NEILIKKAÖLJY KALOJEN NUKUTUSAINEENA

NEILIKKAÖLJY KALOJEN NUKUTUSAINEENA KAL415 Kirjallisuuskatsaus 1ov Petri Hoskonen Jyväskylän yliopisto, Bio- ja ympäristötieteiden laitos, Kalatalouden osasto

2 Sisällysluettelo TIIVISTELMÄ...3 1. MIKSI KALOJA NUKUTETAAN...4 2. MITEN KALOJA NUKUTETAAN...4 3. YLEISIMMIN KÄYTETYT NUKUTUSAINEET...6 3.1. MS-222...7 3.2. Hiilidioksidi...7 4. NEILIKKAÖLJY NUKUTUSAINEENA...8 KIRJALLISUUS...11

3 TIIVISTELMÄ Yleisimmin käytetyt nukutusaineet kaloille ovat MS-222 ja hiilidioksidi. Näiden käyttöön liittyy kuitenkin ongelmia etenkin kenttätöissä. MS-222:lla nukutettuja kaloja on pidettävä karanteenissa kolme viikkoa ennen ihmisravinnoksi käyttämistä tai luonnonvesistöön vapauttamista. Hiilidioksidi puolestaan on kenttäoloissa varsin vaikeakäyttöinen, eikä sillä saada aikaiseksi kovin syvää nukutusta. Kalabiologisissa tutkimuksissa ja kalanviljelyssä olisi siis tarvetta uudelle nukutusaineelle, joka olisi turvallinen niin ihmisille, luonnolle kuin kaloillekin ja olisi tehokas ja helppokäyttöinen. Neilikkaöljy on lupaava, toistaiseksi varsin vähän käytetty nukutusaine. Neilikkaöljy on neilikkapuusta tislaamalla saatava luonnontuote, jonka vaikuttava aine on eugenol. Se ei aiheuta vaaraa käyttäjille, kaloille eikä luonnolle, se on tehokas ja edullinen nukutusaine. Keskimääräiset toipumisajat neilikkaöljynukutuksesta ovat usein pidempiä kuin muita nukutusaineita käytettäessä ja joillakin kalayksilöillä toipumisaika voi olla poikkeuksellisen pitkä. Eugenolin suurimmat haitat ovat sen valoherkkyys ja heikko liukenevuus alle 15 C veteen, mutta näistä aiheutuvat ongelmat voidaan välttää neilikkaöljyn oikeanlaisella säilytyksellä ja sekoittamalla neilikkaöljy etanoliin.

4 1. MIKSI KALOJA NUKUTETAAN Nukutusaineita käytetään yleisesti kalanviljelyssä ja kalabiologisissa tutkimuksissa. Nukutusaineiden käyttö on usein välttämätöntä kalojen stressaantumisen ja vahingoittumisen minimoimiseksi erilaisten käsittelyjen, mm. mädin tai maidin lypsämisen, merkinnän, punnituksen tai mittauksen aikana. Nukutusaineita käytetään myös apuna mm. kerättäessä kaloja vuorovesilammikoista (Griffiths, 2000) ja muista pienistä vesimuodostumista. Kalakuljetusten yhteydessä voidaan käyttää mietoja nukutusaineliuoksia kalojen rauhoittamiseksi etenkin pidemmillä matkoilla. 2. MITEN KALOJA NUKUTETAAN Anesteesia (engl. anaesthesia) on biologinen tila, jossa jokin ulkoinen tekijä aiheuttaa osittaisen tai täydellisen tunnottomuuden ja tahdonalaisen hermoston toimimattomuuden (Summerfelt & Smith, 1990). Anesteesian vaiheet ovat induktio, ylläpito ja virkoaminen (Ross & Ross, 1999). Induktiovaiheessa kala on usein hyperaktiivinen muutaman sekunnin ajan ennen rauhoittumista nukutusaineen kalaa ärsyttävistä ominaisuuksista johtuen. Induktiovaiheen tulisi olla mahdollisimman lyhyt ja tapahtua mielellään ilman hyperaktiivisuusvaihetta. Nukutuksen ylläpito tarkoittaa saavutetun tilan pidentämistä ilman kalaan kohdistuvaa haittaa. Yleensä tämä voidaan toteuttaa induktiovaihetta pienemmällä nukutusaineen pitoisuudella. Virkoamisvaiheessa nukutusaine poistuu kalan elimistöstä ja se palaa normaalitilaan. Vaiheen