Molekyylibiologian perusmenetelmät 740151P Biokemian menetelmät I 26.9.2017 Juha Kerätär / BMTK
Päivän aiheet Mitä on molekyylibiologia? Mitä ovat keskeiset molekyylibiologian menetelmät ja mihin ne perustuvat? Tavoitteet: Opiskelija tietää ja osaa kertoa, mitä tarkoittaa molekyylibiologia. Opiskelija ymmärtää molekyylibiologian perusmenetelmien biokemiallisen taustan ja osaa kertoa mihin menetelmiä voidaan käyttää. 2
Keskustelu Keskustelkaa parin kanssa tai pienessä ryhmässä: Mitä tarkoittaa molekyylibiologia? Mitä on geeniteknologia? Muutama minuutti keskustelua, jonka jälkeen kommentteja. 3
Molekyylibiologia Molekyylibiologia on biologian osa-alue, joka tutkii elävissä soluissa esiintyvien orgaanisten yhdisteiden molekulaarisia ominaisuuksia. Molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät ovat mahdollistaneet esimerkiksi genomiseen DNA:han ja lähetti-rna:han taltioidun tiedon tutkimisen. Menetelmät ovat kehittyneet viimeisen 30-40 vuoden aikana. Tätä ennen tutkittiin proteiineja, tuntematta niitä koodaavia geenejä! 4
Yhdistelmä-DNA (recombinant DNA) EX 1 INT EX 2 INT EX 3 Genominen DNA 5 cap ekspressio poly A käänteiskopiointi mrna DNA-molekyyli, joka syntyy, kun laboratoriossa yhdistetään eri lähteistä olevaa geneettistä materiaalia koeputkessa puhutaan myös kloonauksesta. Tutkittava geeni liitetään kuljettaja-dna:han, esimerkiksi plasmidi-dna:han. Liitettävä DNA: insertti Kuljettava DNA: vektori Alkuperäisestä DNA:sta ekspressoidaan lähetti-rna (mrna, messenger RNA), josta tehdään käänteiskopioijaentsyymillä (reverse transcriptase) komplementaarinen DNA (cdna, complementary DNA). cdna Tutkittavaa geeniä voidaan monistaa bakteerisoluissa. kloonaus Geeni voidaan ilmentää eli ekspressoida mrna:ksi ja siitä edelleen translaation kautta proteiiniksi. 5
DNA-insertin liittäminen vektori-dna:han Tutkittava geeni eristetään solusta tai monistetaan solun ulkopuolella. Katkaistaan siirrettävä DNA-jakso (insertti) ja vektori, johon DNA ollaan siirtämässä siten, että niihin muodostuvat samanlaiset yhteenliittyvät päät. Klassinen menetelmä DNA:n leikkaamiseen ovat restriktioentsyymit. Yhdistetään tutkittava DNA ja vektori. Siirretään vektori isäntäsoluun. Vektori monistuu ja proteiinia tuotetaan geenin ohjeen mukaan. 6
Vektorit ja plasmidit Tyypillisin vektori laboratoriossa on vektorina käytettäväksi muokattu plasmidi. Plasmidit ovat luonnossa lähinnä bakteereissa esiintyviä, kromosomin ulkopuolella sijaitsevia kaksijuosteisia DNA-rakenteita. - Rengasmaisia, kooltaan kromosomaalista DNA:ta pienempiä (laboratorioplasmidit tyypillisesti 1000-20000 bp eli 1-20 kbp). - Itsenäisesti kahdentuvia. - Voivat siirtyä bakteerista toiseen. - Voivat sisältää bakteerille hyödyllisiä geenejä, esimerkiksi jonkin antibioottiresistenssin antava geeni. Plasmideja on muokattu kaupallisesti tutkimuskäyttöön, näitä käytetään vektoreina. - Kloonausvektori: käytetään insertin monistamiseen. - Ilmentämis- eli ekspressiovektori: käytetään proteiinin tuotantoon. 7 - Muokattu promoottorialue mrna:n synteesiä varten. - Puhdistusmerkki esim. histidiini-tag (His-tag) - mrna:n synteesin lopetuskoodi
