(B) (11)KUULUTUBJULKAIBU UTLAGGNINGSSKRIFT C (45) Patentea my;:,,l;v4 Patent (51) Kv.lk.6 - Int.c1.6 C 07K 14/315, 16/12, A 61K 39/09 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 FI00008 01 1 C SUOMI-FINLAND (FI) (21) Patenttihakemus - Patentansökning 940684 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 14.02.94 (24) Alkupäivä - Löpdag 29.01.93 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 30.07.94 Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Patent - och registerstyrelsen Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 13.10.95 (71+72) Hakijat ja keksijät - Sökande och uppfinnare 1. Tikkanen, Kaarina, c/o Biokemian ja teknologian laitos, Kuopion yliopisto, Savilandentie 9 F, 70210 Kuopio, (FI) 2. Finne, Jukka, c/o Biokemian ja teknologian laitos, Kuopion yliopisto, Savilandentie 9 F, 70210 Kuopio, (FI) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä Streptococcus suis -bakteerin adhesiiniproteiinin ja sen vasta-aineen valmistamiseksi Förfarande för framställning av Streptococcus suis -bakteriens adhesinprotein och dess antikropp (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta - Avdelad frb ansökan: 930413 (patentti - patent 93733) (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksinnön kohteena on menetelmä Streptococcus suis -bakteerin adhesiiniproteiinin ja sen vasta-aineen valmistamiseksi. Keksinnön mukaista adhesiiniproteiinia ja sen vasta-aineita voidaan käyttää terapeuttisesti. Uppfinningen berör ett förfarande för framstållning av Streptococcus suis -bakteriens adhesinprotein och av dess antikropp. Adhesinproteinet och dess antikropp i enlighet med uppfinningen kan användas terapeutiskt.
1 Menetelmä Streptococcus suis -bakteerin adhesiiniproteiinin ja sen vasta-aineen valmistamiseksi Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta F1930413 5 Tausta - Keksinnön ala Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen Streptococcus suis -bakteerin adhesiiniproteiinin valmistamiseksi, jolla adhesiiniproteiinilla on 10 galaktoosilla inhiboituva hemagglutinaatioaktiivisuus, ja joka sitoutuu kyyhkyn ovomukoidiin ja joka saa aikaan vasta-aineiden muodostuksen ja jonka molekyylipaino on noin 18 000, isoelektrinen piste on noin 6,4 ja N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro- 15 Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja jolla on seuraava aminohappokoostumus: 20 25 30 35 Aminohappo nmol aminohappoa/nmol proteiinia Asx 13 Thr 8 Ser 6 Gix 26 Gly 22 Ala 17 Val 10 Cys 0 Met 4 Ile 11 Leu 12 Tyr 4 Phe 6 Lys 16 His 7 Arg 7 Pro 12
2 tai sen johdannaisen tai fragmentin valmistamiseksi, jolla on sama biologinen ja immunologinen aktiivisuus. Keksinnön kohteena on edelleen menetelmä mainitun adhesiiniproteiinin tai sen johdannaisen tai fragmentin vastaisen vasta- 5 aineen valmistamiseksi. Keksinnön mukaisesti valmistettua adhesiiniproteiinia, sen johdannaisia ja fragmentteja sekä niiden vasta-aineita voidaan käyttää terapeuttisesti. S. suis -bakteerien (Lancefieldin ryhmä D) tiedetään aiheuttavan sikojen meningiittiä, pneumoniaa, art- 10 riittiä ja sepsistä. S. suis -tyyppi 1 aiheuttaa pääasiassa vastasyntyneiden porsaiden septisemiaa ja meningiittiä, ja tyyppi 2 hieman vanhempien, n. 3-10 viikon ikäisten porsaiden meningiittiä, joka voi tarttua myös ihmiseen. Sian kasvatuksen keskittyessä ja eläintiheysten noustessa 15 tartunnat leviävät yhä helpommin ja S. suis -bakteerin aiheuttamat infektiotaudit yleistyvät. Tästä syystä diagnostiikan ja rokotteen kehittämistä pidetään erittäin tärkeänä sikojen meningiittien ja muiden vakavien infektioiden tunnistamisessa ja torjunnassa. Kyseeseen voi myös 20 tulla suunnattu ennaltaehkäisy siankasvattajilla. Tunnettu tekniikka Bakteerien tarttuminen kohdesolujen pintaan on ensimmäinen tapahtuma bakteeritaudin synnyssä (Beachey, E.H. (1981) J. Infect. Dis. 143, 325-345). Bakteerien tarttu- 25 mista välittää usein bakteerien pinnassa oleva proteiini, adhesiini, joka spesifisesti tarttuu solujen pinnan reseptorirakenteisiin. Näin ollen adhesiini soveltuu hyvin rokotteen kehittämiseen, koska vasta-aineet kohdistuvat spesifisesti bakteerin kannalta välttämättömään tekijään, ja 30 toisaalta spesifisyyden ansiosta vältytään haittaavilta sivuvaikutuksilta. Adhesiineja tunnetaan monenlaisia, mutta niiden täsmällinen rakenne ja mekanismi on usein vielä selvittä- mättä. Ne ovat luonteeltaan proteiineja, jotka spesifises- 35 ti tunnistavat kohdesolun reseptorit, jotka vuorostaan
