Proteiinihydrolysaatit ja peptidit terveyden edistäjinä

Transkriptio

1 Proteiinihydrolysaatit ja peptidit terveyden edistäjinä Anne Pihlanto MTT Biotekniikka ja elintarviketutkimus Tutkimustieto avaa maitoproteiinien merkitystä ruuassamme Meijeritieteellinen seura

2 Sisältö Hydrolysaatit Prosessityypit Optimointi Peptidit Rakenne ja aktiivisuus Tuottaminen ja tutkimusasetelmat In vitro ja in vivo aktiivisuudet Biosaatavuus Päätelmät Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus

3 Lisäarvon tuotto LEVEL OF TECHNOLOGY LOW HIGH PROTEIN ISOLATE PROTEIN POWDER FOOD FEED BIOACTIVE PEPTIDES PROTEIN COMPONENTS PROTEIN CONCENTRATE GROWTH FACTORS LOW HIGH VALUE-ADDED

4 Proteiinihydrolysaatit Toiminnalliset ominaisuudet Allergisuus Bioaktiivisuus Hydrolyysiolosuhteet: ph, lämpötila, E/Ssuhteet, aika

5 Entsyymien ominaisuuksia Enzyme Source Optimal conditions Cleaving sites Trypsin Bovine pancreas ph 7-9, C Lys-, Arg- C-terminal Pepsin Bovine/pig stomach ph 1-4, C Hydrophobic, preferentailly N terminal of Phe, Trp and Tyr Corolase Bacterial, fungal, animal ph 7.0, 50 C broad specificity (preferably hydrophobic) Alcalase Bacillus licheniformis ph 6-10, C Broad specificity, manily hydrophobic aminoacids Subtilisin B. amyloliquefaciens ph 6-10, C Broad specificity, mainily hydrophobic aminoacids Thermolysin B. thermoproteolyticus ph 7-9, C -Ile, -Leu, -Val, -Phe N-terminal Flavourzyme Aspergillus oryzae ph 7.0, 50 C endo- and exopeptidase mixture, broad specificity Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus

6 Prosessityypin valinta Panos Yksinkertainen ja helppo kontrolloida Haitta Entsyymien kustannus ja tehottomuus Ratkaisu Entsyymien immobilisointi Syklinen malli Jatkuvatoiminen Hydrolyysi tuotteiden eristys ja katalysaattorin talteen samanaikaisesti Käytetään laajasti proteiinien toiminnallisten ja ravitsemuksellisten ominaisuuksien muokkaamiseksi Reaktion tehokkuus ja lopputuotteen saanto paranee Helposti skaalattavissa Ultrasuodatusmembraani reaktioilla saadaan tasalaatuinen tuote, jolla haluttu molekyylipaino

7 Jatkuvatoiminen membraanireaktori hemoglogiinin hydrolysoimiseksi enzymatic hydrolysis of haemoglobin by papain in a continuous membrane bioreactor which was equipped with either a microfiltration membrane (Carbosep M14) with an average pore diameter of 0.14 μm or an ultrafiltration membrane (Carbosep M5) with 10 kda molecular weight cut-off. Optimization of enzymatic hydrolysis of haemoglobin in a continuous membrane bioreactor D Belhocine et al Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus

8 Jatkuva hemorfiinien tuotto Substrate Pumps Outlets of organic phase containing peptides a stirred and thermostated reactor Aluminium oxide Resin Duolite A568 with enzyme

9 Prosessin optimointi Vastepinta-menetelmä Heraproteiini ja korolaasi (ph 7.0, 50 C) Vakio proteiinikonsentraatio Hydrolyysiolosuhteet vaihtelivat Esikäsittelyn lämpötila ph, lämpötila, aika ja E:S Hydrolyysiaste, bioaktiivisuus Tilastollinen analyysi Process parameter -α α Pretreatment ( C) E/S ph Temperature ( C) Hydrolysis time (h) Aika (h) DH % IC50 (arvio) ,123 0,202 (mitattu) ,091 0, ,059 0, ,026 0,155 Van der Ven et al. International Dairy Journal 12 (2002) ,148 5, ,196

