(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI 106564 B SUOMI - FINLAND (FI) (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 28.02.2001 (51) Kv.11c7 - Int. k1.7 C12N 15151, 7/00, A61K 39/29, GO1N 33/576 C120 1/70, 1/68 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 981380 PATENTTI- JA REKISTERINALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 15.06.1998 (24) Alkupäivä - Löpdag 18.11.1988 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 15.06.1998 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT1US88104126 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 18.11.1987 US 122714 P 30.12.1987 US 139886 P 26.02.1988 US 161072 P 06.05.1988 US 191263 P 26.10.1988 US 263584 P 14.11.1988 US 271450 P (73) Haltija - Innehavare 1 Chiron Corporation, Delaware, 4560 Norton Street, Emeryville, CA 94608, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Houghton,Michael, 53 Rosemead Court, Danville, CA 94526, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Choo,Qui-Lim, 5700 Fern Street, EI Cerrito, CA 94530, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 3 Kuo,George, 1370 Sixth avenue, San Francisco, CA 94122, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab Iso Roobertinkatu 4-6 A, 00120 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä HCV-polypeptidien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä rekombinanttivektoreita Förfarande för framställning av HCV-polypeptider och vektorer vilka skall användas vid utövande av förfarandet (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta - Avdelad frän ansökan: 893447 (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Esitetään cdna-sekvenssien perhe, joka on peräisin hepatiitti-c (57) En familj cdna-sekvenser presenteras, vilken härrör Erin viruksesta (HCV). Nämä sekvenssit koodaavat antigeeneja, jotka hepatitis-c-viruset. Dessa sekvenser kodar for antigener, vilka reagoivat inununologisesti vasta-aineiden kanssa, jotka ovat läsnä reagerar inununologislct med antikroppar som förekommer hos yksilöissä joiden sairastama hepatiitti ei ole A- eikä B -tyyppiä individer vilka lider av hepatit som inte är vare sig A- eller B-typ (NANBH), mutta jotka yleensä puuttuvat yksilöistä joilla on (NANBH), men som inte forekorrirner hos individer med hepatit hepatiitti-a- (HAV) tai hepatiitti-b- (HAB) virusinfektio, ja joita A-(HAV) eller hepatit-b (HAB), och inte heller hos ei löydy myöskään vertailuyksilöista. Aminohapposekvenssien kontrollindivider. Att döma av aminosyrasekvenserna är HCV ett perusteella HCV on flavivirus tai flavi-tyyppinen virus. flavivirus eller ett virus av flavityp. Keksintö koskee menetelmiä ja rekombinanttivektoreita, jotka Uppfumingen gäller förfaranden och rekombinantvektorer, vilka ovat käyttökelpoisia valmistettaessa HCV:n polypeptidejä. är användbara vid framställning av HCV-polypeptider.
106564 Menetelmä HCV-polypeptidien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä rekombinanttivektoreita 5 Keksintö liittyy materiaaleihin ja metodologiaan hepatitisvirustartunnan, joka ei ole tyyppiä A tai B (NANBV), levinneisyyden selvittämiseksi. Tarkemmin se koskee diagnostisia DNA-fragmentteja sekä diagnostisia proteiineja ja niiden 10 valmistusmenetelmää NANB-hepatitiksen, s.o. hepatitis C- viruksen etiologista ainetta varten. Selityks~X viitata a n sejiraaviin julk a isuihin Barr et al. (1986), Biotechniques A:428. 15 Botstein (1979), Gene Brinton, M.A. (1986), julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 327-374. 20 Broach (1981) julkaisussa Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol.1, s.445, Cold Spring Harbor Press. Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307. Chang et al. (1977), Nature 112. 1056. Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 1 :5294. 25 Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 1 2 156. Clewell et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2:1159. Clewell (1972), J. Bacteriol. 110.:667. Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA a:2110. 30 Cousens et al. (1987), Gene 1:265. De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128. Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease 1 1 761. Feinstone, S.M. and Hoofnagle, J.H. (1984), New Engl. J. Med. 311:185. 35 Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.) Fiers et al. (1978), Nature 271 113. Gerety, R.J. et al. julkaisussa VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, B.N., Dienstag, J.L., and Hoofnagle, J.H., 40 toim., Grune and Stratton, Inc., 1984) ss. 23-47.
2 106564 Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. 2.:4057. Graham and Van der Eb (1978), Virology R2:546. Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11:3961. 5 Grych et al. (1985), Nature 116.74. Gubler and Hoffman (1983), Gene 28:263. Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS. Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 1:149. 10 Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 2R:1929. Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem 255:2073. Holland et al. (1978), Biochemistry 12:4900. Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385. Houghton et al. (1981), Nucleic Acids Res. 1:247. 15 Hunyh, T.V. et al. (1985), julkaisussa DNA CLONING TECHNI- QUES; A PRACTICAL APPROACH (D. Glover, toim., IRL Press, Oxford, U.K.), ss. 49-78. Immun. Rev. (1982) R2:185. Iwarson (1987), British Medical J. 295. 946. 20 Kenneth et al. (1980), MONOCLONAL ANTIBODIES. Laemmli (1970), Nature 227, 680. Lee et al. (1988), Science 219:1288. Maniatis, T. et al. (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 25 N.Y.). Mayer and Walker, toim. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London). Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology RR:499. MacNamara et al. (1984), Science 226:1325. 30 Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 1:309. Messing (1983), Methods in Enzymology 1_01. 20-37. METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press). Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis. Monath (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND 35 FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 375-440. Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem. 141.74. Neurath et al. (1984), Science 224.392.
3 106564 Nisonoff et al. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397-406. Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49. Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65. 5 Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35. Peleg (1969), Nature 221'193. Pferrerkorn and Shapiro (1974), julkaisussa COMPREHENSIVE VIROLOGY, Vol.2 (Fraenkel-Conrat & Wagner, toim., Plenum, N.Y.) ss. 171-230. 10 Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217. Rice et al. (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 279-328. 15 Roehrig (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press). Sadler et al. (1980), Gene 279. 20 Saiki et al. (1986), Nature '124:163. Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14:5463. Schlesinger et al. (1986), J. Virol. 0.:1153. Schreier, M., et al. (1980), HYBRIDOMA TECHNIQUES. Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTI- 25 CE, SECOND EDITiON (Springer-Verlag, N.Y.). Shimatake et al. (1981), Nature 292:128. Steimer et al. (1986), J.Virol. Stollar (1980), julkaisussa THE TOGAVIRUSES (R.W. Schlesinger, toim., Academic Press, N.Y.), ss. 584-622. 30 Taylor et al. (1976), Biochem. Biophys. Acta 442 324. Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 16:4350. Tsu and Herzenberg (1980), julkaisussa SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman and Co.) ss. 373-391. Vytdehaag et al. (1985), J. Immunol. 114-1225. 35 Valenzuela, P., et al. (1982), Nature 298 344. Valenzuela, P., et al. (1984), julkaisussa HEPATITIS B (Millman, I., et al., toim., Plenum Press) ss. 225-236. Warner (1984), DNA 1:401.
