dc dt OTR = k L a = K (P/V) b v s

Aineensiirto ja siihen vaikuttavat tekijät bioreaktorikasvatuksissa Fermentorin tärkeä tehtävä on myös varmistaa prosessin tarvitsema homogeenisuus, hapen saanti (aerobiset ja mikroaerobiset fermentoinnit) sekä lämpötilan säätö Hapen saanti hapen aineensiirto ilmastuksen kaasukuplista nesteeseen Lämpötilan säätö lämmönsiirto panossteriloinnissa ja fermentoinnissa Happi on aerobisen fermentoinnin ravinteista erikoisasemassa, koska se on erittäin niukkaliukoinen veteen ja vielä niukkaliukoisempi kasvuliemiin; liukoisuus (kuten yleensäkin kaasujen liukoisuus) noudattaa Henryn lakia: C P C tot gas. i i * = = H Pi H C i * : i:n kyllästyspitoisuus nesteessä [mg L -1 ] P tot : kaasun absoluuttinen paine [bar] C gas,i : i:n pitoisuus kaasussa [til.- tai mooliosuus] H : Henryn vakio i:lle ko. olosuhteissa [L bar mg -1 ] P i : i:n osapaine kaasussa H:n arvoja löytyy käsikirjoista eri olosuhteissa eri kaasukomponenteille (happi veteen 5 o C: H = n. 0,06 L bar mg -1 ; 35 o C: n. 0,03 L bar mg -1 ); lämpötilan vaikutus: esim. C*=468/(31,6+T); C* [mg L -1 ] T [ o C] 1

Hapen aineensiirto Hapen siirtyminen kaasukuplista kasvuliemeen ja soluille solut pystyvät nesteessä käyttämään vain liuennutta happea Tarkasteltaessa sarjassa olevia aineensiirtovastuksia hapelle todetaan, että suurin vastus vallitsee kaasukuplaa ympäröivässä nestefilmissä OTR = dc dt L = k L a ( C* CL ) OTR: oxygen transfer rate [g L -1 h -1 ] k L : hapen aineensiirtokerroin [m h -1 ] a: spesifinen aineensiirtopinta [m m -3 ] C*: hapen kyllästyspitoisuus [g L -1 ] C L : hapen pitoisuus nesteessä [g L -1 ] a:n arvoa on vaikea mitata => k L ja a yhdistetään hapen volumetriseksi aineensiirtokertoimeksi [h -1 ] ja k L a:n arvoja voidaan määrittää kokeellisesti esim. sekoitusnopeuden, ilmastuksen, sekoitusjärjestelyjen (esim. sekoituselementtien lkm ja laatu), fermentorin geometrian jne. funktiona k L a:lle on löydettävissä myös erilaisia kokeellisia riippuvuuksia tyyliin: k L a = K (P/V) b v s c P: sekoitusteho v s : kaasun lineaarivirtausnopeus K,b,c: vakioita kokeellisella mittausalueella V: kasvuliemen tilavuus

Ilmastus Ilmastus Aerobiset organismit tarvitsevat happea aineenvaihduntaansa Hapen liukoisuus (9 mg/l H O) Hiilidioksidin poisto Hapensiirtoon voidaan vaikuttaa Ilmastus Sekoitus Paine Hapella rikastus k L a kertoo hapensiirron tehokkuuden

Rajapintojen ylityksiä Kaasumolekyylin liukeneminen kasvatusliuokseen ja siirtyminen solun sisälle tapahtuu monen välivaiheen kautta 1. kaasumolekyyli siirtyy kaasun ja nesteen väliselle rajapinnalle (diffuusio). rajapinnan lävitse ja rajapinnan ulkopuolelta nestefaasiin (diffuusio ja konvektio) 3. siirtyminen solun/entsyymin luokse (konvektio ja diffuusio) 4. biokatalyytin pintakerroksen lävitse (diffuusio) 5. siirtyminen sytoplasmisen membraanin läpi (diffuusio tai kuljetusmekanismit)

Figure 10.8 1. Transfer from the interior of the bubble to the gas liquid-interface. Movement across the gas liquid-interface 3. Diffusion through the relatively stagnant liquid film surrounding the bubble 4. Transport through the bulk liquid 5. Diffusion through the relatively stagnant liquid film surrounding the cells 6. Movement across the liquid-cell interface 7. Diffusion through the solid to the individual cell (in a flocc, clump or solid particle) 8. Transport through the cytoplasm to the site of reaction

