Kemian tekniikan korkeakoulu Kemian tekniikan tutkinto-ohjelma Mats Peräsalo PUHELIMILLE JA NÄPPÄIMISTÖILLE SOVELTUVIEN ANTIMIKROBISTEN TUOTTEIDEN KEHITTÄMINEN Diplomityö, joka on jätetty opinnäytteenä tarkastettavaksi diplomiinsinöörin tutkintoa varten Espoossa 1.2.2013. Valvoja Professori Katrina Nordström Ohjaaja Diplomi-insinööri Marko Närhi 1
ALKUSANAT Haluan erityisesti kiittää työn valvojaa professori Katrina Nordströmiä mahdollisuudesta käyttää koulun laboratoriota, sekä häneltä saamastani asiantuntevasta avusta ja kannustuksesta diplomityön ja opintojen aikana. Avusta tutkimuksen käytännön töissä ja mukavista työpäivistä haluan kiittää Marika Hellmania, sekä laboratoriotöiden ohjaajana toiminutta Marko Närheä. Kiitos kuuluu myös NordicHug:ille ja erityisesti Dmitry Geninille, joka toimitti lakkauutteen ja mahdollisti osallistumisen start-up projektiin. Haluan myös kiittää VTT:n Riita Puupponen-Pimiää ja Liisa Nohynekiä lakkauutteeseen liittyvästä avusta ja ideoista. Erityiskiitos kuuluu myös Lab-dig Oy:lle, joka on tarjonnut mukavan työpaikan ja joustavat työajat koko opiskeluaikanani. Lopuksi haluan vielä kiittää vanhempiani Bengt ja Gunilla Peräsaloa tuesta ja kannustuksesta läpi opiskeluvuosien. Helsingissä 31.1.2013 Mats Peräsalo 2
Aalto-yliopisto, PL 11000, 00076 AALTO www.aalto.fi Diplomityön tiivistelmä Tekijä Mats Peräsalo Työn nimi Puhelimille ja näppäimistöille soveltuvien antimikrobisten tuotteiden kehittäminen Laitos Biotekniikan ja kemian tekniikan laitos Professuuri Soveltava mikrobiologia Työn valvoja Professori Katrina Nordström Työn ohjaaja(t)/työn tarkastaja(t) DI Marko Närhi Päivämäärä 1.2.2013 Sivumäärä 72+10 Professuurikoodi Kem-30 Kieli Suomi Tiivistelmä Tämän työn tavoitteena oli selvittää suomalaisten marjojen fenoliuutteiden hyödyntämistä ja soveltuvuutta erilaisten pintojen puhdistukseen tarkoitetuissa desinfektioaineissa. Eräänä käyttökohteena voisivat olla puhelimet sekä näppäimistöt. Kokeissa on tutkittu suomalaisista marjoista eristettyjen uutteiden, pääasiassa lakkauutteen, antimikrobisia ominaisuuksia. Taustatiedoiksi koottiin tietoa marjoissa esiintyvistä fenoliyhdisteistä. Kokeissa todettiin että lakan fenoliuutteella on voimakas antimikrobinen vaikutus tiettyjä Staphylococcus aureus ja Escherichia coli bakteerikantoja vastaan. Lakkauute oli koeputkissa tehdyissä kokeissa bakterisidinen 0,5 % suolaliemilaimennoksessa ja lisäaineiden kanssa tehokas vielä 0,05 % konsentraatiossa. Kokeissa todettiin myös lakkauutteen vesilaimennoksen olevan tehokas sekä muovisella että lasisella pinnalla kun uutetta oli imeytetty kertakäyttöiseen pyyhkeeseen. Lakkauutteen antimikrobinen teho ei veteen liuotettuna säilynyt, mutta ph säilyi muuttumattomana säilytyksen aikana. Työssä pyrittiin myös tutustumaan tuotekehitykseen aloittelevan yrityksen näkökulmasta. Työn tuloksena voitiin todeta että lakan fenoliuutteella on tarpeeksi antimikrobisia ominaisuuksia ja tuotekehityksen jatkaminen pintojen puhdistukseen tarkoitettavaksi tuotteeksi on perusteltua. Lisätutkimuksia tarvitaan kuitenkin selvittämään esimerkiksi marjojen saatavuuden vaikutuksista tuotteen lopulliseen hintaan sekä tutkimuksia tehosta muita bakteerisukuja vastaan. Avainsanat Lakka, fenoliuute, antimikrobinen, matkapuhelin, hygienia, start-up 3
Aalto University, P.O. BOX 11000, 00076 AALTO www.aalto.fi Abstract of master's thesis Author Mats Peräsalo Title of thesis Development of antimicrobial products for mobile phones and keyboards Department Department of Biotechnology and Chemical technology Professorship Applied microbiology Thesis supervisor Professor Katrina Nordström Thesis advisor(s) / Thesis examiner(s) DI Marko Närhi Date 1.2.2013 Number of pages 72+10 Code of professorship Kem-30 Language Finnish Abstract The aim of this study was to elucidate if phenolic extracts from Finnish berries can be used in products for surface disinfecting and cleaning of products such as e.g. mobile phones and keyboards. In this work the antimicrobial properties of extracts from Finnish berries, mainly cloudberry were studied. The study was based on previous publications on berry phenolics and their antimicrobial properties as well as an experimental setup for the purpose of investigating the antimicrobial properties of selected Finnish berries. The results indicated that the phenolic extract of cloudberry possess good antimicrobial qualities against certain species of the bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus. In test tubes the extract was effective in 0,5 % (w/v) saline dilutions and with surfactants a 0,05 % concentration was still effective. The tests also showed good results when applied on plastic and glass surfaces with a disposable wipe. The antimicrobial properties did not persist during storage, although the ph of the solution was found to be stable. In this study the product development process from a start-up point of view was also examined. Phenolic extract from cloudberry was found to have enough desired properties for a disinfectant and it is justified to continue with the product development. However issues as availability of the berry-material for commercial use and the effects of the supply on the final price of the product still needs to be carefully analyzed. Keywords Cloudberry, phenolic extract, antimicrobial, mobile phone, hygiene, start-up 4
TERMINOLOGIA JA LYHENTEET Antiseptinen aine = Bakteereja iholla tappava Bakterisidinen = Bakteereja tappava Bakteriostaattinen = Bakteerien kasvua hidastava tai estävä Desinfektioaine = Bakteereja tappava elottomalla pinnalla PMY = Pesäkkeen muodostava yksikkö SLS = Natriumlauryylisulfaatti Tekes = Teknologian ja innovaatioiden kehittämiskeskus VTT = Teknologian tutkimuskeskus VTT 5
LIITTEET Liite 1. Maljoilta lasketut pesäkkeet ja primaaritulokset 6