4 106564 Wu and Grossman (1987), Methods in Enzymology, Vol. 154, RECOMBINANT DNA, Part E. Wu (1987), Methods in Enzymology, Vol. 155, RECOMBINANT DNA, osa F. 5 Zoller (1982), Nucleic Acids Res. lfl:6487. 10 Viitataan myös seuraaviin US-patentteihin: 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890. Hepatitis, joka ei ole tyyppiä A eikä B (NANBH) on tarttuva tauti tai tautiperhe, jonka uskotaan olevan viruksen aiheuttama ja joka on erotettavissa muista viruksen aiheuttamista maksasairauksien muodoista, mukaanlukien sen, jonka 15 aiheuttavat tunnetut hepatitisvirukset, s.o. hepatitis-avirus (HAV), hepatitis-b-virus (HBV) ja deltahepatitisvirus (HDV), samoin kuin cytomegaloviruksen (CMV) ja Epstein- Barr-viruksen (EBV) aiheuttamat hepatitikset. NANBH tunnistettiin ensin verensiirtopotilaissa. Tarttuminen ihmisestä 20 simpanssiin ja massatartunta simpanssien joukossa antoivat todisteita, että NANBH:n syy on siirtyvä infektioaiheuttaja tai -aiheuttajat. Kuitenkin NANBH:n aiheuttavaa siirtyvää aiheuttajaa ei ole vieläkään määritetty ja taudin aiheuttavien aineiden lukumäärä on tuntematon. 25 Epidemiologisista todisteista voidaan tehdä ehdotelmia, että voi olla kolmentyyppistä NANBH:a: vedessä syntynyt epideeminen tyyppi; vereen tai neulaan liittyvä tyyppi; ja satunnaisesti esiintyvä (yhteisön hankkima = community ac- 30 quired) tyyppi. Kuitenkin niiden aineiden lukumäärä, jotka voivat aiheuttaa NANBH:n on tuntematon. Kliininen NANBH:n diagnoosi ja tunnistus on tehty etupäässä sulkemalla pois muut virusmerkkiaineet. Niiden menetelmien 35 joukossa, joita käytetään havaitsemaan oletettuja NANBVantigeenejä ja vasta-aineita ovat agargeelidiffuusio, vastaimmunoelektroforeesi, immunofluoresenssimikroskopia, im- munoelektronimikroskopia, radioimmunologinen analyysi ja entsyymiin kytketty immunosorbenttianalyysi. Kuitenkaan mi-
5 106564 kään näistä analyyseistä ei ole osoittautunut olevan riittävän herkkä, spesifinen ja toistettava käytettäväksi NANBH:n diagnostisena kokeena. 5 Tähän mennessä ei ole ollut selvyyttä eikä sopimusta NANBH:n aiheuttajiin liittyvien antigeeni-vasta-ainejärjestelmien identtisyyden tai spesifisyyden suhteen. Tämä johtuu ainakin osittain siitä, että henkilöillä on ennalta tai samanaikaisesti NANBV:n kanssa saatu HBV-tartunta ja liu- 10 koisten ja partikkelimuotoisten HBV:een liittyvien antigeenien tunnetusta monimutkaisuudesta ja myös HBV:n DNA:n integraatiosta maksasolujen genomiin. Lisäksi on mandollisuus, että NANBH:n aiheuttaa useampi kuin yksi infektoiva aine, minkä lisäksi on mandollista, että NANBH on diag- 15 nosoitu väärin. Edelleen on epäselvää, mitä serologiset analyysit havaitsevat NANBH-potilaiden seerumista. On väi- tetty, että agargeelidiffuusio-ja vastaimmunoelektrofo-, reesianalyysit havaitsevat autoimmuunivasteita tai epäspe- sifisiä proteiinien keskinäisiä reaktioita, joita esiintyy 20 seeruminäytteiden välillä ja että ne eivät edusta spesifisiä NANBV-antigeeni-vasta-ainereaktioita. Immunofluoresenssi ja entsyymin kytketty immunosorbentti ja radioimmunologiset analyysit näyttävät havaitsevan alhaisia reumatekijän kaltaisen materiaalin tasoja, jota on tavantakaa läsnä sel- 25 laisten potilaiden seerumissa, joilla on NANBH, samoin kuin 30 myös potilaissa, joilla on muita maksasairauksia tai maksaan liittymättömiä sairauksia. Jonkin verran havaittua reaktiivisuutta voi edustaa vasta-ainetta isännän määrittämille sytoplasmisille antigeeneille. On olemassa lukumäärä NANBV-ehdokkaita. Katso esimerkiksi selontekoja Prince (1983), Feinstone ja Hoofnagle (1984) ja Overby (1985, 1986, 1987) ja Iwarsonin (1987) artikkelia. 35 Kuitenkaan ei ole mitään todistetta, että mikään näistä ehdokkaista edustaisi NANBV:n etiologista aiheuttajaa. Vaatimus herkistä, spesifisistä menetelmistä NANBV:n kan- tajien ja NANBV:n saastuttaman veren tai verituotteiden
6 106664 seulomiseksi tai tunnistamiseksi on huomattava. Verensiirron jälkeinen hepatitis (Post Transfusion Hepatitits PTH) esiintyy noin 10 %:11a verensiirron saaneista potilaista ja NANBH:n aiheuttamia näistä tapauksista on jopa 90 %. Pääon- 5 gelma tässä taudissa on sen tavanomainen eteneminen kroonisiksi maksavaurioiksi (25-55 %). Potilashuolto sekä NANBH:n tarttumisen estäminen veren tai verituotteiden tai läheisen henkilökohtaisen kontaktin vä- 10 lityksellä vaatii luotettavia diagnostisia ja ennustavia välineitä NANBV:hen liittyvien nukleiinihappojen, antigeenien ja vasta-aineiden havaitsemiseksi. Lisäksi on tarpeita tehokkaiden rokotteiden ja immunoterapeuttisten terapeuttisten aineiden aikaansaamiseksi taudin estämiseksi ja/tai 15 hoitamiseksi. Keksintö liittyy vastikään keksityn NANBH:n etiologisen aiheuttajan, hepatitis C-viruksen (HCV), eristämiseen ja kuvaamiseen. Tarkemmin keksintö antaa HCV-genomin osien cdna- 20 kopioiden perheen. Nämä cdna-kopiot eristettiin tekniikalla, joka sisälsi uuden vaiheen, jossa seulottiin ekspressiotuotteita cdna-kirjastoista, jotka oli luotu hiukkasmaisesta aiheuttajasta kudoksesta, joka oli tartutettu NANBVpotilaiden seerumilla sellaisten vastasyntetisoitujen anti- 25 geenien havaitsemiseksi, jotka ovat peräisin tähän asti eristämättömän tai kuvaamattoman virusaiheuttajan genomista ja sellaisten kloonien valitsemiseksi, jotka tuottavat tuotteita, jotka reagoivat immunologisesti vain tartutettujen yksilöiden seerumien kanssa, verrattuna tartuttamatto- 30 miin yksilöihin. Tutkimukset HCV:n genomin luonteesta käyttäen koettimia, jotka ovat peräisin HCV:n cdna:sta, ehdottavat, että HCV on Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus. 35 HCV:stä peräisin olevien cdna-sekvenssien osat ovat hyödyllisiä koettimia viruksen näytteissäolon diagnosoimiseksi ja luonnollisesti esiintyvien viruksen muunnoksien eristämiseksi. Nämä cdna:t tuovat myös saataville HCV-genomiin koo-
7 106564 dattujen HCV-antigeenien polypeptidisekvenssit ja sallivat sellaisten polypeptidien tuottamisen, jotka ovat hyödyllisiä standardeina tai reagensseina diagnostisissa testeissä ja/tai komponentteina rokotteissa. Vasta-aineet, sekä poly- 5 klonaaliset että monoklonaaliset, jotka on kohdistettu HCVepitooppeja vastaan, jotka sisältyvät näihin polypeptidisekvensseihin, ovat myös hyödyllisiä diagnostisia testejä varten, terapeuttisina aineina, virustenvastaisien aineitten seulomiseen ja sellaisen NANBV-aiheuttajan eristämisek- 10 si, josta nämä cdna:t ovat peräisin. Lisäksi käyttämällä 15 näistä cdna:oista johdettuja koettimia, on mandollista eristää ja sekvensoida muita HCV-genomin osia, edistäen näin lisäkoettimien ja polypeptidien saamista, jotka ovat hyödyllisiä NANBH:n diagnoosissa. Keksinnön kohteita ovat: yhdistelmäekspressiojärjestelmä, joka käsittää HCV-genomista tai HCV-cDNA:sta peräisin olevan DNA:n avoimen lukualueen (open reading frame = ORF), jossa ORF on toiminnallisesti kytketty säätösekvenssiin, 20 joka on yhteensopiva halutun isännän kanssa ja solu, joka on muunnettu yhdistelmäekspressiojärjestelmällä. Keksintö koskee etenkin menetelmää HCV-epitoopin sisältävän polypeptidin tuottamiseksi, käsittäen sen että inkuboidaan 25 isäntäsoluja, jotka on transformoitu ekspressiovektorilla, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa HCV-epitoopin sisältävää polypeptidiä olosuhteissa, jotka sallivat sanotun polypeptidin ekspression. 30 Keksintöön sisältyviä näkökohtia ovat: puhdistettu HCV-polynukleotidi; yhdistelmä-hcv-polynukleotidi; yhdistelmäpolynukleotidi, joka käsittää sekvenssin joka on peräisin HCV-genomista tai HCV-cDNA:sta; yhdistelmäpolynukleotidi, joka koodaa HCV:n epitooppia; yhdistelmävektori, joka si- 35 sältää minkä tahansa edellisistä yhdistelmäpolynukleotideistä ja isäntäsolun, joka on transformoitu millä tahansa näistä vektoreista.