10 Hydrolyysiprosessin optimointi vastepintaanalyysillä Alkalaasi Hydrolyysiajalla ei vaikutusta (0,5-4 h) Proteiini1.5 % ja E/S 4.8 AU/g proteiinia tuotti korkeimman aktiivisuuden (ACE:n esto) MTT Agrifood Research Finland 11/6/

11 Bioaktiiviset peptidit mitkä? Peptidi on pilkottava irti proteiinimatriisista jotta biologiset vaikutukset tulevat esille Yleisimmin bioaktiiviset peptidit ovat 2-20 aminohapon mittaisia Biologinen vaikutus riippuu aminohapposekvenssistä Aminohappoketjun pilkkominen

12 Peptidien/hydrolysaattien vaikutuksia Cardiovascular system Obesity Type 2 Diabetes Immune system Gastrointestinal system Nervous system Hypocholesterolemic DPP-IV inhibitors Antioxidative Mineral binding Antithrombotic Immunomodulatory Mucin secretion Antihypertensive Insulinotropic Antimicrobial Opioid antagonist Opioid agonist 12

13 Rakenne - aktiivisuus Varaus, molekyylipaino, hydrofobisuus sekvenssi: ACEn esto (verenpaine) C-terminal hydrofoobinen aminohappo (esim. Pro) tai positiivinen varaus (esim. Lys ja Arg) Antioxidatiivisuus (sydän- ja verisuoniterveys) Runsaasti His ja hydrofobisia aminohappoja Pro-His-His hyvä antioksidatiivisuus Opioidipeptidit (hermojärjestelmä) Tyr N-terminal, Phe tai Tyr paikoissa 3 tai 4 Mineraalin sitominen, antimikrobiset Ser-P klusteri ja Glu, emäksiset aminohapot 13

14 Miten haluttuja bioaktiivisia peptidejä vapautuu Entsyymi Pepsiini Trypsiini Termolysiini Spesifisyys Phe-X Leu-X Lys-X Arg-X X-Ile X-Leu X-Val X-Phe Maitohappobakteerit Lactobacillus helveticus Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lactococcus lactis ssp. cremoris Streptococcus salivarius ssp. thermophilus Lactococcus lactis ssp. diacetylactis

15 From hydrolysate to peptide concentrate and identified peptides Protein hydrolysate a complex mixture of proteins and peptides Separation of peptides from intact/larger proteins Concentration of peptides with target properties Purification and identification of peptides with target activity/activities

16 Production of bioactive peptides at laboratory and industrial scale Stage Laboratory scale Industrial scale Protein source Food proteins waste products rich in proteins Hydrolysis Separation and purifi cation Biological activity assessment Determination of peptides sequence hydrolysis by intestinal, proteolytic enzymes, during food processing (fermentation, maturation) ultrafiltration membranes mass exclusion, Ion exchange, affinity and reversed phase hromatography in vitro, ex vivo and in vivo edman s degradation mass spectrometry (API-ESI, FAB, MS/MS, MALDI-TOF) hydrolysis with microbial hydrolases, during fermentation reactors with/without continuous flow; immobilised enzymes ultrafiltration, ionexchange, nanofiltration and electromembranes ionexchange chromatography research in vitro methods Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus

17 Examples of milk protein-derived ACE-inhibitory peptide sequences Sequence Name Fragment Model Release protease VPP/IPP Lactotripeptides β-, κ casein In vitro Fermentation Animal, humans FFVAP α s1 -casokinin-5 α s1 -cn f(23-27) In vitro Proline endopeptidase AVPYPQR β-casokinin-7 β cn f( ) In vitro Trypsin WLAHK Lactokinin α-la f( ) In vitro Trypsin ALPMHIR Lactokinin β-lg f ( ) In vitro Trypsin IPA Lactokinin β-lg f(78-80) In vitro Proteinase K Animal YPFPGPI β-casomorphin-7 β-cn f(60-66) In vitro Trypsin RYLGYLE α-casein exorphin α s1 -cn f(90-96) In vitro Pepsin YGLF α Lactorphin α-la f(50-53) In vitro Pepsin Animal YLLF β-lactorphin β-lg f( ) In vitro Pepsin + trypsin HIRL β-lactotensin β-lg f( ) In vitro Chymotrypsin

