13. Biomolekyylit. 1. iilihydraatit 13.1. iilihydraattien rakenne ja konfigiraatiot iilihydraateilla tarkoitetaan polyhydroksiketoneja ja aldehydejä, joita nimitetään yleisesti sokereiksi. iilihydraatit voidaan jakaa kahteen ryhmään, monomeerisiin monosakkarideihin ja näistä koostuviin oligomeerisiin ja polymeerisiin yhdisteisiin, jotka voidaan hydrolysoida monomeereiksi. Esimerkiksi tavallinen sokeri, sukroosi, on glukoosista ja fruktoosista koostuva disakkaridi. 2 Fruktoosi 2 Glukoosi 2 Monosakkaridit voidaan jakaa kahteen ryhmään, aldooseihin ja ketooseihin, riippuen ketoryhmän paikasta molekyylissä. Monosakkaridin hiiliketjun pituus ilmaistaan tri-, tetr-, pent- jne etuliittein. Glukoosi on aldoheksoosi, fruktoosi ketoheksoosi 1 2 3 4 2 iilihydraateissa on useita kiraalisia hiiliatomeja ja ne esitetään yleensä Fischerin projektioiden avulla. Karbonyylihiili piirretään yleensä hiilivetyketjun yläpäähän. 5 2 Glukoosi 2 Fruktoosi Yleisesti omaksutun käytännön mukaisesti D-sokereiksi nimitetään yhdisteitä, joissa kauimpana karbonyylihiilestä oleva hydroksyyliryhmä Fischerin projektiossa osoittaa oikealle. Vastaavasti L-sokereissa kauimmainen hydroksyyliryhmä osoittaa vasemmalle. Tällä käytännöllä ei ole yhteyttä siihen, mihin suuntaan yhdisteiden vesiliuokset taittavat tasopolaroidun valon suuntaa. Luonnon sokerit ovat D-muotoa. Aldopentooseissa on 3 kiraliakeskusta ja siten 2 3 mahdollista stereoisomeeria. Stereoisomeerit jakautuvat neljäksi enantiomeeripariksi. Enantiomeerit ovat arabinoosi, riboosi, ksyloosi ja lyksoosi. Aldoheksooseita on 8 paria: alloosi, altroosi, glukoosi, mannoosi, guloosi, idoosi, galaktoosi ja taloosi 1 2 3 4 5 2 71
13.2. Syklisen hemiasetaalin muodostuminen. Pyranoosit ja furanoosit Alkoholit ja ketonit reagoivat keskenään muodostaen hemiasetaaleja. Kun alkoholija karbonyyliryhmät ovat samassa molekyylissä, voi tapahtua molekyylinsisäinen (intramolekulaarinen) nukleofilinen hyökäys karbonyylihiileen ja muodostuu syklinen hemiasetaali. 2 2 Glukoosin 5-aseman -ryhmä hyökkää karbonyylihiileen ja muodostuu 6-jäseninen pyranoosirengas Fruktoosi muodostaa kahdenlaisia rengasrakenteita vesiliuoksessa: 6-jäsenisten renkaiden lisäksi muodostuu 5-jäsenisiä pyranoosirenkaita, kun 4-aseman ryhmä hyökkää karbonyylihiileen. Muodot ovat keskenään tasapainossa avoketjuisen muodon kautta. Tasapainoasema riippuu sokerin rakenteesta. Fruktoosin tapauksessa pyranoosi on suositumpi (72:28) 2 2 2 2 2 2 2 Kun rengas muodostuu, syntyy uusi kiraliakeskus ja tuotteella on kaksi diastereomeeria, joita kutsutaan anomeereiksi ja hemiasetaalihiiltä anomeeriseksi keskukseksi / hiileksi. α-anomeerissa 5-aseman hydroksimetyyli ja anomeerisen hiilen hydroksyyliryhmä ovat sokerirenkaan tason vastakkaisilla puolilla, β- anomeerissa samalla puolella. Anomeerit ovat tasapainossa keskenään. iiden muuttumista toisikseen avoketjuisen välivaiheen kautta sanotaan mutarotaatioksi. Reaktio on neutraaleissa olosuhteissa hidas, mutta sitä voidaan nopeuttaa hapokatalysaattorilla. Tasapainon asema riippuu sokerin rakenteesta: glukoosin tapauksessa tasapaino suosii jonkin verran β-anomeeria. Anomeereilla on erilaiset kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet 2 2 α-anomeeri, 36 %, [α] D =+112.2, Mp. 146 2 β-anomeeri, 64 %, [α] D =+18.7,Mp. 148-155 72