8 106564 Kuvio 1 esittää kloonissa 5-1-1 olevan HCV:n cdna-insertin kaksoiskierteisen nukleotidisekvenssin ja siihen koodatun polypeptidin oletetun aminohapposekvenssin. 5 Kuvio 2 esittää HCV:n cdna-sekvenssien homologien päällekkäisyyttä klooneissa 5-1-1, 81, 1-2 ja 91. Kuvio 3 esittää päällekkäisistä klooneista 81, 1-2 ja 91 peräisin olevaa HCV:n cdna:n yhdistelmäsekvenssiä ja siihen 10 koodattua aminohapposekvenssiä. 15 Kuvio 4 esittää HCV:n kloonissa 81 olevan cdna-insertin kaksoiskierteellistä nukleotidisekvenssiä ja sinne koodatun polypeptidin oletettua aminohapposekvenssiä. Kuvio 5 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 36, segmenttiä, joka menee päällekkäin NANBV:n cdna:n kanssa kloonissa 81 ja klooniin 36 koodattua polypeptidisekvenssiä. 20 Kuvio 6 esittää yhdistettyä avointa lukurakennetta HCV:n cdna:oista klooneissa 36 ja 81 ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 7 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 32, seg- 25 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 81 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 8 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 35, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 36 kanssa ja siihen 30 koodattua polypeptidiä. 35 Kuvio 9 esittää HCV:n cdna:oiden yhdistettyä avointa lukurakennetta klooneissa 35, 36, 81 ja 32 ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 10 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 37b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 35 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.
9 106564 Kuvio 11 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 33b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 32 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. 5 Kuvio 12 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 40b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 37b kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 13 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 25c, seg- 10 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33b kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 14 esittää avoimen lukurakenteen, joka ulottuu HCV:n cdna:oiden kautta klooneissa 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b 15 ja 25c, nukleotidisekvenssiä ja siihen koodattua polypeptidiä. Kuvio 15 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissä 33c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonien 40b ja 33c kanssa 20 ja siihen koodattuja aminohappoja. 25 Kuvio 16 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 8h, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 17 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 7e, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 8h kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 30 Kuvio 18 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 14c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 25c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 19 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 8f, seg- 35 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 14c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
10 106564 Kuvio 20 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 33f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 8f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 5 Kuvio 21 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 33g, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 22 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 7f, seg- 10 menttiä, joka menee päällekkäin klovnin 7e kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 23 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 11b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 7f kanssa ja siihen 15 koodattuja aminohappoja. 20 Kuvio 24 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 14i, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin lib kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 25 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 39c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 25 Kuvio 26 esittää HCV:n yhdistelmä-cdna-sekvenssiä, joka on peräisin kohdakkain olevista cdna:oista klooneissa 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f ja 33g; esitettynä on myös sieltä peräisin olevassa sekvenssissä olevaan laajennettuun avoimeen luku- 30 rakenteeseen koodatun polypeptidin aminohapposekvenssi. Kuvio 27 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 12f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 14i kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 35 Kuvio 28 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 35f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 39c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
11 106564 Kuvio 29 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 19g, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 35f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. 5 Kuvio 30 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 26g, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 19g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 31 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa 15e, seg- 10 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 26g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 32 esittää yhdistelmä-cdna:n sekvenssiä, joka on peräisin kohdakkain olevista klooneista 12f - 15e suunnassa 5' 15-3'; se esittää myös ORF:ään koodattuja aminohappoja. 20 Kuvio 33 esittää valokuvaa fuusioproteiinin SOD-NANB 5_ 1_ 1 Western-blotteja BB-NANB:llä, HAV:llä ja HBV:llä infektoitujen simpanssien seerumin kanssa. Kuvio 34 esittää valokuvaa fuusioproteiinin SOD-NANB 5_ 1 _ 1 Western-bloteista NANBV:llä, HAV:llä ja HBV:llä infektoitujen ihmisten ja kontrolli-ihmisten seerumin kanssa. 25 Kuvio 35 on kartta, joka esittää vektorin pab24 merkittävät piirteet. Kuvio 36 esittää fuusiopolypeptidin C100-3 karboksipään oletetusta aminohapposekvenssistä ja sitä koodaavaa nukleo- 30 tidisekvenssiä. Kuvio 37A on valokuva coomassiesinisellä värjätystä polyakryyliamidigeelistä, joka identifioi hiivassa ekspressoitua C100-3:a. 35 Kuvio 37B esittää C100-3:n Western-blottia NANBV:llä tartutetun ihmisen seerumin kanssa.