18 Bioavailabilty Digestion In vitro/in vivo studies Simulation studies Commercial enzymes Pepsin Trypsin/chymotrypsin Corolase Carboxy/aminopeptidases Lipases Amylases Human enzymes Gastric juice (stomach) Duodenal juice (intestine) Brush border/epithelial cell proteses ICFDF

19 Stability of ACE inhibitory compounds during digestion with human digestive liquids The digestibility of samples was studied using an in vitro method which mimics human digestion using human gastric and duodenal juice kda IC50 ug protein/ml ACE inhibition % of control 0 Start HGJ HDJ Step of digestion kda MÄKINEN et al Journal of Functional Foods 4, 3: Start HGJ HDJ MTT Agrifood Research Finland 11/6/

20 Hypotensive effects of some casein derived peptides in spontaneously hypertensive rats (SHR) Organisms/ enzyme Peptide IC 50 µm Dose Response (Max Δ SBP, mmhg) Lb. helveticus CPN4 YP mg/kg (BW) 32.1 ± 7.4 after 6 h Lb. helveticus & VPP, 9 5 ml/kg (BW) 21.8 ± 4.2 after 6 h Sacc. cerevisiae IPP 5 Lb. helveticus VPP, 27 ml/day 21.0 after 14 weeks LBK16H IPP Str. thermophilus, Lb. bulgaricus YPYY ml (peptide 4.9 mg/ml ) after 8 weeks Pepsin RYLGY mg/kg (BW) 25 ±3 after 6 h AYFYPEL after 4 h Yamamoto et al. 1999; Nakamura et al. 1995; Sipola et al. 2002; Tsai et al. 2008; Leclerc et al. 2003, de mal Contreras et al.,

21 Multifunctional properties of peptides (α-lactorphin Tyr-Gly-Leu-Phe) Opioid Antihypertensive Antioxidative Mucin secretion Maximal Change in SBP (mm Hg) Pretreatment: Saline HOE 140 Naloxone 0.3 Naloxone 1 Naloxone 3 * *** α -Lactorphin 100 µg/kg Saline SBP (mm Hg) Time (min) 21

22 Hydrolysaatit ja diabetes Aminohapot (Leu, Arg, Ile, Phe, ja Ala) tai peptidit yhdessä hiilihydraattien kanssa lisäävät insuliinin eritystä in vivo. Solumallilla insuliinin eritys lisääntyi herahydrolysaatilla In conclusion, an 8-wk oral administration of WPH improved blood glucose clearance, reduced hyperinsulinemia, and restored the pancreatic islet capacity to secrete insulin in response to glucose in ob/ob mice. Hence, it may be useful in diabetes management. Gaudel et al. J. Nutr. 143: , Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus

23 Effect of peptides from food proteins on blood pressure: a meta-analysis of randomized controlled trials (Pripp, 2007) 15 clinical trials of which 9 concerned IPP, VPP Standard forest plot from meta-analysis on systolic blood pressure. Cochran s Q-test for homogeneity was Q 30.52, p-value0.02. Diastolic blood pressure. Cochran s Q-test for homogeneity was Q 29.10, p-value

24 Päätelmät Osana normaalia ruokavaliota Riskin alentaminen ei sairauden ehkäisy Maku Tehokkuus in vivo vaikutusten tutkimus, biosaatavuus, farmkokinetiikka, mekanismit Turvallisuus Taste Health Nutriton

25 Kiitos MTT, Metsäntutkimuslaitos (Metla), Riistan ja kalantutkimus (RKTL) ja Maa- ja metsätalousministeriön tietopalvelukeskus (TIKE Tilastot) yhdistyvät Luonnonvarakeskukseksi (Luke)