tulisi olla lyhyt ja tapahtua ilman sivuvaikutuksia. Nukutusaineet (engl. anaesthetics) ovat kemiallisia tai fysikaalisia tekijöitä, jotka aiheuttavat ensin eliön rauhoittumisen, sitten järjestyksessä tasapainon, liikekyvyn, tajunnan ja lopulta refleksitoiminnan menetyksen kun eliö altistuu suuremmille pitoisuuksille tai kun altistusaika pitenee (Summerfelt & Smith, 1990). Nukutusaine voidaan antaa kalalle injektiona. Yleisimmin kala kuitenkin nukutetaan kastamalla se hetkeksi nukutusaineliuokseen tai kylvettämällä sitä liuoksessa pidempään. Kylvetys voi tapahtua joko seisovassa tai virtaavassa vedessä, jossa on sopiva nukutusainepitoisuus. Tietyt nukutusaineina käytetyt kemikaalit eivät ole vesiliukoisia, joten ne on ennen veteen sekoittamista liuotettava orgaaniseen liuottimeen. Kala altistetaan sopivan vahvuiselle nukutusaineliuokselle tietyksi ajaksi tai kunnes kala on halutussa anesteesian vaiheessa. Nukutusaineliuoksen konsentraatio ilmaistaan usein miljoonasosina (p.p.m.) joka vastaa milligrammaa litrassa (mg/l) ja grammaa kuutiometrissä (g/m 3 ). Anesteesian syvyys riippuu käytetystä nukutusaineen pitoisuudesta ja altistusajasta. Kalojen anesteesia ja virkoaminen on jaettu useisiin toisiaan seuraaviin vaiheisiin (taulukko 1).

5 Taulukko 1. Nukahtamisen ja nukutuksesta toipumisen vaiheet kaloilla. (Summerfelt & Smith, 1990). Anesteesian vaihe Kuvaileva Nimi Vaiheen tuntomerkit kalassa 0 Normaali Reagoi ulkoisiin ärsykkeisiin, hengitystiheys ja lihasjännitys normaali 2 syvä rauhoittuminen Virkoamisen vaihe 1 lievä rauhoittuminen 3 osittainen tasapainon menetys 4 täydellinen tasapainon menetys 5 Refleksitoiminta lakkaa 6 Hermotoiminta lakkaa Reagoi hieman heikommin näkö- ja kuuloarsykkeisiin, hengitystiheys hieman pienempi, tasapaino normaali Ulkoisista ärsykkeistä reagoi ainoastaan korkeaan paineeseen, hengitystiheys hieman pienempi, tasapaino normaali Lihasjännitys hieman alhaisempi, uinti säännötöntä, hengitystiheys hieman suurempi, reagoi vain voimakkaaseen kosketus- tai tärähdysärsykkeeseen Täydellinen tasapainon ja lihasjännityksen menetys, hidas mutta säännöllinen hengitystiheys, selkäydinrefleksit katoavat Ei reagoi mihinkään, hengitystiheys hidas ja epäsäännöllinen, sydämen syke hyvin matala, ei refleksitoimintaa Hengitysliikkeet loppuvat, sydämen syke lakkaa yleensä pian Vaiheen tuntomerkit kalassa 1 Hengitysliikkeet alkavat 2 Tasapainon osittainen saavuttaminen ja uintiliikkeiden osittainen alkaminen 3 Tasapainon täydellinen saavuttaminen 4 Reagoi jäykästi ulkoisiin ärsykkeisiin, välttelyuinti alkaa 5 Käyttäytyminen ja uintiliikkeet normaalit Kun nukutetulle kalalle on tehty tarvittavat toimenpiteet, se siirretään virkoamaan puhtaaseen veteen. Kaikkien toimenpiteiden aikana on huolehdittava, että kalan kidukset pysyvät kosteina ja että nukutus- ja virkoamisaltaissa riittää happea. Jos kaloja on pidettävä nukutettuina pitkiä aikoja, niin kala voidaan altistaa vuorotellen nukutusaineliuokselle ja puhtaalle vedelle; tätä varten on kehitetty myös erityisiä laitteistoja. Ross ja Ross (1999) esittivät yleisen toimintamallin nukutettaesssa kaloja kylvettämällä (taulukko 