12 106564 Kuvio 38 esittää autoradiografin Northern-blotista RNA:lle, joka on eristetty BB-NANBV-tartutetun simpanssin maksasta ja jossa koettimena on kloonin 81 BB-NANBV:n cdna. 5 Kuvio 39 esittää autoradiografin NANBV-nukleiinihaposta, jota on käsitelty ribonukleaasi A:lla tai deoksinukleaasi I:llä ja jossa koettimena on klooni 81:n NANBV:n cdna. Kuvio 40 esittää autoradiografin nukleiinihapoista, jotka 10 on uutettu NANBV-partikkeleista, jotka on saatu infektoidusta plasmasta anti-nanb 5 _ 1 _ 1 :11a ja jossa koettimena on 32P-leimattu kloonin 81 NANBV:n cdna. Kuvio 41 esittää autoradiografeja suodattimista, jotka si- 15 sältävät eristettyjä NANBV-nukleiinihappoja, joissa koettimena on 32P-leimattuja plus- ja - kierteisiä DNA-koettimia, jotka ovat peräisin kloonin 81 NANBV:n cdna:sta. Kuvio 42 esittää HCV:n cdna:ssa koodattujen polypeptidien 20 ja Dengue-flaviviruksen NS-proteiinin väliset homologit. Kuvio 43 esittää histogrammin HCV-infektion jakaantumisesta satunnaisissa näytteissä määritettynä ELISA-seulonnalla. 25 Kuvio 44 esittää histogrammin HCV-infektion jakaantumisesta satunnaisissa näytteissä käyttäen kahta immunoglobuliinientsyymikonjugaatin konfiguraatiota ELISA-analyysissä. Kuvio 45 esittää primeriseoksen sekvenssejä, jotka ovat 30 peräisin säilyvistä sekvensseistä flaviviruksien NS1:ssä. Kuvio 46 esittää HCV:n cdna-sekvenssiä kloonissa k9-1, seg-. menttiä, joka menee päällekkäin kuviossa 26 esitetyn cdna:n 35 kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja. Kuvio 47 esittää sekvenssiä yhdistelmä-cdna:ssa, joka on peräisin asettamalla kohdakkain kloonit k9-1-15e suunnassa 5' - 3'; se esittää myös ORF:ään koodatut aminohapot.
13 I Määritelmät 106564 Termi "hepatitis-c-virus" on varattu alalla tähän asti tuntemattomalle NANBV:n etiologiselle aiheuttajalle. Niinpä 5 tässä käytettynä "hepatitis-c-virus" (HCV) viittaa NANBV:n syynä olevaan aiheuttajaan, johon aikaisemmin viitattiin NANBV:nä ja/tai BB-NANBV:nä. Termejä HCV, NANBV ja BB-NANBV käytetään tässä keskenään vaihdellen. Tämän terminologian jatkona kutsutaan HCV:n aiheuttamaa sairautta, jota aikai- 10 semmin kutsuttiin NANB-hepatitikseksi (NANBH), hepatitis- C:ksi. Termejä NANBH ja hepatitis-c käytetään tässä keskenään vaihdellen. 30 Termi "HCV" merkitsee tässä käytettynä viruslajia, joka 15 aiheuttaa NANBH:n ja siitä johdettuja heikennettyjä kantoja tai puutteellisia häiritseviä partikkeleita. Kuten esitetään myöhemmin, HCV-genomi muodostuu RNA:sta. Tiedetään, että viruksia sisältävällä RNA:lla on suhteellisen korkea spontaanien mutaatioiden nopeus, s.o. on raportoitu suu- 20 ruusluokkaa 10-3 - 10-4 nukleotidia kohti olevista nopeuksista (Fields & Knipe (1986)). Siksi alla kuvatun HCV-lajin joukossa on monia kantoja. Tässä kuvatut koostumukset ja menetelmät tekevät mandolliseksi eri sukulaiskantojen lisääntymisen, määrittämisen, osoittamisen ja eristämisen. 25 Edelleen ne myös sallivat diagnostisten välineiden ja rokotteiden valmistamisen eri kantoja varten ja niillä on käyttöä seulontamenetelmissä antiviraalisia aineita varten farmakologiseen käyttöön siinä, että ne estävät HCV:n replikaation. Tässä annettu tieto, vaikkakin se on peräisin yhdestä HCVkannasta, johon tästä lähtien viitataan nimellä CDC/HCV1, on riittävä virustaksonomeille salliakseen muidenkin kantojen identifioinnin, jotka ovat lajin sisällä. Kuten tässä 35 kuvataan, olemme keksineet, että HCV on Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus. Flaviviruksen morfologia ja koostumus ovat tunnettuja ja niistä keskustellaan Brintonin (1986) julkaisussa. Yleisesti morfologian suhteen, Flavivirukset sisältävät keskeisen ydinkapsidin, jota ympäröi kaksiker-
14 106564 roksinen lipidi. Virionit ovat pallomaisia ja niiden halkaisija on noin 40-50 nm. Niiden ytimet ovat noin 25-30 nm halkaisijaltaan. Pitkin virionikuoren ulkopintaa on ulokkeita, jotka ovat noin 5-10 nm pitkiä ja niiden päässä ole- 5 vat nupit ovat noin 2 nm halkaisijaltaan. HCV koodaa epitooppia, joka on immunologisesti identifioitavissa sen epitoopin kanssa HCV-genomissa, josta tässä kuvatut cdna:t ovat peräisin; mielellään epitooppi on koo- 10 dattu tässä kuvatussa cdna:ssa. Epitooppi on vain HCV:ssa esiintyvä, kun sitä verrataan muihin tunnettuihin Flaviviruksiin. Epitoopin ainutkertaisuus voidaan määrittää sen immunologisella reaktiivisuudella HCV:n kanssa ja immunologisen reaktivisuuden puuttumisena muiden Flaviviruslajien 15 kanssa. Menetelmät immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla, esimerkiksi radioimmunologinen analyysi, ELISA-analyysi, hemoagglutinaatio ja tässä annetaan lukuisia esimerkkejä sopivista tekniikoista analyysejä varten. 20 Edellisen lisäksi voidaan käyttää seuraavia parametrejä, joko yksin tai yhdistelmänä, kannan identifioimiseksi HCV:ksi. Koska HCV-kannat ovat kehityksensä suhteen sukulaisia, odotetaan että genomien kokonaishomologia nukleoti- 25 ditasolla on noin 40 % tai enemmän, mieluummin noin 60 % tai enemmän ja vielä mieluummin noin 80 % tai enemmän; ja lisäksi että niissä on vastaavia viereisiä ainakin noin 13 nukleotidin sekvenssejä. Oletetun HCV-kannan genomisekvenssin ja CDC/CH1 HCV:n cdna-sekvenssin välinen vastaavuus 30 voidaan määrittää alalla tunnetuilla tekniikoilla. Esimerkiksi ne voidaan määrittää vertaamalla suoraan oletetun HCV:n polynukleotidin sekvenssitietoa ja tässä kuvattuja HCV:n cdna-sekvenssejä. Esimerkiksi myös ne voidaan määrittää hybridisoimalla polynukleotideja olosuhteissa, jotka 35 muodostavat stabiileja duplekseja homologisten alueiden välille (esimerkiksi niiden alueiden, joita käytettäisiin ennen S 1 -pätkimistä), mitä seuraa pätkiminen yksisäikeisillä erityisillä nukleaaseilla, mitä seuraa pätkittyjen fragmenttien koon määritys.