SISÄLLYSLUETTELO 1 Johdanto... 1 KIRJALLISUUSOSA... 3 2 Matkapuhelimet ja bakteerit... 3 2.1 Sairaalaympäristö - esimerkki matkapuhelimesta taudinlevittäjänä... 5 2.2 Vaihtoehdot puhelimen desinfiointiin... 6 3 Lakan ja vadelman fenoliset yhdisteet... 8 3.1 Marjojen ja marjauutteiden antimikrobiset ominaisuudet... 13 3.2 Vadelman ja lakan antimikrobisten aineiden vaikutusmekanismit... 16 3.3 Muut luonnolliset antimikrobiset kasvit ja yhdisteet... 19 3.4 Mikrokapseloinnin vaikutus fenoliyhdisteisiin... 20 3.5 Säilyvyys... 21 3.6 Erotusmenetelmät ja prosessit... 22 3.7 Raaka-aineen saatavuus, laatu ja logistiikka... 23 4 Antimikrobiset yhdisteet desinfektioaineena... 25 4.1 Menetelmät desinfektioaineen tehon osoitukseen... 27 4.2 Matkapuhelinten asettamat erityishaasteet... 28 5 Proof of concept : Toteutettavuuden osoituksen merkitys startup- yritykselle.30 5.1 Ideasta tuotteeksi... 31 5.2 Bioalan startup-yritysten erityispiirteet... 32 5.3 Viranomaismenettely osana kaupallistamisprosessia... 34 5.4 Markkinakatsaus... 35 TUTKIMUSOSA... 37 6 Materiaalit ja menetelmät... 38 6.1 Virhetarkastelu... 41 6.2 Antimikrobisen tehon tutkiminen... 42 6.3 Antimikrobisen aineen tehon testaus pinnalla... 43 6.4 Antimikrobisen pyyhkeen tehon testaus lasipinnalla... 44 6.5 Antimikrobisen pyyhkeen testaus epätasaisella pinnalla... 44 7
6.6 Marja-uutteen alustava säilyvyystutkimus... 44 6.7 Käsitellyn pinnan antimikrobisuus... 45 6.8 Lakkauutteen vesiliuoksen ph säilytyksen aikana... 45 6.9 Lakkauute ja lisäaineet... 46 6.10 Tulosten matemaattinen käsittely... 46 7 Tulokset ja tulosten tarkastelu... 48 7.1 Testattavien aineiden antimikrobinen teho liuoksessa... 48 7.1.1 Lakkauute... 50 7.1.2 Lakkauute ja lisäaineet... 51 7.2 Aineiden teho lasipinnalla... 52 7.3 Aineiden teho tietokonenäppäimillä... 53 7.4 Tehon säilyminen... 54 7.5 Lakkauutteen ph ja ph:n muutos säilytyksen aikana... 55 7.6 Muut havainnot ja uutteiden fysikaaliset ominaisuudet... 56 8 Johtopäätökset... 58 8.1 Kaupallisten tuotteiden antimikrobinen teho... 58 8.2 Marjauutteet desinfektioaineena... 58 8.3 Tuotteen taloudellinen toteutettavuus... 60 8.4 Jatkotutkimus... 61 8.5 Proof of concept vaikutelmat prosessista... 62 9 Yhteenveto... 66 Lähdeluettelo... 67 8
1 Johdanto Yhdessä maailman myydyimmän puhelimen käyttöoppaassa mainitaan, ettei sen kosketusnäyttöä tulisi puhdistaa alkoholipitoisilla aineilla. Ajatus tämän diplomityön takana on selvittää voidaanko kehittää antimikrobinen tuote joka on tarpeeksi tehokas hävittämään bakteereja puhelimen pinnalta, mutta kuitenkin luonnollinen tai jopa nieltynä täysin vaaraton. Kuluttajat vaativat yhtä aikaa tehokkaita ja turvallisia tuotteita samaan aikaan kuin esimerkiksi EU:ssa kemiallisten yhdisteiden käyttöä kuluttajatuotteissa rajoitetaan. Näin ollen tuotekehityksen valtteina ovat luonnonmukaisuus sekä mahdollisimman laajalle kuluttajasegmentille sopiva tuote. Suomessa on pitkään tutkittu marjojen terveysvaikutuksia sekä antimikrobisia yhdisteitä ja todettu mm. Rubus suvun marjojen vadelman ja lakan sekä Fragaria suvun mansikan sisältävän mikrobien kasvua inhiboivia fenoliyhdisteitä. Erityisen herkkiä näille aineille ovat Salmonella- ja Escherichia coli bakteerit, kun taas Lactobacillus ja Listeria kantojen kasvu ei häiriinny (Puupponen-Pimiä, et al., 2001). Myös Staphylococcus aureus bakteerin kasvua voidaan hillitä marjojen fenoliyhdisteillä (Puupponen-Pimiä, et al., 2005a). Suomessa tehdyn tutkimuksen näkökulmana on ollut tehon tutkiminen pitoisuuksissa, joka vastaa syötyä marjamäärää ruoasta löytyvää bakteerifloora vastaan. Tämän diplomityön tarkoituksena on selvittää valittujen kasviperäisten sekä suomalaisista marjoista eristettyjen antimikrobisten aineiden käyttöä desinfektioaineena. Selvitys fenoliyhdisteistä on tarkoitettu oleelliseksi johdannoksi fenoliyhdisteiden antimikrobisten ominaisuuksien jatkotutkimuksia ja formulointia varten erään startup-yrityksen näkökulmasta. Tutkimukseen teesinä on, että marjapohjaisten fenoliyhdisteiden avulla voidaan löytää uusia ratkaisuja pintojen desinfektioon. 1
Tämän työn kirjallisuusosassa on koostettu tietoa marjojen antimikrobisista yhdisteistä, niiden tehosta sekä ilmentymisestä suomalaisissa marjoissa. Tarkastelun kohteena työssä on myös ollut startup-yrityksen tuotekehitys, josta johtuen työssä perehdytään myös startup-yritysten menestymiseen ja nimenomaan bioalaan liittyviin erityispiirteisiin ja haasteisiin. Kokeellisessa osassa tehdyt kokeet ovat laadultaan yksinkertaisia ja tarkoitettu tehon ja toimivuuden ja toteutettavuuden osoittamiseen. Kyseessä on siten tuotekehitykseen liittyvän proof of concept testauksen esittely ja sen pohdinta empiirisestä näkökulmasta. 2
KIRJALLISUUSOSA 2 Matkapuhelimet ja bakteerit Matkapuhelimissa esiintyvistä bakteereista on tehty paljon tutkimuksia liittyen sekä yleiseen puhelimenkäyttöön että sairaalaympäristössä tehtyihin kokeisiin. Puhelimen pinnalla esiintyvät bakteerit ovat lähes tarkalleen samat joita on myös käsissä joten hyvä käsihygienia on hyvän puhelinhygienian ensivaihe (Ulger, et al., 2009). Jatkuvan kosketuksen ja sopivan lämpötilan ansiosta puhelin muodostaa lähes optimaalisen ympäristön bakteeripopulaation selviytymiseen (Akinyemi, et al., 2009). Riskinä on myös biofilmin muodostuminen ja bakteerien selviäminen hyvinkin pitkään (Tagoe, et al., 2011). Tutkimusten mukaan bakteereja on vähintään joka toisessa puhelimessa mutta eri käyttäjäryhmien välillä on eroja. Tutkimuksesta riippuen voidaan todeta bakteereja löytyvän keskimäärin 62 94,5 % tutkituista puhelimista. S. aureus bakteeria löytyy puhelimesta ja käsistä eniten, mutta myös muiden bakteerien osuus, esimerkiksi E. coli on merkittävä (Akinyemi, et al., 2009; Ulger, et al., 2009). Tutkimustulokset ovat hyvin ristiriitaisia ja eräässä tutkimuksessa löydettiin bakteereja kaikissa tutkituista puhelimissa. Samassa tutkimuksessa todettiin että 65 % puhelimissa on enemmän kuin 3 bakteerisukua (Tagoe, et al., 2011). Toista ääripäätä edustaa tutkimus, jossa todetaan bakteereja vain noin 15 % terveydenhuollon parissa työskentelevien puhelimista. (Akinyemi, et al., 2009) Ulgerin tutkimuksissa 49 % puhelimista oli vain yhden suvun bakteeria, 34 % oli kahden eri suvun bakteeria ja noin joka kymmenennessä puhelimessa oli kolmea tai useampaa bakteerisukua. Huomattava osuus kannoista todettiin resistentiksi metisilliinille (Ulger, et al., 2009). 3
Kuva 1. Saman puhelimen bakteerit maljakasvatuksena agar maljalla kahtena eri viikkona, ennen pyyhkimistä antimikrobisella pyyhkeellä ja pyyhkimisen jälkeen, kun puhelimesta otettiin näytteet painamalla kasvatusalustaan. (Verran, 2008). Voidaan päätellä että kirjallisuus antaa hyvin ristiriitaisia tuloksia puhelinten bakteerikontaminaatiosta vaikeasti standardoitavissa olevien olosuhteiden ja koemenetelmien takia. Matkapuhelimissa esiintyvä runsas bakteerimäärä ja bakteerien laatu on kuitenkin merkittävä tekijä varsinkin kriittisissä ympäristöissä, kuten sairaaloissa. Kuvasta 1 voidaan nähdä bakteerisukujen vaihtelevan kouluympäristössä viikosta toiseen ja nähdään populaation olevan runsasta. Matkapuhelimen bakteerit muodostavat myös tavalliselle käyttäjälle riskin ympäristöissä joissa hygienia on rajoitettua. Ellei käsihygieniasta päästä huolehtimaan, voivat matkapuhelimet toimia merkittävänä välittäjänä suun kautta ja hengitysteitse leviäville tartunnoille (Akinyemi, et al., 2009). 4