3 yleensä ovat hiilihydraattirakenteita. Bakteerien erityyppisiä adhesiineja ja niiden tunnistamia hiilihydraattirakenteita on esitetty mm. julkaisussa Sharon, N., (1987) FEBS Letters, 217, 145-157. 5 E. coli ja monet muut gram-negatiiviset bakteerit tarttuvat lektiinien kaltaisilla bakteeriadhesiineilla isäntäsolun pinnan määrättyihin molekyyleihin. Tavallisia adhesiinien reseptoreita ovat glykolipidien ja glykoproteiinien sokeriosat. Usein adhesiinit ovat kiinnittyneet 10 bakteerisolun pinnalla oleviin hiusmaisiin rakenteisiin fimbrioihin (piliin). Fimbrioita on monen tyyppisiä; ne vaihtelevat sekä rakenteen että sokerispesifisyyden suhteen. Koska punasolujen pinnalla on usein bakteerien re- 15 septorirakenteita, bakteerit tarttuvat näihin rakenteisiin ja agglutinoivat punasoluja in vitro-olosuhteissa. Bakteeriviljelmät saattavat ilmentää kolmea tai neljää hemagglutiniinia (adhesiinia), joista jokaisella on erilainen hiilihydraattispesifisyys; täten bakteerilla on kyky tarttua 20 moniin eri solutyyppeihin. Enterobakteereiden tutkimuksissa adheesioreaktiot on jaettu kahteen pääluokkaan: mannoosiherkkiin (MS) reaktioihin, jolloin hemagglutinaatioreaktio inhiboituu a-mannosideilla ja mannoosiresistentteihin (MR) reaktioihin, 25 jolloin hemagglutinaatio ei ole inhiboitavissa a-mannosideilla. E. colin tyyppi 1 fimbria (MS-rakenne) koostuu lähes pelkästään 17 kda:n suuruisista identtisistä osayksiköistä. Useat MR-adhesiinit tunnistavat a-gal(1-4)-b-gal -rakennetta (P-spesifinen adhesiini) tai a-neunac-(2-3)- 30 B-Gal (S-spesifinen adhesiini). Yleensä puhdistetut fimbriat koostuvat osayksiköistä, joiden molekyylipaino vaihtelee 15-22 kda. Adhesiiniproteiini on tavallisesti erillinen proteiini, joka on kiinnittynyt fimbrioiden päihin tai fim- 35 brioiden sivuille, sitä voi olla myös kiinnittyneenä suo-
4 raan bakteerin ulkomembraaniin. Joillakin bakteerikannoilla adhesiiniproteiinia on bakteerisolun pinnalla vaikka fimbriat puuttuvat. Adhesiinit saattavat tällöin muodostaa adhesiinisen kapselin bakteerin ympärille. E. colin non- 5 fimbriaalisten adhesiinien koko vaihtelee 13-28 kda välillä (Jann, K. ja Hoschutzky, H. (1990), Current Topics in Microbiology and Immunology 151, 55-70). Streptokokkien tiedetään sitoutuvan erilaisiin liukoisiin proteiineihin ja glykoproteiineihin, sen sijaan 10 niiden oligosakkaridispesifisyyttä ei juurikaan tunneta. Myös spesifinen sitoutuminen epiteelisoluihin on lähes tuntematonta. Jotkut Streptococcus sanguis- ja Streptococcus mitis-kannat sitovat galaktoosia ja sialohappoa (Murray, P.A., Levine, M.J., Tabak, L.A., ja Reddy, M.S. 15 (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 390-396). Streptococcus pneumoniaen sitoutuminen epiteelisoluihin inhiboituu G1cNAc81-3Gal-rakenteella ja tämän bakteerin on raportoitu sitoutuvan Ga1NAcB1-4Gal-rakennetta sisältäviin glykolipideihin keuhkoissa (Krivan, H.C., Roberts, D.D. ja 20 Ginsburg, V. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 6157-6161). S. mitis tarttuu hampaan pintaan ja on osatekijä plakin muodostuksessa. Tästä bakteerikannasta on kyetty eristämään sialohappoa sitova adhesiini. Sialohappoa sito- 25 vassa proteiinissa oli ainakin kaksi disulfidi-sidottua osayksikköä 96 kd ja 70 kd. Molemmat osayksiköt sitoivat N-asetyylineuramiinihappo-a2-3-galaktoosi-81-3-N-asetyyligalaktosamiinia (Murray, P.A., Levine, M.J., Reddy, M.S., Tabak, L.A., Bergey, E.J. (1986) Infect. Immun. 53, 359-30 365). S. sanguis-bakteerin galaktoosia sitovan adhesiinin molekyylipainoksi saatiin noin 20 kda ja sen isoelektrinen piste oli 8,5-9 (Nagata, K., Nakao, M., Shibata S., Shizukuishi, S., Nakamura R. ja Tsunemitsu, A. (1983) J. Periodontol. 54, 163-172). Tämän lisäksi S. sanguis-baktee- 35 reista on kloonattu 36 kda-suuruinen adhesiini-proteiini.
