KE Käytännön NMR-spektroskopia (3 op) Staff Scientist, FT Jari Koivisto. Huone: C308b Puhelin: Sähköposti:

Transkriptio

1 KE Käytännön NMR-spektroskopia (3 op) Staff Scientist, FT Jari Koivisto Huone: C308b Puhelin: Sähköposti: 1

2 Käytännön NMR-spektroskopia Yleistä Luennot Tiistaisin klo 12:15 14:00 salissa B202b ( ). Harjoitukset NMR-huoneessa C121. Aika sovitaan ensimmäisellä luennolla. Kirjallisuus Jari Koivisto: Bruker Avance DPX400 User Manual (Version 1/2010) Luentomoniste ja lisämateriaali Muuta luettavaa Bruker-manuaalit ( Berger, S.; Braun, S. 200 and More NMR Experiments, A Practical Course; Wiley-VHC: Weinheim, Kurssin suoritus Käytännön koe. Aika sovitaan myöhemmin. 2

3 Käytännön NMR-spektroskopia Sisältö, tavoitteet ja esitiedot Sisältö Kurssilla perehdytään Bruker Avance DPX400 NMR-spektrometrin operointiin käytännön harjoitusten avulla. Pääpaino on kehittyneemmillä NMR-tekniikoilla (selektiiviset 1D-mittaukset, erilaiset 2D-mittaukset, pure shift-mittaukset, ja mittaukset eri lämpötiloissa). Mittausten teoreettinen tausta ja spektrien tulkinta käydään lyhyesti läpi. Lisäksi tutustutaan laitteistoon ja sen ylläpitoon. Tavoitteet Kurssin ensisijaisena tavoitteena on oppia itsenäisesti operoimaan Bruker Avance DPX400 NMR-spektrometria. Lisäksi tavoitteena on hallita TopSpin-ohjelmisto sekä oppia selviytymään erilaisista ongelmatilanteista ilman NMR-vastaavan apua. Esitiedot CHEM-E8100 Organic Structural Analysis tai KE Orgaaninen rakenneanalytiikka. 3

4 1. Johdanto 1.1 NMR-Laboratorion yleiset säännöt Vain valtuutetut käyttäjät voivat operoida spektrometria Valtuutettuja käyttäjiä ovat henkilöt, jotka ovat saaneet koulutuksen NMR-laboratorion vastaavalta (JK) ja ovat osoittaneet pystyvänsä operoimaan spektrometria itsenäisesti Käytä ainoastaan AN-alkuisia parametreja! Älä tee muutoksia ohjelmistoihin äläkä laitteistoon ilman JK:n opastusta Täytä lokikirja ennen kuin poistut NMR-laboratoriosta. Merkitse mahdolliset epämääräisyydet lokikirjaan ja kerro niistä välittömästi JK:lle Älä vie mitään mukanasi NMR-laboratoriosta (manuaalit, työkalut jne...) Kopioi vanhat/turhat tiedostot ja poista alkuperäiset tiedostot kovalevyltä Älä tuo ruokaa äläkä juomaa NMR-laboratorioon Älä operoi spektrometria suojakäsineet kädessä Älä käytä NMR-tietokonetta nettisurffailuun tai s-postin lukemiseen (virusvaara) Sulje (ja lukitse) ovi lähtiessäsi 4

5 1. Johdanto 1.2 NMR-Laboratorion varaussäännöt Varauslista löytyy osoitteesta \\work\t102\t10203\nmr-booking\nmr BOOKING.xls Varauksen saa tehdä aikaisintaan edellisenä päivänä Varattavissa on sekä 10 min että 15 min aikoja. Varaa vain yksi 10 min aika / pariton tunti Maksimivaraus on arkisin päivällä ( ) 2h; pitkät mittaukset tehdään yöllä tai viikonloppuisin Yömittaukset alkavat aikaisintaan ja päättyvät viimeistään 8.00 Jos teet mittauksia muussa kuin normaalilämpötilassa (25 C, 298 K), ota huomioon proben jäähtymiseen/lämpenemiseen tarvitsema aika Jos et käytä kaikkea varaamaasi aikaa, ilmoita siitä varauslistassa seuraavana olevalle Älä kajoa toisten varauksiin; jos on jotain valittamista, kerro siitä JK:lle JK varaa oikeuden tehdä mitä huvittaa ja milloin huvittaa! 5

6 1. Johdanto 1.3 Magneetti ja turvallisuus Lyhyesti ja ytimekkäästi: Älä tuo mitään magneettisia esineitä magneetin lähelle! Tyhjennä taskusi ja ota kello ranteestasi ennen kuin lähestyt magneettia! Sydämentahdistin / metalli-implantti VAARA! 6

7 2. NMR-Spektrometri Magneetin kelat Näyte Näytteen vaihdin Näytteenvaihdin N 2 täyttö He täyttö He He Magneetti Esivahvistin N 2 Shimmauskelat Esivahvistin Probe N 2 Elektroniikka (mm. lähetin ja vastaanotin) Probe Shimmauskelat Lähetin Vahvistin/ vastaanotin Tietokone Tulostin 7

8 2. NMR-Spektrometri Magneetti Suprajohtava magneetti kehittää magneettikentän, jota tarvitaan indusoimaan NMR-siirtymät. Jotta magneetti pysyisi suprajohtavassa tilassa, sitä jäähdytetään nestemäisellä heliumilla (4 K, -269 C), jota puolestaan jäähdytetään nestemäisella typellä (77 K, -196 C). Bruker Avance DPX400 NMRspektrometrissa on 9.40 Teslan magneetti. Shimmausysteemi Huoneenlämpötilassa olevat shimmauskelat sijaitsevat magneetin pohjaosassa. Niiden avulla pyritään maksimoimaan magneettikentän homogeenisuus näytteen ympäristössä. Shimmaussysteemiä ohjataan tietokoneelta tai BSMS-näppäimistön (Bruker Smart Magnet System) kautta. BSMS-näppäimistö on pöydällä tietokoneen vieressä. Probe Probe sijaitsee magneetin pohjassa. Shimmauskelat ovat proben ympärillä. Probessa sijaitsevat näytteeseen suunnattujen radiotaajuussignaalien lähettämiseen ja näytteestä emittoituvien signaalien vastaanottamiseen tarkoitetut kelat. Probe hoitaa myöskin lukkosignaalin lähettämisen ja vastaanottamisen. Lisäksi probessa sijaitsee näytteenlämmitysyksikkö. Mittauksen aikana näyteputki on proben sisällä. Orgaanisen kemian laboratorion spektrometri on varustettu 5 mm BBFO-probella (Broad Band Observe), jolla voidaan mitata protonin ( 1 H) lisäksi hiiltä ( 13 C), fosforia ( 31 P), fluoria ( 19 F), typpeä ( 15 N), sekä useita muita NMR-aktiivisia ytimiä. Tämä probe on varustettu Z-gradienttikeloilla sekä automaattisella virityksellä/sovituksella (ATM). BBFO-proben lisäksi NMR-laboratoriosta löytyy vanha QNPprobe (Quattro Nucleus Probe). 8

9 2. NMR-Spektrometri Esivahvistin Esivahvistinyksikkö (HPPR, High Performance PreamplifieR) välittää lähetetyn signaalin näytteeseen ja vahvistaa näytteestä tulevan erittäin heikon signaalin ennen sen syöttämistä vahvistimelle menevään kaapeliin. HPPR myös lähettää ja vastaanottaa lukon deuteriumsignaalia (tai fluorisignaalia). Lisäksi sitä käytetään wobble-rutiinissa (tuning ja matching) sekä kontrolloimaan QNP-proben pneumaattista kytkintä. HPPR sijaitsee lattialla magneetin vieressä. Konsoli Suurin osa spektrometrin elektroniikasta sijaitsee konsolissa. Tärkeimmät elektroniikkayksiköt ovat AQS (AcQuisition control System), BSMS ja VTU (Variable Temperature Unit). AQS hoitaa näytteen virittämiseen tarkoitettujen radiotaajuuspulssien kehittämisen sekä näytteestä emittoituvien signaalien vastaanottamisen, vahvistamisen ja digitoinnin. AQS:stä data siirretään PC:lle prosessointia ja varastointia varten. AQS kontrolloi täydellisesti spektrometria NMR-mittauksen aikana. BSMS-yksikköä ohjataan BSMSnäppäimistön tai tietokoneen kautta ja sitä käytetään kontrolloimaan lukkoa, shimmaussysteemiä sekä näytteen nostoa/laskua ja pyöritystä. Orgaanisen kemian laboratorion spektrometrissa VTU on osa BSMSyksikköä. VTU:n tarkoituksena on pitää näytteen lämpötila tasaisena ja tarvittaessa muuttaa sitä kontrolloidusti. VTU:ta ohjataan tietokoneelta. Tietokone Windows XP Pro työasema, joka sisältää TopSpin 2.1 ohjelmistopaketin. Muuta Orgaanisen kemian laboratorion spektrometri on varustettu automaattisella 24:n näytteen vaihtimella (NMR Case), jota ohjataan tietokoneelta käsin. 9