2). Käytettävän nukutusaineen valintaan vaikuttavat yleensä useat eri tekijät: 1) aineen saatavuus, 2) tehokkuus suhteessa hintaan, 3) käytön helppous, 4) turvallisuus käyttäjälle sekä 5) tutkimuksen luonne (Cho & Heath, 2000). Lisäksi huomioon tulisi ottaa myös aineen turvallisuus kohdekalalle ja ympäristölle. Marking ja Meyer (1985) kuvailivat ideaalisen nukutusaineen kahdeksan ominaisuutta: 1) induktioaika on alle 15 min ja mielellään alle 3 min, 2) virkoamisaika on enintään 5 min, 3) aine ei ole myrkyllinen kalalle ja sillä on suuri

6 turvakerroin, 4) aine on helppokäyttöinen eikä se ole haitallinen ihmiselle normaalikäytössä, 5) sillä ei ole pysyviä vaikutuksia kalan fysiologiaan tai käyttäytymiseen, 6) se häviää kalan elimistöstä nopeasti, siitä ei jää jäämiä kalaan eikä se vaadi karanteeniaikoja, 7) toistuva käyttö ei aiheuta kumulatiivisia vaikutuksia tai ongelmia ja 8) aine on edullinen. Taulukko 2. Yleinen toimintamalli nukutettaessa kaloja pienissä ryhmissä kylvettämällä niitä nukutusaineliuoksessa. (Ross & Ross, 1999). Ryhmänukutus kylvettämällä : toimintamalli 1. Valmista kantaliuos. Säilytä se mielellään tummassa pullossa jääkaapissa. 2. Valmista sopivan vahvuinen nukutusaineliuos lisäämällä kantaliuosta vähitellen veteen sekoittaen samalla huolellisesti. Sekoittaminen on tässä vaiheessa tärkeää ettei nukutusaine erotu liuoksesta erilleen. 3. Valmista virkoamisallas puhtaasta, runsashappisesta vedestä. 4. Varmista että kalojen säilytysallas, nukutusallas ja virkoamisallas ovat samassa lämpötilassa. Säädä tarvittaessa. 5. Varmista, että kaikki tarvittavat välineet, haavit, ämpärit, ruiskut, neulat, merkit, käsipyyhkeet ym., ovat valmiina ja käden ulottuvilla. 6. Nopeasti, mutta hellästi, haavitse säilytysaltaasta pieni määrä kaloja ja siirrä ne nukutusaltaaseen. Kerralla nukutettavien kalojen määrä riippuu kunkin kalan käsittelyyn kuluvasta ajasta. Ensimmäisellä haavitsemisella ei kannata nukuttaa useampaa kuin 3-4 kalaa. Kun kaikki tarvittavat välineet ja käsittelyvarmuus on saavutettu kalojen määrää voi nostaa. Kalojen ei kuitenkaan saisi antaa olla nukutusaineliuoksessa pitkiä aikoja, 10 minuuttia on maksimi. 7. Yksinkertaiset käsittelyt onnistuvat yleensä jo ennen kuin kalat ovat menettäneet tasapainoaan. Käsittelyt on syytä aloittaa heti kun kalaa voidaan käsitellä ilman ongelmia. 8. Kala on syytä laittaa virkoamisaltaaseen heti kun tarvittavat käsittelyt on tehty. Kalat toipuvat huomattavasti yleensä jo minuutissa, mutta joillakin lajeilla se voi viedä huomattavasti kauemminkin. Virkoamisaltaan kalamäärä on pidettävä sopivana. 3. YLEISIMMIN KÄYTETYT NUKUTUSAINEET Nukutustapoina kaloille on käytetty kymmeniä erilaisia kemiallisia yhdisteitä, kaasuja ja sähkövirtaa (Ross & Ross, 1999). Kuitenkin vain muutama nukutustapa on yleisessä käytössä. Lähes kaikkiin käytössä oleviin nukutustapoihin liittyy riskejä tai ongelmia, jotka rajoittavat niiden käyttöä. Yksi suurimmista ongelmista on edelleen tiedon puute; monien nukutusaineiden sopivasta pitoisuudesta eri lajeille tai mahdollisista haitallisista vaikutuksista kaloille, ihmisille tai ympäristölle ei ole tietoa.