2.1 Sairaalaympäristö - esimerkki matkapuhelimesta taudinlevittäjänä Suurin osa matkapuhelimen bakteereista tehdyistä tutkimuksista on suoritettu sairaalaympäristössä. Matkapuhelimia käytetään niin leikkaussaleissa kuin tehoosastoilla yhteydenpitoon ja konsultoimiseen. Toimenpiteiden laatua voidaan yhteydenpidon avulla parantaa, samalla kun ristikontaminaation riski kuitenkin kasvaa. (Ulger, et al., 2009; Badr, et al., 2012). Tutkimusten tärkeyttä lisäävät tulokset, joiden mukaan varsinkin sairaalainfektioita aiheuttavia ja ihmiselle haitallisia bakteereja on matkapuhelimissa. Jeske et. al. 2007 tutkimuksissa todettiin että kännykän käytön jälkeen kontaminaatioita aiemmin desinfioidulle käsille ilmestyi 38/40 lääkäreille joista neljällä todettiin patogeenikontaminaatio. Tutkimuksissa käsien pesun ja desinfektion jälkeen 40 nukutuslääkäriä jotka toimivat leikkaussalissa käyttivät henkilökohtaista sairaalakännykkäänsä soittaakseen lyhyen puhelun. Tämän jälkeen tutkittiin myös kiinteiden puhelinten käyttöä leikkaussalin ulkopuolella joista 33/40 lääkärillä todettiin kontaminaatio, ja näistä jälleen 4/40 oli saanut patogeenikontaminaation (Jeske, et al., 2007). Tutkimuksen tuloksena todettiin, että kännyköiden käytöllä on vakavia mikrobihygienisia implikaatioita sairaalaympäristössä ja varsinkin leikkaussaleissa. Bakteerien on todettu sairaaloissa leviävän kaikenlaisten henkilökohtaisten elektronisten laitteiden, puhelinten ja näppäimistöjen kautta ja että matkapuhelimet voivat olla merkittäviä sairaalabakteerien leviämisen lähteitä (Ulger, et al., 2009). Karabay et. al. (2007) ovat myös tutkineet 122 kännykän mikrobiflooraa sairaalahenkilökunnalla johon kuului 39 lääkäriä, 50 sairaanhoitaja ja 33 lääketieteen opiskelijaa. Kännyköistä eristettiin esimerkiksi E. coli, Pseudomonas aeruginosa ja Klebsiella pneumoniae bakteereja. Kaikki edellä mainitut bakteerit ovat vakavien sairaalainfektioiden aiheuttajia ja on siten selvää, että kännykät voivat olla edesauttamassa kyseisten sairaalatartuntojen leviämistä (Karabay, et al., 2007). Sairaalahygienian pääpaino onkin käsien ja pintojen puhdistuksessa, jossa saippuan ohella käytetään erilaisia kemiallisia desinfektio- ja sterilointiaineita. Näiden 5
soveltuvuus on kuitenkin rajoitettua ja esimerkiksi tässä työssä tutkimuksen kohteena oleva hellävaraisempi desinfektioaine voisi soveltua esimerkiksi sairaalan lelujen pintapuhdistukseen, joiden kautta tartunnat myös leviävät. On myös tärkeä huomioida että sairaalassa käytettävät puhelimet kulkevat leikkaussaleista kotioloihin ja päinvastoin (Badr, et al., 2012). Näin ollen on tarpeen myös kiinnittää huomiota siihen, että myös altistumista sairaalabakteereille tulisi minimoida sitä mukaan kun kännyköiden kautta tarjottavat palvelut yleistyvät ja niitä käytetään jatkumona sekä kotona että työympäristössä. 2.2 Vaihtoehdot puhelimen desinfiointiin Tutkimusten mukaan noin 90 % terveydenhuollon ammattilaisista ei koskaan desinfioi matkapuhelintaan (Ulger, et al., 2009). Osasyynä voidaan pitää huonoa ohjeistusta mutta tekijänä on myös vakiintuneiden käytäntöjen ja menetelmien puuttuminen. Kannettavien laitteiden käyttöä varsinkin kuluttajien keskuudessa on vaikea rajoittaa, joten ainoaksi mahdollisuudeksi jää puhelimen desinfiointi esimerkiksi antimikrobisella pyyhkeellä (Akinyemi, et al., 2009; Badr, et al., 2012). Puhelimen säännöllinen puhdistaminen alkoholipitoisella tuotteella vähentäisi riskikontaminaatioiden mahdollisuutta. Desinfektioaineen suurin haastaja ovat antimikrobiset lisäaineet joilla puhelimet voisi jo valmistusvaiheessa varustaa antimikrobisilla ominaisuuksilla (Ulger, et al., 2009). Puhelimen bakteerimäärää voitaisiin myös vähentää itsessään antimikrobisella liinalla tai ympäröimällä puhelin antimikrobisella kankaalla. Myös monet metallit ovat jo pienissä määrissä tehokkaita bakterisidejä ja esimerkiksi hopeaa on käytetty paljon sekä lisäaineena muoveissa että antimikrobisissa kankaissa, kuten myös laastareissa. Ongelmana on kuitenkin jo nyt eri bakteerien muuttuminen resistentiksi hopealle (Mekewi, et al., 2012). Vaihtoehtoja mikrobien resistenttiydelle on kuitenkin löydettävissä sekä orgaanisista että epäorgaanisista yhdisteistä. Voidaan esimerkiksi käyttää erilaisia TiO 2 -, kultatai kuparinanoyhdisteitä, tai orgaanisten aineiden mikro- tai nanokapseleita. (Dastjerdi & Montazer, 2010). Ultraviolettivalo on myös osoittautunut tehokkaaksi monessa applikaatiossa (Vélez-Colmenares, et al., 2011). Ultraviolettivalo ei 6
kuitenkaan poista pinnoilta likaa samalla tavalla kuin mekaanisen pyyhkimiseen perustuvat puhdistusmenetelmät On syytä huomioida, että tässä työssä tutkitaan mahdollisuutta käyttää luonnontuotetta puhelinten bakteerimäärän vähentämiseen. Työssä ei siten pyritä sairaalatasolla käytettävään desinfektioaineeseen vaan keskitytään kuluttajalle vaarattomiin ja houkuteleviin raaka-aineisiin, joiden avulla voidaan vähentää haitallisten bakteerien määrää. Edelleen on syytä korostaa, että bakteerien kokonaisvaltainen tappaminen puhelinten tai näppäimistöjen pinnoilta ei ole tavoitteena, vaan työssä haetaan vastausta voidaanko haitallisten, lähinnä patogeenisten mikrobien määrään vähentää ja millä aikavälillä kyseinen mikrobivastainen teho on pysyvä. 7