10 3. Ennen mittausta 3.1 Näytteen valmistus Käytä aina deuteroituja liuottimia Huomioi liukoisuus, jäännösliuotinsignaalin paikka, lämpötilariippuvuus, viskositeetti, vesipitoisuus, hinta Tavalliseen 1 H NMR-mittaukseen riittää 1 5 mg näytettä; 13 C NMR n. 5 määrä 25 mg riittää lähes kaikkiin 2D-mittauksiin; 1 H, 1 H-mittaukset (esim. COSY) 1 5 mg on riittävä määrä Pyri käyttämään aina samaa liuoskorkeutta NMR-putkessa. Suositus (vähintään) 0.6 ml tai 4 cm liuosta ø 5 mm putkessa Käytä aina korkeatasoisia NMR-putkia (esim. Wilmad 527-PP tai 528-PP), jotka ovat puhtaita ja kuivia. Huom! Suoraan pakkauksesta käyttöön otetut putket eivät ole puhtaita! Suodata näyte (varmista, ettei näytteessä ole magneettisia epäpuhtauksia) 10

11 3. Ennen mittausta 3.2 NMR-Putken asettaminen spinneriin Käytä aina syvyysmittaa kun laitat NMR-putken spinneriin Ole varovainen syvyysmitan kanssa: älä muuta syvyyttä! (pohjalevyn pitää olla kohdassa 5 15 mm) Pyyhi NMR-putki ennen kuin laitat sen spinneriin. Pyyhi putki toistamiseen spinneriin asettamisen jälkeen Älä koske spinneriin paljain käsin! NMR-Putken asettaminen spinneriin: laita spinneri syvyysmitan suulle ja työnnä NMR-putkea varovasti spinnerin läpi, kunnes putken pohja osuu syvyysmitan pohjalevyyn Poista syvyysmitta ennen kuin laitat NMR-putken ja spinnerin magneettiin Tarkista, että NMR-putki istuu tiukasti spinnerissä 11

12 4. Normaalin 1D NMR-mittauksen kulku 1. Laita näyte magneettiin ja tarkista, että spinneri on päällä (gradientteja hyödyntävissä mittauksissa spinneri pois päältä) 2. Avaa oma kansiosi ja luo uusi tiedosto. Tässä yhteydessä valitaan liuotin ja mittausparametrit sekä annetaan mittaukselle otsikko 3. Lukitse spektrometri deuteroidun liuottimen 2 H-signaaliin 4. (Tarvittaessa tuning ja matching) 5. Optimoi Z-shimmit (tarvittaessa myös XY-shimmit) 6. Käynnistä mittaus. Vastaanottimen tason säätö, mittauksen käynnistäminen, Fourier-muunnos, faasikorjaus ja pohjaviivan korjaus tapahtuvat automaattisesti (kaikki nämä voidaan tehdä myös manuaalisesti) 7. Kalibroi 8. Määritä piikkien huippujen ppm/hz-arvot 9. Integroi 1 H-spektri 10. (Tulosta) 12

13 5. Toimenpiteet ennen lukitsemista Operaattori ohjaa spektrometria PC:llä olevan TopSpin-ohjelmiston ja BSMS-näppäimistön avulla. TopSpin hoitaa tiedon varastoinnin ja analysoinnin. Kaikki keräämiseen liittyvät toiminnot hoitaa kuitenkin konsolissa sijaitseva AQS-yksikkö. BSMS-näppäimistöllä kontrolloidaan lukkoa, shimmaussysteemiä (manuaalinen shimmaus) sekä näytteen nostoa/laskua ja pyöritystä. Näytteen nostaminen ja laskeminen tehdään paineilman avulla. Tätä toimintaa ohjataan BSMSnäppäimistöllä. Varmista, että näytteen vaihdin on ylhäällä ja paineilma virtaa (kuuluu selvä kohina) ennen kuin laitat spinnerissä olevan NMR-putken magneetin aukon suulle. Laske näyte alas ja tarkista, että spinneri on päällä (ei kuitenkaan ole katastrofi, vaikka näytettä ei pyöritetä). Jos TopSpin-ohjelma on suljettu, avataan se kaksoisklikkaamalla TopSpin 2.1 ikonia. Uusi mittaustiedosto luodaan klikkaamalla kuvaketta ja antamalla uusi tiedostonimi tai eksperimenttinumero. Uusille käyttäjille luodaan kansio kirjoittamalla kohtaan USER käyttäjän sukunimi. Tässä yhteydessä valitaan myös liuotin ja sopiva AN-alkuinen parametrisetti sekä kirjoitetaan mittauksen otsikko. Mittausparametrit sisältävät pulssisarjan, keräys- ja prosessointiparametrit, kuten myös kaikki muut tarvittavat parametrit, mukaan lukien pulssien kestot ja tehot. 13

14 6. Lukko ja shimmaus Lukitseminen ja shimmaaminen tehdään aina ennen NMR-mittauksen aloittamista. Nämä toimenpiteet pitää tehdä uudelleen vain siinä tapauksessa, että näyte vaihdetaan mittausten välillä! Lukko Signaali-kohinasuhteen parantamiseksi kerätään yleensä useita FID-signaaleja (Free Induction Decay) ennen Fourier-muunnosta, jolloin keräysajat saattavat muodostua pitkiksi. Muutokset magneettikentässä ja radiotaajuudessa mittauksen aikana aiheuttavat signaalien levenemistä (2D-mittauksissa t 1 -kohinaa). Kentän ja taajuuden stabiloimiseen käytetään kenttä/taajuuslukkoa. Lukko pitää yllä resonanssiehtoa erillisessä NMR-kokeessa, joka on käynnissä rinnakkain oikean mittauksen kanssa (lukko pitää itse asiassa kentän ja taajuuden suhdetta vakiona). Yleensä lukkosignaalina käytetään deuteroidun liuottimen 2 H-resonanssia. Niin kauan kun lukkosignaali pidetään resonanssissa, on kentän ja taajuuden suhde määritelty myös havaitsemiskanavalla. Lukkosignaali näkyy erillisessä lukkoikkunassa. Lukkoikkuna avataan klikkaamalla kuvaketta. Lukitseminen tehdään klikkaamalla kuvaketta, jonka jälkeen valitaan oikea liuotin listasta. Shimmaus Mittauksen aikana kaikilla tutkittavilla spineillä pitää olla sama Larmor-taajuus, eli kentän tulee olla homogeeninen. Epähomogeeninen kenttä heikentää resoluutiota ja signaalien viivanmuotoa. Magneettikentän homogeenisuutta näytteen ympäristössä säädetään ns. shimmauskelojen avulla. Rutiinityöskentelyssä optimoidaan Z-shimmit automaattisesti käyttäen topshim-rutiinia. Shimmaus voidaan myös tehdä manuaalisesti BSMS-näppäimistön avulla. Homogeenisuutta voidaan lisätä pyörittämällä näytettä 20 Hz nopeudella. 14

15 6. Lukko ja shimmaus OK shimmi Kapea symmetrinen signaali Huono Z 1 Symmetrisesti leventynyt signaali Huono Z 2 Leventymä tai olkapää jommallakummalla puolella signaalia 15

