LIPIDIT lipos (kreik.) = rasva MÄÄRITELMIÄ: Lipidit ovat rasvahappoja ja niiden johdannaisia sekä biosynteettisesti tai toiminnallisesti näiden kaltaisia yhdisteitä. Lipidit ovat öljymäisiä orgaanisia yhdisteitä, jotka eivät liukene veteen, mutta liukenevat joihinkin orgaanisiin liuottimiin. Reijo Käkelä Y, Biotieteiden laitos, Fysiologia ja neurotieteet Luennon teemat 1. Lipidien luokittelu ja rakenteet (nisäkkäät) 2. Lipidien tehtävät Kalvot ja niiden ominaisuudet (pääpaino) Energian varastointi ja kuljetus [ 3. Lipidien analysointi ] Massaspektrometria 1
1. Lipidien luokittelu Rasvahapot Glyserolipidit Glyserofosfolipidit Triasyyliglyserolit Sfingolipidit Sterolit (Vahat ja vahaesterit) Rasvahapot Steariinihappo (18:0) Öljyhappo (18:1n-9) 2
Luonnosta on löydetty yli 1000 erilaista rasvahappoa Kertatyydyttymättömiä Tyydyttyneitä Monityydyttymättömiä DA Lipidien yleisimpiä rasvahappoja: Lyhenne 14:0 16:0 16:1n-7 18:0 18:1n-9 18:2n-6 18:3n-3 20:4n-6 20:5n-3 22:6n-3 24:1n-9 Yleisnimet Myristiinihappo Palmitiinihappo Palmitoleiinihappo Steariinihappo Öljyhappo Linolihappo Alfa-linoleenihappo Arakidonihappo EPA DA Nervonihappo Systemaattiset nimet (engl.) n-tetradecanoic acid n-exadecanoic acid cis 9-exadecenoic acid n-ctadecanoic acid cis 9-ctadecenoic acid cis,cis 9, 12 ctadecadienoic acid all-cis- 9, 12, 15 ctadecatrienoic acid all-cis 5, 8, 11, 14-Eicosatetraenoic acid all-cis 5, 8, 11, 14, 17-Eicosapentaenoic acid all-cis 4, 7, 10, 13, 16, 19-Docosahexaenoic acid cis 15-Tetradocosanoic acid Solun koko rasvahappovalikoima on yleensä 100-200 (10-30 pääkomponenttia). 3
mega-nimeämisjärjestelmä 2 4 6 8 1 3 5 7 9 Öljyhappo (18:1n-9 eli 18:1 9) MEGA 9 -sarja 1 3 5 2 4 6 Linolihappo (18:2n-6 eli 18:2 6) MEGA 6 sarja Välttämätön 1 2 3 Alfa-linoleenihappo (18:3n-3 eli 18:3 3) MEGA 3 sarja Välttämätön Monia kirjoitustapoja: 18:3 3, 18:3n-3, etc Välttämätön = saatava ravinnosta Glyserofosfolipidit Esimerkkeinä: Fosfatidyylikoliini Fosfatidyylietanoliamiini Fosfatidyyliseriini Fosfatidyyli-inositoli 4
2C C C 2 P N Fosfatidyylikoliini Tyypilliset piirteet: -Iso polaarinen pää (sitoo n. 30 vesimolekyyliä) - Ei nettovarausta (±) -Tyydyttymäton rasvahappo sn-2 asemassa -Määrällisesti tärkein fosfolipidi nisäkässoluissa (50-60 mol%) P 2 C C C 2 N3 Fosfatidyylietanoliamiini Tyypilliset piirteet: -Pieni polaarinen pää -Ei nettovarausta (±) -Tyydyttymätön rasvahappo sn-2 asemassa -Toiseksi suurin fosfolipidiluokka (n. 25 mol%) 5
P 2 C C C 2 N 3 C Fosfatidyyliseriini Tyypilliset piirteet: -Negatiivinen nettovaraus (-) -Keskikokoinen polaarinen pää -Tyydyttymätön rasvahappo sn-2 asemassa - 3-5 mol% solun fosfolipideistä Fosfatidyyli-inositoli Tärkeä viestinnässä: fosfatidyyli-inositolia voidaan fosforyloida (inositolin hydroksyyliryhmiin) Muodostaa kalvoihin proteiiniankkureita 6
Kolesteroli (steroli) Tyypilliset piirteet: - Pieni pää - Jäykkä, levymäinen rakenne C 2 C N C C Sfingolipidit N P C 2 C C C N C 2 C C C N Tyypilliset piirteet: - Tyydytetyt ja pitkät rasvahapot - Polaarinen pää voi olla hyvin iso (glykosfingolipidit) Keramidi Sfingomyeliini Laktosyylikeramidi (glykosfingolipidi) 7
2. Lipidien tehtäviä 2.1. Muodostavat kaikkien biologisten kalvojen perusrakenteen eli lipidikaksoiskerroksen 2.1.1. Lipidikalvojen yleiset ominaisuudet 2.1.2. Solun lipidikalvojen erityisominaisuudet 2.2. Muodostavat elimistön tärkeimmän energiavaraston Lisäksi lipidit: vat keskeisiä tekijöitä erilaisissa biologisissa viestintäjärjestelmissä (toisiolähetit) Sallivat keuhkorakkuloiden avautumisen Estävät veden haihtumista ihon läpi 2.1. Lipidikalvot Fig/biocrawler 8