Sokerien konformaatioita kuvataan useita tapoja käyttäen:fischerin projektio (vasemmalla), aworthin projektio (keskellä) ja tuolikonformaatiomalli (oikealla) 1 2 3 4 5 2 5 4 2 1 3 2 2 13.3. Monosakkaridien reaktioita. 1. Esterien ja eetterien muodostuminen 3 l 3 3 3 3 3 = 3 Asetyyliryhmä Penta--asetyyli-β-Dglukopyranoosi 3 X, Ag 3 3 3 3 3 3 β-d-glukopyranoosi pentametyylieetteri Esterinmuodostus on nukleofiilinen asyylisubstituutioreaktio, jossa nukleofiilina toimii sokerin -ryhmä. Syyliryhmää käytetään -ryhmän suojaukseen modifioituja sokereita syntetisoitaessa. Asylointireagenssina käytetään yleensä asetyylikloridia tai etikkahappoanhydridiä. Eetterinmuodostus on S 2-reaktio (Williamsonin eetterisynteesi). Sokerisyntetiikassa käytetään usein Ag 2 :ta emäksenä, sillä se on hellävarainen reagenssi, joka ei aiheuta sivureaktioita. 73
Reaktioita. 2. Pelkistys. Avoketjuisessa muodossaan olevan sokerin karbonyyliryhmä pelkistyy ab 4 :llä -ryhmäksi. Tuotteet ovat alditoleja α 2 2 β ab 4 D-sorbitoli Reaktioita. 3. apetus. Aldoosien karbonyyliryhmä voidaan hapettaa karboksyylihapporyhmäksi. Aldoosit ovat pelkistäviä sokereita, sillä hapettuessan ne pelkistävät hapetusreagenssin. Sokerit, jotka eivät voi esiintyä avoketjuisessa muodossa, eivät hapetu, eivätkä siis ole pelkistäviä sokereita. apetusreagensseja: Tollensin reagenssi (Ag+ ammoniakin vesiliuoksessa), Fehlingin reagenssi (u 2+ atartraattiliuoksessa) Benediktin reagenssi (u 2+ asitraattiliuoksessa) 2 2 [] 2 2 Yllälueteltuja hapetusreagensseja voidaan käyttää sokerien osoitusreaktioissa, sillä reaktion tuotteet ovat helposti havaittavia. Laimea typpihappoliuos hapettaa myös hydroksimetyyliryhmän ja tuotteena saan dikarboksyylihappoja, joita kutsutaan aldaarihapoiksi. 74
Reaktioita. 4. Glykosidin muodostuminen. Reaktiossa muodostuu asetaali hemiasetaalin ja alkoholin reagoidessa keskenään. Tuotetta, joka syntyy kun glukopyranoosi reagoi, kutsutaan glukopyranosidiksi. Glykosidin rengasrakenne on neutraaleissa olosuhteissa pysyvä, eikä sille tapahdu mutarotaatiota. Glykosidit eivät ole pelkistäviä sokereita 2 2 3, + 3 β-d-glukopyranoosi Metyyli-β-D-glukopyranosidi 13.4. Disakkaridit ja polysakkaridit. Disakkaridi muodostuu, kun monosakkaridin hemiasetaaliryhmä reagoi toisen monosakkaridin jonkin alkoholiryhmän kanssa. Esimerkiksi maltoosi muodostuu glukoosin 4- aseman -ryhmän reagoidessa glukoosin hemiasetaaliryhmän kanssa. Glykosidisen sidoksen konfiguraatio tässä tapauksessa on α. Maltoosi on 1,4 -glykosidi ja sen täydellinen nimi on 4--(α D-glukopyranosyyli)-α-Dglukopyranoosi. Sakkaroosi (sukroosi, tavallinen sokeri) koostuu