5 Kloonatun adhesiinin hiilihydraattispesifisyys on tuntematon; adhesiinin tiedetään kuitenkin tarttuvan syljellä pinnoitettuun hydroksiapatiittiin ph-herkän reseptorin välityksellä (Ganeskumar, N., Song, M. ja McBride, B.C. 5 (1988) Infect. Immun. 56, 1150-1157). S. suis on tärkeä sikojen patogeeni. Se levittäytyy porsaiden tonsilloihin tai sieraimiin ja aiheuttaa vakavia infektioita. S. suis-bakteerien kapselipolysakkarideilla ja pintaproteiineilla on esitetty olevan merkitystä pato- 10 geneesissä, mutta infektion molekulaarinen mekanismi on tuntematon. S. suis-bakteerien on osoitettu sitoutuvan sialyloituihin poly-n-asetyylilaktosamiiniglykaaneihin (Liukkonen J., Haataja, S., Tikkanen, K., Kelm, S., ja Finne, J. (1992) J. Biol. Chem. 267, 21105-21111). Kuiten- 15 kin useimpien S. suis-bakteerien aiheuttama hemagglutinaatio inhiboituu galaktoosilla, täten galaktoosia tunnistava adhesiini on todennäköisesti yleisempi S. suis-bakteerissa kuin edellä mainittu (Kurl, D., Haataja S. ja Finne, J. (1989) Infect. Immun. 57, 384-389). 20 Adhesiineja on usein pyritty irroittamaan ja eris- tämään lämpökäsittelyllä ja/tai uuttamalla. Proteus mirabilis-bakteerin adhesiini eristettiin lämpökäsittelyllä (65 C, 20 min, 2 M urea) ja puhdistettiin geelisuodatuksella (Sepharose CL-4B) (Wray, S.K., Hull, S.I., Cook, 25 R.G., Barrish, J. ja Hull, R.A. (1986) Infect. Immun. 54 43-49). S. mitis-bakteerin lektiini irroitettiin uuttamalla bakteerit litium-3,5-dijodosalisylaatilla ja uutteesta puhdistettiin sialohappoa sitova proteiini geelisuodatuksen ja affiniteettikromatografian avulla (Murray, P.A., 30 Levine, M.J., Reddy, M.S., Tabak, L.A. ja Bergey, E.J. (1986) Infect. Immun. 53, 359-365). Streptococcus pyogenes-bakteerin (Lancefieldin ryhmä A) sydänlihaskudokseenja munuaissolujen tyvikalvoon tarttuva proteiini kyettiin eristämään käsittelemällä bakteereita emäksellä 35 18 h ajan (Stinson, M.W. ja Bergey E.J (1982). Infect.
6 Immun. 35, 335-342). E. colin nonfimbriaalinen adhesiini uutettiin kuumentamalla bakteerisuspensiota 65 C lämpötilassa 30 min ajan (Goldhar, J., Perry, R., Golecki, J.R., Hoschutzky, H., Jann B., ja Jann, K. (1987) Infect. Immun. 5 55, 1837-1842). Fimbriaalisesta E. colista erotettiin fimbriat homogenoimalla mekaanisesti ja fimbriahomogenaatista adhesiiniproteiini irroitettiin kuumennuskäsittelyllä (70 C 1 h, 5 mm EDTA) (Moch, T., Hoschutzky, H., Hacker, J., Kröncke, K.-D ja Jann, K. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 10 USA 84, 3462-3466). Usein adhesiiniproteiinin irroittamisen jälkeen adhesiini on saostettu ammoniumsulfaattisaostuksella, minkä jälkeen adhesiinit on jatkopuhdistettu vaihtelevilla menetelmillä. Adhesiinien eristämiseksi käytetyt tavanomaiset menetelmät eivät kuitenkaan sopineet S. 15 suis-bakteerien adhesiinien eristämiseksi. Yhteenveto keksinnöstä Nyt on onnistuttu eristämään ja karakterisoimaan Streptococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiini. Keksinnön kohteena on näin ollen menetelmä adhesiiniproteiinin tai 20 sen biologisesti tai immunologisesti aktiivisen johdannaisen tai fragmentin valmistamiseksi, jonka molekyylipaino on noin 18 000, isoelektrinen piste on noin 6,4 ja N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser- Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1). Keksinnön mu- 25 tiaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että S. suis-bakteerikanta sonikoidaan ja irronnut adhesiiniproteiini esipuhdistetaan proteiinipuhdistuksessa tavanomaisella tavalla, minkä jälkeen se puhdistetaan elektroforeettisesti tai kromatografisesti. Adhesiiniproteiinin puhdistuksen seu- 30 rannassa käytetään edullisesti kyyhkyn ovomukoidia. Keksintö koskee myös menetelmää adhesiiniproteiinin, sen johdannaisen tai fragmentin vastaisen vasta-aineen valmistamiseksi käyttämällä mainittua adhesiiniproteiinia, sen johdannaista tai fragmenttia immunogeeninä. Keksinnön mu- 35 kaisesti valmistettua adhesiiniproteiinia, sen johdannais-
7 ta tai fragmenttia voidaan käyttää rokotteena ja mainittuja vasta-aineita passiiviseen immunisaatioon. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tässä kuvattua adhesiiniproteiinia pystytään ir- 5 voittamaan S. suis-bakteerin pinnasta sonikoimalla. Sonikoinnin jälkeen on syytä lisätä proteaasi-inhibiittoria proteolyysin estämiseksi. Sitten sonikaatti sentrifugoidaan ja supernatantti otetaan talteen. Adhesiiniproteiinia sisältävä supernatantti on hyvä esipuhdistaa, jollain pro- 10 teiinipuhdistuksessa tavanomaisella tavalla, kuten esim. ultrafiltraatio, dialyysi, geelisuodatus, saostuminen suolalla. Edullisesti käytetään ammoniumsulfaattisaostusta ja erityisesti muita proteiineja voidaan poistaa noin 60 %:- isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella, minkä 15 jälkeen adhesiiniproteiini voidaan saostaa noin 70 %:isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella. Varsinainen puhdistus voidaan suorittaa elektroforeettisesti esim. geelielektroforeesilla tai kromatografisesti esim. affiniteettikromatografialla tai immunoaffini- 20 teettikromatografialla. Edullisesti käytetään preparatiivista natiivigeelielektroforeesia. Natiivielektroforeesilla ymmärretään elektroforeesia ilman natriumdodekyylisulfaattia eli SDS:ää. Erityisesti käytetään jatkuva-eluutioelektroforeesilaitetta, joka edullisesti on sylinterinmuo- 25 toinen. Laitteesta kerätään fraktiot ja otetaan talteen ne proteiinifraktiot, joissa on adhesiiniaktiivisuutta. Adhesiiniproteiinin puhdistuksen seurannassa voidaan käyttää hyväksi S. suis-bakteerin adhesiiniproteiinin biologista aktiivisuutta. Adhesiiniproteiini liittyy S. 30 suis-bakteerien hemagglutinaatiokykyyn, jota voidaan inhiboida tietyillä sokeriyhdisteillä, kuten galaktoosilla ja N-asetylgalaktosamiinilla tai vain galaktoosilla, millimolaarisissa pitoisuuksissa. Tutkittaessa galaktoosispesifisiä adhesiiniproteiineja käytetään edullisesti sialidaa- 35 sikäsiteltyjä ihmisen punasoluja. Hemagglutinaatiokokeet
8 ja hemagglutinaation inhibiitiokokeet kuvataan julkaisuissa Kurl, D.N., Haataja, S. ja Finne, J. (1989) Infect. Immun. 57, 384-389 ja Haataja, S., Tikkanen, K., Liukkonen, J., Francois-Gerard, C. ja Finne, J., (1993) Charace- 5 rization of a Novel Bacterial Adhesion Specificity of Streptococcus suis Recognizing Blood-Group P Receptor Oligosaccharides. J. Biol. Chem. 268, (painossa). Mono- ja oligosakkaridi-inhibitiokokeilla on havaittu, että S. suis-bakteerin reseptorirakenne on Galal- 10 4Ga1B1-4G1c. Tämä muodostaa oligosakkaridiosan P veriryhmän glykolipidien Pk-antigeenissa. Toisaalta hemagglutinaation inhibitiokokeilla ja suoralla glykoproteiinien ja neoglykoproteiinien sitoutumisella on osoitettu, että adhesiini tunnistaa myös P 1 -antigeenirakenteen, Gala1-4GalB1-15 4G1cNac. Tämä on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että adhesiini sitoutuu voimakkaasti Galal-4Gal-disakkaridirakenteeseen verrattuna al-3, al-6, a-galaktoosi-disakkaridi-johdannaisiin. Inhibitiokokeet oligosakkarideilla osoittavat, että adhesiinin sitoutumiselle oleellista on 20 terminaalinen a-galaktoosi. Nyt on keksitty, että kyyhkyn ovomukoidi on erityisen tehokas inhibiittori. 0,06 pg/m1 kyyhkyn ovomukoidia inhiboi täysin S. suis-kannan 628 indusoiman hemagglutinaation. Kyyhkyn ovomukoidi on glykoproteiini, jonka gly- 25 kaaniketjujen terminaalinen sekvenssi on Gala1-4GalB1-4G1cNAc ja jota on kuvattu julkaisussa Francois-Gerard C., Gerday C. ja Beeley, J.G. (1979) Biochem. J. 117, 679-685. Tästä rakenteesta johtuu voimakas S. suis-adhesiiniproteiinin sitoutuminen kyyhkyn ovomukoidiin ja tästä johtuen 30 kyyhkyn ovomukoidilla on myös veriryhmä P 1 -aktiivisuus. Neoglykoproteiini Gala1-4GalB1-4G1c-O-CETE-BSA on myös osoittautunut hemagglutinaatio-inhibitiossa erittäin voimakkaaksi inhibiittoriksi. Adhesiiniproteiinin puhdistumista voidaan helposti 35 seurata yksinkertaisella kyyhkyn ovomukoidin sitoutumisko-
9 keella. Puhdistuksen seurannassa käytettävä ovomukoidi voidaan leimata esim. radioaktiivisella merkkiaineella. Koe voi olla esim. täplätesti, jolloin adhesiiniproteiinia sisältävä näyte pipetoidaan nitroselluloosapaperille, joka 5 sitten peitetään radioaktiivisesti merkityllä kyyhkyn ovomukoidilla, inkuboidaan ja pestään se ja määritetään paperiin sitoutunut radioaktiivisuus. Sitoutumisen voimakkuus korreloi kannan hemagglutinaatioaktiivisuuteen. Edullisesti adhesiiniproteiinin puhdistumista seu- 10 rataan "western blot" -menetelmällä, jolloin näytteille suoritetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesi, minkä jälkeen proteiinit siirretään sähkövirran avulla membraanille, jota sitten käsitellään kuten paperi yllä. S. suisbakteerisonikaatit antavat yhden adhesiiniproteiinivyöhyk- 15 keen, joka liikkuu samalla kohdalla eri kannoilla. Vyöhykkeen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen. Myös hemagglutinaationegatiivisilla kannoilla erottuu vyöhyke, vaikka yleensä heikommin. Syy siihen lienee adhesiiniproteiiniin liittyvä faasivariaatio ts. bakteerit saat- 20 tavat ilmentää adhesiinia eri tasolla eri olosuhteissa, tai muiden pintarakenteiden kuten kapselin inhiboiva vaikutus. Edellä kuvatulla menetelmällä voidaan valmistaa S. suis-bakteerin adhesiiniproteiini, jonka molekyylipaino on 25 noin 18 000, isoelektrinen piste on noin 6,4, N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe- Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja aminohappokoostumus on:
10 Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja aminohappokoostumus on: Aminohappo nmol aminohappoa/nmol proteiinia 5 Asx =asparagiini ja/tai aspargiinihappo 13 Thr =treoniini 8 Ser =seriini 6 Glx =glutamiini(glu) ja/tai glutamiinhappo 26 Gly =glysiini 22 10 Ala =alaniini 17 Val =valiini 10 Cys =kysteiini 0 Met =metioniini 4 Ile =isoleusiini 11 15 Leu =leusiini 12 Tyr =tyrosiini 4 Phe =fenyylialaniini 6 Lys =lysiini 16 His =histidiini 7 20 Arg =arginiini 7 Pro =proliini 12 Edellä kuvatun biologisen aktiivisuuden lisäksi adhesiiniproteiinin ominaisuuksiin kuuluu edelleen se, että 25 se on immunologisesti aktiivinen, toisin sanoen se saa ai- kaan vasta-aineiden muodostuksen. Valmistettavan adhesiiniproteiinin piiriin kuuluu näin ollen myös kuvatun proteiinin johdannaiset ja fragmentit, joilla on oleellisesti sama biologinen tai immuno- 30 loginen aktiivisuus kuin kuvatulla adhesiiniproteiinilla. Johdannaisella ymmärretään proteiini, josta osa aminohapoista on korvattu, poistettu tai lisätty, mutta joka on säilyttänyt oleelliset biologiset tai immunologiset ominaisuutensa. Korvaavat tai lisätyt aminohapot käsittävät 35 sekä proteiineissa esiintyvät aminohapot että niiden joh-
11 dannaiset. Mandolliset aggregaatit lasketaan myös mainittuihin johdannaisiin. Fragmentilla ymmärretään kuvatun adhesiiniproteiinin osaa, joka on säilyttänyt oleelliset biologiset tai immunologiset ominaisuutensa. Johdannaiset 5 ja fragmentit voidaan valmistaa proteiinikemiassa tavanomaisella tavalla. Fragmentit valmistetaan edullisesti peptidisynteesillä esim. kiinteäfaasimenetelmällä. Keksinnön piiriin kuuluu edelleen adhesiiniproteiinin vastaisten vasta-aineiden valmistus, joihin vasta-aineisiin tässä 10 yhteydessä lasketaan myös vasta-ainefragmentit, kuten esim. Fab-fragmentit tai faageissa ekspressoidut vastaaineiden osat, jotka sitoutuvat tässä kuvattuun adhesiiniproteiiniin, sen johdannaiseen tai fragmenttiin. Immunologisten ominaisuutensa vuoksi keksinnön mu- 15 kaisesti valmistetuilla adhesiiniproteiinilla, sen johdannaisilla ja fragmenteilla voi olla käyttöä rokotteena S. suis-bakteerien aihettamia tauteja vastaan. Käyttö ihmisten rokotteena voi myös olla mandollista esim. riskiryhmille kuten siankasvattajille tai teurastamohenkilökunnal- 20 le. Vasta-aineita voitaisiin ajatella käytettäväksi passiiviseen immunisointiin. Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat keksintöä. Esimerkki 1 25 Streptococcus suis-bakteerien kasvatus Tutkimuksissa käytettiin seuraavia S. suis-kantoja: Hemagglutinoivat: 628, TEW/2, R75/L1, 825 ja 752 Ei-hemagglutinoivat: 3027, 1045 ja 598/T5 Kannat 628, TEW/2, R75/L1 ja 825 on kuvattu julkaisussa 30 Kurl, D.N., Haataja, S. ja Finne, J., (1989) Infect. Immun. 57, 384-389. Loput kannoista saatiin Dr. J. Hommezilta, Regional Veterinary Investigation Laboratory, Torhout, Belgia. Kannat säilytettiin pakastettuina Todd-Hewitt -ela- 35 tusaineessa -20 C:ssa. Bakteerit kasvatettiin anaerobi-
12 sesti (Gas Pak -systeemi) tuoreilla lampaan veriagar-maljoilla 37 C:ssa yön yli. Bakteerit kerättiin maljoilta ja suspensoitiin fosfaattipuskuriin A (10 mm natriumfosfaattipuskuri, 0,15 M NaC1, ph 7,4) siten, että konsentraa- 5 tioksi saatiin 10 9 pesäkettä muodostavaa yksikköä/ml (Awom Esimerkki 2 Adhesiiniproteiinin puhdistus Adhesiiniproteiini irroitettiin bakteerin pinnalta 10 sonikoimalla 5x15 sek. (jäähdytys jäissä 2x1 min. ja 1x2 min.) 2,5 ml:n erissä fosfaattipuskuriin A. Sonikoinnin jälkeen lisättiin proteaasi-inhibiittoria PMSF (fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) 2 mm:ksi konsentraatioksi. Sonikaatit sentrifugoitiin 15 800 x g, +8 C:ssa ja superna- 15 tantit otettiin talteen. Adhesiiniproteiini esipuhdistettiin seoksesta fraktioivalla ammoniumsulfaattisaostuksella. Ammoniumsulfaattisaostukseen käytettiin 16 ml supernatanttia. Muita proteiineja poistettiin seoksesta 60 %:- isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla ja adhesiini 20 saostettiin 70 %:isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla. Adhesiiniproteiinia ei jäänyt merkittäviä määriä 70 %:- iseen supernatanttiin. Kylmää kylläistä ammoniumsulfaattia tiputettiin pisaroittain liuokseen (0 C), seisotettiin 1 tunnin ajan jäähauteessa, sentrifugoitiin 15 800 x g, 20 25 min. Sakat 70 %:n saostuksesta otettiin talteen ja liuotettiin 16 ml:aan fosfaattipuskuria B (3,3 mm natriumfosfaattipuskuri, 0,05 M NaC1, ph 7,4). Sakat dialysoitiin yön yli +8 C, H 20:ta vastaan, lyofilisoitiin ja liuotettiin 4 ml:aan fosfaattipuskuria A. Puhdistumista seurat- 30 tiin 6 %:isessa natiivissa polyakryyliamidigeelielektroforeesissa radioaktiivisella jodilla merkityn kyyhkyn ovomukoidin avulla Bio Rad -minigeelilaitteella (ks. esimerkki 3). Varsinainen puhdistus suoritettiin Bio Rad 491 Prep 35 Cell preparatiivisen elektroforeesilaitteen avulla. Sylin- 5,0).