7 3.1. MS-222 MS-222 lienee yleisimmin käytössä oleva nukutusaine kaloille. Sen käyttöön liittyy kuitenkin huomattavia ongelmia. MS-222:lla nukutettuja kaloja on pidettävä karanteenissa 21 päivää ennen vapautusta takaisin luonnonvesiin tai käyttöä ihmisravinnoksi (Bowser, 2001). Esimerkiksi luonnonvesistä pyydettyjen ja nukutettuina merkittyjen kalojen tai viljelylaitokselta istutuspaikalle rauhoitettuina kuljetettujen kalojen pitäminen eristyksissä kolme viikkoa ennen vapautusta on käytännössä vaikeaa ja kallista ja osa kaloista voi kuolla. MS-222 on luultavasti karsinogeeninen, vaikka ei olekaan mutageeni ja se on myös kallis nukutusaine (Yoshimura ym., 1981). MS-222 liukenee veteen hyvin ja on myös rasvaliukoinen, joten se siirtyy tehokkaasti kalan verenkiertoon kidusten pinnan läpi. MS-222:a käytetään kalojen nukutukseen yleensä pitoisuuksissa 15-330 mg/l. Sopiva pitoisuus riippuu nukutuksen halutusta syvyydestä, kalalajista ja kalan koosta, veden lämpötilasta ja veden kovuudesta. Yhdiste on tehokkainta lämpimässä ja pehmeässä vedessä (Bowser, 2001). MS-222:n vesiliuos on hapan ja se pitäisi neutraloida (esim. natriumbikarbonaatilla, NaHCO 3 ) ph 7,0-7,5:een. Kalojen toipuminen MS-222 nukutuksesta riippuu käytetystä pitoisuudesta ja altistusajasta (Bowser, 2001) sekä veden lämpötilasta: lämpimässä MS-222 poistuu kalan elimistöstä nopeammin kuin kylmässä (Cho & Heath, 2000). 3.2. Hiilidioksidi Hiilidioksidin käytön kalojen nukutusaineena kuvaili ensimmäisenä Fish (1943). Hiilidioksidi (CO 2 ) on veteen liukeneva kaasu. Hiilidioksidi voidaan lisätä veteen kaasuna tai sekoittamalla veteen natriumbikarbonaattia, NaHCO 3 (Bowser, 2001). Jos hiilidioksidi lisätään veteen kaasuna, niin tarkan pitoisuuden määrittäminen on hankalaa ja nukutusliuoksen happipitoisuutta on syytä tarkkailla (Bowser, 2001). Aina hiilidioksidia veteen lisättäessä on syytä tarkkailla veden ph:a, sillä vedessä hiilidioksidista muodostuu heikko happo. Hiilidioksidin käyttö nukutusaineena on siis melko vaikeaa moniin muihin nukutusaineisiin verrattuna eikä se sovellu kenttäolosuhteisiin. Hiilidioksidi on edullinen, siitä ei jää kalaan myrkyllisiä jäämiä eikä se aiheuta vaaraa käyttäjälle tai ympäristölle kunhan käyttötilan ilmanvaihto on hyvä (Post, 1979; Bell, 1964, 1987; Loch, 1991; Iwama & Ackerman, 1994). Hiilidioksidinukutuksessa induktio- ja virkoamisvaiheet ovat melko pitkät (Bell, 1987; Gilderhus & Marking, 1987; Marking & Meyer, 1985). Induktiovaiheessa kalalla on lyhyt voimakas hyperaktiivisuusvaihe (Mechelen, 1985; Bell, 1987; Loch, 1991; Bernier & Randall, 1998), ja stressi-indikaattorit, kuten veren adrenaliini- ja kortisolipitoisuus, nousevat nopeammin ja korkeammalle tasolle käytettäessä puskuroimatonta hiilidioksidia kuin muita nukutusaineita käytettäessä (Iwama ym., 1989). Useiden altistusten on huomattu johtavan kuolleisuuteen (Marking & Meyer, 1985). Hiilidioksidilla ei yleensä saavuteta syvää nukutusta (Gilderhus & Marking, 1987), joten sitä onkin yleisimmin käytetty kalojen rauhoittamiseen kuljetusten ajaksi ja suurten kalamäärien käsittelyn helpottamiseksi (Bowser, 2001). Hiilidioksidia käytetään myös yleisesti tainnutusaineena ennen kalojen perkausta.