glukoosista ja fruktoosista. Siinä glykosidinen sidos on kahden anomeerisen hiilen välillä, eikä sakkaroosi ole pelkistävä sokeri. sakkaroosi on 1,2 -glykosidi ja sen täydellinen nimi on 2--(α Dglukopyranosyyli)-β-D-fruktofuranosidi 2 Glukoosi 2 1 2 Fruktoosi 2 2 Polysakkaridit koostuvat jopa tuhansista monosakkarideista. Selluloosa koostuu toisiinsa 1,4 -β-sidoksin liittyneistä glukoosiyksiköistä. Tärkkelys on myös glukoosin polymeeri. Siinä monomeeriyksiköiden väliset sidokset ovat 1,4-αsidoksia. 75
14. Biomolekyylit. 2. Aminohapot, lipidit ja nukleiinihapot 14.1. Aminohapot ja peptidit Aminohapot ovat monomeerisia yksiköitä, joista peptidit ja proteiinit koostuvat. e ovat α-aminokarboksyylihappoja ja sisältävät siis emäs- ja happoryhmän. p:sta riippuen aminohapot esiintyvät vesiliuoksessa kationisina, neutraaleina tai anioneina. eutraali muoto on liuoksessa kahtaisionina, jossa aminoryhmä on protonoitunut ja happoryhmä anioninen. 3 - + - + 3 2 3 3 3 Kahtaisioni Aminohappojen α-hiili on kiraalinen ja aminohapot ovat optisesti aktiivisia. Kun aminohappo esitetään Fischerin projektion avulla, karboksyylihapporyhmä piirretään ylimmäksi ja aminoryhmä osoittamaan vasemmalle. Luonnon aminohappojen sanotaan olevan L-enantiomeereja. 2 3 Aminohapoissa on erilaisia sivuketjuja ja ketjun kemiallisten ominaisuuksien perusteella aminohapot voidaan jakaa neutraaleihin, emäksisiin ja happamiin. Sivuketjuissa voi olla myös aromaattisia renkaita ja funktionaalisia ryhmiä kuten alkoholi- tai tiolifunktioita. appamat ja emäksiset ryhmät voivat toimia esim. katalyyttisinä ryhminä entsyymeissä ja sivuketjujen funktionaaliset ryhmät vaikuttavat proteiinien vuorovaikutuksiin. 2 2 2 2 Asparagiinihappo; hapan aminohappo 2 istidiini; emäksinen aminohappo 2 2 2 Fenyylialaniini Seriini 2 Kysteiini 2 S 76
Aminohapot liittyvät toisiinsa peptidisidoksin, jotka muodostuvat aminohapon aminoryhmä reagoi toisen molekyylin karboksyylihapporyhmän kanssa. - sidoksella on osittainen kaksoissidosluonne ja se on siksi tasoimainen ja jäykkä (amidi). Kun esimerkiksi alaniinin karboksyylihapporyhmä reagoi seriinin aminoryhmän kanssa muodostuu alanyyliseriini. 2 3 2 3 2 2 2 Vakintuneen käytännön mukaisesti peptidit piirretään niin, että aminoryhmä on vasemmalla, karboksyylihapporyhmä oikealla. Kaksi tai useampia aminohappotähteitä muodostaa peptidin. Yli 50 aminohappotähdettä sisältävää polypeptidiä sanotaan proteiiniksi. Peptidien aminohappokoostumuksen määrittäminen ja aminohapposekvenssin määrittäminen (sekvennointi) voidaan tehdä automaattisesti. Aminohappokoostumuksen määrittäminen perustuu aminohappojen havaitsemiseen ninhydriinin avulla. Sekvennointi tapahtuu aminohappo kerrallaan: -terminaalinen aminohappo reagoi fenyyli-isotiosyanaatin kanssa, jonka jälkeen aminohappojohdos irrotetaan ja analysoidaan. 14.2. Peptidien kemiallinen synteesi Peptidisidosta muodostettaessa muut mahdollisesti reagoivat ryhmät on suojattava helposti ja selektiivisesti poistettavilla suojaryhmillä Karboksyylihappo-ryhmä suojataan esterinä. Suojaus voidaan poistaa emäshydrolyysillä. 2 3 3, + 2 3 3 Aminoryhmä suojataan Bsuojaryhmällä, joka voidaan poistaa happokäsittelyllä 2 2 tbu tbu tbu 2 =B 77