13 terinmuotoiseen geelilaitteeseen valettiin 6 %:inen natiivi polyakryyliamidigeeli (alageelin korkeus 6 cm, ylägeelin 2 cm). Näytteen kokonaistilavuus oli 4 ml, josta 3000 gl yllä valmistettua proteiiniliuosta, 920 gl näytepusku- 5 ria (ei SDS-liuosta) ja 80 gl merkkiväriä BPB (bromfenolisininen). Ajoliuoksena oli 25 mm Tris-192 mm glysiini, ph 8,3 ja eluutiopuskurina Tris-HC1, ph 8,3. Näytteistä kerättiin 4 ml:n fraktiot, jotka analysoitiin mittaamalla fraktioiden absorbanssi kandella eri aallonpituudella (214 10 nm ja 280 nm), minkä jälkeen näytteet ajettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesissa Bio Rad-minigeelilaitteella, kuten esimerkissä 3 on kuvattu. Adhesiiniproteiinia oli fraktioissa 79-83. Fraktiot 79-81 yhdistettiin, dialysoitiin yön yli +8 C:ssa fosfaattipuskuria B vastaan ja 15 kylmäkuivattiin. Kuivattu sakka säilytettiin myöhempiä analyysejä varten -20 C:ssa. Esimerkki 3 Puhdistumisen seuranta Puhdistumisen seurannassa käytettiin hyväksi ha- 20 vaintoa, että S. suis-bakteerit sitoivat voimakkaasti kyyhkyn ovomukoidia, joka siis sisältää disakkaridirakenteen galaktosyyli-al-4-galaktosidin. Tästä syystä kehitettiin adhesiiniproteiinin tunnistusmenetelmä merkitsemällä kyyhkyn ovomukoidi radioaktiivisesti 125I-merkkiaineella. 25 Radioaktiivisesti merkityn ovomukoidin sitoutumiskokeessa hemagglutinoivan S. suis 628-bakteerikannan lisäksi kontrollikantoina käytettiin negatiivista ts. ei-hemagglutinoivaa S. suis-kantaa 598/T5 sekä heikosti hemagglutinoivaa S. suis-bakteerikantaa 825 (S. suis 628-kannan hemag- 30 glutinaatiotiitteri oli 64, 825-kannan tiitteri 4 ja 598/ T5-kannan tiitteri 0). Ovomukoidi merkittiin radioaktiivisesti m I-isotoopilla Iodo-Bead-menetelmällä (Pierce Chemical Co, Rockford II) valmistajan ohjetta mukaillen. Ensi vaiheessa kehitettiin ns. täplätesti. Tässä 35 sitoutumiskokeessa kukin esimerkin 1 mukaisesti valmistet-
14 tu bakteerisuspensio laimennettiin (1:1; 1:10; 1:50) fosfaattipuskuriin A. Suspensioita pipetoitiin 1 gl ruudutetulle nitroselluloosapaperille, minkä jälkeen ylimääräiset sitomispaikat peitettiin inkuboimalla 1,5 h fosfaattipus- 5 kurissa C (0,1 M natriumfosfaattipuskuri, 0,5 % Tween 20, 150 mm NaC1, ph 5,3). Tämän jälkeen nitroselluloosa peitettiin 125I-ovomukoidilla (6x10 5 cpm, spesifinen akt. 2,5x10 5 cpm/µg ovomukoidi) ja inkuboitiin lh, +8 C:ssa. Membraani pestiin 3x10 min. fosfaattipuskurilla C, kuivat- 10 tiin suodatinpaperien välissä ja valotettiin röntgenfilmille -80 C:ssa 24 h. Sitomista oli havaittavissa ainoastaan hemagglutinoivissa kannoissa jopa pienissä bakteeripitoisuuksissa, lisäksi sitoutumisen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen. 15 Toisessa vaiheessa edellä kuvattua menetelmää so- veltaen, kehitettiin "western blot" tunnistusmenetelmä adhesiiniproteiinille polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (Laemmli, U.K. (1970) Nature (London) 227, 680-685). Käytettiin natiivia geelielektroforeesia; ilman SDS-li- 20 säystä, jolloin proteiinit säilyvät natiivissa muodossaan. Esimerkin 2 mukaisesti valmistetut bakteerisonikaatit eroteltiin useissa polyakryyliamidigeelielektroforeesisysteemeissä, jotka sisälsivät eri pitoisuuksia polyakryyliamidia (5-9 %). Lopuksi päädyttiin käyttämään 6 %. Erotta- 25 misen jälkeen sonikaatit siirrettiin sähkövirran avulla (60 ma, 30 min) PVDFp (Millipore) membraanille (Burnette, W.N. (1981) Anal. Biochem. 