Antibioottiresistenssigeeni, marker: mahdollistaa vain plasmidin sisältävien solujen säilyttämisen kasvatuksessa. MCS, multiple cloning site, polylinker: alue, jolla katkaisukohtia useille restriktioentsyymeille. 8 ORI, origin of replication: plasmidin replikaation aloituskohta
Restriktioentsyymit (restriktioendonukleaasit) 5 N N N G A A T T C N N N 3 3 N N N C T T A A G N N N 5 Entsyymeitä, jotka katkaisevat kaksijuosteisen DNA:n tietyn nukleotidisekvenssin kohdalta. Tunnistavat DNA:sta tietyn emäsjärjestyksen, joka usein on palindrominen (esim. kuvassa EcoRI). - Katkaisussa leikkauskohtaan muodostuu kohesiivinen pää (cohesive end, sticky end), jossa on yhden tai useamman nukleotidin yksijuosteinen osa (overhang). Joillain restriktioentsyymeillä muodostuu tylppä pää (blunt end) jossa tätä ei ole. Restriktioentsyymit ovat peräisin bakteereista. - Pilkkovat bakteereille vierasta DNA:ta. - Bakteereiden oma DNA on suojattu metyloimalla. Saatavana on satoja erilaisia kaupallisia restriktioentsyymejä - Esim. NEB: https://www.neb.com/products/restrictionendonucleases 9
DNA:n katkaisu restriktioentsyymillä (digestio) Sama entsyymi katkaisee aina saman sekvenssin mistä tahansa DNA:sta. Samanlaiset kohesiiviset päät insertissä ja vektorissa tarttuvat toisiinsa. DNA:t voidaan liittää saumattomasti toisiinsa ligaatioreaktiossa DNA-ligaasientsyymillä. Yhdistelmä-DNA Restriktioentsyymin toimintateho: 1 U (unit) = entsyymin määrä, joka pilkkoo 1 µg DNA:ta optimiolosuhteissa yhdessä tunnissa (yksi katkaisukohta). Entsyymi toimii tietyssä puskuriliuoksessa: - ph, suolapitoisuus, tarvitaanko albumiinia (BSA)? - Uudemmat kaupalliset restriktioentsyymit usein muokattu toimimaan samassa puskuriliuoksessa perinteisten kanssa täytyy olla tarkempi. Entsyymi lisätään viimeisenä jäillä olevaan reaktioputkeen. Pilkkomisen reaktiolämpötila tyypillisesti +37 C riippuu entsyymistä. Entsyymin säilytys työskennellessä jäillä, ja sen jälkeen -20 C. Entsyymi viimeisenä pakkasesta reaktioon, ja ensimmäisenä takaisin pakkaseen! 10
Laskuesimerkki Reaktion kokoaminen: - Pipetoidaan jäillä olevaan 1,5 ml mikroputkeen (eppendorf-putkeen, eppariin ): dh 2 O 23,8 µl Plasmidi (500 µg/ml) 8 µl EcoRI-reaktiopuskuri (5x) 8 µl EcoRI (20 U/µl) 0,2 µl 40 µl - Annetaan digestion tapahtua 1 H +37 C vesihauteessa tai lämpöblokissa. - Mitä muuta tarvitaan: jäitä tai kylmäblokki entsyymin säilyttämiseen; automaattipipettisarja; lämpöblokki tai lämmitettävä vesihaude; putki; vortex; minisentrifugi. Sinun pitää katkaista 4 µg plasmidi- DNA:ta EcoRI-restriktioentsyymillä. Reaktion kokonaistilavuus on 40 µl. Käytössä olevat reagenssit: Plasmidi-DNA, pitoisuus 500 µg/ml EcoRI-reaktiopuskuriliuos, 5x Restriktioentsyymi EcoRI, 20 U/µl. Kuinka paljon komponentteja pipetoit DNA:n katkaisureaktioon? Mitä välineitä tarvitset? Plasmidi: V = 4 µg 500 µg Puskuri: V = ml 1x 40 µl 5x = 0,008 ml = 8 µl = 8 µl Restriktioentsyymi: V = 4 U 20 U µl = 0,2 µl Vesi: V = 40 µl 8 µl 8 µl 0,2 µl = 23,8 µl 11
Keskustelu Keskustele vierustoverin kanssa: Mikä on polymeraasiketjureaktio (PCR) ja mitä sillä voidaan tehdä? Mitä reaktioon tarvitaan? Mitä reaktiossa tapahtuu? 12