16 7. Tuning ja matching Tuning ja matching eivät ole tarpeellisia toimenpiteitä normaalissa rutiinityöskentelyssä! Tuning (virittäminen) Probeen lähetetyn signaalin taajuus vaikuttaa proben herkkyyteen. On olemassa tietty taajuus, jolla probe on kaikkein herkimmillään. Tätä taajuutta voidaan säätää proben resonanssipiireissä sijaitsevien kondensaattorien avulla. Virittämisessä proben resonanssipiiriä säädetään siten että taajuus, jolla probe on herkimmillään on relevantti lähetystaajuus. Kaikki proben kelat viritetään (ja sovitetaan) erikseen. Matching (sovittaminen) Jos probe viritetään, pitää se myös sovittaa. Sovittamisessa säädetään proben resonanssipiirien impedanssia siten, että se vastaa siihen kytketyn kaapelilinjan impedanssia. Tämä impedanssi on 50. Sovittamisessa pyritään varmistamaan, että maksimimäärä tehoa siirtyy proben kelaan, eikä heijastu takaisin vahvistimiin (ja mene hukkaan). Hyvä viritys ja sovitus BBFO-proben viritys ja sovitus tehdään automaattisesti komennolla atma. Tällöin saadaan PC:n näytölle oheisen näköinen wobble-käyrä. QNP-proben säätötoimenpiteet tehdään probessa olevilla ruuveilla. Sovitus Viritys 16

17 8. Vastaanottimen tason säätäminen Vastaanottimen taso (receiver gain) on tärkeä parametri, jota käytetään sovittamaan FID:n amplitudi ADC:n (Analog/Digital Converter) dynaamiseen alueeseen. Oikea taso voidaan määrittää tarkastelemalla FID-signaalia. Jos FID leikkautuu ensimmäisten pulssien aikana näytön ylä- ja alalaidassa, pitää tasoa pienentää. Liian suuri taso johtaa Fourier-muunnoksen jälkeen spektrin pohjaviivan vääristymiseen. Toisaalta jos taso on liian pieni, ei pystytä hyödyntämään ADC:n täyttä dynaamista aluetta. Siinä tapauksessa tasoa pitää nostaa. Taso voidaan säätää automaattisesti komennolla rga. Joissain tapauksissa taso annetaan komennolla rg. Liian suuri taso t [s] 17

18 9. Keräyksen aloittaminen ja Fourier-muunnos Prosessia, jossa NMR-signaalia vastaanotetaan, kutsutaan keräämiseksi (acquisition). Ts. mittauksen aikana dataa kerätään. Keräys aloitetaan komennolla zg. Tämä komento tuhoaa kaiken aiemman datan (Zero) ja aloittaa mittauksen (Go). Mittauksen aikana kerättävä signaali on muodoltaan aikaspektri, eli ns. FID (Free Induction Decay). FID sisältää koko spektriä varten tarvittavan informaation ja se vaimenee ajan funktiona. FID muutetaan taajuusspektriksi matemaattisella operaatiolla, jota kutsutaan Fouriermuunnokseksi (FT). Fourier-muunnos tehdään yleensä komennolla ef. Tällä komennolla FID:iä muokataan eksponentiaalisella funktiolla ennen Fourier-muunnosta, jotta saavutettaisiin parempi signaali/kohinasuhde (resoluution kustannuksella). Komento ft tekee pelkän Fourier-muunnoksen. FID Taajuusspektri FT 6,50 6,00 5,50 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 t [s] [Hz] 18

19 10. Faasikorjaus ja pohjaviivan korjaus Detektiomenetelmästä johtuen signaalit yleensä sisältävät Fourier-muunnoksen jälkeen sekä absorptioettä dispersiokomponentteja. Normaalisti 1D NMR-spektrit esitetään absoptiomuodossa. Tämän vuoksi dispersiokomponentit poistetaan ns. faasikorjauksen avulla. Tämä tehdään yleensä automaattisesti komennolla apk. Faasikorjaus voidaan tehdä myös käsin. Yleensä faasikorjauksen jälkeen tehdään automaattinen pohjaviivan korjaus komennolla abs. Tällä komennolla poistetaan pohjaviivan vääristymät vähentämällä siitä joku sopiva polynomi. Dispersiosignaali Absorptiosignaali Faasikorjaus 19

20 11. Kalibrointi, integrointi ja tulostaminen Kalibrointi NMR-spektroskopiassa ei ole absoluuttista mitta-asteikkoa, koska resonanssiehdon seurauksena resonanssitaajuus riippuu magneettivuon tiheydestä. Tämän vuoksi käytetään ns. sisäistä standardia, joka on 1 H ja 13 C NMR:ssä yleensä tetrametyylisilaani (TMS, (CH 3 ) 4 Si). TMS:n resonanssitaajuutta merkitään sopimuksen mukaan arvolla = 0. Jos ei käytetä TMS:ää, voidaan spektri kalibroida liuottimen jäännösprotonien signaaliin. Kalibrointi aloitetaan klikkaamalla kuvaketta. Piikkien huippujen määrittäminen Piikkien huippujen ppm/hz-arvojen määrittäminen voidaan tehdä automaattisesti tai manuaalisesti (suositeltavampi). Manuaalinen huippujen määrittäminen aloitetaan klikkaamalla kuvaketta. Integrointi 1 H NMR-spektroskopiassa signaalin pinta-ala (integraali) on suoraan verrannollinen signaalin aiheuttaneiden protonien lukumäärään. Tämän johdosta integroimalla voidaan määrittää protonien suhteelliset lukumäärät molekyylissä. Se mahdollistaa seosten kvantitatiivisen analyysin ja auttaa rakennemäärityksessä. Integrointi aloitetaan klikkaamalla kuvaketta. Tulostaminen Tulostaminen aloitetaan klikkaamalla directly sekä sopiva AN-alkuinen layout. kuvaketta. Tämän jälkeen valitaan kohta Print with layout plot HUOM! Kaikki prosessoiminen ja tulostaminen tehdään omalla koneella. Suurin osa orgaanisen kemian laboratorion tietokoneista sisältää TopSpin-ohjelmiston. Tiedostot ovat siirrettävissä koneelle verkon kautta. 20

21 12. Mittauksen jälkeen Spektrometri pitää palauttaa normaalitilaan ennen poistumista NMR-laboratoriosta. Mikäli mittauksia on tehty jossain muussa kuin normaalilämpötilassa (25 C, 298 K), pitää probe palauttaa tähän lämpötilaan ennen standardinäytteen asettamista magneettiin. 1. Vaihda standardinäyte magneettiin (liuottimena CDCl 3 ) 2. Lukitse spektrometri kloroformiin 3. Optimoi Z-shimmit (topshim) jos olet käyttänyt muuta liuotinta kuin kloroformia 4. Sulje keräysikkuna 5. Avaa guest -kansiossa oleva EB-tiedosto 6. Merkitse lokikirjaan oikeaan ajankohtaan nimikirjaimesi, suoritetut mittaukset ja käytetty liuotin 7. Merkitse mahdolliset epämääräisyydet lokikirjaan ja kerro niistä mahdollisimman nopeasti JK:lle 8. Sulje (ja lukitse) ovi poistuessasi NMR-laboratoriosta 21

22 13. Normaalit 1D-mittaukset H NMR 1 H NMR-mittauksen pulssisarja koostuu relaksaatioviiveestä d1 ja radiotaajuuspulssista p1 sekä keräysajasta aq, jonka aikana FID tallennetaan. Kuvassa pulssikulma on 90. Todellisuudessa tässä pulssisarjassa käytetään 30 kulmaa. d1 on tyypillisesti muutaman sekunnin luokkaa, kun taas p1 on tyypillisesti pituudeltaan joitain mikrosekunteja. 90 x FID 1 H d1 p1 aq 1 H NMR-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_1H_routine, jossa: Pulssisarja (pulprog): zg30 Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 k Prosessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 k Skannausten lukumäärä (ns): 16 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 2 Spektrin leveys (sw): 15 ppm Spektrin keskikohta (o1p): 6.5 ppm Mittausaika (expt): n. 1 min 15 s 22

23 13. Normaalit 1D-mittaukset 13.2 Esimerkki pulssisarjasta: 1 H NMR 1. ;zg30 2. ;avance-version (00/02/07) 3. ;1D sequence 4. ;using 30 degree flip angle 5. #include <Avance.incl> 6. 1 ze 7. 2 d1 8. p1*0.33 ph1 9. go=2 ph wr #0 11. exit 12. ph1= ph31= ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default) 15. ;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse 16. ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1 Varsinainen pulssisarja Rivit 1-4: Kommentteja (alkavat puolipisteellä) Rivi 5: Avance.incl tiedosto sisältyy zg30-pulssisarjaan Rivit 6-13: Varsinainen pulssisarja ze - Muistissa oleva data korvautuu ensimmäisen skannauksen datalla. Tämän jälkeen tulevat skannaukset tallentuvat muistiin d1 - Viive p1*0.33 ph1 - Pulssi p1 * 0.33 = 30 pulssi. Pulssin faasi ph1 asetetaan go=2 ph31 - Käynnistää useita prosesseja (mm. vastaanotin aukeaa, NMR-signaalien digitointi alkaa). Kun keräys loppuu ohjelma palaa riville 7. ja prosessi toistuu ns kertaa. Vastaanottimen faasi ph31 asetetaan wr #0 - Tietokone tallentaa kerätyn datan kovalevylle Exit - Pulssisarja päättyy ph1= Lähettimen faasikierto ph31= Vastaanottimen faasikierto Rivit 14-16: Kommentteja 23

