Agaroosigeelielektroforeesi (AGE) Johdanto Agaroosigeelielektroforeesi (AGE) on yksinkertainen ja tehokas menetelmä erikokoisten DNA/RNA -jaksojen erottamiseen, tunnistamiseen ja puhdistamiseen. Agaroosigeelielektroforeesin idea on yksinkertainen: negatiivisesti varautuneet DNA-palaset (engl. fragments) ajetaan sähkökentässä kohti positiivista napaa (anodi) agaroosigeelissä (kuva 1). Pienet palaset liikkuvat geelissä nopeammin kuin pitkät. Geelin agaroosiprosentti tulee valita aina kohteen mukaan, koska yhdellä geelillä ei pysty ajamaan pieniä ja suuria fragmentteja samanaikaisesti tarkasti (kuva 2). Käytännössä menetelmää käytetään tuntemattomien DNApalasten mittaamiseen DNA-töissä. Peruslaboratoriotöiden lisäksi sovellutuksia aiheesta löytyy mm. elintarvikediagnostiikasta ja rikostutkinnassa. Agaroosielektroforeesista löytyy paljon materiaalia internetistä (kuva 3). Näppäriä ja havainnollisia simulaatioita löydät esim. hakusanoilla: Virtual Lab Agarose Gel Electrophoresis of Restriction Fragments. Kuva 1 Agaroosielektroforeesin periaate. Kuva 2 Agaroosigeelin toimivuusalueet erilaisilla agaroosipitoisuuksilla.
Kuva 3 AGE-simulaatio-ohjelmilla voi tutustua tehokkaasti aiheeseen. (kuvan lähde: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html) HUOM! DNA-töiden työturvallisuus: 1. Agaroosigeelielektroforeesissa on muistettava leimamolekyylin mahdollinen mutageenisyys ja toksisuus. Yleisesti käytetty merkkiaine, etidiumbromidi, EtBr on mutageeninen ja kaikki syntyvät jätteet ovat ongelmajätteitä. Töissä on käytettävä aina käsineitä ja suojatakkia. Huomaa, että eri merkkiaineiden, esim. SYBR kanssa työskennellään hieman eri tavoin. 2. Silmät on aina suojattava UV-valolta. Paljaan ihon altistaminen UV:lle on minimoitava. 3. Liuottimia (kloroformi ja fenoli) käsitellään vetokaapissa suojakäsinein varustautuneena. Varmista suojakäsineiden sopivuus ko. kemikaaleille. 4. Geneettisesti muokattujen mikrobien käyttö on luvanvaraista toimintaa. Lisätietoja aiheesta löydät hakusanalla geenitekniikan lautakunta. Geeniteknisesti muokattuja mikrobeja sisältävät kasvatusmediumit ja -maljat ja muut tarvikkeet tuhotaan esim. autoklavoimalla. Muista nämä AGE-ajoissa: 1. Valitse leima ja leimaustapa. Värjätäänkö geeli ennen ajoa (EtBr:llä tehdään usein näin), sen jälkeen vai värjätäänkö näytteet. Muista, että värjäysreagenssi vaikuttaa vyöhykkeiden liikkuvuuteen geelillä. Valitse myös tarkoitukseen sopiva näytepuskuri (engl. loading dye). 2. Näyte määrää ajo-olosuhteet eli selvitä tarvittava agaroosiprosentti. Pienet fragmentit (joitakin satoja emäspareja) tarvitsevat tiukan geelin 2-3 % ja isommille palasille (500 10000 bp) sopii noin 1-prosenttinen geeli (kuva 2). 3. Pipetoi näytteet varovasti näytekoloihin nesteen alle puhkomatta geeliä. 4. Aja kohti positiivista napaa. 5. Kuvaa ajettu geeli oikein. Useimmiten geeli asetetaan UV-valon päälle, valitaan sopiva suodatin ja kuvataan. Muista sammuttaa kamera ja UV-valo töiden lopuksi ettei UV-säteily pilaa kameraa.