Polymeraasiketjureaktio (PCR) PCR (polymerase chain reaction) mahdollistaa tarkasti valitun DNA-jakson, esimerkiksi yhden geenin monistamisen koeputkessa. Ensimmäiset julkaisut DNA:n monistamisesta koeputkessa 70-luvun alussa (Kleppe ja Khorana), menetelmä kehitettiin lopullisesti 1983 (Mullis). Kary Mullisille kemian Nobel 1993. Avain teknologian kehittämiseen DNApolymeraasin eristäminen termofiilisistä (kuumissa oloissa elävistä) bakteereista Thermus aquaticus. Polymeraasi aktiivinen olosuhteissa, joissa DNA on denaturoitunut. Haluttu DNA-jakso rajataan käyttäen alukkeita, lyhyitä oligonukleotideja jotka sitoutuvat monistettavaan DNA-jaksoon, templaattiin. Reaktiossa syntynyt uusi DNA-juoste voi toimia uutena templaattina DNA:n määrä kasvaa reaktiossa eksponentiaalisesti. 13
Mitä PCRreaktioon tarvitaan? Lämpötila riippuu alukkeen sekvenssistä! Templaatti-DNA (template) Templaattiin spesifisesti sitoutuvat oligonukleotidi-alukkeet (primer, forward ja reverse) Vapaita deoksinukleotideja: datp, dgtp, dctp, dttp (dntp-seos) Puskuriliuos, joka sisältää MgCl 2 :a, polymeraasientsyymin kofaktoria Korkeita lämpötiloja kestävä DNApolymeraasientsyymi: useita erilaisia entsyymejä saatavana kaupallisesti. PCR-laite: lämpöhaude, joka nopeasti ja tarkasti lämmittää ja viilentää näytteitä haluttuihin lämpötiloihin, ja pitää ne niissä. 14
PCR-alukkeet 5...CTACGGATTAGCGTGGCAATCGATGAACGT... 5 -CGGATTAGCGTGGCAATC-3 3...GATGCCTAATCGCACCGTTAGCTACTTGCA......TGCCATGAAGGCTCCGATGCTTAAGCCCTA... 3 3 -CGAGGCTACGAATTCGGG-5...ACGGTACTTCCGAGGCTACGAATTCGGGAT... 5 5 -pää: fosfaattiryhmä 3 -pää: hydroksyyliryhmä Synteettisiä oligonukleotideja. Toinen aluke koodaavan juosteen, toinen ei-koodavan juosteen sekvenssiä. Alukkeiden 3 -päät (= alukkeen pää, johon polymeraasi alkaa rakentaa uutta DNAjaksoa) toisiaan kohti. Alukkeet voi suunnitella itse, tai käyttää suunnitteluohjelmaa (tarkemmin Molekyylibiologia I kurssilla). Alukkeen pituus tyypillisesti 18-24 bp. Alukkeita käytetään aina parina, parilla oltava suunnilleen sama sulamislämpötila (T m ) jotta ne toimivat PCR-reaktiossa hyvin. Tm määrittää reaktiossa käytetyn Alukkeet tilataan kaupalliselta valmistajalta. 15
Mitä PCR-reaktion aikana tapahtuu? 4. Uusi sykli: palataan kohtaan 1 ja denaturoidaan syntynyt kaksijuosteinen DNA. Sykli toistetaan yleensä 20-30 kertaa. PCR-reaktion edetessä synteesin mallina (templaattina) toimii yhä useammin reaktion aikana syntynyt DNAjuoste. 1. DNA:n denaturoituminen: juosteet irtoavat toisistaan korkeassa lämpötilassa (98 C). 2. Sitoutuminen (annealing): lämpötilaa lasketaan, alukkeet sitoutuvat templaattiin (esim 55 C). 3. DNA:n synteesi: polymeraasi syntetisoi deoksinukleotideista uuden juosteen alukkeiden jatkeeksi, käyttäen templaatti-dna:ta mallina (72 C). DNA monistuu PCRreaktiossa eksponentiaalisesti: Teoriassa esim. 30 sykliä = 2 30 = 1,07 x 10 9 kertainen kohdesekvenssin monistus! 16
Esimerkki PCR-reaktion suunnittelusta 500 µl https://www.neb.com/applications/dna-amplification-pcrand-qpcr 17
Huomioita PCRreaktion tekemisestä laboratoriossa Polymeraasiketjureaktio on herkkä menetelmä: pienikin määrä DNA:ta voidaan monistaa moninkertaiseksi. Työskentele puhtaasti, ja käytä steriilejä pipetinkärkiä ja putkia pyritään estämään vieraan DNA:n pääsy kontaminoimaan reaktio. Reaktioissa usein varsinaisen PCR-reaktion lisäksi kontrollireaktioita: Esimerkiksi kontrolli-pcr-reaktio, joka muuten samanlainen kuin varsinainen PCR, mutta templaatti-dna:n tilalla dh 2 O. Jos tässä reaktiossa monistuu DNA:ta, jokin työväline tai reagenssi kontaminoitunut! Liiallinen templaatin määrä voi inhiboida reaktiota. Onnistumisen kannalta tärkeintä: alukkeiden suunnittelu ja oikea sitoutumislämpötila; reaktion tarkka kokoaminen. 18