24 13. Normaalit 1D-mittaukset 13.2 Esimerkki pulssisarjasta: 1 H NMR 90 x FID 1 H FT d1 p1 aq ppm Pulssisarja zg, jossa ns = 4 ja ds = 0 p1 p1 p1 p1 d1 d1 d1 d1 ze aq aq aq aq wr#0 exit Aika 24

25 13. Normaalit 1D-mittaukset 13.3 UDEFT ( 13 C NMR) UDEFT (Uniform Driven Equilibrium Fourier Transform) on 13 C NMR-mittaus, jossa havaitaan hiiltä (kanava 1) ja samalla irrotetaan kytkennät protoneihin (kanava 2) hyödyntäen CPD-sekvenssiä (Composite Pulse Decoupling). UDEFT on korvannut perinteisen 13 C-mittauksen, koska se on selvästi jälkimmäistä herkempi menetelmä. 90 FID C d1 p1 aq p33 TAU=aq p1 p34 1 H CPD UDEFT-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_UDEFT, jossa: Pulssisarja (pulprog): udeft_an_shit Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 18 k Prosessoidun reaalisen spektrin koko (si): 64 k Skannausten lukumäärä (ns): 130 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 0 Spektrin leveys (sw): 250 ppm Spektrin keskikohta (o1p): 120 ppm Irroituksen keskikohta (o2p): 4 ppm Mittausaika (expt): n. 13 min 25

26 13. Normaalit 1D-mittaukset 13.4 DEPT 45, DEPT 90 ja DEPT 135 DEPT-eksperimentissä (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) polarisaatiota (magnetisaatiota) siirretään herkemmiltä (suoraan hiileen kytkeytyneiltä) 1 H-ytimiltä epäherkille 13 C- ytimille. Tästä seuraa, että protoneihin suoraan kytkeytyneiden hiilien signaalien intensiteetit kasvavat. Pulssissarjassa y :lle voidaan antaa arvot: 1 =45, 2 =90 ja 3 = 135, eli on mahdollista tehdä kolme erilaista eksperimenttiä, jotka ovat DEPT 45, DEPT 90 ja DEPT 135. DEPT 45 antaa positiiviset CH-, CH 2 -jach 3 -signaalit, DEPT 90 antaa pelkät positiiviset CH-signaalit ja DEPT 135 antaa positiiviset CH- ja CH 3 -signaalit sekä negatiiviset CH 2 -signaalit. 13 C 1 H 90 x 180 x FID p1 p2 90 x 180 x y d1 p3 p4 d2 CPD p0 d2 d2 aq DEPT-mittauksissa käytetyt parametrisetit ovat AN_DEPT45, AN_DEPT90 ja AN_DEPT135, joissa: Pulssisarja (pulprog): dept45, dept90 ja dept135 Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 64 k Prosessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 k Skannausten lukumäärä (ns): 220 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 8 Spektrin leveys (sw): 250 ppm Spektrin keskikohta (o1p): 120 ppm Mittausaika (expt): n. 13 min 26

27 13. Normaalit 1D-mittaukset 13.4 DEPT 45, DEPT 90 ja DEPT 135 CH-, CH 2 - ja CH 3 -signaalien intensiteetit riippuvat kulmasta : CH: I = [ ( 1 H)/( ( 13 C)]sin CH 2 : I = [ ( 1 H)/( ( 13 C)]sin2 CH 3 : I = [3 ( 1 H)/(4 ( 13 C)](sin + sin3 ) CH-Alispektri: 2 = 90 DEPT 90 ( 1 H)/ ( 13 C) CH 2 -Alispektri: DEPT 45 - DEPT 135 CH 3 -Alispektri: DEPT 45 + DEPT DEPT DEPT 45: 1 = 45 CH-, CH 2 -ja CH 3 -piikit ylöspäin DEPT 90: 2 = 90 CH-piikit ylöspäin ( 1 ) 90 ( 2 ) 135 ( 3 ) 180 y DEPT 135: 3 = 135 CH- ja CH 3 -piikit ylöspäin, CH 2 -piikit alaspäin Kvaternaariset hiilet eivät anna signaalia. 1.0 CH CH 2 CH 3 27

28 14. Esimerkki faasikierrosta: inversion recovery experiment (180 x 90 x ) z Vajaa 180 x 90 x M 0 y M -y M -y B 1 M 0 B 1 M -z M 0 x M 0 A B C D M 0 z Vajaa 180 -x 90 x M 0 B 1 M z M 0 D + H y M y M y M 0 B 1 x E F M 0 G H 28

29 15. Pulssitetut kenttägradientit 15.1 Yleistä Jos koherenssien valinnassa hyödynnetään PFG-(pulsed field gradient)tekniikaa, voidaan saavuttaa seuraavia etuja: 1. Tarvitaan vähemmän faasikiertoja erilaisten virheiden eliminoimiseksi 2. Vahvoilla näytteillä selvästi lyhyemmät mittausajat 3. 2D-Mittauksissa vähemmän t 1 -kohinaa 4. Spektrien prosessointi ja analyysi helpompaa 5. Tehokas ei-haluttujen signaalien eliminointi (esim. intensiivinen liuotinpiikki H 2 O-näytteissä) 6. Dynaaminen alue pienempi 29

30 15. Pulssitetut kenttägradientit 15.2 PFG:n vaikutus transversaaliseen magnetisaatioon PFG-tekniikassa käytetään erityisiä gradienttikeloja tuottamaan lineaarinen magneettikenttä ulkoisen kentän B 0 (Z-akselin) suunnassa. Tästä seuraa, että ytimet kokevat erilaisen magneettikentän niiden paikasta riippuen. Gradienttikenttää pidetään päällä tietty aika, jonka jälkeen se sammutetaan ja ytimet kokevat jälleen pelkän B 0 :n ja prekessoivat samalla taajuudella 0. B 0 + g n 5 5 = 0 + ( / 2 )g 5 (B 0 + g 5 ) g 5 Havaittava tilavuus = 0 + ( / 2 )g 4 (B 0 + g 4 ) 3 = 0 B 0 -g 2 g 3 = 0 g = 0 -( / 2 )g 2 (B 0 - g 2 ) 1 = 0 -( / 2 )g 1 (B 0 - g 1 ) -g 1 n = ( / 2 )(B 0 + g n ) 30

31 15. Pulssitetut kenttägradientit 15.2 PFG:n vaikutus transversaaliseen magnetisaatioon A Z B Z C Gradienttipulssin vaikutus transversaaliseen magnetisaatioon M 5 M 4 M 3 M 2 M 1 D x M 1 M 2 M n (z) = M y M 3 y y A ja C: Tilanne 90 -x -pulssin jälkeen. Viipaleiden 1-5 magnetisaatiovektoreiden summa muodostaa y -suuntaisen kokonaismagnetisaatiota kuvaavan vektorin M n, joka pyörii z-akselin ympäri nopeudella 0 (ytimien prekessiotaajuus). Pyörivä koordinaatisto pyörii samalla nopeudella M n :n kanssa. B ja D: Tilanne gradienttipulssin aikana. Vektorit, jotka muodostavat M n :n, alkavat pyöriä eri taajuuksilla n. Koordinaatisto (x ja y ) pyörii edelleen taajuudella 0,kuten myös M 3. Vektoreiden M 1 - M 5 erilaiset prekessionopeudet 1-5 johtuvat erilaisista gradienttikontribuutioista g 1 - g 5. x y x y M 5 x M 4 Gradienttipulssin aikana vektorien faasikoherenssi katoaa. Jos on riittävän pitkä (~1 ms), transversaalisen magnetisaation komponentti tuhoutuu täydellisesti, eikä vastaanottimen kelalle indusoidu signaalia. 31