8 4. NEILIKKAÖLJY NUKUTUSAINEENA Neilikkaöljyä, jonka vaikuttava ainesosa on eugenol (4-allyyli-2- metoksifenoli), saadaan tisleenä neilikkapuiden (Eugenia caryophyllata ja E. aromatica) rungosta, lehdistä ja kukista (Griffiths, 2000). Neilikkaöljy sisältää 90-95 % eugenolia (Bowser, 2001). Eugenolilla on ominaisuuksia, jotka tekevät siitä hyödyllisen moniin eri tarkoituksiin; eugenolia on käytetty mm. antioksidanttina (Rajakumar & Rao, 1993), antifungisena aineena (Karapmar, 1990), antibakteerisena aineena (Moleyar & Narasimham, 1992) sekä kivun lievittäjänä ja paikallispuudutuksessa hammaslääketieteessä (Curtis, 1990). Neilikkaöljyä on myös käytetty vuosikymmenien ajan mausteena ruoissa (Bowser, 2001). Neilikkaöljy ei liukene kunnolla alle 15 C -asteiseen veteen. Liukenemisen parantamiseksi neilikkaöljy liuotetaan ensin etanoliin, esim. suhteessa 1:9 (Anderson ym., 1997). Neilikkaöljyn tiheys on noin 1 g/ml, joten 1 ml etanolin ja neilikkaöljyn seosta sisältää noin 100 mg neilikkaöljyä (Soto & Burhanuddin, 1995). Etanolilla ei ole pieninä pitoisuuksina anesteettista tai haitallista vaikutusta kaloihin (Anderson ym., 1997; Munday & Wilson, 1997). Neilikkaöljy ei vaadi karanteeniaikoja ja luonnontuotteena se ei aiheuta ympäristöriskiä (Cho & Heath, 2000), se on helppokäyttöinen ja tehokas, joten se sopii erinomaisesti myös kentällä tapahtuviin nukutuksiin. Neilikkaöljyn suurin heikkous on sen valoherkkyys (Cho & Heath, 2000), joten sitä kannattaakin säilyttää tummassa pullossa suojassa valolta. Neilikkaöljyä on käytetty nukutusaineena pitoisuuksissa 25-100 mg/l kalalajista ja halutusta nukutuksen syvyydestä riippuen (Bowser, 2001). Neilikkaöljyn on havaittu olevan pienissä pitoisuuksissa huomattavasti tehokkaampaa kuin MS-222, mutta suuremmissa pitoisuuksissa merkittävää eroa induktioajoissa ei ole (Munday & Wilson, 1997). Toipumisajat neilikkaöljynukutuksesta ovat melko pitkiä muihin yleisesti käytettyihin nukutusaineisiin verrattuna ja joillakin kalayksilöillä toipumisaika voi olla poikkeavan pitkä (Anderson ym., 1997; Munday & Wilson, 1997; Peake, 1998; Prince & Powell, 2000). Pitkät altistusajat neilikkaöljylle voivat johtaa erittäin pitkiin (jopa yli 90 minuuttia) toipumisaikoihin (Peake, 1998). Tämän on arveltu johtuvan neilikkaöljyn hengitysjärjestelmää lamauttavasta vaikutuksesta (Keene ym., 1998). Keene ym. (1998) havaitsivat, että 9,5 C lämpötilassa suuretkin (80-100 mg/l) neilikkaöljyn pitoisuudet ovat turvallisia kirjolohen (O. mykiss) poikasten nukutuksessa, mutta pienempi pitoisuus (40 mg/l) oli silti suositeltavampi lyhyemmän toipumisajan ja suuremman turvakertoimen vuoksi. Neilikkaöljynukutus sopivalla pitoisuudella oli nopeampi kuin MS-222:lla, mutta toipumisaika oli selvästi pidempi. 8-96 tunnin LC 50 neilikkaöljylle oli 9 mg/l. Noin 2 mg/l (ei yli 5 mg/l) pitoisuutta suositeltiin kirjolohen poikasten pidempiaikaiseen (6-8 tuntia) rauhoittamiseen esim. kuljetuksen aikana. Prince & Powell (2000) nukuttivat aikuisia kirjolohia (keskipaino 2,2 kg) neilikkaöljyliuoksella, jonka pitoisuus oli 30-40 mg/l. Keskimääräinen nukahdusaika oli 3,7 minuuttia ja toipumisaika 4,9 minuuttia. Prince & Powell havaitsivat, että aikuisella kirjolohella nukahdusaika ei riipu kalan painosta tai veden lämpötilasta, mutta toipumisaika riippuu lämpötilasta. Lämpötilan