15 106564 HCV-kantojen kehitykseen liittyvän Suhteen takia voidaan oletetut HCV-kannat tunnistaa niiden polypeptiditasolla vallitsevan homologiansa avulla. Yleisesti HCV-kannat ovat enemmän kuin noin 40 % homologisia, mieluummin enemmän kuin 5 noin 60 % homologisia ja vielä mieluummin enemmän kuin 80 % homologisia polypeptiditasolla. Tekniikat aminohapposekvenssien homologian määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla. Esimerkiksi aminohapposekvenssi voidaan määrittää suoraan ja sitä voidaan verrata tässä annettuihin sekvensseihin. 10 Myös esimerkiksi oletetun HCV:n genomimateriaalin nukleotidisekvenssi voidaan määrittää (tavallisesti cdna-välituotteen kautta); siinä koodattu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia alueita voidaan verrata. 15 Tässä käytettynä polynukleotidi, joka "on peräisin" annetusta sekvenssistä, esimerkiksi HCV:n cdna, erityisesti kuvioissa 1-32 esimerkkeinä annetut, tai HCV-genomista johdettu, viittaa polynukleotidisekvenssiin, joka muodostuu arviolta noin 6 nukleotidin sekvenssistä, joka on mieluum- 20 min ainakin noin 8 nukleotidin, vielä mieluummin ainakin noin 10-12 nukleotidin ja vieläkin mieluummin vastaavasti ainakin noin 15-20 nukleotidin pituinen,s.o. homologinen tai komplementaarinen annetun nukleotidisekvenssin alueen kanssa. Mieluummin alueen sekvenssi, josta polynukleotidi 25 on peräisin, on homologinen tai komplementaarinen sekvenssille, joka on ainutkertainen HCV-genomille. Olipa sekvenssi ainutkertainen HCV-genomille tai ei, se voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alan ammattilaiselle tunnettuja. Esimerkiksi sekvenssiä voidaan verrata tietopankkien, 30 esimerkiksi Genebank'in sekvensseihin sen määrittämiseksi, onko se läsnä infektoitumattomassa isännässä tai muussa organismissa. Sekvenssiä voidaan myös verrata muiden virusaineiden tunnettuihin sekvensseihin, sisältäen ne aineet, jotka ovat tunnettuja hepatitiksen aiheuttajia, esimerkiksi 35 HAV, HBV ja HDV ja muihin Flaviviridae-perheen jäseniin. Vastaavuus tai vastaamattomuus johdetun sekvenssin ja muiden sekvenssien välillä voidaan määrittää myös hydridisaation avulla sopivissa tiukoissa olosuhteissa. Hybridisaatiotekniikat nukleiinihapposekvenssien komplementaarisuuden
16 106564 määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla ja niistä keskustellaan myöhemmin. Katso myös esimerkiksi julkaisua Maniatis et al. (1982). Lisäksi hybridisaatiolla muodostuneiden dupleksipolynukleotidien sopimattomuus voidaan määrittää tun- 5 netuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi pätkimisen nukleaasilla, kuten S1:11ä, joka spesifisesti katkoo yksisäikeisiä alueita polynukleotideissa. Alueet, joista tyypillisiä DNA-sekvenssejä voidaan "johtaa", sisältävät, mutteivat ne ole niihin rajoitettuja, esimerkiksi alueet, jot- 10 ka koodaavat erityisiä epitooppeja ja lisäksi ei-transkriptoituja ja/tai ei-transloituja alueita. Johdettu polynukleotidi ei ole välttämättä fysikaalisesti peräisin esitetystä nukleotidisekvenssistä, mutta se voi- 15 daan luoda millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen synteesin tai DNA:n replikoimisen tai käänteisen transkription tai transkription, jotka perustuvat siihen tietoon, jonka antaa emässekvenssi alueilla, joista polynukleotidi on peräisin. Lisäksi niiden alueiden yhdis- 20 telmiä, jotka vastaavat annetun sekvenssin alueita, voidaan muokata tavoilla, joiden tiedetään alalla vastaavan aiottua käyttöä. Samoin polypeptidi- tai aminohapposekvenssi, joka on peräi- 25 sin annetusta nukleiinihapposekvenssistä, esimerkiksi kuvioiden 1-32 sekvensseistä, tai HCV-genomista, viittaa polypeptidiin, jossa on aminohapposekvenssi, joka on identtinen sen polypeptidin aminohapposekvenssin kanssa, joka on koodattu sekvenssiin tai sen osaan, jossa osa käsittää ainakin 30 3-5 aminohappoa ja mieluummin ainakin 8-10 aminohappoa ja vielä mieluummin ainakin 11-15 aminohappoa tai joka on immunologisesti tunnistettavissa sekvenssiin koodatun polypeptidin avulla. 35 Yhdistelmä- tai johdettu polypeptidi ei ole välttämättä transloitu annetusta nukleiinihapposekvenssistä, esimerkiksi kuvioiden 1-26 sekvensseistä tai HCV-genomista; se voi olla luotu millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi
17 106564 kemiallisen synteesin tai yhdistelmäekspressiojärjestelmän ekspression tai eristämisen mutatoituneesta HCV:stä. Termi "yhdistelmäpolynukleotidi" käytettynä tässä merkitsee 5 polynukleotidia, joka on peräisin genomista, cdna:sta, se on semsiynteettistä tai synteettistä alkuperää, joka alkuperänsä tai manipulaationsa takia: (1) ei liity kaikkiin niihin polynukleotideihin tai niiden osaan, joihin se liittyy luonnossa tai kirjaston muodossa; ja/tai (2) on kytket- 10 ty polynukleotidiin, joka on muu kuin se, johon se on kytketty luonnossa. Termi "polynukleotidi" tässä käytettynä viittaa minkä tahansa pituisten nukleotidien, joko ribonukleotidien tai 15 deoksiribonukleotidien, polymeeriseen muotoon. Tämä termi viittaa vain molekyylin ensisijaiseen rakenteeseen. Täten tämä termi sisältää kaksi- ja yksisäikeistä DNA:ta ja lisäksi kaksi- ja yksisäikeistä RNA:ta. Se sisältää myös modifioituja, esimerkiksi metyloimalla ja/tai kapseloimalla 20 ja modifioimattomia polynukleotidin muotoja. Tässä käytettynä termi "HCV, joka sisältää sekvenssin, joka vastaa cdna:ta" merkitsee, että HCV sisältää polynukleotidisekvenssin, joka on homologinen tai komplementaarinen 25 sekvenssille annetussa DNA:ssa; homologia-asteen tai komplementaarisuusasteen ollessa suurin piirtein 50 % tai enemmän, on mieluummin ainakin noin 70 % ja vielä mieluummin se on ainakin noin 90 %. Sekvenssit, jotka vastaavat toisiaan ovat ainakin noin 70 nukleotidia ja vielä mieluummin aina- 30 kin noin 90 nukleotidia pitkiä. HCV-sekvenssin ja cdna:n välinen vastaavuus voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja, sisältäen esimerkiksi sekvensoidun materiaalin suoran vertailun cdna:t kuvattuna tai hybridisaation ja pilkkomisen yksisäikeisillä nukleaaseilla, 35 mitä seuraa pilkottujen fragmenttien koon määrittäminen. Termi "puhdistettu viruspolynukleotidista" viittaa HCV-genomiin tai sen fragmenttiin, joka on olennaisen puhdas, s.o. se sisältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähem-