32 15. Pulssitetut kenttägradientit 15.3 Gradienttikaiku Gradienttipulssi ei tuhoa transversaalista magnetisaatiota peruuttamattomasti, päinvastoin kuin epähomogeenisen magneettikentän aiheuttamat satunnaiset kenttägradientit. Gradienttikaiku -eksperimentti A: Pulssisarja. B: Viipaleen n transversaalisen magnetisaation käyttäytyminen. A 90 -x Kaiku FID Jos spinsysteemiin kohdistetaan gradienttipulssin jälkeen toinen samanlainen, mutta vastakkaismerkkinen gradienttipulssi, saadaan spinit jälleen refokusoitua transversaalisen magnetisaation vektorit M n osoittavat y -suuntaan, kuten ensimmäisen 90 -x -pulssin jälkeen gradienttikaiku indusoituu vastaanottimen kelalle. a G b -G c B a b c = 0 = 2 ( n - 0 ) = 2 ( 0 - n ) y y y x x x 32

33 15. Pulssitetut kenttägradientit 15.4 Spinkaiku gradienteilla Spinkaiku -eksperimentti A: Spinkaikueksperimentin pulssisarja, jossa käytetään gradienttipulsseja (gs = gradient selected). A 90 -x 180 -y FID B: Viipaleen 5 transversaalisen magnetisaation M 5 käyttäytymistä kuvaavat vektoridiagrammit. c d t t a c d f y y G 1 G 2 b e x x B a b e f M 5 M 5 y y y y x x x x 33

34 16. Selektiivinen eksitaatio: Double-Pulsed-Field- Gradient Spin-Echo (DPFGSE) DPFGSE-sekvenssin avulla voidaan valita selektiivisesti vain yksi resonanssi useiden signaalien joukosta. 90 -Pulssi kääntää kaikki magnetisaatiot transversaaliselle x,y -tasolle. Ensimmäinen gradientti G 1 tuhoaa kaikkien magnetisaatioiden faasikoherenssin. Jatkossa selektiivinen pulssi kääntää vain valitun magnetisaation. Tästä seuraa, että toisen gradientin G 1 jälkeen vain valittu magnetisaatio refokusoituu. Kaikkien muiden magnetisaatioiden faasit puolestaan menevät vielä enemmän sekaisin. Ensimmäistä gradienttispinkaikua (G 1 selektiivinen 180 G 1 )seuraatoinen(g 2 selektiivinen 180 G 2 ), jossa gradienttien G 2 voimakkuus on eri kuin gradienttien G 1. Kahden peräkkäisen gradienttispinkaiun ansiosta saavutetaan halutun signaalin faasivirheistä vapaa selektiivinen eksitaatio. DPFGSE-sekvenssi sopii erinomaisesti selektiivisten 1D-pulssisarjojen ensimmäiseksi elementiksi. 90 Selektiivinen 180 Selektiivinen H Grad. G 1 G 1 G 2 G 2 34

35 17. Selektiiviset 1D-mittaukset 17.1 Yleistä Selektiivinen 1D-mittaus on usein parempi valinta kuin vastaava 2D-mittaus: 1. 1D-spektrien analyysi antaa usein luotettavampia tuloksia 2. Korkeampi digitaalinen resoluutio 3. Lyhyemmät keräys- ja prosessointiajat 4. Pienemmät tiedostokoot 5. Joissain tapauksissa gradientteja voidaan käyttää menettämättä mittausherkkyyttä 6. 1D-mittaukset erittäin käyttökelpoisia kun halutaan vain rajoitettu määrä informaatiota 35

36 17. Selektiiviset 1D-mittaukset D COSY 1D COSY (COrrelation SpectroscopY) on vastaavan 2D-mittauksen selektiivinen 1D-versio. Tässä mittauksessa 2D-version ensimmäinen 90 -pulssi on korvattu DPFGSE-sekvenssillä, jolloin mitataan täyden 2D-matriisin sijaan vain yksi rivi. Näin ollen spektrissä nähdään vain ne signaalit, joihin selektiivisesti valittu signaali on spin-spin-kytkeytynyt. Viive d2 määrittää säteilytettyyn signaaliin kytkeytyneiden signaalien intensiteetin. Saattaa olla tarpeellista tehdä mittaus kahdesti eri d2-arvoilla (30 60 ms), jotta voitaisiin tunnistaa sekä pienen että suuren kytkeytymisvakion omaavat kytkeytymiskumppanit. 1/(2J HH ) Selektiivinen Selektiivinen FID 1 H d1 p1 p12 p12 d2 p1 aq Grad. G 6 G 1 G 2 G 3 G 4 G 5 36

37 17. Selektiiviset 1D-mittaukset D COSY Signaali antifaasissa 1D COSY-spektrissä säteilytetty protoni antaa normaalin absorptiosignaalin. COSY-Signaaleissa aktiivinen kytkeytyminen näkyy antifaasirakenteena. Gradienttien aiheuttamasta lineaarisesta faasisiirtymästä johtuen faasikorjaus on tehtävä kaikille signaaleille erikseen. Normaali signaali 1D COSY-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_1D_COSY, jossa: Pulssisarja (pulprog): dpfgse-cosy Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 k Prosessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 k Skannausten lukumäärä (ns): 32 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 4 Spektrin leveys (sw): 10 ppm (optimoidaan) Spektrin keskikohta (o1p): 5 ppm (optimoidaan; viritettävän signaalin keskikohta) Selektiivinen 180 -pulssi (p12): 80 ms (viritettävän alueen leveys n Hz) Selektiivisen pulssin vaimennus (sp2): 65 db Viive 1/(2J HH ) (d2): 50 ms (vastaa 10 Hz-kytkeytymisvakiota) Mittausaika (expt): n. 4 min Selektiivisen 180 -pulssin (p12) kestoa voidaan vaihdella halutun selektiivisyyden mukaan. Tällöin myös vaimennus (sp2) muuttuu. 37

38 17. Selektiiviset 1D-mittaukset D TOCSY 1D TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) on vastaavan 2D-mittauksen selektiivinen 1D-versio. Tässä mittauksessa 2D-version ensimmäinen 90 -pulssi on korvattu DPFGSE-sekvenssillä, jolloin mitataan täyden 2D-matriisin sijaan vain yksi rivi. Näin ollen spektrissä nähdään vain ne signaalit, joihin selektiivisesti valittu signaali on spin-spin-kytkeytynyt. 1D TOCSY-mittaus sisältää kaksi ZQF-sekvenssiä (Zero-Quantum Filter), joiden avulla spektristä voidaan suodattaa dispersiivisiä antifaasikomponentteja (vääristyneitä signaaleja). 1D TOCSY-spektristä saadaan sama informaatio kuin 1D COSY-spektristä. Lisäksi korrelaatioita havaitaan sellaisten protonien välillä, jotka eivät ole kytkeytyneet suoraan toisiinsa, mutta sijaitsevat samassa spinsysteemissä. TOCSY-Spinlukon kestoaika d9 määrittää kuinka pitkälle spin-spin-kytkeytynyttä verkostoa tutkitaan. Lyhyillä d9:n arvoilla (20 40 ms) mittaus antaa saman informaation kuin 1D COSY. Pidemmillä arvoilla ( ms) voidaan havaita kytkeytymisiä saman spinsysteemin kaukaisempiin protoneihin. 90 Selektiivinen 180 Selektiivinen Smoothed Chirp (ZQF) Spinlukko DIPSI-2 Smoothed Chirp (ZQF) 90 FID 1 H d1 p1 p12 p12 p1 p32 p34 p1 aq Grad. G 1 G 1 G 2 G 2 G 0 G 3 G 0 38

39 17. Selektiiviset 1D-mittaukset D TOCSY 1D TOCSY-spektrissä sekä säteilytetyn signaalin että TOCSY-signaaleiden faasit korjataan positiivisiksi. 1D TOCSY-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_1D_TOCSY, jossa: Pulssisarja (pulprog): dpfgse-zqf-tocsy_dipsi2 Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 k Prosessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 k Skannausten lukumäärä (ns): 128 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 4 Spektrin leveys (sw): 10 ppm (optimoidaan) Spektrin keskikohta (o1p): 5 ppm (optimoidaan; viritettävän signaalin keskikohta) Selektiivinen 180 -pulssi (p12): 80 ms (viritettävän alueen leveys n Hz) Selektiivisen pulssin vaimennus (sp2): 65 db Sekoitusaika (d9): 80 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan) Mittausaika (expt): n. 14 min Selektiivisen 180 -pulssin (p12) kestoa voidaan vaihdella halutun selektiivisyyden mukaan. Tällöin myös vaimennus (sp2) muuttuu. 39