9 vaihteluväli tutkimuksessa tosin oli vain 2 C (16,5-18,5 C). Toipumisaika ei riippunut nukahdus- tai altistusajasta. Nukutuksen jälkeen jokeen vapautettujen kirjolohien havaittiin ruokailevan aktiivisesti viikon kuluttua nukutuksesta ja 44% kaloista oli siirtynyt vapautuspaikalta huomattavasti ylävirtaan. Griffiths (2000) selvitti kahdeksan eri merikalalajin nukutukseen sopivat neilikkaöljyn pitoisuudet noin 18 C lämpötilassa. Nukahtamis- ja toipumisajoissa oli selkeitä lajien välisiä eroja (kuva 1). Nukutuksista ei aiheutunut kuolleisuutta. Kuva 1. Keskimääräiset (± S.E.) nukahtamis- ja toipumisajat kahdeksalle vuorovesivyöhykkeen kalalajille neilikkaöljyliuoksen pitoisuuksissa 30, 40, 50 ja 60 mg/l. (Griffiths, 2000). Peake (1998) suositteli neilikkaöljyn pitoisuutta 60 mg/l valkosilmäkuhan (Stizostedion vitreum), hauen (Esox lucius), pikkubassin (Micropterus dolomieu) ja järvisammen (Acipencer fulvescens) nukuttamiseen. Lajien välillä oli selkeitä eroja nukahtamis- ja toipumisajoissa. Valkosilmäkuhan toipumisaika oli sitä pidempi mitä suurempaa neilikkaöljyn pitoisuutta käytettiin, mutta ei riippunut

10 kalan koosta. Myöskään nukahtamiseen kulunut aika ei riippunut kalan koosta. Ylipitkä altistus neilikkaöljylle johti toipumisajan selvään pidentymiseen. Taylor & Roberts (1999) tutkivat neilikkaöljyn sopivuutta kirjolohen (Oncorhynchus mykiss), kuningaslohen (O. tshawytscha), hopealohen (O. kisutsh) ja valkosammen (Acipencer transmontanus) nukutukseen. 10 minuutin altistuksen mediaani letaalipitoisuus oli 62 mg/l kuningaslohelle, 96 mg/l hopealohelle, 250 mg/l kirjolohelle ja 526 mg/l valkosammelle. Pitoisuudessa 25 mg/l kaikkia lajeja voitiin pitää 120 minuuttia ilman kuolleisuutta. Endo ym. (1972) suositteli neilikkaöljyn pitoisuutta 25 mg/l kirjolohen poikasten (9,1-12,4 g) nukuttamiseen 14 C lämpötilassa; keskimääräinen nukahdusaika oli 2,5 minuuttia. Waterstrat (1999) havaitsi, että pilkkupiikkimonnin (Ictalurus punctatus) poikasia voitiin turvallisesti pitää neilikkaöljyliuoksen pitoisuudessa 100 mg/l 15 minuuttia, mutta pidempi altistus johti toipumisajan selvään pidentymiseen ja kuolleisuuteen. Pitoisuudessa 300 mg/l 10 minuuttia pidetyistä poikasista noin puolet kuoli. Woody ym. (2001) havaitsi, että neilikkaöljyn pitoisuuksilla 20, 50 ja 80 mg/l nukutettaessa aikuisten punalohien (Oncorhynchus nerka) nukahtamisaika riippui kalan pituudesta, mutta pitoisuuksilla 110 ja 140 mg/l pituudella ei ollut vaikutusta nukahdusaikaan (kuva 2). Toipumisajat eivät riippuneet kalan koosta tai sukupuolesta, mutta riippuivat nukutuksessa käytetystä neilikkaöljypitoisuudesta. 15 minuuttia pitoisuuksissa 20, 50 ja 80 mg/l pidetyt kalat toipuivat syvästä nukutuksesta; keskimääräiset toipumisajat olivat 950, 1673 ja 2085 sekuntia. Sen sijaan pitoisuudessa 110 mg/l 15 minuuttia pidetyt kalat kuolivat tai eivät saavuttaneet nukutuksen jälkeen enää tasapainoa. Veden lämpötila tutkimuksessa oli 9,6 C. Woody ym. suosittelivat punalohien kevyeen nukutukseen neilikkaöljyn pitoisuutta 50 mg/l ja syvempään nukuttamiseen suurempaa, esim. 80 mg/l, pitoisuutta. Kuva 2. Punalohien nukahdusajan riippuvuus kalan pituudesta neilikkaöljyn pitoisuuksissa 20, 50, 80 ja 110-140 mg/l. (Woody ym., 2001).