18 106564 män kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % polypeptidejä, joihin viruspolynukleotidi luonnollisesti liittyy. Tekniikat viruspolynukleotidien puhdistamiseksi viruspartikkeleista ovat tunnettuja alalla ja sisäl- 5 tävät esimerkiksi partikklein katkaisun kaotrooppisella aineella ja polynukleotidien ja polypeptidien erottamisen joninvaihtokromatografian, affiniteettikromatografian ja sedimentoimisen avulla tiheyden mukaan. 10 Termi "puhdistettu viruspolypeptidi" viittaa HCV-polypeptidiin tai sen fragmenttiin, joka on olennaisen vapaa, s.o. se sisältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % solukomponentteja, joihin viruspolypeptidi luonnollisesti 15 liittyy. Tekniikat viruspolypeptidien puhdistamiseksi ovat alalla tunnettuja ja näiden tekniikoiden esimerkeistä keskustellaan alla. "Yhdistelmäisäntäsolut", isäntäsolut", "solut", "solulin- 20 jat", "soluviljelmät" ja muut sellaiset termit, jotka merkitsevät mikro-organismeja tai korkeampia eukarioottisolulinjoja, joita viljellään yksisoluisina kokonaisuuksina viittaavat soluihin, joita voidaan käyttää tai on voitu käyttää yhdistelmävektorin tai muun siirto-dna:n vastaanot- 25 tajana ja jotka sisältävät sen alkuperäisen solun perimän, johon siirros on tehty. Ymmärretään, että yksittäisen emäsolun perimä ei välttämättä ole täysin identtinen morfologialtaan tai genomiltaan tai ole täysi DNA-komplementti alkuperäisenä vanhempana onnettomuuden seurauksena tapahtu- 30 neen tai tarkoitetun mutaation seurauksena. Emäsolun perimä, mikä on riittävän samanlainen asiaan kuuluvalta ominaisuudeltaan, kuten haluttua peptidiä koodaavan nukleotidisekvenssin läsnäolon suhteen, määritettävän emäsolun kanssa, sisältyy tähän määritelmään aiottuun perimään ja 35 ylläolevat termit kattavat ne. "Replikoni" (replicon) on mikä tahansa geneettinen elementti, esimerkiksi plasmidi, kromosomi, virus, joka käyttäytyy autonomisena polynukleotidin replikaation yksikkönä solun
19 106564 sisällä; s.o. se pystyy replikoitumaan oman kontrollinsa alaisena. "Vektori" on replikoni, johon on kiinnittynyt toinen po- 5 lynukleotidisegmentti tuodakseen mukaan kiinnittyneen segmentin replikaation ja/tai ekspression. "Säätösekvenssi" viittaa polynukleotidisekvensseihin, jotka ovat välttämättömiä niiden koodaussekvenssien, joihin ne 10 ovat sitoutuneet, ekspression aikaansaamiseen. Sellaisten säätösekvenssien luonne eroaa isäntäorganismin mukaan; prokariooteissa sellaiset säätösekvenssit sisältävät yleisesti promoottorin, ribosomin sidoskohdan ja terminaattoreita; eukariooteissa sellaiset säätösekvenssit sisältävät ylei- 15 sesti promoottoreita, terminaattoreita ja joissakin tapauksissa vahvistajia. Termi "säätösekvenssit" on aiottu sisältämään minimissään kaikki komponentit, joiden läsnäolo on välttämätöntä ekspressiota varten ja ne voivat myös sisältää lisäkomponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esi- 20 merkiksi johtosekvenssejä. "Toiminnallisesti kytketty" viittaa rinnakkainasetteluun, jossa niin kuvatut komponentit ovat sellaisessa suhteessa, joka sallii niiden toiminnan aiotulla tavalla. Säätösek- 25 venssi, joka on "toiminnallisesti kytketty" koodaussekvenssiin, on sidottu sellaisella tavalla, että koodaussekvenssin ekspressio saadaan aikaan olosuhteissa, jotka ovat yhteensopivia säätösekvenssien kanssa. 30 "Avoin lukurakenne" (Open reading frame ORF) on polynukleotidisekvenssin alue, joka koodaa polypeptidiä; tämä alue voi edustaa koodaussekvenssin osaa tai kokonaista koodaussekvenssiä. 35 "Koodaussekvenssi" on polynukleotidisekvenssi, joka on transkriptoitu mrna:han ja/tai transloitu polypeptidiin, kun se on pantu sopivien säätävien sekvenssien kontrolliin. Koodaussekvenssin rajat määrittävät translaation aloittava kodoni 5'-päässä ja translaation lopettava kodoni 3'-pääs-
20 106564 sä. Koodaussekvenssi voi sisältää, muttei se ole rajoitettu niihin, mrna:n, cdna:n ja yhdistelmäpolynukleotidisekvenssejä. 5 "Immunologisesti tunnistettavissa jollakin/jonakin" viittaa sellaisten epitooppien ja polypeptidien läsnäoloon, jotka ovat myös läsnä ja ovat ainutkertaisia annetuille polypeptideille, tavallisesti HCV-proteiineille. Immunologisen identiteetin voi määrittää vasta-aineen sitoutuminen ja/tai 10 kilpailu sitoutumisessa; nämä tekniikat ovat tunnettuja alan keskitason ammattilaiselle ja niitä kuvataan myös alla. Epitoopin ainutkertaisuus voidaan myös määrittää tietokonehaulla tunnetuissa tietopankeissa, esimerkiksi Genebank'ssa, epitooppia koodaavien polynukleotidisekvenssien 15 löytämiseksi ja vertaamalla aminohapposekvenssiä muihin tunnettuihin proteiineihin. Tässä käytettynä "epitooppi" viittaa polypeptidin antigeeniseen polypeptidin determinanttiin; epitooppi voisi 20 käsittää kolme aminohappoa epitoopille ainutkertaisessa avaruuskonformaatiossa, yleisesti epitooppi käsittää ainakin viisi sellaista aminohappoa ja tavallisemmin se käsittää ainakin 8-10 sellaista aminohappoa. Aminohappojen avaruuskonformaation määrittämismenetelmät ovat alalla tunnet- 25 tuja ja sisältävät esimerkiksi röntgenkristallografian ja kaksiulotteisen ydinmagneettisen resonanssin. Polypeptidi on "immunologisesti reaktiivinen" vasta-aineen kanssa, kun se sitoutuu vasta-aineeseen siten, että se tun- 30 nistaa tietyn polypeptidin sisältämän epitoopin. Immunologisen reaktiivisuuden voi määrittää vasta-aineen sitoutuminen, erityisemmin vasta-aineen sitoutumisen kinetiikka ja/tai kilpailu sitoutumisessa käyttäen kilpailijoina tunnettuja polypeptidejä, jotka sisältävät epitoopin, jota 35 vastaan vasta-aine on suunnattu. Tekniikat sen määrittämiseksi onko polypeptidi immunologisesti reaktiivinen vastaaineen kanssa vai ei, ovat alalla tunnettuja.