Laboratoriotyö: Agaroosigeelielektroforeesi EtBr-leimalla Geelin valmistaminen Näytteiden ja standardien pipetointi Ajo Tulosanalyysi Geelin valmistus 1. Mittaa geelin tilavuus, usein pienelle geelitarjottimelle sopiva geelin määrä on 50-60 ml. 2. Selvitä näytteiden mukaan sopiva geelin agaroosipitoisuus (kuva 2). Punnitse agaroosi, lisää 10xTBE tai TAE-puskuri ja vesi (vaihtoehtoisesti 1xTBE tai TAE). 3. Kuumenna agaroosi ja puskuri esim. mikroaaltouunissa varovasti (kiehuu helposti yli) kunnes kaikki agaroosi on liuennut nesteeseen. Kiehautettaessa seoksesta saattaa haihtua runsaasti vettä. Tämän vuoksi on tarpeen merkitä astian kylkeen merkki ennen lämmittämistä. Mikäli haihtumista on tapahtunut paljon, täydennetään nestemäärä vedellä merkkiin asti. 4. Jäähdytä liuos alle 65 o C:n lämpötilaan ja lisätään etidiumbromidiliuosta niin että loppupitoisuus on 0,5 µg/ml. Tässä työssä ajopuskuriin ei lisätä etidiumbromidia. Muita mahdollisia tapoja ovat etidiumbromidin lisääminen ajopuskuriin heti tai ajaa ilman väriainetta ja värjätä geeli ajon jälkeen. Vältä EtBr-pölyä työskennellessä, käytä tabletteja tai liuoksia. 5. Kaada sopivan lämpöinen geeli valumuottiin ja aseta sopiva näytekampa paikoilleen. Geeli käytetään yleensä heti, mutta sitä voi säilyttää pari päivää kylmässä muoviin käärittynä (kuivuminen estettävä). Näytteiden käsittely 1. Näytteestä, harjoitustyössä voi näytteenä olla myös vaikka toinen standardi, otetaan esim. 1 µl ja 10 µl näyte koeputkiin agaroosigeelielektroforeesia varten. 2. Lisätään esim. 6xnäytepuskuria näytetilavuudesta riippuva määrä. Lopputilanteessa näytepuskurin tulee olla 1x. Pipetin kärki kannattaa irrottaa ja jättää eppariin ja käyttää samaa kärkeä uudelleen geelille pipetointiin.
Geelille pipetointi Ajo 1. Aseta valettu agaroosigeeli ajolaitteeseen. 2. Täytä allas ajopuskurilla (1xTBE tai 1xTAE) siten, että geeli juuri ja juuri peittyy. 3. Geelille pipetointi pitää suorittaa rauhallisesti pipetin mäntää painaen käden tärisemättä. Näytepuskurin sininen väri helpottaa pipetointia. Älä paina pipetin kärjellä näytekolon pohjaa puhki. Muista varoa pipetoitavan nesteen loputtua ilmakuplaa, muutoin voit menettää näytteesi sen levitessä ajopuskurin sekaan. 4. Muista käyttää myös jotakin DNA:n kokomarkkeeria (kokostandardi). Lambda-DNA-markkeereita käytettäessä tulos paranee, mikäli näytettä kuumennetaan ennen geelille pipetointia +65 o C:ssa. Merkitse geelille pipetoimiesi näytteiden järjestys työpäiväkirjaasi heti. 1. Kun näytteet ovat näytekoloissa, aseta ajolaitteen kansi päälle - Selvitä miten se on OIKEIN PÄIN. 2. Kytke virta päälle. Säädä jännite sopivaksi, yleensä 60 100 V. Varmista vielä, että olet pannut kannen oikein päin paikalleen, jotta näytteet lähtevät oikeaan suuntaan. 3. Lopeta ajo kun väririntama on geelin toisessa reunan tuntumassa. Näytepuskurin väri kertoo ajon etenemisestä. Kun olet arvioinut värin edenneen riittävästi (useimmiten noin ½-1 h), kytke virta pois virtalähteestä ja irrota ajolaitteen johdot virtalähteestä. 4. Nosta käyttämäsi laitteen kansi pois ja varovasti geeli ajotarjottimella ylös ajoaltaasta. Valuta puskuri pois (älä pudota geeliä) ja kuivaa geelitarjotin. HUOM: puskurissa on nyt geelistä irronnutta leimaa (EtBr) eli käsittely AINA hanskat kädessä. Geelin tarkastelu ja dokumentointi (kuvaaminen) 1. Siirrä geeli alustoineen valotuspöydälle ja kytke UV-valo päälle. Mikäli erottumista ei vielä ole tapahtunut riittävästi, ajoa jatketaan kunnes haluttu erotus havaitaan. Mikäli tulokseen ollaan tyytyväisiä, voidaan geeli kuvata kameran avulla. Älä paista geeliä kuin tarvittavan ajan UVvalossa, koska UV-valo tuhoaa DNA:ta ja mahdolliset jatkotyöt käyvät näin vaikeammiksi. 2. Säädä monitorissa näkyvä kuva tarkaksi, usein voit myös rajata sitä zoomilla sekä säätää valotusta. Tallenna tai tulosta raakakuva kun olet näkemääsi tyytyväinen. 3. Laske lopulliset tulokset ohjelmiston tai taulukkolaskentaohjelman avulla.