11 Anderson ym. (1997) havaitsivat, että neilikkaöljynukutus ei vaikuta aikuisen kirjolohen uintikykyyn. Neilikkaöljyn todettiin olevan yhtä tehokas sekä aikuisten että poikasten nukutukseen kuin MS-222. Nukutukset tehtiin lämpötilassa 11 C ja sopivaksi neilikkaöljyn pitoisuudeksi havaittiin 40 mg/l. Cho & Heath (2000) nukuttivat kuningaslohen poikasia 7 C lämpötilassa neilikkaöljyliuoksella, jonka pitoisuus oli 20 mg/l. Nukutuksen ei todettu vaikuttavan merkittävästi kalojen hematokriitti-, serumin kortisoli-, serumin glukoosi- tai serumin lysotsyymiaktiivisuusarvoihin eikä myöskään erilaisten leukosyyttien lukumääriin. Nukutuksista ei aiheutunut kuolleisuutta. Soto & Burhanuddin (1995) havaitsivat, että juovakaniinikalan (Siganus lineatus) poikaset ruokailivat normaalisti pian neilikkaöljynukutuksen jälkeen. Nukutuksissa käytetty neilikkaöljyn konsentraatio oli 100 mg/l ja kalat toipuivat nukutuksesta 20-160 sekunnissa. Pirhonen & Schreck (julkaisematon) havaitsivat että neilikkaöljy-, MS-222- tai hiilidioksidinukutus eivät vaikuta kirjolohen poikasten nukutuksen jälkeiseen ruoanottoon tai plasman kortisolipitoisuuteen. Nukutukset tehtiin 13 C lämpötilassa ja neilikkaöljyn pitoisuus oli 40 mg/l. KIRJALLISUUS Anderson, W.G., McKinley, R.S., Colavecchia, M. (1997). The use of clove oil as an anesthetic for rainbow trout and its effects on swimming performance. North American Journal of Fisheries Management 17, 301-307. Bell, G.R. (1964). A Guide to the properties, characteristics, and uses of some general anesthetics for fish. Bulletin of the Fisheries Research Board of Canada 148. (ref. Bernier & Randall (1998)). Bell, G.R. (1987). An outline of anesthetics and anesthesia for salmonids, a guide for fish culturists in British Columbia. Canadian Technical Report of Fisheries and Aquatic Sciences 1534. (ref. Bernier & Randall (1998)). Bernier, N.J. & Randall, D.J. (1998). Carbon dioxide anaesthesia in rainbow trout: effects of hypercapnic level and stress on induction and recovery from anaesthetic treatment. Journal of Fish Biology 52, 621-637. Bowser, P.R. (2001). Anesthetic options for fish. Teoksessa: Gleed, R.D. & Ludders, J.W. (toim.), Recent advances in veterinary anesthesia and analgesia: companion animals. International Veterinary Information Service, Ithaca, New York, USA. (www.ivis.org). Cho, G.K. & Heath, D.D. (2000). Comparison of tricaine methanesulphonate (MS-222) and clove oil anaesthesia effects on the physiology of juvenile chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha (Walbaum). Aquaculture Research 31, 537-546. Curtis, E.K. (1990). In pursuit of palliation: oil of cloves in the art of dentistry. Bulletin of the History of Dentistry 38, 9-14. Endo, T., Ogishima, K., Tanaka, H. & Ohshina, S. (1972). Studies on the anesthetic effect of eugenol in some fresh water fishes. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 38, 761-767.

