjuvantti on koleratoksii- 15 ni, sitä on sopivaa käyttää määränä 5-50 µg, esimerkiksi µg. Mikrokapseleiden muodossa käytetty määrä riippuu määrästä, joka on käytetty mikrokapseleiden matriksiin halutun annoksen saavuttamiseksi. Tämän määrän määrittäminen kuuluu tavanomaisen alan ammattimiehen taitoihin. Sopi- 20 via kantajia kyseisiä rokotteita varten ovat päällystetyt suolistokapselit ja polyaktidi-glykolidi-mikropalloset. Sopivia laimennusaineita ovat 0,2 N NaHCO3 ja/tai suolaliuos. Erityinen hydroksyloitu kalsiumfosfaatti (HCP) on erityisen hyödyllinen kantajana H. pylorin ureaasille an- 25 nettavaksi limakalvojen pintaan. Uskotaan, että H. pylorin ureaasi - hydroksyloitu kalsiumfosfaatti -konjugaatti kuljetetaan epiteelin läpi, jossa se nostattaa poly Ig -immuunivasteen. Hydroksyloitu kalsiumfosfaatti on edullisesti mikropartikkelien muodossa, jotka ovat sopivia 30 kuljetukseen epiteelin läpi, erityisesti tähän tarkoitukseen erikoistuneista soluista (M-solut). Edullinen muoto hydroksyloidusta kalsiumfosfaatista on hydroksiapatiitti,

30 29 kaupallisensti saatavilla oleva kiteinen hydroksyloitu kalsiumfosfaatti Calo(PO4)6(OH)2. Kaupallisesti saatavilla oleva hydroksiapatiitti koostuu yleensä laattamaisista kiteistä, jotka ovat kemial- 5 lisesti ja fysikaalisesti analogisia epäorgaaniselle hydroksiapatiitille normaalissa luukudoksessa. Hydroksiapatiitin nauttimisen tulisi siten olla turvallista, mitä todistaa nautittavaksi suunniteltujen jauhetusta luusta tehtyjen kalsium/fosforilisäravinteiden olemassaolo. Kaupallinen 10 korkean erotuskyvyn hydroksiapatiitti (CalBioChem:iltä) koostuu kiteistä, joiden koko vaihtelee suuresti. M-solut tuskin ottavat sisäänsä yli 1 µm:n pituisia kiteitä. Sen vuoksi keksinnössä käytettävät kaupalliset hydroksiapatiittikiteet rikotaan pieniksi, suhteellisen samankokoisiksi 15 kidefragmenteiksi, esimerkiksi sonikoimalla. Edullisesti olennainen osa hydroksiapatiitista on noin 0,01-0,0 µm fragmentteina. Fragmentointi voidaan mitata joko elektronimikroskopialla tai valon sironnalla käyttäen tavanomaisia tekniikoita. 20 Edulliset antomuodot H. pylorin ureaasiantigeenille ovat oraalisesti, nasaalisesti, rektaalisesti tai okulaarisesti. Oraalinen antotapa voi tarjota jakaantumisen muihin ruoansulatuskanavan limakalvoihin, mukaan luettuna suoliston limakalvo. 25 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat rokotteet voidaan antaa limakalvon pinnalle aerosolin, suspension, kapselin ja/tai peräpuikon muodossa. Antotapa on helposti ilmeinen tämän alan tavanomaiset taidot omaavalle. Tässä esitetty kuvaus käsittää lisäksi nisäkkäiden, 30 mukaan luettuna ihmiset, passiivisen immunisaation Helicobacter-infektiota vastaan. Tämä saavutetaan antamalla potilaan limakalvon pinnalle tehokas määrä ureaasille spesifistä vasta-ainetta. Edullisesti tehokas määrä H. pylorin ureaasille spesifistä IgA monoklonaalista vasta-ainetta. 35