21 106564 Tässä käytettynä termi "HCV-epitoopin sisältävä immunogeeninen polypeptidi" sisältää luonnollisesti esiintyviä HCVpolypeptidejä tai niiden fragmentteja ja myös polypeptidejä, jotka on valmistettu muilla tavoin, esimerkiksi kemial- 5 lisella synteesillä tai ekspressoimalla polypeptidi yhdistelmäorganismissa. Termi "polypeptidi" viittaa aminohappojen molekyyliketjuun, eikä viittaa tuotteen erityiseen pituuteen; täten peptidit, 10 oligopeptidit ja proteiinit sisältyvät polypeptidin määritelmään. Tämä termi ei myöskään viittaa polypeptidien ekspression jälkeisiin muunnoksiin, esimerkiksi glykosylaatioihin, asetylaatioihin, fosforylaatioihin ja sen kaltaisiin. 15 "Transformaatio" tässä käytettynä viittaa ulkopuolisen polynukleotidin panemiseen isäntäsoluun, riippumatta panemiseen käytetystä menetelmästä, esimerkiksi suora otto, transduktio tai f-liitto. Ulkoinen polynukleotidi voidaan 20 pitää integroimattomana vektorina, esimerkiksi plasmidina tai vaihtoehtoisesti se voidaan integroida isäntägenomiin. 25 30 "Hoito" tässä käytettynä viittaa ennaltaehkäisyyn ja/tai terapiaan. "Yksilö" tässä käytettynä viittaa selkärankaisiin, erityisesti imettäväislajin jäseniin ja sisältää, muttei ole niihin rajoitettu, kotieläimet, urheilueläimet, kädelliset ja ihmiset. Tässä käytettynä nukleiinihapon "plussäie" sisältää sekvensin, joka koodaa polypeptidiä. "Miinussäie" sisältää sekvenssin, joka on plussäikeelle komplementaarinen. 35 Tässä käytettynä viruksen "positiivisen säikeen genomi" on sellainen, jossa genomi, joko RNA tai DNA, on yksisäikeinen ja joka koodaa viruspolypeptidejä. Esimerkkejä positiivisen säikeen RNA-viruksista ovat Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae, ja Caliciviridae. Mukaan si-
22 106564 sältyvät myös Flaviviridae, joka aikaisemmin luokiteltiin kuulumaan lajiin Togaviridae. Katso Fields & Knipe (1986). Tässä käytettynä " vasta-aineen sisältävä ruumiin osa" 5 viittaa yksilön ruumiin osaan,joka on kyseessä olevien vasta-aineiden lähde. Vasta-aineita sisältävät ruumiin osat ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi plasman, seerumin, selkäydinnesteen, imunesteen, hengitysteiden, ruuansulatuskanavan ja sukupuoli-virtsakanavan ulko-osat, 10 kyyneleet, syljen, maidon, veren valkosolut ja myeloomat. Tässä käytettynä "puhdistettu HCV" viittaa HCV-valmisteeseen, joka on eristetty soluosasista, joihin virus tavallisesti liittyy ja muista virustyypeistä, jotka voivat olla 20 15 läsnä infektoituneessa kudoksessa. Tekniikat virusten eristämiseksi ovat tunnettuja alan ammattilaisille ja sisältävät esimerkiksi sentrifugoinnin ja affiniteettikromatografian; menetelmästä puhdistetun HCV:n valmistamiseksi keskustellaan alla. II Keksinnön kuvaus Tämän keksinnön käytännön suorituksessa käytetään, ellei toisin ole mainittu, molekyylibiologian, mikrobiologian, 25 yhdistelmä-dna-tekniikan ja immunologian tavanomaisia tekniikoita, jotka ovat alalla käytössä. Sellaisia tekniikoita selvitetään täysin kirjallisuudessa. Katso esimerkiksi seuraavia: Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I AND II 30 (D.N. Glover toim. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait toim. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins toim. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney toim. 1986); IMMOBOLIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B.Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING 35 (1984); sarja, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller ja M.P.Calos toim. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu ja Grossman, ja vastaavasti Wu, toim.), Mayer ja Walker, toim.
23 106564 (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLO- GY (Academis Press, Lontoo), Scopes, (1987), PROTEIN PURI- FICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Toinen painos (Springer- Verlag, N.Y.), ja HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VO- 5 LUMES I-IV (D.M.Weir ja C.C. Blackwell toim. 1986). Kaikki patentit, patenttihakemukset ja julkaisut, jotka tässä on mainittu, sekä yllä että alla, liitetään tähän mukaan käsiteltäväksi viitejulkaisuina. 10 Tämän keksinnön hyödylliset materiaalit ja menetelmät tekee mandolliseksi läheisesti homologisten nukleotidisekvenssien, jotka on eristetty cdna-kirjastosta, joka on peräisin HCV-infektoituneen simpanssin plasmassa olevista nukle- 15 iinihapposekvensseistä, aikaansaaminen. Tämä nukleotidisekvenssien perhe ei ole peräisin ihmisestä tai simpanssista, koska se ei hybridisoidu infektoitumattomista yksilöistä peräisin olevan ihmisen eikä simpanssin genomin DNA:n kanssa, koska sekvenssien tämän perheen nukleotidit ovat läsnä 20 vain simpanssien maksassa ja plasmassa HCV-infektion myötä ja koska sekvenssi ei ole läsnä Genebank'issa. Lisäksi sekvenssien perhe ei osoita mitään merkittävää homologiaa HBVgenomiin sisältyvien sekvenssien kanssa. 25 Yhden perheen jäsenen sekvenssissä, joka jäsen sisältyy klooniin 5-1-1, on jatkuva avoin lukualue (ORF), joka koodaa arviolta 50 aminohapon polypeptidiä. HCV-infektoituneen ihmisen seerumi sisältää vasta-aineita, jotka sitoutuvat tähän polypeptidiin, kun taas infektoitumattomien ihmisten 30 seerumi ei sisällä tämän polypeptidin vasta-aineita. Lopulta infektoitumattomien simpanssien seerumi ei sisällä tämän polypeptidin vasta-aineita, vasta-aineet syntyvät simpansseihin seuraten akuuttia NANBH-infektiota. Edelleen tämän polypeptidin vasta-aineita ei havaita simpansseissa tai 35 ihmisissä, joilla on HAV- tai HBV-infektio. Näillä perusteilla sekvenssi on cdna virussekvenssille, jossa virus aiheuttaa NANBH:n tai liittyy NANBH:hon; tämä cdna-sekvenssi esitetään kuviossa 1. Kuten keskustellaan seuraavassa, kloonin 5-1-1 cdna-sekvenssi eroaa toisten eristettyjen
24 106564 cdna:oiden sekvensseistä siinä, että se sisältää 28 ylimääräistä emäsparia. Muiden tunnistettujen cdna-perheen jäsenien yhdistelmä, 5 jotka jäsenet eristettiin käyttäen koettimena synteettistä sekvenssiä, joka oli samanlainen kuin kloonissa 5-1-1 oleva cdna:n fragmentti, esitetään kuviossa 3. cdna-perheen jäsen, joka eristettiin käyttäen synteettistä sekvenssiä, joka on peräisin kloonin 81 cdna:sta, esitetään kuviossa 5 10 ja tämän sekvenssin yhdistelmä kloonin 81 sekvenssin kanssa esitetään kuviossa 6. Muita cdna-perheen jäseniä, mukaanlukien ne, jotka ovat klooneissa 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f ja 33g, 39c, 35f, 19g, 26g ja 15e, kuvataan osassa IV.A.. 15 Näissä klooneissa olevien cdna:aiden yhdistelmää kuvataan osassa IV.A.19 ja se esitetään kuviossa 32. cdna:jen yhdistelmä osoittaa, että se sisältää yhden jatkuvan ORF:n ja täten se koodaa polyproteiinia. Tämä tieto on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, josta keskustellaan seuraavassa, 20 että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus. Vain tämän kuvioissa 1-32 esitetyn cdna-perheen saatavuus sallii sellaisten DNA-koettimien ja polypeptidien rakentamisen, jotka ovat hyödyllisiä HCV-infektion seurauksena 25 syntyneen NANBH:n diagnosoimisessa ja seulottaessa verenluovuttajia ja myös luovutettua verta ja verituotteita infektion suhteen. Esimerkiksi sekvensseistä on mandollista syntetisoida DNA-oligomeereja, joissa on noin 8-10 nukleotidia tai suurempia, jotka ovat hyödyllisiä hybridisaa- 30 tiokoettimina virusgenomin osoittamiseksi esimerkiksi sellaisten kohteiden seerumissa, joiden epäillään kantavan virusta tai luovutetun veren seulomiseksi viruksen läsnäolon varalta. cdna-sekvenssien perhe sallii myös HCV-spesifisten polypeptidien suunnittelemisen ja tuottamisen, jotka 35 polypeptidit ovat hyödyllisiä diagnostisina reagensseina NANBH:n aikana syntyvien vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi. cdna:sta peräisin olevien puhdistettujen polypeptidien vasta-aineita voidaan myös käyttää virusantigeenien osoittamiseksi infektoituneissa yksilöissä ja veressä.