12 Fish, F.F. (1943). The anaesthesia of fish by high carbon dioxide concentrations. Transactions of the American Fisheries Society 72, 25-29. Gilderhus, P.A. & Marking, L.L. (1987). Comparative efficacy of 16 anesthetic chemicals on rainbow trout. North American Journal of Fisheries Management 7, 288-292. Griffiths, S.P. (2000). The use of clove oil as an anaesthetic and method for sampling intertidal rockpool fishes. Journal of Fish Biology 57, 1453-1464. Iwama, G.K., McGeer, J.C. & Pawluk, M.P. (1989). The effects of five fish anesthetics on acid-base balance, hematocrit, blood gases, cortisol, and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology 67, 2065-2073. Iwama, G.K. & Ackerman, P. (1994). Anesthetics. Teoksessa: Hochachka, P.W. & Mommsen, T.P. (toim.), Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Vol. 3. Elsevier Science, Amsterdam. s. 1-15. (ref. Bernier & Randall (1998)). Karapmar, M. (1990). Inhibitory effects of anethole and eugenol on the growth and toxin production of Aspergillus parasiticus. International Journal of Food Microbiology 10, 193-200. (abstrakti). Keene, J.L., Noakes, D.L.G., Moccia, R.D. & Soto, C.G. (1998). The efficacy of clove oil as an anaesthetic for rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Aquaculture Research 29, 89-101. Loch, J.J. (1991). Carbon dioxide as an anesthetic for handling steelhead collected at the Toutle River Fish Collection Facility, 1990. Report No. 90-18. Washington Department of wildlife, Fisheries Management Division, 600 Capitol Way, No. GJ- 11, Olympia, WA. 98501-1091. (ref. Bernier & Randall (1998)). Marking, L.L. & Meyer, F.P. (1985). Are better anesthetics needed in fisheries? Fisheries 10, 2-5. Mechelen, J.A.N. van (1985). Report on a practical training at the Salmonid Enhancement Project, Department of Fisheries ond Oceans, Canada. II. The use of carbon dioxide as an anesthetic for fish. Quinsam Hatchery, Department of Fisheries and Oceans. Box 467, Campbell River, B.C. V9W 5C1. (ref. Bernier & Randall (1998)). Moleyar, V. & Narasimham, P. (1992). Antibacterial activity of essential components. International Journal of Food Microbiology 16, 337-342. (abstrakti). Munday, P.L. & Wilson, S.K. (1997). Comparative efficacy of clove oil and other chemicals in anaesthetization of Pomacentrus amboinensis, a coral reef fish. Journal of Fish Biology 51, 931-938. Peake, S. (1998). Sodium bicarbonate and clove oil as potential anesthetics for nonsalmonid fishes. North American Journal of Fisheries Management 18, 919-924. Pirhonen, J. & Schreck, C.B. (julkaisematon). Anaesthesia with MS-222, clove oil and CO 2 had similar effects on feed intake and cortisol of steelhead trout (Oncorhynchus mykiss). Post, G. (1979). Carbonic acid anesthesia for aquatic organisms. The Progressive Fish Culturist 41, 142-144.

13 Prince, A. & Powell, C. (2000). Clove oil as an anaesthetic for invasive field procedures on adult rainbow trout. Journal of Fisheries Management 20, 1029-1032. Rajakumar, D.V. & Rao, M.N.A. (1993). Dehydrozingerone and isoeugenol as inhibitors of lipid peroxidation and as free radical scavangers. Biochemical Pharmacology 46, 2067-2072. (ref. Keene ym., (1998)). Ross, L.G. & Ross, B. (1999). Anaesthetic and sedative techniques for aquatic animals. 2nd edition. Blackwell Science ltd. 159 s. Soto, C.G. & Burhanuddin (1995). Clove oil as a fish anaesthetic for measuring length and weight of rabbitfish (Siganus lineatus). Aquaculture 136, 149-152. Summerfelt, R.C. & Smith, L.S. (1990). Anaesthesia, surgery and related techniques. Teoksessa: Schreck, C.B. & Moyle, P.B. (toim.), Methods for fish biology. American Fisheries Society, Bethesda, MD. 684 s. Taylor, P.W. & Roberts, S.D. (1999). Clove oil: an alternative anaesthetic for aquaculture. North American Journal of Aquaculture 61, 150-155. Yoshimura, H., Nakamura, M. & Koeda, T. (1981). Mutagenicity screen of anaesthetics for fishes. Mutation Research 90, 119-124. (ref. Cho & Heath, (2000)). Waterstrat, P.R. (1999). Induction and recovery from anesthesia in channel catfish Ictalurus punctatus fingerlings exposed to clove oil. Journal of the World Aquaculture Society 30, 250-255. Woody, C.A., Nelson, J. & Ramstad, K. (2001). Clove oil as an anaesthetic for adult sockeye salmon: field trials. Journal of Fish Biology 60, 340-347.