40 17. Selektiiviset 1D-mittaukset D NOESY, 1D ROESY ja 1D off-resonance ROESY 1D NOESY/ROESY/off-resonance ROESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY/Rotating-frame Overhauser Effect SpectroscopY) mittauksissa yhden protonin/protoniryhmän selektiivinen säteilyttäminen aiheuttaa intensiteetin muutoksen muissa signaaleissa. Tämä intensiteetinmuutos on verrannollinen spinien välisen avaruudellisen etäisyyden käänteiseen kuudenteen eksponenttiin (1/r 6 ). Ts. 1D NOESY/ROESY/off-res-ROESY-spektrissä säteilytettyä signaalia avaruudellisesti lähellä sijaitsevat protonit antavat NOE/ROE-signaalin. 1D NOESY-mittauksessa parametri d8 määrittää sekoitusajan pituuden, jonka aikana NOE:n kehittyminen tapahtuu. 1D ROESY/off-res-ROESY-mittauksissa vastaava parametri on p15, joka määrittää spinlukon kestoajan. 1D NOESY-mittaus sisältää ZQF-sekvenssin, joka suodattaa spektristä dispersiivisiä antifaasikomponentteja (vääristyneitä signaaleja). Off-resonance ROESY-mittauksessa spinlukkoon käytetään trapetsoidin muotoista pulssia, joka on kohdistettu kauas sivuun spektrin keskikohdasta. Off-resonance ROESY on tavallaan NOESY- ja ROESYmittausten kombinaatio, jossa normaalissa ROESY-mittauksessa esiintyvät HOHAHA(HOmonuclear HArtmann-HAhn)-tyyppiset ja off-resonance-virheet ovat tehokkaasti eliminoitu. 40

41 17. Selektiiviset 1D-mittaukset D NOESY, 1D ROESY ja 1D off-resonance ROESY 1D NOESY 90 Selektiivinen 180 Selektiivinen Smoothed Chirp (ZQF) 90 FID 1 H d1 p1 p12 p12 p1 p32 p1 aq d8 Grad. 1D ROESY G 1 Selektiivinen G 1 G 2 G 2 G 0 G 3 FID 90 Selektiivinen CW- 180 Spinlukko CW- Spinlukko 90 FID 1 H d1 p1 p12 p12 p15 aq p1 p15 p1 aq Grad. G 1 G 2 G 3 G 4 1D offresonance ROESY 41

42 17. Selektiiviset 1D-mittaukset D NOESY, 1D ROESY ja 1D off-resonance ROESY 1D NOESY/ROESY-spektrissä säteilytetyn signaalin faasi korjataan negatiiviseksi, jolloin todelliset NOE/ROEpiikit ovat positiivisia. 1D NOESY/ROESY-mittauksissa käytettävät parametrisetit ovat AN_1D_NOESY, AN_1D_ROESY ja AN_1D_off-res-ROESY, joissa: Pulssisarja (pulprog): dpfgse-zqf-noe_jk (NOESY), selrogp.5 (ROESY) ja dpfgse-troesy (off-res-roesy) Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 k Prosessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 k Skannausten lukumäärä (ns): 128 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 4 Spektrin leveys (sw): 10 ppm (optimoidaan) Spektrin keskikohta (o1p): 5 ppm (optimoidaan; viritettävän signaalin keskikohta) Selektiivinen 180 -pulssi (p12): 80 ms (viritettävän alueen leveys n Hz) Selektiivisen pulssin vaimennus (sp2): 65 db NOE-Sekoitusaika (d8): 500 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan) ROE-Spinlukko (p15): 500 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan) Mittausaika (expt): Kaikki n. 15 min Selektiivisen 180 -pulssin (p12) kestoa voidaan vaihdella halutun selektiivisyyden mukaan. Tällöin myös vaimennus (sp2) muuttuu. Off-resonance ROESY-mittausta varten lasketaan spinlukon siirtymä [Hz] kaavalla SL = (B 1 /tan ) + O1 jossa B 1 = herätekentän taajuus [5107 Hz], tan =45 =1ja O1 =spektrinkeskikohta[hz]. SL ja O1 kirjataan taajuuslistaan, jota pulssisarja lukee mittauksen aikana. 42

43 17. Selektiiviset 1D-mittaukset 17.5 SELINCOR SELINCOR(SELective INverse H,C CORrelation)-mittaus tuottaa 1D-protonispektrin, jossa näkyvät ainoastaan ne protonit, jotka ovat kytkeytyneet suoraan ( 1 J CH ) selektiivisesti säteilytettyyn 13 C-ytimeen. 1/(4 1 J CH ) 1/(4 1 J CH ) 1/(4 1 J CH )1/(4 1 J CH ) Spinlukko FID 1 H d1 p1 d4 p2 d4 p1 p28 p1 d4 p2 d Selektiivinen aq 13 C CPD p4 p3 p14 p3 p4 Grad. G 3 G 5 G 1 G 2 G 4 43

44 17. Selektiiviset 1D-mittaukset 17.5 SELINCOR SELINCOR-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_SELINCOR, jossa: Pulssisarja (pulprog): selincorgp Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 k Prosessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 k Skannausten lukumäärä (ns): 256 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16 Spektrin leveys (sw): 15 ppm Spektrin keskikohta 1 H(o1p): 6.5 ppm Spektrin keskikohta 13 C(o2p): 50 ppm (optimoidaan, viritettävän signaalin keskikohta) Mittausaika (expt): n. 22 min 44

45 18. Erittäin selektiiviset pseudo-2d-mittaukset Erittäin selektiiviset pseudo-2d-mittaukset hyödyntävät CSSF(Chemical Shift Selective Filter)-sekvenssiä. CSSF:n avulla voidaan selektiivisesti valita yksi signaali useiden päällekkäisten signaalien joukosta, vaikka valitun signaalin ja muiden signaalien välisen kemiallisen siirtymän ero on vain muutaman Hertsin (Hz) luokkaa. Normaaleissa selektiivisissä 1D-mittauksissa tämän eron pitää olla vähintään noin 30 Hz, eivätkä signaalit saa olla päällekkäin. Onnistuneella CSSF-mittauksella on kaksi edellytystä: (1) Valitulla signaalilla tulee olla erillinen kemiallinen siirtymä, sillä CSSF ei pysty erottelemaan kahta saman siirtymän omaavaa signaalia. (2) Valitun signaalin kemiallinen siirtymä on tunnettava tarkasti. Vaikka edellämainut edellytykset toteutuvatkin, saattaa CSSFmittaus silti antaa valitun signaalin naapuripiikeistä johtuvia heikkoja signaaleja. NMR-manuaalista löytyy kolme CSSF-mittausta: CSSF-TOCSY, CSSF-NOESY ja CSSF-off-res-ROESY. Nämä mittaukset ovat CSSF-sekvenssiä lukuunottamatta identtisiä vastaavien selektiivisten 1D-mittausten kanssa (antavat saman informaation). 45

46 18. Erittäin selektiiviset pseudo-2d-mittaukset DPFGSE-CSSF-sekvenssi Selektiivinen 180 Selektiivinen H d1 p1 d21 p2 p12 d21 p Grad. G 1 G 1 G 2 G 2 46

47 18. Erittäin selektiiviset pseudo-2d-mittaukset CSSF-mittauksissa käytettävät parametrisetit ovat AN_CSSF-TOCSY, AN_CSSF-NOESY ja AN_CSSFoff-res-ROESY. CSSF-mittausten parametrit ovat lähes identtisiä vastaavien selektiivisten 1Dmittausten parametrien kanssa. Suurin ero on CSSF-mittausten F 1 -dimensio, jonka ansiosta CSSF-mittaus antaa samanlaisen korrelaatiokartan kuin 2D-mittaukset. CSSF-spektri kuitenkin prosessoidaan 1Dspektriksi. Tästä nimitys pseudo-2d-mittaus. CSSF-sekvenssin optimaalinen kesto, t max, voidaan laskea yhtälöllä t max = 0.5/ jossa = valitun signaalin ja lähimmän naapurisignaalin välinen ero Hertseinä (Hz). Yleensä t max asetetaan pidemmäksi kuin laskettu arvo. Näin huomioidaan relaksaation vaikutukset. CSSF:n kestoa voidaan pidentää/lyhentää muuttamalla CSSF-inkrementtien määrää, eli muuttamalla kerättyjen datapisteiden määrää (td) F 1 -suunnassa (oletusarvo 8). Myös viiveellä d21 (oletusarvo 1 ms) sekä kyseisen viiveen inkrementillä in21 (oletusarvo 10 ms) voidaan vaikuttaa CSSF-sekvenssin kestoaikaan. 47