3 Lakan ja vadelman fenoliset yhdisteet Tutkimusten mukaan suomalaisissa marjoissa on runsaasti bioaktiivisia yhdisteitä jotka hidastavat ja estävät erilaisten bakteerien kasvua. Näitä ovat esimerkiksi fenoliyhdisteet, jotka marjoissa ovat flavonoidit, fenolihapot, lignaanit ja polymeeriset tanniinit (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b). Fenoliyhdiste on varsin laaja käsite, jonka alle kuuluu monta erityyppistä yhdistettä. Kasvikunnasta on tällä hetkellä tunnistettu yli 8000 fenoliyhdistettä, joista yli 6000 on flavonoideja (Myllymäki, et al., 2007). Marjoissa yhdisteet ovat usein lähellä pintaa, jossa ne suojaavat marjaa patogeenejä ja ympäristönvaihtelua vastaan (Nohynek, et al., 2006). Myös lakan ja vadelman siemenissä on paljon antimikrobisesti merkittäviä fenolisia yhdisteitä (Lee, et al., 2012). Fenoliyhdisteiden uskotaan olevan tulehduksia vähentäviä, antikarsinogeeneja, antioksidentteja sekä antimikrobisia (Kylli, 2011). Fenolit esiintyvät kasveissa glykosideina tai kompleksisina suurikokoisina molekyyleinä (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b). Marjojen fenolikoostumukset ja kompositiot vaihtelevat lajin ja suvun mukaan, eivätkä Suomessa kasvavien luonnonmarjojen fenoliprofiilit ole vielä täysin tiedossa (Kylli, 2011; Lee, et al., 2012). Marjojen fenolisten yhdisteiden pitoisuuksiin vaikuttavat myös kasvupaikan maantieteellinen sijainti, sääolosuhteet sekä kypsyysaste (Törrönen, 2006; Lee, et al., 2012). Kuva 2. Runsaasti ellagitanniineja sisältävät Rubus suvun marjat mesimarja, lakka ja vadelma. Kuvat: Arktiset Aromit Ry (Anon., 2013b). 8
Prosessointi- ja säilöntämenetelmien vaikutuksia fenolisiin yhdisteisiin on tutkittu vain flavonolien (kversetiinin, kamferolin, myrisetiinin) ja ellagitanniinien osalta (Myllymäki, et al., 2007). Ellagitanniineja sisältävillä Rubus suvun marjoilla on todettu vahvimmat antimikrobiset ominaisuudet, mutta oleellista on kuitenkin yhteisvaikutus muiden vaikuttavien aineiden, esimerkiksi orgaanisten happojen kanssa (Puupponen-Pimiä, et al., 2005a). Esimerkkejä Rubus suvun marjoista on esitetty kuvassa 2. Fenoliyhdisteiden tutkimustieto perustuu pitkälti oletukseen, että määrät ovat suhteessa terveelliseen ruokavalioon. Tutkimustulokset ovat monelta osin puutteellisia ja ristiriitaisia, eikä haitoista ole riittävää tukimusta tai näyttöä. Fenoliyhdisteillä on monenlaisia vaikutuksia ja osa voi olla ihmisen elimistön kannalta haitallisia tai jopa lisätä riskiä altistua sairauksille (Törrönen, 2006). Fenoliset yhdisteet ovat kasvien sekundaarimetaboliitteja, jotka muodostuvat fenyylialaniinista. Yhdiste, jossa vähintään yksi hydroksyyliryhmä on sitoutunut aromaattiseen renkaaseen, voidaan määritellä fenoliyhdisteeksi. Suomalaiset marjat sisältävät runsaasi fenoliyhdisteitä joko yksinkertaisina fenoleina tai fenolisina polymeereinä (Saviranta, 2005). Tärkeimmät fenoliyhdisteet marjoissa ovat bentsoehapot, kanelihapot, flavonolit, antosyaanit, flavanolit ja proantosyanidiinit, sekä ellagitanniinit (Kylli, 2011). Rubus suvun marjat sisältävät runsaasti bentsoehappoyhdisteitä joista gallihappo on yleisin. Kanelihappoa ei vadelmassa ja lakassa ole paljon, mutta pieniä määriä p-kumariinihappoa esiintyy. Flavonoleja ei myöskään Rubus suvun marjoissa juuri ole. Lakassa on antosyaaneista eniten syanidiinia kun taas mansikassa pelargonidiinit ovat tärkeimmät. Mansikan ja vadelman proantosyanidiinit muodostuvat lähinnä prosyanidiinista ja propelargonidiinista (Kylli, 2011). Marjojen eri fenoliyhdistepitoisuudet on esitetty taulukossa 1. 9
Taulukko 1. Vertailu vadelman, lakan ja karpalon fenolisten yhdisteiden koostumuksesta mg/kuivapaino (Kylli, 2011). Yhdiste Vadelma Lakka Karpalo (Eurooppa) Bentsoehapot 24 129 11 30 Kanelihapot 3,4 16 9,7 7,6 Antosyaanit 40 163 1,0 1,9 66 86 Flavonolit 0,3-5,7 0,5 27 Flavanolit 1,0 3,3 1,3 3,1 Proantosyanidiinit 0,3-26 0,4 1,5 2,0 Ellagihapot 1,0 24 3,3 10 Ellagitanniinit 107 311 312 329 Varsinkin lakassa ellagitanniinien määrä muihin fenoliyhdisteisiin verrattuna on huomattava. Ellagitanniinit ovat tanniineja, jotka koostuvat heksahydroksidifenolihapon ja glukoosin tai kiinihapon estereistä. Ellagitanniinit ovat hydrolysoituvia tanniineja, eli esterisidokset hydrolysoituvat happojen tai emästen vaikutuksesta (Kylli, 2011). Hydrolysoitavat tanniinit ovat gallihapon ja ellagihapon, kuvassa 3, glukoosiestereitä (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b), Vapautunut hexahydroxydifenolihappo muodostaa ellagihappoa. Ellagitanniinit voivat polymeroitua dimeereiksi, trimereiksi ja oligomeereiksi (Kylli, 2011). Vadelmassa tavallisimmat ellagitanniinit ovat sanguiin H-6, lambertianin D, casuarictin, potentillin ja pedunculagin. Sanguiin H-6 on casuarcitiinin dimeeri, lambertianin C trimeeri ja lambertianin D tetrameeri (Tanaka, et al., 1993; Lee, et al., 2012). Toisten tutkimusten mukaan sanguiin H-6 ja lambertianin C vastaisivat yhdessä 81 % ellagitanniineista vadelmassa (Kylli, 2011). Kyllin tutkimuksissa ilmeni, että lakassa ellagitanniinit ovat pääosin lambertianin C ja sanguiin-h6, mutta myös näiden isomeerejä sekä pedunculagiinia tai casuariinia. Molekyylien rakenteet on esitetty 10
kuvassa 3 (Kylli, 2011). Fenolisten yhdisteiden kemiallisia rakenteita on esitetty kuvassa 4. Kuva 3. (A) Ellagihapon, (B) Sanguiin H-6 ja (C) Lambertianin C molekyylirakenteet (Tanaka, et al., 1993). 11
Kuva 4. Luvussa 3 mainittujen fenolisten yhdisteiden jaottelu, sekä molekyylirakenne (Roininen & Mokkila, 2007; Kylli, 2011). 12
3.1 Marjojen ja marjauutteiden antimikrobiset ominaisuudet Suomessa on tutkittu marjojen antimikrobisia ominaisuuksia vastaamaan elintarviketeollisuuden tarpeita, sekä selvittämään marjojen mahdollisia terveysvaikutuksia ihmisen elimistössä. Tutkimusten mukaan marjojen fenoliyhdisteistä eteenkin ellagitanniinit ovat vahvoja antimikrobisia aineita (Puupponen-Pimiä, et al., 2004; Törrönen, 2006). Nohynekin tutkimusten mukaan antimikrobisuus vaihtelee suuresti riippuen marjasta ja bakteerista. Yleisesti ottaen lakalla on voimakkain antimikrobinen aktiivisuus eri bakteerikantoja vastaan, mutta myös vadelmalla ja mansikalla esiintyy voimakasta antimikrobista aktiivisuutta. Helicobacter Pylori ja Bacillus cereus olivat kokeissa mukana olleista bakteerikannoista herkimmät. Nämä bakteerit ovat herkkiä lähes kaikkien marjojen fenoliuutteille (Nohynek, et al., 2006). Pitoisuudessa 1 mg/ml lakan fenoliuute pystyy inhiboimaan Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Staphylococcus epidermidis ja Candidia albicans bakteerien kasvua. Samassa pitoisuudessa lakkauute pystyi hävittämään Clostridium perfingeris, Helicobacter pylori ja S. aureus populaatiot (Nohynek, et al., 2006). Listeria ja Lactobacillus bakteerit sen sijaan ovat hyvinkin resistenttejä marjauutteille (Puupponen-Pimiä, et al., 2005a). Joidenkin bakteerien kohdalla fenoliyhdisteiden inhibitio on rajallinen ja epäillään, että antimikrobisuus johtuu muista tekijöistä, esimerkiksi marjoissa olevista orgaanisista hapoista (Puupponen-Pimiä, et al., 2004). Kuvasta 5 nähdään, että aktiiviseksi aineeksi esitetyn ellagitanniinifraktion antimikrobinen vaikutus S. aureus bakteeria kohtaan on pienempi kuin monta yhdistettä samanaikaisesti sisältävän marjauutteen vaikutus. Ei siis ole riittävää tutkia vain ellagitanniineja, vaan muidenkin yhdisteiden vaikutusmekanismit on selvitettävä. 13