112, 195-203) ja membraani merkittiin 125I-ovomukoidilla kuten yllä. Kokeissa käytettiin S. suis-kantoja hemagglutinoivia kantoja: 628, TEW/2, R75/ 30 Ll, 825, 752 ja ei-hemagglutinoivia kantoja: 3027 ja 1045. Sonikaateista erottui voimakkaasti yksi proteiinivyöhyke, joka liikkui elektroforeesissa hemagglutinoivilla bakteerikannoilla samalla kohdalla. Vyöhykkeen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen, mutta myös nega- 35 tiivisista kannoista erottui samalla kohdalla natiivissa
15 geelielektroforeesissa liikkuva vyöhyke, yleensä heikommin. Esimerkki 4 Adhesiiniproteiinin molekyylipaino ja puhtauden 5 varmistus Adhesiinin puhtaus varmistettiin ja elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella määritettiin molekyylipaino 15 %:isessa SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (Laemmli, U.K. (1970) Nature (London) 227, 680-685). Kan- 10 nan 628 adhesiiniproteiinia (4 gg) keitettiin 5 min. ajan 2 %:isessa SDS-liuoksessa, jossa oli joko 5 % merkaptoetanolia tai 2,5 mm ditiotreitolia. Puhdistetusta adhesiiniproteiinista erottui yksi vyöhyke. Molekyylipainostandardeina käytettiin Pharmacian Low Molecular Weight Standards 15 -standardiproteiineja. Adhesiinin molekyylipainoksi saa- tiin 18 000. Esimerkki 5 Isoelektrinen piste Isoelektrinen fokusointi suoritettiin Phast geeli- 20 elektroforeesi-laitteella Phast isoelektristä systeemiä käyttäen (Pharmacia). Geelinä oli Phast Gel 15531 3-9 ja standardeina IEF standardi 3-10 (Pharmacia). Puhdistettua kannan 628 adhesiinia käytettiin määritykseen 0,2 gg. Isoelektrinen fokusointigeeli värjättiin käyttäen Phast sys- 25 teemin Silver IEF-Method 6. Adhesiinin isoelektriseksi pisteeksi saatiin 6,4. Esimerkki 6 Aminohappoanalyysi Aminohappoanalyysiä varten 7 nmol kannan 628 puh- 30 distettua adhesiinia liuotettiin 100 gl:aan 6 M HC1-liuosta. Sisäiseksi standardiksi lisättiin 60 nmol norleusiinia. Hydrolysoitiin 110 C:ssa, 24 h, kylmäkuivattiin ja analysoitiin LKB 4151 Alpha Plus Aminoacid Analyzer -laitteen avulla valmistajan ohjeen mukaan.
16 Aminohappokoostumus oli seuraava: Aminohappo 1 Asx 5 2 Thr 3 Ser 4 Glx 5 Gly 6 Ala 10 7 Val 8 Cys 9 Met 10 Ile 11 Leu 15 12 Tyr 13 Phe 14 Lys 15 His 16 Arg 20 17 Pro nmol aminohappoa/ nmol proteiinia 13,2 8,1 5,8 26,4 22,3 16,9 10,3 0,0 3,9 11,4 12,3 3,9 6,0 15,9 6,6 6,8 12,4 Esimerkki 7 Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen aminohapposekvenssi 25 Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritettiin Applied Biosystems 477A Pulsed Liquid Protein/Peptide Sequencer with 120A Amino Acid Analyzer -peptidisekvensaattorin avulla valmistajan ohjeen mukaan. Puhdistettua adhesiinia ajettiin 6 %:iseen natiivipolyak- 30 ryyliamidigeeliin, josta adhesiini siirrettiin sähkövirran avulla PVDFp-membraanille, kuten esimerkissä 3. Membraani värjättiin Coomassie Brilliant Blue -proteiinivärillä (10 min.), ylimääräinen väri poistettiin ja proteiinivyöhyke leikattiin peptidisekvensointia varten.