Vapaa karboksyylihapporyhmä ja aminoryhmä reagoivat keskenään D:n läsnäollessa, jolloin muodostuu peptidisidos. B 2 D 2 3 3 Disykloheksyylikarbodi-imidi B 2 3 3 Suojaryhmät voidaan poistaa selektiivisesti (=vain toinen poistetaan), jolloin vapautuu yksi funktionaalinen ryhmä ja peptidi voi reagoida selektiivisesti suojatun aminohapon kanssa B -,- 3 peptidiketjuun voidaan hallitusti lisätä yksi aminohappo kerrallaan 2 3 14.3. Lipidit Lipidit ovat rakenteellisesti epäyhtenäinen ryhmä ja nimellä tarkoitetaan yleensä yhdisteitä, joita saadaan soluista orgaanisella liuottimella uuttamalla. e sisältävät yleensä pitkiä hiilivetyketjuja tai renkaita ja liukenevat siksi orgaanisiin liuottimiin, mutta eivät juurikaan veteen. Rasvat ja öljyt kuuluvat ensimmäiseen ryhmään. e ovat glyserolin ja rasvahappojen estereitä ja esterisidokset voidaan hydrolysoida hapolla tai emäksellä 2 2 R R R 2 2 Toisen ryhmän yhdisteissä ei ole esterisidoksia, eikä niidä voida hydrolysoida. Ryhmään kuuluvat mm. steroidit, jotka koostuvat neljästä fuusioituneesta renkaasta. Renkaat voivat olla myös aromaattisia ja niissä voi olla heteroatomeita. Kolesteroli ja monet hormonit ovat steroideja A B +3R D 78
Rasvahapot ovat yleensä suoraketjuisia ja sisältävät 12-20 hiiltä. Jos ketjuissa on kaksoissidoksia, ne ovat yleensä cis- muotoa. Jos rasvahapossa on useita kaksoissidoksia, rasvahapon sanotaan olevan monityydyttymätön. Tyydyttymättömien rasvahappojen sulamispisteet ovat yleensä alhaisempia kuin samanpituisten tyydyttyneiden yhdisteiden. Tyydyttymättömät rasvahapot ovat siksi yleensä nestemäisiä, kun taas tyydyttyneet ovat kiinteitä. Tyydyttyneitä rasvahappoja voidaan valmistaa tyydyttymättömiä vedyttämällä. Saippuat ovat rasvahappojen a-suoloja. iitä voidaan valmistaa hydrolysoimalla rasvaa a:lla. Saippuoiden puhdistava vaikutus perustuu siihen, että molekyylien päät ovat erilaiset. Karboksyylihappopää on hydrofiilinen ja pyrkii liukenemaan veteen. iilivetyketju on hydrofobinen ja liuottaa rasvoja. Saippuat ovat pinta-aktiivisia aineita ja ne muodostavat vedessä misellejä, joissa hiilivetyketjut nuodostavat hydrofobisen pallon, joka liuottaa rasvoja. Karboksyylihapporyhmät jäävät pallon pinnalle, mikä parantaa vesiliukoisuutta. Fosfolipidit sisältävät fosforihappoesteriryhmiä. Fosfoglyserideissä glyseroliin on liittynyt kaksi rasvahappoa ja fosforihappoesteri. Rasvahapot ovat 12-20 hiilen pituisia. 1:en liittynyt on yleensä tyydyttynyt, 2:n tyydyttymätön. Fosforihappo on lisäksi esteröitynyt aminoalkoholin kanssa Fosfatidyylikoliinissa fosfaattiryhmä on esteröitynyt koliinin kanssa. Solunpinnan fosfolipidit muodostavat kaksoiskerroksen, jossa hiilivetyketjut ovat aggregoituneet. Polaariset fosfoesteriryhmät peittävät solun ulko- ja sisäpintaa. egatiivinen varaus hylkii anionisia yhdisteitä ja estää niiden pääsyn solunpinnan läpi R 2 2 P R 2 2 3 3 3 Fosfoesteriryhmät Rasvahappoketjut 79