25 106564 Tieto näistä cdna-sekvesseistä tekee myös mandolliseksi sellaisten polypeptidien suunnittelemisen ja tuottamisen, joita voidaan käyttää rokotteina HCV:ta vastaan ja myös vasta-aineiden tuottamisen, mitä vuorostaan voidaan käyttää 5 tautia vastaan suojaamiseksi ja/tai HCV-infektoituneiden yksilöiden hoitamiseksi. Lisäksi cdna-sekvenssien perhe tekee mandolliseksi HCV-genomin lisäkuvaamisen. Näistä sekvensseistä peräisin olevia 10 polynukleotidikoettimia voidaan käyttää seulomaan cdna-kirjastoja sellaisten lisä-cdna-sekvenssien varalta, jotka menevät päällekkäin niiden kanssa, joita vuorostaan voidaan käyttää päällekkäin menevien sekvenssien lisän saamiseen. Ellei genomi ole segmentoitu, eikä segmenteillä ole yhtei- 15 siä sekvenssejä, tätä tekniikkaa voidaan käyttää koko genomin sekvenssin saamiseksi. Kuitenkin jos genomi on segmentoitu, muita genomin segmenttejä voidaan saada toistamalla lambda-gt11-serologinen seulontamenettely, jota käytetään tässä kuvattujen cdna-kloonien eristämiseksi tai vaihtoeh- 20 toisesti eristämällä genomi puhdistetuista HCV-partikkeleista. cdna-sekvenssien perhe ja polypeptidit, jotka ovat peräisin näistä sekvensseistä ja myös vasta-aineet, jotka on suun- 25 nattu näitä polypeptidejä vastaan, ovat myös hyödyllisiä BB-NANBV-aineiden eristämisessä ja tunnistamisessa. Esimerkiksi vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja HCV-epitooppeja vastaan, jotka sisältyvät polypeptideihin, jotka ovat peräisin cdna:sta, voidaan käyttää menetelmissä, jotka perus- 30 tuvat affiniteettikromatografiaan viruksen eristämiseksi. Vaihtoehtoisesti vasta-aineita voidaan käyttää tunnistamaan viruspartikkeleita, jotka on eristetty muilla tekniikoilla. Virusantigeenit ja genomimateriaali eristetyissä viruspartikkeleissa voidaan sitten edelleen määrittää. 35 Tieto, joka saadaan sekventoimalla HCV-genomeita edelleen, samoin kuin myös HCV-antigeenejä edelleen karakterisoimalla ja genomia karakterisoimalla tekee mandolliseksi lisäkoettimien ja polypeptidien ja vasta-aineiden suunnittelun ja
26 106564 synteesin, joita aineita voidaan käyttää HCV:n aiheuttaman NANBH:n diagnoosiin, estämiseen ja hoitoon ja infektoituneen veren ja vereen liittyvien tuotteiden seulomiseen. 5 HCV-koettimien saatavuus, sisältäen antigeenit ja vastaaineet ja polynukleotidit, jotka ovat peräisin genomista, josta cdna-perhe on peräisin, sallii myös kudosten viljelyjärjestelmien kehittämisen, jotka järjestelmät ovat suuresti käytössä HCV:n biologiaa selvitettäessä. Tämä vuorostaan 10 voi johtaa uusien hoito-ohjeiden kehittymiseen, jotka perustuvat antiviraalisiin yhdisteisiin, jotka etupäässä estävät HCV:n replikaation tai sen tarttumisen. Menetelmä, jota käytetään NANBH:n etiologisen aiheuttajan 15 tunnistamiseen ja eristämiseen, on uusi ja se voi olla käyttökelpoinen tätä ennen karakterisoimattomien aineiden, jotka sisältävät genomin, tunnistamiseen ja/tai eristämiseen, ja jotka liittyvät lukuisiin tauteihin, mukaan lukien ne, jotka aiheutuvat viruksista, viroideista, bakteereista, 20 sienistä ja loisista. Tässä menetelmässä luotiin cdna-kirjasto nukleiinihapoista, jotka olivat läsnä infektoituneen yksilön infektoituneessa kudoksessa. Kirjasto luotiin vektoriin, joka salli sellaisten polypeptidien ekspression, jotka olivat koodattuna cdna:ssa. Isäntäsolujen klooneja, 25 jotka sisälsivät vektorin, joka ekspressoi immunologisesti reaktiivisen etiologisen aiheuttajan polypeptidin fragmenttia, valittiin kirjaston ekspressiotuotteiden immunologisella seulonnalla vasta-aineen sisältävän ruumiin komponentin kanssa toisesta yksilöstä, joka oli aikaisemmin infek- 30 toitu oletetulla aiheuttajalla. Immunologisen seulontatekniikan vaiheet käsittivät cdna:n sisältävien vektoreiden saattamisen reagoimaan vasta-aineen sisältävän, toisen infektoidun yksilön ruumiin komponentin kanssa ja antigeenivasta-ainekompleksin syntymisen osoittamisen ekspres- 35 siotuotteiden ja toisen infektoidun yksilön vasta-aineiden välille. Eristetyt kloonit seulotaan edelleen immunologisesti saattamalla niiden ekspressiotuotteet reagoimaan vasta-aineen sisältävän, oletetulla aiheuttajalla infektoitujen toisten yksilöiden ruumiin komponenttien kanssa ja ver-