17 Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen sekvenssi pystyttiin määrittämään myös sonikoitujen bakteerien supernatanteista: Adhesiiniproteiinin liikkuvuus natiivigeelielektroforeesissa tunnetaan, koska adhesiiniproteiinivyö- 5 hyke pystytään identifioimaan ' 251-kyyhkyn ovomukoidin avulla PVDFp-membraanilta. Viidestä eri hemagglutinoivasta S. suis -kannasta (628, TEW/2, R75/L1, 825, 752) identifioitiin adhesiiniproteiinin liikkuvuus 6 %:isessa natiivipolyakryyliamidigeelielektroforeesissa;näiden bakteeri- 10 kantojen sonikaatit ajettiin elektroforeesissa ja vyöhykkeet siirrettiin PVDFp-membraanille. Tästä adhesiinivyöhykkeet leikattiin aminohapposekvensointia varten, kuten edellä. Saatu N-terminaalinen sekvenssi oli kaikilla kannoilla 15 sama eli: Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) Esimerkki 8 Adhesiiniproteiinin vasta-aineen valmistaminen 20 Kannan 628 adhesiiniproteiinin vasta-ainetta valmistettiin Balb/c-hiirissä. Hiiret immunisoitiin joko puhtaalla adhesiinilla (10 gg/hiiri) tai S. suis-bakteerista valmistetulla sonikaatilla (80 gg/hiiri). Ensimmäisessä tapauksessa adhesiini injisoitiin kaksi kertaa Freundin 25 täydellisessä adjuvantissa (F.C.A.) ja kerran Freundin epätäydellisessä adjuvantissa (F.I.C.A.). Jälkimmäisessä tapauksessa proteiiniseos pistettiin hiiriin kerran F.C.A.:n kanssa ja kaksi kertaa sekoitettuna F.I.C.A.:iin. Immunisointi suoritettiin subkutaanisesti. Molemmissa ta- 30 pauksissa vasta-aineita muodostui adhesiiniproteiinia vas- taan. Vasta-aineen muodostus tutkittiin PVDFp-membraanilta, johon oli siirretty S. suis-bakteereiden sonikaattisupernatantteja (ks. esimerkki 2). Adhesiiniproteiinin 35 vyöhyke tunnistettiin (vrt. esimerkki 3) ja vasta-aineen
18 muodostus S. suis-bakteerikannan 628 adhesiiniproteiinia vastaan oli voimakasta. Vasta-aine kykeni spesifisesti tunnistamaan adhesiiniproteiinin vielä laimennoksessa 1 : 5x10 5. (Vasta-aineen epäspesifinen sitoutuminen estettiin 5 inkuboimalla membraania 1,5 h, 1,5 % maitojauhe-0,5 % Tween 20 -liuoksessa, joka oli tehty puskuriin D (10 mm Tris, 150 mm NaC1, ph 7.8). Membraani pestiin kolmesti puskurilla D, johon oli lisätty 0,05 % Tween 20. Vastaainelaimennokset lisättiin yhden tunnin ajaksi, jonka jäl- 10 keen membraani pestiin 5x puskurilla D, johon oli lisätty 0,05 % Tween 20. Membraania inkuboitiin alkaalisella fosfataasilla merkityn hiiren vasta-aineen kanssa tunnin ajan (1:1000 laimennos), pestiin viidesti puskurilla D ja lisättiin alkaalisen fosfataasin substraattia värireaktion 15 aikaansaamiseksi (bromikloori-indolyylifosfaatti-nitrosinitetratsoliumi). Aminohapposekvenssi nro 1: Ala Ser Pro Ala Glu Ile Ala Ser Phe Ser Pro Ala Pro Leu Ala 1 5 10 15
19 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen Streptococcus suis -bakteerin adhesiiniproteiinin valmistamisek- 5 si, jolla adhesiiniproteiinilla on galaktoosilla inhiboituva hemagglutinaatioaktiivisuus, ja joka sitoutuu kyyhkyn ovomukoidiin ja joka saa aikaan vasta-aineiden muodostuksen ja jonka molekyylipaino on noin 18 000, isoelektrinen piste on noin 6,4 ja N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala- 10 Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja jolla on seuraava aminohappokoostumus: Aminohappo nmol aminohappoa/nmol proteiinia Asx 13 15 Thr 8 Ser 6 Glx 26 Gly 22 Ala 17 20 Val 10 Cys 0 Met 4 Ile 11 Leu 12 25 Tyr 4 Phe 6 Lys 16 His 7 Arg 7 30 Pro 12 tai sen johdannaisen tai fragmentin valmistamiseksi, jolla on sama biologinen ja immunologinen aktiivisuus, t u n - nettu siitä, että S. suis -bakteerikanta sonikoidaan, 35 ja irronnut adhesiiniproteiini esipuhdistetaan tavanomaisel-
20 la tavalla, minkä jälkeen se puhdistetaan elektroforeettisesti tai kromatografisesti. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään preparatiivista na- 5 tiivigeelielektroforeesia. 3. Menetelmä vasta-aineen valmistamiseksi, t u n - nettu siitä, että se muodostetaan käyttämällä immunogeenina patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä adhesiiniproteiinia tai sen johdannaista tai fragmenttia, jolla on sama 10 biologinen ja immunologinen aktiivisuus.
21 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av ett terapeutiskt användbart adhesinprotein av en Streptococcus suis -bakter- 5 ie, vilket adhesinprotein har en hemagglutinationsaktivitet som kan inhiberas med galaktos, och vilket binds vid duvovomukoid och vilket ger upphov till bildning av antikroppar och med molekylvikten ca 18 000, isoelektriska punkten ca 6,4 och med den N-terminala sekvensen Ala-Ser-Pro-Ala-Glu- 10 Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvens 1) och med följande aminosyrasammansättning: Aminosyra nmol aminosyra/nmol protein Asx 13 15 Thr 8 Ser 6 Glx 26 Gly 22 Ala 17 20 Val 10 Cys 0 Met 4 Ile 11 Leu 12 25 Tyr 4 Phe 6 Lys 16 His 7 Arg 7 30 Pro 12 eller ett derivat eller fragment därav, med samma biologiska och immunologiska aktivitet, k ä n n e t e c k n a t därav, att man sonikerar en S. suis -bakteriestam och förrenar 35 det lösgjorda adhesinproteinet på sedvanligt sätt, varefter det renas elektroforetiskt eller kromatografiskt.
111. Mlk/ 1 1 22 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att man använder preparativ nativgelelektrofores. 3. Förfarande för framställning av en antikropp, 5 k ä n n e t e c k n a t därav, att den framställs genom att använda det i patenkrav 1 definierade adhesinproteinet eller derivatet eller fragmentet därav, med sama biologiska och immunologiska aktivitet.