14.4. ukleiinihappojen rakenne ukleiinihapot koostuvat nukleosideista, jotka ovat liittyneet toisiinsa fosfodiesterisidoksin. Sidokset muodostuvat, kun fosforihappo esteröityy yhden nukleosidin 3 -:n ja toisen nukleosidin 5 --ryhmän kanssa ukleosidit koostuvat riboosista (RA:ssa) tai 2 deoksiriboosista (DA:ssa) ja heteroaromaattisesta emäksestä, joka on liittynyt -atomistaan sokerirenkaan 1-asemaan. -glykosidisen sidoksen konfiguraation on β. ukleosidien fosfoestereitä kutsutaan nukleotideiksi. 5' B 4' 2' 1' 3' P B 2 2 Ribonukleosidi: Adenosiini 2 -deoksibonukleotidi: 2 -deoksiguonosiini 3 monofosfaatti P - ukeliinihappoemäkset ovat pyrimidiinin ja puriinin johdannaisia. Emäkset voivat muodostaa vetysitoutuneita G- ja A-T/U emäspareja. Vetysidosten muodostuminen vastakkaisten nukleiinihappoketjujen välille on yksi DA:n kaksoiskierrerakennetta ylläpitävistä vuorovaikutuksista. 2 2 3 2 Adeniini Guaniini Sytosiini Urasiili Tymiini 80
14.5. DA:n sekvennointi ja kemiallinen DA-synteesi SM -08 Maxamin ja Gilbertin menetelmä perustuu tietylle emäkselle selektiivisiin kemiallisiin reaktioihin. 1.DA ketju leimataan: Ketjun päässä olevaan 5 - ryhmään liitetään 32 P leimattu fosfaattiryhmä analysoinnin helpottamiseksi. 2.Leimattu DA jaetaan neljään osaan, jotka käsitellään niin, että DA ketju katkeaa tietyn emäksen kohdalta. losuhteet valitaan niin, vain osa ketjuista katkeaa. Esim. 32 P-G-A--A-T-G-A-G-T-A-G---T A-spesifinen reaktio 32 P-G, 32 P-G-A-, 32 P-G-A--A-T-G, 32 P-G-A--A-T-G-A-G-T 3. Erimittaiset DA-fragmentit voidaan erottaa geelielektroforeettisesti Jokaisesta reaktiosta otetaan näyte, joka aplikoidaan geelille. Laitteeseen kytketään jännite, jolloin varautuneet hiukkaset kulkeutuvat kohti vastakkaismerkkistä elektrodia. DA-fragmenteissa on negatiivinen varaus (fosfodiesterisidoksissa) ja sähkökentässä ne kulkevat kohti + - elektrodia Geeli hidastaa kulkeutumista sitä enemmän, mitä suurempi fragmentti on erottuvat koon perusteella. A G T Fragmentit voidaan havaita radioaktiivisuuden perusteella ja emäsjärjestys voidaan lukea levyltä aloittaen alhaalta ja edeten ylöspäin. ligonukleotidisynteesi. ligonukleotideja, DA- ja RA fragmentteja, voidaan syntetisoida kemiallisesti. Pieniä molekyylejä (2-3 nukleosidia) voidaan valmistaa liuoksessa, mutta pidemmät syntetisoidaan automaattisesti DAsyntetisaattorissa. Syntetisaattorin toimintaperiaate on yksinkertainen: oligonukleotidin ensimmäinen nukleosidi kiinnitetään kiinteälle kantajalle, jonka jälkeen selektiivisesti suojatut nukleosidit liitetään kasvaan ketjuun yksi kerrallaan. Lopuksi valmis ketju irroitetaan kiinteästä kantajasta ja suojaryhmät poistetaan. Myös peptideille on kehitetty omat sekvensointimenetelmänsä ja vastaavasti niitä voidaan myös syntetisoida peptidisyntetisaattorissa. 81