Hapen siirtoon vaikuttavia tekijöitä ELEKTROLYYTIT NOSTAVAT k L a :n ARVOA PINTA-AKTIIVISET AINEET PIENENTÄVÄT LABORATORIO/TEHDAS SUURI ERO k L a ALEMPI REAKTORIN POHJALLA k L a :n mittaus Dynaaminen menetelmä Suora sulfiittimenetelmä

Ilmastus ja aineensiirto Ilmastus ilmoitetaan yksikössä vvm = volume per volume per minute; esim. ilmavirtaus L min -1 5 L:n kasvuliemeen = 0,4 vvm; laboratoriofermentoinneissa usein yli-ilmastus (> 1 vvm); isommassa mittakaavassa tyypillisesti 0, 0,6 vvm Kaasukuplan kokoon kasvuliemessä vaikuttaa useita tekijöitä: Ilmastusrenkaan toteutus (putki; rengas, jossa pieniä reikiä; sintteri tai membraani) Nesteen pintajännitys Sekoituksen aiheuttamien leikkausvoimien kuplia hajottava vaikutus Kaasukuplien yhteenliittyminen (ns. coalescence) Kasvatusalustat ja kasvuliemet ovat yleensä vaahtoavia ilmastuksen ja sekoituksen vaikutuksesta (pinta-aktiiviset aineet) => fermentointiin lisätään jotakin vaahdonestoainetta (antifoam agent), joka tuhoaa vaahdon 7

Vaahdonesto ja k L a Vaahdonestoaineet alentavat paikallisesti nesteen pintajännitystä => kaasukuplien koko pienenee (= a kasvaa), mutta samalla k L pienenee (vaahdonestoaine kasvattaa filmikerroksen paksuutta kaasukuplan ulkopuolella, alentaa hapen diffuusiokerrointa sekä voi lisätä filmin viskositeettia; yhteisvaikutus k L a:han on siis yleensä negatiivinen 8

Hapen aineensiirto Ilmastuksen käytännön toteutus: Ilmastusilmassa vaadittava paine > (painehäviöt steriilisuodattimissa + kasvuliemen hydrostaattinen paine + painehäviö linjassa => puhallin (blower) vai kompressori Hydrostaattinen paine: 10 m vesipatsasta = n. 1 bar; fermentorin geometria vaikuttaa: T V = π H Geometria: esim. H/T = 4 4 jos V = 100 m 3 => T =? ja H =? P hydrost =? Ilma esisuodatetaan ennen steriilisuodatinta Usein linjassa myös veden ja öljyn erottimet Mikroaerobisissa fermentoinneissa (varsinkin tutkimustyössä) ilmaan voidaan sekoittaa typpeä happipitoisuuden alentamiseksi (esim. 1-10 til-% happea) Aerobisissa fermentoinneissa hapen saatavuus on usein prosessin nopeutta (kapasiteettia) rajoittava tekijä => voidaan lisätä ilman happipitoisuutta OTR vaikuttavat tekijät: Ilman happipitoisuus (vol-% tai mol-%; ideaalikaasu) C* Fermentorin paine (kaasufaasin paine + hydrostaattinen paine C* (vaikuttaa myös C* CO ) Sekoitus (rpm, sekoituselementtien laatu ja määrä) ja ilmastus k L ja a Liuenneen hapen pitoisuus kasvuliemessä (C) C*-C (driving force) 9

Happitase Tyypillisiä k L a arvoja : Mikrotiitterilevyt 300 h -1 (eli n. 0,08 s -1 ) Mikrotiitterilevyt sekoitushaitoilla 500 Ravistelupullot 300 Ravistelupullot sekoitushaitoilla 600 Laboratoriofermentorit (CSTR) 1000 Tuotantofermentorit (>0 m 3 ) (CSTR) 600 Tuotantofermentorit (kuplakolonni) 300 Mikrobeilla ja fermentointiprosesseilla voidaan ilmoittaa kriittiset liuenneen hapen pitoisuudet C crit kun C > C crit esim. µ tai r P eivät ole C:n arvosta riippuvaisia; kun C < C crit niin µ, r P = f(c) C:tä fermentointien yhteydessä merkitään yleensä DO (dissolved oxygen) ja se ilmoitetaan % kyllästysarvosta ko. olosuhteissa (0 100 %) Kun fermentori siirrostetaan C = 100 % (esim. 6 mg/l). Alussa driving force (C*-C) on hyvin pieni => C laskee nopeasti. Solumassan kasvun myötä jossain vaiheessa C = C crit. Tällöin voidaan aloittaa liuenneen hapen säätö esimerkiksi lisäämällä sekoitusnopeutta => kun OUR=OTR on C = vakio dc dt = OTR OUR 10