PMY/ml Inkubaatioaika (h) Kuva 5. Kylmäkuivatun lakan ( ), lakkauutteen ( ) ja ellagitanniinifraktion ( ) sekä kontrolliin ( ) antimikrobinen teho S. aureus bakteeria vastaan (Puupponen- Pimiä, et al., 2004). Myös vertaamalla kuvia 6 ja 7 nähdään että eristetyn ellagitanniinien teho poikkeaa marjauutteen tehosta ja käyttäytymisestä. Kuvassa 6 kummankin uutteen teho näyttää tietyn ajan jälkeen heikentyneen ja kanta pääsee jälleen kasvamaan. Oleellista on kuitenkin, että sekä vadelman että lakan fenoliuutteilla ja uutteista eristetyillä ellagitanniinifraktioilla on todistetusti antimikrobisia ominaisuuksia (Puupponen- Pimiä, et al., 2005a). 14
PMY/ml Inkubaatioaika (h) Kuva 6. Vadelmauutteen ( ) ja lakkauutteen ( ) antimikrobinen teho S. aureus bakteeria vastaan verrattuna kontrolliin ( ) (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b). PMY/ml Inkubaatioaika (h) Kuva 7. Lakan ( ) ja Vadelman ellagitanniinifraktioiden ( ) antimikrobinen teho S. aureus bakteeria vastaan, verrattuna kontrolliin ( ) (Puupponen-Pimiä, et al., 2005a). 15
3.2 Vadelman ja lakan antimikrobisten aineiden vaikutusmekanismit Gram-negatiivisia bakteerisoluja ympäröi ulkomembraani, jonka ansiosta näillä on hydrofiilinen pinta. Ulkomembraani suojaa solua monelta ulkoiselta aineelta ja entsyymeiltä. Vaikutus johtuu lipopolysakkaridikerroksesta, joka suojaa monelta hydrofobiselta antimikrobiselta aineelta (Nohynek, et al., 2006). Marjauutteissa olevat fenoliset yhdisteet vaikuttavat bakteereihin esimerkiksi heikentämällä sytoplasmista membraania, lisäämällä plasmamembraanin permeabilisaatiota, inhiboimalla solun ulkopuolisia entsyymejä, vaikuttamalla suoraan solun metaboliaan tai välillisesti solun substraatteihin (Puupponen-Pimiä, et al., 2004). Kuvassa 8 on ehdotettu muutamaa antimikrobisen aineen vaikutuskohtaa. Kuva 8. Antimikrobinen yhdiste voi esimerkiksi vaikuttaa (A) metaboliaan ja ionien ja yhdisteiden ulosvirtaukseen, (B) koaguloimalla sytoplasmaa, (C) muuttamalla protonitasapainoa, (D) hajottamalla soluseinää, (E) tuhoamalla membraanien proteiinejä tai (F) vahingoittaa sytoplasmista membraania (Burt, 2004). Marjojen antimikrobisten ominaisuuksien tutkimustulokset ovat rajallisia ja pitkälti keskittyneet marjojen vaikutukseen elimistössä tai elintarvikkeissa. Ulkomailla tehdystä tutkimuksista löytyy tietoa tietyn fenoliyhdisteen vaikutustavasta, mutta marjojen kohdalla tieto on rajallista monimutkaisen koostumuksen takia (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b). Tutkimusten vertailu on myös vaikeaa erilaisten koeolosuhteiden ja sekavasti tai vajavasti esitettyjen menetelmien takia. Ei ole 16
olemassa tiettyä standardimenetelmää marjatutkimukselle koskien säilytystä, valmisteluja, uuttoa, puhdistusta, analyysiä tai tulosten ilmoittamista. Vertailua vaikeuttaa myös puutteellinen tieto pakastuksen vaikutuksesta fenolisiin yhdisteisiin (Nohynek, et al., 2006; Lee, et al., 2012). Moni tutkimus osoittaa, että vadelmassa, lakassa ja mansikassa esiintyvät antimikrobiset yhdisteet ovat tehokkaimmat. Vain nämä marjat sisältävät merkittävästi ellagitanniineja, joten oletetaan että näiden marjojen antimikrobinen aktiivisuus perustuu ellagitanniineihin. Tätä teoriaa tukevat myös tutkimukset, jotka osoittavat että jotkut bakteerit ovat herkkiä vain näille kolmelle marjalle (Nohynek, et al., 2006). Ellagitanniinit Suurin osa lakan ja vadelman fenoliyhdisteistä ovat ellagitanniineja. Kirjallisuuden mukaan lakan fenoleista yli 90 % on ellagitanniineja, mutta tutkimuksissaan Kylli sai pitoisuudeksi vain 77,1 % (Kylli, 2011). Lakan ja vadelman fenoliuutteiden voidaan monella tavalla osoittaa hajottavan Salmonella- bakteerien ulkomembraania. Mekanismiksi on ehdotettu ainakin osittain ulkomembraanin kationien kelatointia. Pelkästään ellagitanniinifraktioilla ei kuitenkaan ole vaikutusta ulkomembraanin läpäisevyyteen. S. aureus bakteerin kohdalla tietyt tutkimukset ehdottavat, että vaikutusmekanismi olisi fibriinin muodostumisen inhibointi tai vaikuttaminen suoraan solun metaboliaan, substraatteihin ja entsyymeihin. (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b). Orgaaniset hapot VTT on tutkimuksissaan osoittanut, että fenoliuutteet sisältävät runsaasti orgaanisia happoja jonka ansiosta kasvatuksen ph laski alle viiden. Kriittiset arvot Staphylococcus- ja Salmonella- suvun bakteereille ovat ph 5-5,5 joten alhainen ph selittää osittain antimikrobiset ominaisuudet. Koska myös puhtaalla, hapoista 17
eristetystä ellagitanniinilla todettiin antimikrobisia ominaisuuksia, ei vaikutusta kuitenkaan voida selittää ainoastaan alhaisella ph:lla (Puupponen-Pimiä, et al., 2005a). Heikot orgaaniset hapot, sitruunahappo ja maitohappo tekevät ulkomembraanista läpäistävän, mutta tarvitsevat muita yhdisteitä tehostamaan bakterisidistä vaikutusta (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b). Gallihappo todettiin hajottavan solun ulkomembraania kelatoimalla kationeja (Nohynek, et al., 2006). Adheesio Nohynekin tutkimukset osoittavat että yksi vaikutusmekanismi ja huomattava virheenlähde tutkimuksissa on bakteerien tarttuminen marja-aineeseen. Fluoresenssimikroskoopilla nähtiin että, lakan fenoliyhdisteet sitoivat eläviä Salmonella- bakteerin soluja ja myös mansikan yhdisteet sitoivat bakteerisoluja. Nämä solut eivät näy maljalaskennassa vaan liuos vaatii ultraäänikäsittelyä jotta laskenta olisi luotettava. Lakka- ja mansikkauute sitovat myös kuolleita S. aureus soluja samalla kun laskettavat pesäkkeet vähenevät (Nohynek, et al., 2006). Kuvassa 9 nähdään selvästi sekä konsentraation vaikutus tehon nopeuteen että adheesion vaikutus. Kasvusto näyttää häviävän nopeasti täysin, mutta vuorokauden jälkeen maljoille ilmestyi jälleen pesäkkeitä. 18