Laboratoriotyö: Agaroosigeelielektroforeesi SYBR-leimalla SYBR toimii parhaiten (herkimmin) jälkivärinä, mutta sitä voi käyttää myös näytteiden värjäämiseen. SYBRväri ei ole yhtä mutageenistä kuin EtBr ja SYBR-värin avulla analyysiherkkyys on mahdollista saada myös hyväksi. Näiden seikkojen takia EtBr:n korvaavia värejä käytetään yhä enenevissä määrin. On kuitenkin syytä muistaa, etteivät mutageenisyys ja toksisuus kulje käsi kädessä eli vähemmän mutaatioita aiheuttava aine voikin olla vastaavasti toksisempi. EtBr-jäte on aina ongelmajätettä eli tästä aiheutuu lisäkustannuksia. Jotkin vaihtoehtovärit saa hävittää normaalin sekajätteen mukana esimerkiksi USA:ssa. EtBr-geelien kuvantamisessa tarvitaan UV-valoa, mutta monia vaihtoehtovärejä voidaan virittää myös esim. normaalilla sinisellä valolla ja näin työturvallisuus paranee. 1. Hae valuallas tarvikkeineen sekä steriilejä eppendorf-putkia ja pipetinkärkiä. 2. Tarkista/sovita geelin päädyt pitäviksi. 3. Mittaa geelin tilavuus, sopiva geelipaksuus on 3-4 mm. 4. Suunnittele oikea agaroosiprosentti näytteen perusteella (usein perus-dna-töissä noin 0,8 %). 5. Sovita sopiva näytekampa oikealle korkeudelle ja suoraan valualtaassa. 6. Mittaa/tee tarvittava määrä 1 TBE-puskuria tai 1 TAE-puskuria tms. (puskurien varastoliuokset, stokit ovat usein 10 ). Noin 400 ml riittää yleensä yhteen geeliin ja ajopuskuriksi. Ajopuskurilla voi ajaa monta ajoa eli sitä ei tarvitse joka kerta tehdä. Huomaa, että käytetyssä puskuriliuoksessa on myös käytettyä leimaa eli eri leimojen puskuriliuoksia ei tule sekoittaa keskenään. Pienille fragmenteille (<1 kb) sopii parhaiten TBE-puskuri ja suurille TAE-puskuri. TBE-puskuri luokitellaan boorihapon takia myrkyksi. TAE-puskuri on kuitenkin huomattavasti parempi vaihtoehto AGE:iin, jos tarkoituksena on eristää näyte geeliltä ja jatkaa näytteen käsittelyä entsymaattisilla reaktioilla, sillä TBE-puskurin sisältämä boraatti inhiboi monia entsyymejä. 7. Punnitse agaroosi esim. erlenmayeriin ja lisää valittu 1 puskuri. Merkitse nestepinta astiaan. 8. Lämmitä geeliaines mikroaaltouunissa välillä sekoittaen ja koko ajan tarkkaillen kunnes liuos on kirkas. Ole huolellinen sillä liuos kiehuu melko herkästi. Ei foliota tms. mikroon. Tarkista lopuksi nestepinta, jos tarvetta niin lisää vettä. 9. Kaada hieman jäähtynyt (noin 65 C) sulatettu agaroosi geelitasolle, aseta kampa paikoilleen ja anna jäähtyä. Hyytymisen jälkeen poista kampa, peitä geeli ajoliuoksella (1 puskuri) niin että pinta on pari millimetriä geelin yläpuolella. 10. Standardien ja näytteiden valmistus SYBR-väriä ja valmista standardia käyttäen: a) Pipetoi 1 µl SYBR-väriä (SYBR 1:100 laimennos 10000 X SYBR-kantaliuoksesta) pienoisputken seinään. b) Pipetoi 6 µl DNA:ta värin päälle ja sekoita pipetillä. Sentrifugoi pisarat lopuksi putken pohjaan. Jätä pipetinkärjet pienosputkiin geelin pipetointia varten ettei tavaraa menee hukkaan. c) Muista lisätä näytteeseen näytepuskuri (engl. loading dye), jotta näyte painuu pohjaan latausvaiheessa. Ostetuissa standardeissa näytepuskuri