DO-mittaus Tavallisin anturi on ns. polarografinen DO-anturi, jossa Pt-katodi on eristetty kasvuliemestä vain kaasuja läpäisevällä hydrofobisella kalvolla (esim. teflon); katodi on elektrolyyttinesteessä (kylläinen KCl); happimolekyylit pelkistyvät katodilla (ottavat vastaan elektroneja), kun katodin ja anodin välillä vallitsee sopiva polarisaatiojännite (500 800 mv); muodostuva virta (na luokkaa) on verrannollinen hapen virtaukselle katodille eli liuennen hapen pitoisuudelle kasvuliemessä Pt-katodi: O + H O + 4 e - 4 OH - Ag-anodi: 4 Ag + 4 Cl - 4 AgCl + 4 e - YHT: O + H O + 4 Ag + 4 Cl - 4 AgCl + 4 OH - DO- mittaukseen perustuen voidaan DO säätää halutulle tasolle sekoituksen ja ilmastuksen avulla (ns. kaskadi-säätö: liuenneen hapen säädin lähettää asetusarvoa esim. sekoituksen säätimelle) DO-mittauksen avulla voidaan myös määrittää arvoja k L a:lle 11

k L a:n määritys 1. Dynaaminen gassing out gassing in: Kalibroidaan DO-anturi halutulla sekoitusnopeudella ja ilmastuksella (100 %) Happi huuhdotaan liuoksesta typpikaasun avulla (anturin nollaus) Aloitetaan ilmastus ja kerätään DO-arvoja = f(t) dc = OTR dt dc = k C * C L dc dt a dt C * ln( ) = C * C( t) k L = k a t C L a ( C * C) dc C * C = k a L 0 0 t dt Sovitetaan koepisteisiin suoran yhtälö: ln(c*/(c*-c)) = kk x t Kulmakerroin kk = k L a Tehdään mittauksia eri sekoitus/ilmastusolosuhteissa Ei fermentoinnin aikana 1

k L a:n määritys. Dynaaminen määritys fermentoinnin aikana Oletus: lyhyellä aikavälillä vakio-olosuhteissa DO on vakio (C = C 0 ) Lopetetaan ilmastus (tai typetetään) ja aloitetaan se uudelleen ennen kuin DO = DO crit Kerätään DO dataa (C(t)) Kun C AL saavuttaa vakioarvon; tällöin OUR = OTR (dc AL /dt = 0) 13

k L a:n määritys. Dynaaminen määritys fermentoinnin aikana Sovitetaan koepisteisiin yo. yhtälöön suora, jonka kulmakerroin on k L a. Määritys kahden pisteen avulla, tai useammasta pisteestä graafisesti 14

k L a:n määritys 3. Poistokaasun koostumusmittaukseen perustuva menetelmä. OUR määritetään mittausten avulla fermentoinnin aikana. Happitaseen avulla saadaan k L a ratkaistua: dc dt = OTR OUR OTR = dc dt + OUR OUR määritetään sisään tulevan ilmavirtauksen ja sen happipitoisuuden sekä ulostulevan ilmavirtauksen happija hiilidioksidipitoisuuden (mitatut) avulla Ulostuleva ilmavirtaus voidaan määrittää pitoisuuksien ja inerttikaasun avulla F F in out C N OUR= = F in in ( F OUR= F = F in in out 1 C C C O out O in N V out 0,79 C F L CO out out (0,1 1 C F O out V out C L = F O out 0,79 C in ) = C C CO out N N ( F in out in C p O out O in T ) in F R V out L p O out T out ) 15

Poistokaasumittaus Fermentorin poistokaasusta pumpataan pieni sivuvirta poistokaasuanalysaattorille Kiinnostavimmat kaasukomponentit ovat happi ja hiillidioksidi Happipitoisuus voidaan edullisimmin mitata elektrokemiallisesti (esim. lyijyanodi hapettuminen PbO tai zirkonium dioksidi) ja hiilidioksidipitoisuus perustuen sen valon absorptioon infrapuna-alueella Massaspektrometrilla voidaan mitata muidenkin kaasumaisten komponenttien pitoisuuksia (esim. etanoli, metanoli, butanoli ) Analysaattorille menevä virta suodatetaan ja kuivataan Ilmavirtauksen mittaus termisellä massavirtausmittarilla 16