PMY/ml Inkubaatioaika (h) Kuva 9. Lakkauutteen ja vadelmauutteen antimikrobinen teho Salmonella enterica bakteeria vastaan verrattuna kontrolliin (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b). 3.3 Muut luonnolliset antimikrobiset kasvit ja yhdisteet Tässä työssä mainittujen marjojen lisäksi, luonnossa on suuri määrä muitakin antimikrobisia yhdisteitä. Yrteistä saatavat eteeriset öljyt ja niiden terpenoidit ja fenoliyhdisteet ovat tutkitusti antimikrobisia ja niistä onkin jo olemassa myös kaupallisia tuotteita. Oreganon ja timjamin tymoli ja karvakroli ovat tutkituimpia yhdisteitä. Näiden tiedetään rikkovan mikrobisolun ulkomembraania, irrottavan lipopolysakkaridikerrosta ja lisäävän sytoplasmisen ATP:n ulosvirtausta solusta (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b; Burt, 2004). Kasveja, joiden eteerisissä öljyissä esiintyy antimikrobisia yhdisteitä, ovat esimerkiksi rosmariini, sitrusheinät, salviat, neilikka, maustekurkuma ja teepuska. Tutkimukset osoittavat myös, että lisäämällä muita aineita voidaan joko tehostaa tai vähentää yhdisteiden bakterisidistä vaikutusta (Burt, 2004). Koivun uutteen, on todettu S. aureus bakteerin kasvua ehkäiseväksi, ja myös männyn uutteet ovat antimikrobisia. Edelleen, myös perunan kuorijätteitä voidaan hyödyntää antimikrobisiin tarkoituksiin (Rauha, et al., 2000). Piparmintusta, sipulista ja 19
valkosipulista saatavat öljyt ovat myös antimikrobisia (Saviranta, 2005). Verrattuna ellagitanniineihin, eteeristen öljyjen yhdisteet ovat kuitenkin huomattavasti yksinkertaisempia ja pienikokoisempia. Tymolin ja karvakroli molekyylirakenne on esitetty kuvassa 10 (Burt, 2004). Kuva 10. A) Karvakrolin ja B) Tymolin molekyylirakenne. Suomessa kaikesta yleisimmin käytetyt ruoan säilöntäaineet ovat bentsoehappo ja sorbiinihappo, sekä näiden suolat. Sorbiinihappoa esiintyy mm. pihlajanmarjoissa ja bentsoehappoa esiintyy mm. karpalossa, puolukassa ja lakassa (Juuvinmaa, 2004). Pihlajamarjojen fenoliuutteilla ei kuitenkaan ole voimakasta antimikrobista vaikutusta S. aureus ja E. coli bakteereja vastaan (Nohynek, et al., 2006; Kylli, et al., 2010). Kaliumsorbaattia käytetään elintarviketeollisuudessa 0,2 % pitoisuuksissa ja natriumbentsoaatin käyttö elintarvikkeissa on rajattu välille 0,015-0,5 %. Kummallakin aineella on todettu antimikrobisia vaikutuksia sekä S. aureus että E. coli bakteeria vastaan. Sekä natriumbentsoaatti että kaliumsorbaatti inhiboivat jo 0,5 % pitoisuuksissa E. coli bakteerin kasvua (Stanojevic, et al., 2009). Tiedetään, että marjoissa olevat orgaaniset hapot ovat keskeisessä osassa esimerkiksi Salmonella bakteerin ulkomembraanin hajottamisessa ja läpäisemisessä (Alakomi, et al., 2007). 3.4 Mikrokapseloinnin vaikutus fenoliyhdisteisiin Mikrokapselointi on tekniikka jonka avulla voidaan sulkea kiinteitä aineita, nesteitä ja kaasuja pieniin kapseleihin joista sisältö voidaan vapauttaa hallitusti. Kapseleiden päällystysmateriaali voi olla hiilihydraattia, kumia, proteiineja, polysakkarideja, 20
lipidejä tai synteettisiä polymeerejä. Eri kapselointimenetelmien vaikutusta polyfenolisiin yhdisteisiin on tutkittu laajasti (Fang & Bhandari, 2010). Mikrokapseloinnin avulla voidaan pidentää marjojen fenoliuutteiden säilyvyyttä ja suojata yhdisteitä hapelta, valolta, kosteudelta ja muilta tekijöiltä. Mitä kosteammat olosuhteet, sitä huonommin fenolit säilyvät. Mikrokapseloinnilla voidaan sekä vaikuttaa yhdisteiden suhteiden säilymiseen sekä kokonaismäärän säilymiseen (Kylli, 2011). Mikrokapseloinnilla voidaan myös vaikuttaa paitsi säilyvyyteen, myös sovelluskohteisiin tai kaupallisten tuotteiden toteutukseen. On todettu että mikrokapselointi paitsi parantaa säilyvyyttä, myös mahdollistaa hallitumman vapauttamisen ja pitkäaikaisemman vaikutuksen. Mikrokapseloidun tymolin todettiin kestävän hyvin mikrokapseloinnin sekä muovimassaan lisäämisen (Guarda, et al., 2011). 3.5 Säilyvyys Fenoliuutteiden säilyvyyttä pakastettuna on selvitetty mutta suoraa yhteyttä fenolien stabilisuuden ja antimikrobisuuden välillä ei näytä olevan. Lakan fenoliuutteen säilyvyys pakastettuna on yksi parhaimmista ja antimikrobinen teho jopa parantunut vuoden säilytyksen aikana (Nohynek, et al., 2006). Kokonaisessa marjassa on kuitenkin murskattuun marjaan verrattuna korkeampi fenoliyhdistepitoisuus (Törrönen, 2006). Yleisesti antimikrobiset ominaisuudet säilyvät fenoliuutteessa, vaikka fenolipitoisuus säilytyksen aikana lähes poikkeuksetta vähenee (Puupponen- Pimiä, et al., 2005b). Pakastuksen aikana ellagitanniinit voivat hydrolysoitua ja muodostaa vapaata ellagihappoa (Nohynek, et al., 2006). Tarkkaa tutkimustietoa marjojen antimikrobisten tehon pitkäaikaisuudesta ei ole, mutta VTT:n kokemusten mukaisesti, veteen liuotetun lakkauutteen antimikrobiset ominaisuudet vähenevät noin kahdessa viikossa. 21
3.6 Erotusmenetelmät ja prosessit Marjojen ja kasvien fenoliyhdisteet ovat poolisia yhdisteitä jotka voidaan uuttaa asetonilla tai metanolilla. Fenoliuutteen koostumus vaihtelee hieman käytettyjen liuottimien mukaan ja esimerkiksi etanolilla saadaan uutteeseen enemmän poolisia yhdisteitä kuten antosyaaneja, kun taas etyyliasetaatilla saadaan enemmän poolittomampia yhdisteitä esimerkiksi flavonoleja. Tutkimuksissa ellagitanniineja on usein uutettu marjoista 70 % asetonilla, mutta myös etanolilla, vedellä ja muurahaishapolla suhteessa 80:20:1. Erotus muista fenoliyhdisteistä tehdään tarpeen vaatiessa ioninvaihtokolonnilla (Kylli, 2011). Fenoliuutteen valmistuksen virtauskaavio ja prosessin yksikköoperaatiot on esitetty kuvassa 11. Marjan kylmäkuivatus Liuottimen lisäys Seoksen homogenisointi Sentrifugointi ja erotus Liuottimien haihdutus Sokereiden ja happojen poisto Kuva 11. Fenoliuutteen valmistusprosessin yksikköoperaatiot. Uuttoa edeltää usein pakkaskuivaus mutta uutto voi tapahtua myös tuoreista marjoista. Marja-aines sekoitetaan liuottimeen ja uutto toistetaan usein 2-3 kertaa jonka jälkeen supernatantit yhdistetään. Saannon parantamiseksi käytetään vortex sekoitusta, ravistelua tai Ultra-Turrax sekoitusta (Kylli, 2011). VTT on yhteistyössä Suomen itsenäisyyden juhlarahaston (Sitra), kanssa selvittänyt fenoliyhdisteiden eristysteknologiaa ja koostanut yhteenvedon eri uutto- ja erotusprosesseista. Erotuksessa tarvittavat prosessit ja operaatiot ovat yleisesti tunnettuja, joten mitään esteitä ei ole fenoliyhdisteiden erotukselle teollisessa mittakaavassa (Myllymäki, et al., 2007). Orgaanisia happoja ja sokereita poistetaan marjauutteesta uuttamalla C18 kolonnin läpi. Eluenttina käytetään happamaksi säädettyä poolista liuotinta (Kylli, 2011; Nohynek, et al., 2006). Flavanolit ja proantosyanidiinit saattavat reagoida kolonnin 22