Yhdistelmä-DNA:n monistaminen bakteereissa Escherichia coli -bakteerin pesäkkeitä agaroosimaljalla Yhdistelmä-DNA (tyypillisesti plasmidi- DNA:na) siirretään bakteeriin transformaatioreaktiolla (transformation). Genetiikassa transformaatio = ulkoisen geneettisen informaation siirto soluun. Käsitellään tarkemmin kurssilla Molekyylibiologia I. Bakteereja kasvatetaan ensin maljalla, mutta plasmidin tai plasmidin sisältämän geenin ohjeella tuotetun proteiinin eristämiseksi bakteereista tehdään liuoskasvatus. Muista ohjeet bakteerijätteen käsittelyyn luennolta 1! 19
GMM geenimuunnellut mikro-organismit Yhdistelmä-DNA:n siirtäminen bakteeriin tai muuhun isäntäsoluun synnyttää geenimuunnellun mikro-organismin (GMM). Käytetyistä GMM:eista pidettävä kirjaa, tarpeen tullen tehtävä ilmoitus valvovalle viranomaiselle. (ks. Luento 1) http://www.geenitekniikanlautakunta.fi/ 20
Selektiivisellä maljalla kasvatettu yksittäisiä bakteeripesäkkeitä, joissa käytetty plasmidi. Tuotetaan siirretyn geenin koodaama proteiini uudessa kasvustossa, joka siirrostetaan y/y kasvustosta: Lämpötila +37 C Aika 2-3 h y/y Kasvatusliuos ehkä erilainen Bakteerien kasvatus Pesäkkeen siirrostus Kasvatus LBliemessä, jossa antibiootteja, y/y +37 C sekoittajassa Monistuneen plasmidi-dna:n eristys Bakteeripesäke siirrostetaan maljalta steriilisti kasvatusliuokseen. Kaikkien käytettävien tarvikkeiden tulee olla steriilejä. Kasvatusliuos tyypillisesti LB-liemi, joka sisältää pääasiassa hiivauutetta ja tryptonia (trypsiinillä hajotettua proteiinia). Antibioottia voidaan lisätä kasvatusliuokseen, jotta vain tietyn plasmidin sisältävät bakteerit kasvavat. Kasvatusastian tulee olla tilavuudeltaan vähintään 5x suurempi kuin kasvatusliuoksen tilavuus (hapetus!). Kasvatetaan yön yli sekoittavassa inkubaattorissa, yleensä +37 C. Yön yli kasvatetusta kasvustosta voidaan: Eristää plasmidi-dna:ta. Tehdä uusi, hyvässä kasvuvaiheessa oleva kasvusto, jossa voidaan tuottaa rekombinanttiproteiinia. Bakteerisolut kerätään sentrifugoimalla. 21
Plasmidi-DNA:n eristys Bakteerisolujen hajotus Alkaalinen (NaOH) puskuriliuos hajottaa solut. Lisäksi puskurin EDTA kelatoi Mg 2+ -ionit, joita DNAasit tarvitsevat toimiakseen. RNAasi hajottaa solulysaatin RNA:n. Plasmidi-DNA:n eristäminen alkaalisissa (emäksisissä) olosuhteissa perustuu plasmidien pienempään kokoon verrattuna bakteerin kromosomaaliseen DNA:han. Alkaalinen DNA:n denaturaatio: Alkaalisessa, NaOH:a sisältävässä liuoksessa sekä plasmidi että kromosomaalinen DNA denaturoituvat. SDS-detergentti denaturoi ja saostaa proteiineja ja hajottaa lipidejä. Liukoisen plasmidi-dna:n keräys: Solujätteet (solukalvot, saostuneet proteiinit ja kromosomaalinen DNA) poistetaan sentrifugoimalla, jolloin plasmidi-dna jää liukoisena supernatanttiin. Näytteen neutralointi: Näyte neutraloidaan nopeasti lisäämällä kaliumasetaattia, jolloin plasmidi-dna renaturoituu, mutta suurempi kromosomaalinen DNA ei ehdi renaturoitua vaan saostuu. 22