Fermentorin mekaaninen sekoitus Hapen liuotuksen kannalta edullisin sekoituselementti on Rushton -turbiini Rushton -turbiini on tehokas kaasun dispergoinnissa, mutta radiaalisekoittimena huono kasvuliemen homogeenisuuden kannalta Sekoitinakselille laitetaan useita sekoituselementtejä; elementtien etäisyys toisistaan > D i (= elementin halkaisija); alin elementti lähelle ilmastusrengasta Homogeenisuuden kannalta pumppaavat, vertikaalilementit ovat parempia Sekoittimen kierrosnopeus (N i, [rpm]) ei ole kovin informatiivinen tieto; parempi ns. tip speed eli sekoituselementin kehänopeus (tip speed = π x N i x D i /60 [m s -1 ] ) Sekoituksen tehtävät: hapen liuotus k L a (aerobinen fermentointi), lämmönsiirto, homogeenisuus Mekaanisen sekoituksen vaatima teho voidaan laskea sekoituksen teholuvun (N p = Po = Ne; jos n sekoituselementtiä Po = n x Po yhdelle) avulla, kun virtausolosuhteet ovat turbulentit (sekoittimen Reynoldsin luku Re i > 10 4 ) [yleisin tilanne ellei kasvuliemen viskositeetti ole erittäin korkea] N P P = Re 3 ρ N D L i 5 i i ρ Di N = µ i 18

Radiaali- vs. aksiaalisekoitus Flow pattern produced by a radialflow impeller in a baffled tank. Flow pattern produced by an axialflow impeller in a baffled tank. 19

P on ilmastamaton teho µ c : kasvuliemen dynaaminen viskositeetti Ilmastus pienentää tehonkulutusta Ilmastettu teho : P a Kts. käyrästö alla (N a : ilmastusluku) Fermentorin sekoitus N a = D Vair 3 i N i

Homogeenisuus fermentorissa Laboratoriomittakaavan fermentoinneissa voidaan yleensä olettaa kasvuliemi homogeeniseksi (ellei viskositeetti ole hyvin korkea), vaikka fermentoriin syötettäisiin ph-säätökemikaaleja, vaahdonestoainetta, ravinteita, ilmaa Pilot- ja tuotantomittakaavassa olosuhteet vaihtelevat syöttöjen takia fermentorissa paikallisesti Sekoituksen intensiteettiä (eli vaikutusta) kuvaa hyvin termi sekoitusaika: t m,95 : se aika, jonka kuluessa pulssimaisen lisäyksen vaikutus pitoisuuteen on 95 %:sti tasoittunut hitaimmin reagoivassa fermentorin paikassa Sekoitusaika laboratoriofermentoreissa voi olla joitakin sekunteja, tuotantomittakaavassa (esim. 50 m 3 ) kymmeniä sekunteja/jopa joitakin minuutteja Solut siis kohtaavat toistuvasti erilaisia olosuhteita => stressi? Epähomogeenisuuden vaikutuksia voidaan tutkia simuloimalla kokeellisesti isoja fermentoreita labramittakaavassa (ns. scale-down): esim. CSTR + PFR (plug flow reactor) yhdistelmällä, jossa kasvulientä kierrätetään fermentorista tulppavirtausreaktorin läpi ja tähän syötetään happo/emäs/ravinne liuosta 3

Homogeenisuus fermentorissa - reologiaa Sekoitusolosuhteetkin vaihtelevat isossa fermentorissa (kuvassa kasvuliemen lineaarivirtausnopeuksia eri kohdissa; sekoituselementtinä Rushton turbiini) Virtausolosuhteiden paikalliset vaihtelut ovat erityisen suuria rihmamaisten mikrobien fermentoinneissa, sillä nämä liemet ovat yleensä pseudoplastisia (siis ei- Newtonisia); yksisoluisilla organismeilla kasvuliemet ovat Newtonisia (so. viskositeetti ei riipu leikkausnopeudesta (~sekoitusnopeudesta) ellei jokin aineenvaihduntatuote vaikuta reologiaan 4

Reologiaa Newtonisten fluidien viskositeetti ei riipu leikkausnopeudesta (µ dynaaminen viskositeetti kuvaa leikkausjännityksen ja leikkausnopeuden välistä suhdetta) riippuu T, pitoisuuksista jne.): τ xy = µ dv ( x dy ) Ei-Newtonisten fluidien (esim. paksunnosaineliuokset) viskositeetti riippuu leikkausnopeudesta (joillakin fluideilla myös leikkausajasta; esim. tiksotrooppiset fluidit) τ dv K ( dy x n 1 xy = ) dv ( dy K : konsistenssi-indeksi n : ns. power law index; x ) µ = Newtoninen fluidi: n = 1 Pseudoplastinen fluidi: n < 1 (leikkauksella oheneva fluidi) Dilatantti fluidi: n > 1 (leikkauksella paksuuntuva fluidi, ei biopr.) Bingham plastinen fluidi: n = 1/<1/>1 vaaditaan τ 0, jotta lähtee liikkeelle K dvx ( dy ) n 1 5

Reologiaa 6