voi olla jo valmiiksi mukana. Yleensä näytepuskuri on 6X eli nyt 2 µl/kuoppa on nyt sopiva määrä. SYBR (1:100 käyttölaimennos 10000X:stä)/DNA suhde 1/10 riittää. d) Lisää steriiliä vettä 3 µl. Lopputilavuus on nyt siis 12 µl. 11. Pipetoi näytteet ja standardit koloihin nesteen alle. Standardit pipetoidaan usein reunakoloihin ja näytteet geelin keskelle. Muista merkitä pipetointijärjestys laboratoriokirjaan. Pipetoi varovasti, älä puhko geeliä pipetinkärjellä. 12. Kytke virtalähde. Säädä jännite - yleensä 60-100V. Ajojännite (<1 kb 5 V/cm, 1-12 kb 4-10 V/cm, >12 kb 1-2 V/cm). Matka on elektrodien väli, ei geelin pituus. Ajon kesto riippuu geelin tiukkuudesta, ajoaika useimmiten on 30 min - 1 tunti (0,8 % geeli). Tarkkaile ajon kehittymistä ettet aja DNA:ta geelin läpi. Näytepuskurin sininen väri kertoo ajon etenemisestä. Virtalähde on sammutettava jos ajolaitteen kantta tarvitsee avata työskenneltäessä. 13. Poista geeli ajoaltaasta, kuvaa ja analysoi. HUOM: SYBR-väri hajoaa säilytyksessä ja valon vaikutuksesta eli kuvaa geeli välittömästi ajon jälkeen kuvantamislaitteistolla.
Reagenssit 10 x TBE-puskuri (litraa kohden) 108 g Tris-Base [tris(hydroxymethyl)aminomethane, MW 121.14] 55 g boorihappo H 2 BO 3 [MW 61.83], myrkky 9,3 g Na 2 EDTA (tai 40ml/l 0,5 M Na 2 EDTA ph 8) H 2 O säilytys huoneenlämmössä 10 x TAE-puskuri (litraa kohden) 48.4 g of Tris-Base [tris(hydroxymethyl)aminomethane, MW 121.14] 11.4 ml etikkahappo (17.4 M) 3.7 g of EDTA H 2 O Tulosten käsittely Yleisesti yhtälösovituksissa käytetään pienimmän neliösumman metodia, mutta joskus pisteestä pisteeseen -sovitus on toimiva vaihtoehto. Käyränsovituksissa kannattaa aina myös käyttää maalaisjärkeä ja katsoa lopuksi, että tulokset ovat loogisia. Kuvassa 4 on esimerkki analysoidusta geelistä, tuloksista ja standardisuorasta point-to-point -sovituksella. Vyöhykkeiden huono näkyvyys geelillä on usein ongelma kun kuvista tehdään erilaisia esityksiä. Kuvan kontrastia ja valoisuutta muuttamalla voi päästä parempaan lopputulokseen. Myös värien kääntämisellä voi saada toimivamman kuvan (kuva 5). Kuva 4 DNA-geelin tuloslaskentaesimerkki ohjelmistolla tehtynä.
Kuva 5 DNA-geelin alkuperäinen kuva vasemmalla ja sama kuva värit käännettyinä oikealla. Kysymyksiä 1. Hae hakusanojen Virtual Lab Agarose Gel Electrophoresis of Restriction Fragments avulla simulaatio-ohjelma ja selvitä seuraavat asiat: a. Millä entsyymillä pbr322-plasmidi kannattaa linearisoida? b. Minkä kokoisia fragmentteja tulee jos pbr322-plasmidi pilkotaan entsyymillä PLE I? c. pcdna3.1/ct GFP pilkotaan entsyymillä Nco I. Mitkä ovat muodostuvien fragmenttien koot? 2. Miksi Lambda-DNA kuumennetaan ennen geelille pipetointia? 3. Mitkä ovat työssä käytettyjen digestiopuskurin (reaktiopuskuri), ajopuskurin ja näytepuskurin tehtävät? 4. Miksi nopeammin kulkevat bandit ovat himmeämpiä kuin hitaammin etenevät? 5. Usein havaitaan pilkotun lambda-dna:n yhden bandin (4,3kb) olevan poikkeuksellisen himmeä. Mistä tämä johtuu? 6. Geelillä ei näy ajon jälkeen mitään. Mikä voi olla vikana?