Supernatantista plasmidi-dna voidaan puhdistaa edelleen joko uuttamalla tai käyttämällä pylväskromatografiaa (kaupallinen kitti). Plasmidi-DNA:n uuttaminen: Supernatanttiin lisätään fenoli-kloroformia ja sentrifugoidaan, jolloin proteiinit jäävät orgaaniseen faasiin. Plasmidi-DNA:n saostaminen: Vesifaasissa oleva DNA saostetaan suolalla ja isopropanolilla. Plasmidi-DNA:n puhdistus pylväskromatografialla: Supernatantissa oleva plasmidi-dna sidotaan silikageelimatriksiin kaotrooppisen suolan (esim. guanidiinihydrokloridi) avulla. Suola poistaa veden DNA:n ympäriltä, jolloin DNA:n rungon ja silikageelin negatiiviset ryhmät voivat sitoutua positiivisten ionien kautta. Plasmidi-DNA:n keräys: Plasmidisakka sentrifugoidaan erilleen. Pesu: DNA-pelletti pestään 70% etanolilla. DNA:n liuotus: Sakan annetaan kuivua ja DNA liuotetaan steriiliin veteen tai laimeaan Tris-puskuriin. Plasmidi-DNA:n pesu: Epäpuhtaudet pestään pylväästä korkealla suolapitoisuudella ja etanolilla. Plasmidi-DNA:n eluointi: DNA eluoidaan silikageelistä laskemalla suolapitoisuutta, yleensä Tris- tai Tris- EDTA-puskurilla jonka ph 8-9 23 https://www.youtube.com/watch?v=8xedej0dhfa
Eristetyn plasmidi-dna:n puhtauden ja pitoisuuden määritys Eristetyn plasmidin pitoisuutta ja puhtautta tutkitaan puhdistuksen jälkeen tyypillisesti spektrofotometrisesti kertaa spektrofotometriaa käsitelleeltä luennolta ja laskuharjoituksista miten. Haluttaessa tarkistaa esimerkiksi onko eristetyn plasmidin koko mitä pitäisi, voidaan leikata plasmidirengas auki (= linearisoida plasmidi) restriktioentsyymillä ja ajaa agaroosigeelielektroforeesi (käsitellään myöhemmillä luennoilla). Pieni proteiiniepäpuhtaus eristetyssä plasmidissa ei tyypillisesti estä sen käyttämistä jatkokokeissa. Kaupallisessa eristyksessä myös pylväästä irronnut silika voi muuttaa A 260 /A 280 -suhdetta. Tyypillinen saanto plasmidia kaupallisella kitillä kahdesta ml:sta yön yli kasvustoa: esim. 50 µl, 50-500 ng/µl. Käytettävä plasmidi voi vaikuttaa! 24
Mihin eristettyä plasmidia voidaan käyttää? Plasmidista voidaan katkaista insertti, esimerkiksi siihen aiemmin liitetty geeni, ja siirtää uuteen vektoriin. Plasmidia voidaan käyttää templaattina PCR-reaktiossa, kun kloonataan inserttiä uuteen vektoriin. Plasmidi voidaan siirtää bakteeriin, hiivaan tai muuhun eukaryoottisoluun ja tuottaa siinä plasmidin (eli sen insertin) koodaamaa proteiinia. 25
26 Esimerkki: Geenin kloonaus uuteen ekspressiovektoriin Plasmidin voi esimerkiksi imeyttää puhtaaseen filtteripaperiin, ja lähettää kuivalähetyksenä kirjekuoressa. Plasmidia jossa tutkittava geeni saatu toiselta tutkijalta vähän (muutama µg). Siirretään plasmidi bakteeriin (transformaatio), kasvatetaan bakteerikasvusto, eristetään plasmidi. Geeni on plasmidivektorissa, joka ei sovi käyttämääni isäntäsoluun. Voin joko: Katkaista geenin entisestä vektorista, tai Monistaa geeniä PCR:llä Uudessa vektorissa ei ole samoja katkaisukohtia kuin vanhassa, joten joudun käyttämään PCR:ää. PCR, PCR-tuotteen ja uuden vektorin katkaisu samoilla restriktioentsyymeillä, ligaatio, bakteerin transformaatio, plasmidin eristys, sekvensointi (= tarkistus). Lopputuloksena plasmidivektori, jolla voin tuottaa proteiinia käyttämissäni isäntäsoluissa.