materiaalin kanssa mutta joidenkin tutkimusten mukaan saanto on usein hyvin lähellä 100 % (Kylli, 2011). VTT:n tutkimuksissa on myös todettu entsyymikäsittelyn parantavan saantoa. Entsyymikäsitelty auttaa irrottamaan marjakuoreen sidotut fenoliyhdisteet ja tuotteen antimikrobiset ominaisuuden paranevat. Käsittelyllä on todennäköisesti vaikutusta molekyylirakenteisiin ja fenolikoostumukseen joka vaikuttaa antimikrobisuuteen (Puupponen-Pimiä, et al., 2005b). Kaikista yleisimmin viitattu menetelmä suomalaisissa marjatutkimuksissa vaikuttaisi olevan Kähkösen menetelmä vuodelta 2001. Pakkaskuivattua marja-ainesta punnitaan 500 mg ja lisätään 10 ml liuotinta (asetonia, metanolia, vettä tai heksaania). Seos homogenoidaan 1 minuutin Ultra-Turrax sekoituksella, sentrifugoidaan jonka jälkeen kerätään talteen supernatantti. Uutto toistetaan kerran lisäämällä 10 ml liuotinta marja-aineeseen, tai kaksi kertaa jos luottimena käytetään vettä. Uuton jälkeen supernatantit yhdistetään ja annetaan liuottimen haihtua. (Kähkönen, et al., 2001). 3.7 Raaka-aineen saatavuus, laatu ja logistiikka Suomen metsissä kypsyy vuosittain 500 1000 milj. kg luonnonvaraisia marjoja, joista vain 40 45 milj. kg poimitaan talteen. Marjoista teollisuuteen päätyy vain 12 15 milj. kg, vaikka taloudellisesti kannattavasti poimittavissa olisi jopa 100 milj. kg vuosittain. Vuonna 2005 marjoja vietiin Suomesta 8,8 milj. kg, ja tästä vain 4,5 % marjavalmisteina. Vienti koostuu pääasiallisista kokonaisista marjoista, jäädytetystä mustikasta, puolukasta, lakasta ja karpalosta (Roininen & Mokkila, 2007). 23
Kotitalouksien käyttöön poimittavat lakat Myyntiin tulevat lakat Teollisus Pienet jalostajat Vienti Kuva 12. Vuosittaisen noin 7000 tonnin lakkasadon jakautuminen aloittain. Lakkasadon jakautuminen eri aloille on havainnollistettu kuvassa 12. Lakkaa poimitaan vuosittain talteen noin 7 miljoonaa kg, josta myyntiin tulee vain noin 0,2 miljoonaa kg. Lakka on marjoista hintavin ja hinta vaihtelee myös vallitsevan sadon mukaan. Lakkakilon keskihinta vähittäismyynnissä on ollut noin 8 euroa, mutta hinta on vuodesta riippuen vaihdellut 6 ja 10 euron välillä. Teollisuuden lakkatarve on vuosittain noin 250 tonnia ja pienten jalostajien tarve noin 50 tonnia. Teollisuuden valmistamista lakkatuotteista syntyy prosesseissa sivuvirtoja joita mahdollisesti voitaisiin hyödyntää muissa tuotteissa (Roininen & Mokkila, 2007). Sivuvirrat sisältävät runsaasti kuorimateriaalia jossa on paljon sekundaarimetaboliitteja ja fenolisia yhdisteitä. Hinta sivuvirroille voi kuitenkin olla vain murto-osa verrattuna marjaraaka-aineeseen (Saviranta, 2005). 24
4 Antimikrobiset yhdisteet desinfektioaineena Tarkoituksesta riippuen voidaan mikrobien tuhoamiseen tai niiden vähentämiseen käyttää erilaisia kemiallisia tai fysikaalisia menetelmiä. Kuumentamista kestävät materiaalit voidaan kuumentaa autoklaavissa mutta moni sovellus, esimerkiksi. elintarvikkeiden ja niiden raaka-aineiden säilytys, vaatii usein kemiallisten säilöntäaineiden käyttämistä. Kemiallisiin aineisiin voidaan luokitella sekä mm. orgaaniset hapot kuten myös kemialliset yhdisteet kuten nitriitit ja nitraatit joiden käyttö on perusteltua niiden patogeenejä tappavien eli bakterisidisten vaikutusten takia. Aine tai yhdiste on antiseptinen jos se on tarkoitettu iholle tai limakalvolle tuhoamaan mikrobeja tai estämään niiden kasvua joka perustuu lähinnä bakteriostaattiseen tai desinfioivaan vaikutukseen. (Raasmaja & Männistö, 2001). Desinfektioaineella tarkoitetaan ainetta joka on tarkoitettu veden, jätteiden tai elottomien pintojen puhdistukseen. Desinfektioaineelta vaaditaan mikrobeja tappava ominaisuus, mutta yleensä ei desinfektioaineella voida tappaa bakteerien itiöitä. Käsitteenä desinfektioaine on varsin laaja ja käsittää suuren ryhmän erilaisia kemikaaleja jotka vaikuttavat hyvinkin eri lailla eri mikro-organismeihin. Desinfektioaineesta voidaan käyttää myös nimitystä saniteettinen aine. Saniteettinen aine vähentää mikrobien määrän turvalliselle pidettävälle tasolle. Dekontaminaatio vähentää mikro-organismien määrää tai aktiivisuutta (Raasmaja & Männistö, 2001; Russel, 1998). Desinfektioaineelta vaaditaan nopeaa tehoa laajaa mikrobikirjoa, sekä bakteereja, homeita, viruksia että alkueläimiä vastaan (Raasmaja & Männistö, 2001). Herkimpiä desinfektioaineille ovat lipidivaippaiset virukset kuten HIV virus, johtuen siitä että desinfektioaineet yksinkertaisesti uuttavat lipidikomponentit ja näin hajottavat tai vaurioittavat virusta suojaavan ulkoisen vaipan. Järjestyksessä herkemmästä resistentimpään ovat, Gram-positiiviset bakteerit, suuret vaipattomat virukset, homeet ja Gram-negatiiviset bakteerit. 25
Vaikeasti tuhottavia ovat alkueläimet, pienet koteloimattomat virukset, kystat, mykobakteerit, itiöt, coccidiat ja prionit. Kuvassa 13 mikro-organismit on järjestetty desinfektioaineille resistentimmästä herkimpään. Mikrobien välillä löytyy kuitenkin poikkeuksia ja esimerkiksi Gram-negatiivisten bakteerien välillä on suuria eroja. Enterokokit ovat stafylokokkeja ja streptokokkeja vastustuskykyisempiä (Russel, 1998). Kuva 13. Mikrobien herkkyys desinfektioaineille (Russel, 1998). Desinfektioaine tulisi olla mikrobeja tappava eikä vain mikrobien kasvua estävä, eli mikrobisidinen eikä mikrobistaattinen ja toimia myös orgaanisen materiaalin ollessa läsnä (Raasmaja & Männistö, 2001; Laitinen, 2009). Altistusaika, ph, lämpötila, kosteus ja paine vaikuttavat myös antimikrobisen aineen tehoon. Desinfektioaineen kinetiikka on tärkeä tuntea, sillä on oltava näyttöä tarpeeksi nopeasta vaikutuksesta (Raasmaja & Männistö, 2001). Desinfektioaineena käytettävältä antimikrobiselta aineelta vaaditaan alhainen pintajännitys ja kemiallinen stabilisuus, eikä se saa syövyttää instrumentteja tai pintoja kuten pöytiä tai lattioita. Aineen pitoisuudella voidaan myös vaikuttaa aineen 26