48 19. 2D NMR 19.1 Yleistä 1D NMR-spektroskopiassa taajuudet (kemialliset siirtymät) ovat x-akselilla ja intensiteetit y-akselilla. 2D NMR:ssä molemmilla taajuusakseleilla voi olla kemialliset siirtymät, jolloin puhutaan (siirtymä)korrelaatiospektristä. 2D-spektriä, jossa toisella taajuusakselilla on kemialliset siirtymät ja toisella kytkentävakiot, kutsutaan J -resolvoiduksi 2D spektriksi. Intensiteetit ovat z-akselilla (tavallaan kolmas ulottuvuus). Kahdesta em. spektristä korrelaatiospektrit ovat tärkeämpiä. 2D-menetelmät voivat perustua ydindipolien välisiin skalaarisiin (esim. COSY) tai dipolaarisiin (esim. NOESY) kytkentöihin. Magnetisaation siirto voi tapahtua myös kemiallisen vaihdon kautta (esim. EXSY), jolloin kyseessä on dynaaminen 2D NMR-spektroskopia. 2D NMR-spektri saadaan, kun mitataan sarja 1D NMR-spektrejä. Nämä yksittäiset 1D-spektrit eroavat toisistaan vain pulssisarjaan sisälletyn aikainkrementin verran. 2D-mittauksen pulssisarjoista voidaan löytää neljä erilaista aikajaksoa: valmistelu, evoluutio, sekoitus ja havaitseminen. 48

49 19. 2D NMR 19.1 Yleistä Valmistelu Evoluutio Sekoitus Havaitseminen FID t 1 t 2 Valmistelu: Spinsysteemi relaksoituu, jonka jälkeen sitä häiritään ainakin yhdellä radiotaajuuspulssilla. Evoluutio (t 1 ) Spinsysteemi kehittyy vapaasti eri vuorovaikutusten alaisena, joita ovat esim. Larmor-prekessio tai spinspinkytkeytyminen. t 1 -jakson pituutta muutetaan systemaattisesti (inkrementoidaan) 2D NMR-kokeen aikana. Sekoitus ( ) Sisältää pulsseja ja viiveitä. Sekoitusajan pituus pidetään vakiona. Havaitseminen (t 2 ) FID-signaali havaitaan. 1D-NMR:ssä tätä jaksoa kutsutaan keräämiseksi. 49

50 19. 2D NMR 19.1 Yleistä Primaarinen 2D-matriisi muodostuu sarjasta FID-signaaleja. Ensimmäinen Fourier-muunnos t 2 :n suhteen tuottaa sarjan 1Dspektrejä, joiden signaaleilla voi olla erilainen amplitudi ja/tai faasi. Toinen Fourier-muunnos t 1 :n suhteen antaa lopullisen 2D-matriisin, jossa on taajuusakselit F 1 ja F 2. Esimerkkinä kloroformin ( 13 CHCl 3 ) kuvitteellisen J -resolvoidun 2D NMR-eksperimentin tuottama spektri. F 2 - akselilla hiilen kemiallinen siirtymä ( 13 C) = 77.7 ja F 2 -akselilla kytkentävakio 1 J (C,H) = 206 Hz. 2D-spektrit voidaan esittää joko contour plot-tyylillä (A, spektri suoraan ylhäältäpäin katsottuna) tai stacked plottyylillä (B, sarja F 2 -spektrejä erilaisilla F 1 -arvoilla päällekkäin pinottuna), joista ensin mainittu on selvästi informatiivisempi. S (t 1, t 2 ) S (t 1, F 2 ) A S (F 1, F 2 ) t t F n FT 2. FT -100 [Hz] t 2 F 2 ( 13 C) 77.7 F 2 B F 1 [Hz] ( 13 C) 77.7 F

51 19. 2D NMR 19.1 Yleistä S (t 1, F 2 ) t 1 S (F 1, F 2 ) 51

52 19. 2D NMR 19.1 Yleistä 1D NMR:ssä käytetään normaalisti quadrature-detektiota. Siinä kantoaalto on asetettu spektrin keskelle. Alkuperäinen NMR-signaali on jakautunut kahteen osaan ja sitä havaitaan kahdella detektorilla, joiden faasiero on 90. Nämä detektorit tuottavat NMR-signaalin sini- ja kosinikomponentit. NMRsignaalin taajuus eroaa kantoaallon taajuudesta jonkin tietyn taajuuden verran. Tämän taajuuseron etumerkki kantoaallon suhteen voidaan määrittää yhtäaikaisella tai perättäisellä sini- ja kosinikomponenttien keräämisellä. Sini FT + Kosini FT 2D NMR-spektroskopiassa ei ole detektoria F 1 -suunnassa. Tämän vuoksi F 1 -suunnassa taajuuksien etumerkit määritetään etukäteen F 2 -suunnassa tapahtuvan keräyksen aikana. Signaalin etumerkin määrittäminen F 1 -suunnassa perustuu yksittäisten F 2 -suunnassa saatujen FID:ien faasikierrätykseen (phase cycling) jokaisen 1 t -inkrementin aikana. Koherenssipolut voidaan valita myös pulssitettujen kenttägradienttien (PFG) avulla. Tällöin faasikiertoa ei tarvita. 52

53 19. 2D NMR 19.1 Yleistä On tärkeää tietää, onko 2D NMR-spektri faasisensitiivinen vai ei. Faasisensitiiviselle spektrille pitää tehdä faasikorjaus, kun taas ei-faasisensitiiviselle spektrille (eli ns. magnitude-spektrille) sitäeitehdä. Faasisensitiivisyys riippuu siitä, miten faasikierron tuottamia sini- ja kosinikomponentteja käsitellään mittauksen aikana. Faasisensitiivisessä menetelmässä faasikierto tuottaa evoluutioajan t 1 suhteen sini- ja kosinikomponentit, jotka talletetaan erikseen. Tämän jälkeen tehtävä reaalinen Fourier-muunnos havaitsee taajuuksien etumerkit ja signaalien faasit. Tämä on lähes samanlainen menetelmä kuin 1D-NMR:ssä ja voidaan tehdä yhtäaikaa (RSH, Ruben-States-Haberkorn) tai perättäisesti (TPPI, Time Proportional Phase Increment). Ei-faasisensitiivisessä menetelmässä faasikierron tuottamia sini- ja kosinikomponentteja ei talleteta erikseen. Kompleksinen Fourier-muunnos havaitsee tälläkin kertaa taajuuksien etumerkit. Tuloksena on kuitenkin vääristyneitä signaaleja, jotka sisältävät sini- ja kosinikomponentteja molemmissa dimensioissa. Sen vuoksi nämä spektrit prosessoidaan yleensä magnitude-menetelmällä. Gradienttivalittu 2D-spektri ei ole faasisensitiivinen, jos gradienttipulsseja on käytetty evoluutioajan t 1 aikana. Faasisensitiivisen spektrin etuna on, että siinä korrelaatiopiikkien viivanmuoto voidaan esittää puhtaalla absorptiolla sekä F 1 - että F 2 -suunnassa. Tästä seuraa, että faasisensitiivisellä spektrillä on korkeampi resoluutio kuin muuten ulkomuodoltaan samanlaisella magnitude-spektrillä. Magnitudesignaalin viivanmuoto on leveämpi kuin puhtaan absorptiopiikin viivanmuoto. Faasisensitiivisen spektrin haittana puolestaan on faasikorjaukseen kuluva aika. Kurssin perustana olevassa Bruker Avance DPX400-spektrometrin manuaalissa DQF-COSY, TOCSY, NOESY/gs-NOESY, ROESY/T-ROESY/off-res-ROESY, HSQC ja G-BIRD-HSQMBC ovat faasisensitiivisiä 2Dmittauksia. 53