Genomisen DNA:n eristäminen Genominen DNA on pitkäketjuista ja hajoaa helposti. Solut on hajotettava mahdollisimman hellävaraisesti. Solujen tai kudoksen hajotus (lyysaus): Esim. Tris-puskuri, jossa EDTA:a ja SDS:a, lisäksi proteinaasi K:ta, RNAasia ja lysotsyymiä. DNA:n uutto: Lysaattiin lisätään fenolia tai fenolikloroformia ja sentrifugoidaan, jolloin lysaatin proteiinit jäävät orgaaniseen faasiin. DNA:n kerääminen, pesu ja liuotus DNA:n saostaminen: Vesifaasissa oleva DNA saostetaan suolalla ja isopropanolilla tai etanolilla. 27
Mihin genomista DNA:ta tarvitaan? Mutaatioiden etsiminen kudoksesta tai soluista. Geenin tai geenialueen kloonaaminen. Geenien säätelyalueiden tutkiminen. Muuntogeenisten eläinten tunnistaminen. 28
RNA:n eristäminen RNA on herkkä ribonukleaaseille eli RNAaseille, eli RNA:ta hajottaville entsyymeille. RNAaseja on kaikkialla, esimerkiksi iholla, ja ne ovat usein sekä aktiivisia että hyvin erilaisia olosuhteita kestäviä (stabiileja). RNA-töissä kiinnitetään erityistä huomiota työtapoihin: Käsineet kaikissa työvaiheissa kädet yleisin kontaminaation lähde (myös esim. pipettikotelon täyttö!). Käytä steriileja, mielellään kertakäyttöisiä välineitä. Liuokset käsiteltävä dietyylipyrokarbonaatilla (DEPC), joka inaktivoi RNAaseja, ja autoklavoitava. Autoklaavissa DEPC hajoaa etanoliksi ja hiilidioksidiksi. Välineet, joita ei voida autoklavoida käsitellään detergentillä (esim 0,5% SDS) ja huuhdellaan RNAasivapaalla vedellä (DEPC-H 2 O). 29
Totaali-RNA:n eristäminen Solujen tai kudoksen hajotus: Proteiinit (ml. RNAasit) denaturoidaan voimakkaasti: lyysipuskurissa guanidiinisuoloja, SDS:ää, β- merkaptoetanolia. RNAasit denaturoitava solut lyysattaessa, jonka jälkeen happamissa uuttoolosuhteissa DNA on liukoinen fenoliin, mutta RNA jää vesifaasiin. RNA:n uutto: Lysaattiin lisätään hapanta fenolia tai fenoli-kloroformia ja sentrifugoidaan, jolloin DNA ja proteiinit jäävät orgaaniseen faasiin. RNA:n kerääminen, pesu ja liuotus RNA:n saostaminen: Vesifaasin RNA saostetaan suolalla ja isopropanolilla. 30 https://www.thermofisher.com/fi/en/home/references/ambion-techsupport/rna-isolation/general-articles/the-basics-rna-isolation.html
Mihin totaali- RNA:ta käytetään? RNA-siru-tekniikoilla voidaan esimerkiksi tutkia satojen eri geenien ilmentymistä eri kudoksissa. Geenien ilmentymisen (ekspression) tutkimus: Käänteistranskriptio-PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) tai kvantitatiivinen RT-PCR (qrt-pcr) Northern-blottaus RNA-siru-analyysit (RNA-microarray) Lähetti-RNA:n (mrna) eristäminen. cdna:n synteesi cdna:n kloonaus Mutaatioiden etsiminen 31
Loppukertaus Kirjoita tai piirrä lyhyt yhteenveto seuraavista aiheista: Plasmidi-DNA:n, genomisen DNA:n ja totaali-rna:n eristämisen erot. Miten erilaiset nukleiinihapot saadaan puhdistettua solu- tai kudoslysaatista, ja mihin puhdistuminen perustuu? Kun olet valmis, vaihda yhteenvetosi vierustoverin kanssa. Täydentäkää toistenne yhteenvetoja, ja sen jälkeen keskustelkaa täydennyksistä. 32