tehokkuuteen mikrobisidisen tai mikrobistaattisen välillä, tai mahdollisiin käyttökohteisiin. Yleensä mikrobisidinen vaikutus kasvaa konsentraation kasvaessa, mutta monelle yhdisteelle on optimaalinen vaikutuspitoisuus jota ei kannata ylittää (Raasmaja & Männistö, 2001). 4.1 Menetelmät desinfektioaineen tehon osoitukseen Varsinkin kriittisissä ympäristöissä käytettävien desinfektioaineiden teho on pystyttävä todistamaan. Joidenkin desinfektioaineiden teho häviää orgaanisen aineen ollessa läsnä, joten tehon säilyminen on pystyttävä osoittamaan. Tehon osoitukseen voidaan käyttää useaa eri menetelmää jolla jokaisella on omat edut ja haittansa. Virhetekijät kuten desinfektioaineen kantautuminen viljelmiin tulisi eliminoida mahdollisimman huolellisesti (Rao, 2008). Kantaja-ainetta tai kantajamateriaalia hyödyntävässä testauksessa ( Carrier test ) bakteerisuspensioon upotetaan silkkikuitua tai muu materiaali joka halutaan kontaminoida. Materiaalin annetaan kuivua jonka jälkeen se saatetaan kosketuksiin tutkittavan aineen kanssa. Halutun ajan jälkeen kontaminoitu materiaali upotetaan ravintoliemeen ja viljellään. Kasvuston puuttuminen inkuboinnin jälkeen on osoitus desinfektioaineen toimivuudesta. Menetelmää on kuitenkin vaikea saada täysin toistettavaksi ja standardoiduksi (Rao, 2008). Suspensiotestit ovat helpommin standardoitavissa ja antavat luotettavammat tulokset. Esimerkki suspensiotestistä on koe jossa tutkittavaan aineeseen sekoitetaan bakteerisuspensiota, ja seoksesta tehdään viljelmä (Rao, 2008). Desinfektioaineen on standardin EN 1276, Kemiallisten desinfektio- ja antiseptisten aineiden bakterisidisen tehon tutkiminen, mukaan saatava aikaan suuruusluokan 10 5 väheneminen pesäkkeitä muodostavien yksiköiden alkuperäisestä määrästä. Standardissa aineita testataan käyttötarkoituksenmukaisissa konsentraatioissa vähintään kahdelle bakteerille. Testattavaa ainetta käytetään huomattava ylimäärä verrattuna bakteerisuspension määrään (Laitinen, 2009). 27
Kuormitustestissä selvitetään desinfektioaineen tehon säilymistä jatkuvassa käytössä kun epäpuhtauksia pääsee kosketuksiin aineen kanssa tai ainetta kuluu. Voidaan määrittää kriittiset rajat, eikä vain paljonko ainetta tarvitaan tappamaan bakteerit, vaan myös seurata tehon heikkenemistä kun samaan liuokseen lisätään bakteerisuspensiota useasti. Käytännön kokeissa käytetään steriilejä pintoja jotka kontaminoidaan bakteerisuspensiolla ja annetaan tutkittavan aineen vaikuttaa. Tulisi myös seurata käytössä olevien desinfektioaineiden tehoa, ottamalla näytteitä suoraan astioista (Rao, 2008). 4.2 Matkapuhelinten asettamat erityishaasteet Tässä työssä esitetään esikartoitus, jossa tavoitteena on selvittää kotimaisista marjoista eristettävien antimikrobisten aineiden kykyä vähentää mikrobipopulaatiota tai tuhota ne kokonaan. Eräänä sovelluksena ovat matkapuhelimien ja muiden kannettavien ATK-laitteiden ja näppäimistöjen pinnat. Näitä pidettiin tämän työn ja uuden ratkaisun löytämisen lähtökohtana, sillä monessa tämän tyyppisessä laitteessa on teknisiä rajoitteita joita tulee huomioida antimikrobisen tuotteen kehittämisessä. Esimerkiksi Applen kannettavien laitteiden näytöt on päällystetty öljyä hylkivällä pinnoitteella, joka ei kestä perinteisiä desinfektioaineita. Näyttöön ei valmistajan mukaan saa kohdistaa ikkunanpuhdistusaineita tai kodin puhdistusaineita, ammoniakkia, liuottimia tai hankausaineita. Puhdistukseen voi käyttää pehmeää nukatonta liinaa, mutta desinfektiolle ei anneta suosituksia (Apple, 2012). Nestemäiset suihkutettavat desinfektioaineet ovat selvästikin täysin sopimattomia monille elektronisille laitteille, jotka ovat jatkuvassa kosketuksissa ihon pintaflooran kanssa. Kuten jo luvussa 2 on esitetty, voidaan todeta että bakteerien esiintyminen matkapuhelinten pinnoilla kuten myös kannettavissa ATK-laitteissa on varsin todennäköistä ja yleisesti ottaen tiedossa. Tarkkaan ei kuitenkaan voida määrittää niiden aiheuttamaa todellista riskiä ihmisen terveydelle tai niiden välityksellä mahdollisesti kulkeutuvien taudinaiheuttajien todellista määrää. Pintamateriaalin sileys, pinnan lämpötila, mahdolliset bakteereihin vaikuttavat elektroniset 28
vyöhykkeet, ilmavirtaus jne. ovat kaikki tekijöitä jotka eri tavalla voivat vaikuttaa eri mikrobipopulaation kykyyn selvitä pinnoilla. Pelkkä mikrobien läsnäolo ei välttämättä ole osoitus mahdollisesta vaarasta. Olisi myös tunnistettava mikä mikrobi on kyseessä, mikä sen kyky lisääntyä on kyseisellä pinnalla sekä huomioitava millaisessa ympäristössä puhelinta käytetään. Matkapuhelin toimii kuitenkin vektorina bakteeritartunnoille ja kuten yllä on aiemmin esitetty, puhelimissa esiintyvät bakteerit ovat usein samoja sukuja kuin käyttäjän käsissä esiintyvät bakteerit. Desinfektioaine on vettä tehokkaampi vain jos matkapuhelimen muovipinta pyyhitään kerran. Useat tutkimukset osoittavat, että haluttu tulos saavutetaan kun pyyhkimiskertoja lisätään tai desinfiointiaikaa pidennetään (Berendt, et al., 2011). 29
5 Proof of concept : Toteutettavuuden osoituksen merkitys startup- yritykselle. Seuraavaksi luodaan katsaus biologiseen materiaaliin perustuvan tuotteen kaupallistamiseen, siihen liittyvään terminologiaan sekä viitekehyksiin. Tässä työssä esitetty tuote tai teknologia hyödyntäisi marjojen antimikrobisia ominaisuuksia esimerkiksi matkapuhelinten näytön puhdistukseen. Näistä lähtökohdista seuraavaksi esitetty katsaus on lähtökohtaisesti aseteltu suomalaiseen tutkimus- ja kehitysympäristöön, johtuen siitä että tässä diplomityössä pilot-kokeiden tavoitteena on ollut tuottaa tietoa ja toimia tukena erään startup-yrityksen tuotekehityksessä. Proof of concept eli toteutettavuuden osoituksen merkitys on keskeisessä osassa uuden tuotteen kehityspolulla. Toteutettavuuden osoituksen määrittelyt ovat kuitenkin varsin laajoja ja epätarkkoja kun puhutaan alkuvaiheessa olevasta ideasta. Kolmiulotteista esitystä tai konkreettista mallia voidaan jo kutsua prototyypiksi, lähes valmista tuotetta toimivaksi prototyypiksi. Englanniksi puhutaan usein prototyyppiä edeltävästä proof of conceptista. Vaikka nimitys on alakohtainen, tarkoitetaan käsitteellä usein idean toiminnallista validointia. Proof of Concept on tavallisesti teoreettinen tai ideatasolla oleva esitys joka kuitenkin todistaa että tuoteidea on toteutettavissa (Anon., 2012a). Tarkastelutavasta riippuen toteutettavuuden osoitus voi myös sisältää liiketoimintasuunnitelman ja laskelmat taloudellisesta kannattavuudesta (Anon., 2012b). Lääkkeitä kehittävässä bioalan yrityksessä käsite proof of concept voi merkitä viimeistä vaihetta ennen tuotteen lisensioimista eteenpäin. Ykkösvaiheessa (Phase 1) tuote pyritään formuloimaan ja kakkosvaiheessa (Phase 2) tarkastellaan että tuote toimii kohdeympäristössä halutulla tavalla ja formulaatio toimii. Toisaalta, edes lääkekehityksessä järjestyksen ei kuitenkaan tarvitse olla kronologinen vaan kehitys voi toimia rinnakkain ennen kuin edetään (Kolchinsky, 2004). 30