54 19. 2D NMR 19.2 Normaalin 2D-mittauksen kulku 1. Mittaa tarvittava(t) 1D spektri(t) ja määritä optimaalinen mittausalue, spektrin keskikohta, kalibrointiparametri(t) ja tarvittaessa kirjoita ylös 1D-mittauksen antama vastaanottimen taso 2. Luo uusi tiedosto ja valitse oikea 2D-parametrisetti 3. (Tarvittaessa tuning ja matching) 4. Jos olet mitannut 1D spektri(t) ennen tätä NMR-sessiota, lukitse ja shimmaa Z-shimmit (topshim, ilman näytteen pyöritystä). Tarvittaessa XY-shimmit manuaalisesti 5. Aseta oikeat keräysparametrit AcquPars-valikossa ja prosessointiparametrit ProcPars-valikossa 6. Pysäytä spinneri (jos ei pysäytetty kohdassa 4.) 7. Tee automaattinen vastaanottimen tason säätö (mikäli tasoa ei asetettu kohdassa 5.) 8. Käynnistä mittaus 9. Tee Fourier-muunnos ja automaattinen pohjaviivan korjaus 10. Aseta 1D-projektiot 11. Tee faasikorjaus, jos kyseessä on faasisensitiivinen 2D-spektri (pohjaviivan korjaus faasikorjauksen jälkeen) 12. Tee manuaalinen kalibrointi, mikäli tarpeellista 13. (Tulosta spektri) 54

55 19. 2D NMR 19.3 COSY ja DQF-COSY 1 H, 1 H COSY on homonukleaarinen 2D-menetelmä, jossa spin-spinkytkeytyneet protonit antavat korrelaatiopiikin. 1D NMR-spektri (yhdisteen normaali 1 H spektri) esiintyy 2D-spektrin diagonaalilla ja korrelaatiopiikit symmetrisesti diagonaalin molemmilla puolilla 1D-spektrin projektiot a b c c b Diagonaali F 1 a Korrelaatiopiikki F 2 55

56 19. 2D NMR 19.3 COSY ja DQF-COSY COSY:ssä käytetään gradienttivalintaa halutun koherenssipolun valitsemiseen (korvaa faasikierron), jolloin tarvitaan periaatteessa vain yksi skannaus yhtä t 1 -inkrementtiä kohden. Tästä on seurauksena lyhyempi mittausaika kuin ei-gradienttivalitulla eksperimentillä. DQF(Double Quantum Filtered)-COSY:ssä gradienttipulssit toimivat kaksoiskvanttisuodattimina. Edelleen tarvitaan vain yksi skannaus per t 1 - inkrementti. Alla on esitetty COSY:n (A) ja DQF-COSY:n (B) pulssisarjat. A H t 1 t 2 d1 p1 d0 p0 aq Grad. G 1 G 2 B H t 1 t 2 d1 p1 d0 p1 p2 p1 p2 aq Grad. G 1 G 2 56

57 19. 2D NMR 19.3 COSY ja DQF-COSY DQF-COSY:llä on joitain etuja normaaliin COSY:yn verrattuna: 1. DQF-eksperimentti on faasisensitiivinen, ja sillä on siten korkeampi resoluutio kuin muuten saman informaation antavalla magnitude-spektrillä (COSY) 2. DQF-spektrissä diagonaalipiikit ovat pienempiä kuin normaalissa COSY-spektrissä 3. Kaksoiskvanttisuodatin eliminoi voimakkaat signaalit. Vain kaksoiskvanttisiirtymistä (double quantum transfer) johtuvat piikit näkyvät selkeästi. Yksikvanttisiirtymistä (single quantum tranfer) aiheutuvat signaalit eivät pääse suodattimen läpi. Spinsysteemin täytyy sisältää vähintään kaksi kytkeytynyttä spiniä (esim. AX, AB,...), jotta piikit saataisiin näkyviin. Tämä tarkoittaa sitä, että esim. liuottimen 1 H-jäännöspiikit, jotka eivät ole homonukleaarisesti J -kytkeytyneet, eivät näy spektrissä (mm. veden häiritsevä signaali saattaa kadota) DQF-COSY:n haittana on sen epäherkkyys normaaliin COSY-mittaukseen verrattuna (pidempi mittausaika). Myös prosessointiin (faasikorjaus) kuluvaa aikaa voidaan pitää haittana. 57

58 19. 2D NMR 19.3 COSY ja DQF-COSY COSY-spektrille ei tehdä faasikorjausta. DQF-COSY-spektrin faasikorjauksessa tarkastellaan korrelaatiopiikkejä (ei diagonaalipiikkejä), jotka korjataan puhtaiksi absorptiosignaaleiksi. Aktiivinen kytkeytyminen näkyy antifaasirakenteena, joten multipletteja ei voi korjata siten, että kaikki piikit olisivat positiivisia. COSY-mittauksissa käytetyt parametrisetit ovat AN_COSY ja AN_DQF-COSY, joissa: Pulssisarja (pulprog): cosygpqf (COSY) ja cosygpmfph (DQF-COSY) Kerättyjen datapisteiden määrä F 2 (td): 2 k Kerättyjen datapisteiden määrä F 1 (td): 256 (COSY) ja 512 (DQF-COSY) Prosessoidun reaalisen spektrin koko F 1 + F 2 (si): 1 k (COSY) ja 2 k (DQF-COSY) Skannausten lukumäärä (ns): 2 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16 Spektrin leveys F 1 + F 2 (sw): 8 ppm (optimoidaan) Spektrin keskikohta (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan) Mittausaika (expt): n. 17 min (COSY) ja n. 1 h (DQF-COSY) 58

59 19. 2D NMR 19.4 TOCSY 1 H, 1 H TOCSY-spektri antaa saman informaation kuin COSY. Lisäksi korrelaatioita havaitaan sellaisten protonien välillä, jotka eivät ole kytkeytyneet suoraan toisiinsa, mutta sijaitsevat samassa spinsysteemissä. TOCSY-spinlukon kestoaika d9 määrittää kuinka pitkälle spin-spin-kytkeytynyttä verkostoa tutkitaan. Lyhyillä d9:n arvoilla (20 40 ms) mittaus antaa saman informaation kuin COSY. Pidemmillä arvoilla ( ms) voidaan havaita kytkeytymisiä saman spinsysteemin kaukaisempiin protoneihin. Kuten 1D TOCSY, 2D TOCSY-mittaus sisältää kaksi ZQF-sekvenssiä (Zero-Quantum Filter), joiden avulla spektristä voidaan suodattaa dispersiivisiä antifaasikomponentteja (vääristyneitä signaaleja). TOCSY:ssä 1D NMR-spektri esiintyy 2D-spektrin diagonaalilla ja korrelaatiopiikit symmetrisesti diagonaalin molemmilla puolilla Smoothed Chirp (ZQF) Spinlukko DIPSI-2 Smoothed Chirp (ZQF) 90 1 H t 1 t 2 d1 p1 d0 p1 p32 p34 p1 aq Grad. G 0 G 1 G 0 59

60 19. 2D NMR 19.4 TOCSY TOCSY-spektrissä diagonaalipiikit korjataan positiivisiksi. Tällöin myös todelliset TOCSY-signaalit ovat positiivisia. TOCSY-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_TOCSY, jossa: Pulssisarja (pulprog): zqf-tocsy_dipsi2 Kerättyjen datapisteiden määrä F 2 (td): 2 k Kerättyjen datapisteiden määrä F 1 (td): 256 Prosessoidun reaalisen spektrin koko F 1 + F 2 (si): 1 k Skannausten lukumäärä (ns): 8 Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16 Spektrin leveys F 1 + F 2 (sw): 8 ppm (optimoidaan) Spektrin keskikohta (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan) Sekoitusaika (d9): 80 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan) Mittausaika (expt): n. 1h 25 min 60

61 19. 2D NMR 19.5 NOESY ja gs-noesy NOESY(Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY)-mittauksessa avaruudellisesti lähellä toisiaan olevat (dipoli-dipolikytkeytyneet) ytimet antavat spektrissä korrelaatiopiikin. NOEn etumerkki riippuu molekyylin korrelaatioajasta C. Seurauksena on, että NOESY-mittauksessa molekyylien, joiden molekyylipaino on luokkaa , korrelaatiopiikit saattavat kadota. Tällöin voi vaihtoehtoisesti kokeilla ROESY-mittausta. NMR-manuaalista löytyy kaksi NOESY-mittausta: standardi NOESY ja gradienttivalittu gs-noesy, joista saadaan sama informaatio. Kuten 1D NOESY, standardi 2D-NOESY-mittaus sisältää ZQF-sekvenssin, joka suodattaa spektristä dispersiivisiä antifaasikomponentteja (vääristyneitä signaaleja). Tämän vuoksi standardi NOESY on parempi valinta, vaikka gs-noesy:llä onkin selvästi lyhyempi mittausaika. NOESY:ssä 1D NMR-spektri esiintyy 2D-spektrin diagonaalilla ja korrelaatiopiikit sijaitsevat symmetrisesti diagonaalin molemmilla puolilla. 61