Fosfolipidit muodostavat vesiliuoksissa spontaanisti kaksoiskalvoja ja kalvorakkuloita. Kalvorakkula fosfolipidikalvo ydrofiiliset ns. polaariset päät (emäs & fosfaatti) ydrofobiset pitkät asyyliketjut (esteröidyt rasvahapot) Miksi näin? (a) Vesimolekyylit ovat normaalisti sitoutuneet toisiinsa heikoin vetysidoksin. (b) iilivetyketju vedessä pakottaa vesimolekyylejä järjestäytymään toisin => Entropia laskee (b) 9
iilivetyketjujen keräytyminen yhteen vapauttaa vesimolekyylejä näistä pakotetuista hiloista => Entropia kasvaa! Lipidiaggregaatin muoto riippuu lipidin muodosta. 10
Lipidimolekyylien erilaiset muodot mahdollistavat kalvojen kaareutumisen. 2.1.1. Lipidikalvojen yleiset ominaisuudet A) Kalvot ovat nestekiteitä Lipidimolekyylien pyörintä ja sivuliike on hyvin nopeaa. Siirtyminen kalvon lehdykältä toiselle (flip-flop) on hidasta! B) Kalvon nestemäisyys riippuu lipidien rasvahappojen: a) tyydyttymättömyyden asteesta b) ketjunpituuksista C) Kolesteroli lisää nestemäisen kalvon jähmeyttä ja jähmeän kalvon nestemäisyyttä D) Kalvolipidit voivat lautoittua 11
A) nestekide. Siirtyminen kalvon lehdykältä toiselle (flip-flop) on hidasta! Tehokas flip-flop on mahdollista flippaasien avulla. Lipidimolekyylien pyörintä ja sivuliike tasossa on hyvin nopeaa (jopa 10 000 000 paikanvaihtoa/s) B) nestemäisyys. Kalvon sulamislämpötila riippuu rasvahappoketjujen tyydyttyneisyydestä Kaksoissidos pakottaa vierekkäiset Fosfolipidi Di-16:0-PC Di-16:1-PC Sulamislämpötila + 42 C - 20 C rasvahappoketjut kauemmaksi toisistaan heikentäen lyhyen kantaman vetovoimia. 12
C) kolesteroli. Kolesteroli säätelee kalvon fysikaalista tilaa Geelitila Nestetila T + Kolesteroli + Kolesteroli Järjestäytynyt nestetila 2.1.2. Solun kalvot Soluja ja niiden organelleja ympäröi kalvo i.e. Lipidikaksoiskerros. 13
Kalvot osastoivat solun, koska Aineenvaihdunnan lähtöaineet ja tuotteet sekä entsyymit voidaan väkevöidä => reaktiot nopeutuvat sastoituminen mahdollistaa paremman kontrollin Synteettisten ja hajottavien reaktioiden haitallinen kilpailu voidaan eliminoida ym. Solun lipidikalvojen keskeisiä ominaisuuksia: a) Kalvo läpäisee valikoivasti. b) Soluorganellien lipidikoostumukset ovat erilaiset. c) Useimmat kalvot ovat asymmetrisia. d) Lipidit siirtyvät solun sisällä kalvosta toiseen. e) Kalvoissa on lauttoja. 14
a) Lipidikalvo läpäisee yhdisteitä valikoivasti elpoiten itse lipidikalvon läpäisevät yhdisteet ovat: -pieniä -rasvaliukoisia -varauksettomia MUTTA solukalvoissa on kanavia ja pumppuja... Solujen kalvolipidit: (vielä muistin virkistämiseksi) Fosfolipidit Sfingolipidit (sfingomyeliini ja glykosfingolipidit) Kolesteroli (hiivalla ergosteroli; prokaryooteilla ei sfingolipidejä eikä steroleja) 15
b) rganellikalvojen koostumukset ovat erilaiset Kalvojen proteiinikoostumukset ovat täysin erilaiset: -proteiinin rakenteeseen perustuva sijoittelu -valikoiva kuljetus Lipidit valtaosin samoja, mutta suhteelliset määrät vaihtelevat paljonkin: -valikoiva kuljetus (siirtäjäproteiinit/lipidilautat) -paikallisesti erilainen synteesi/hajotus? c) Kalvot ovat asymmetrisiä, Ihmisen punasolun kalvo: mol%, kustakin fosfolipidistä eli solun kalvojen ulko- ja sisälehdykän lipidikoostumukset ovat erilaiset Flippaasi pitää yllä aminofosfolipidien (PC, PE, PS) asymmetriaa mol%, kokonaisfosfolipidistä Zachowski (1993) Biochem J 16
Lipidien siirtyminen kalvon läpi; mekanismit: i) ii) iii) i) Spontaani siirtyminen ( Flip-flop, hidas) ii) Passiivinen siirtyminen (Lipidikanavat) iii) Aktiivinen kuljetus (Lipidipumput) Mikä on lipidiasymmetrian tarkoitus? Solukalvon ulkopinta inertti ja riittävän tiivis (sfingolipidi- ja kolesterolirikas) Sisäpinta reaktiivinen -Fosfatidyyliseriini aktivoi kalvoentsyyymejä -Apoptoosi => fosfatidyyliseriiniä ulkopinnalle => Solu tuhotaan -Fostatidyyliseriini verihiutaleiden pinnalla käynnistää veren hyytymisen 17
d) Lipidien solunsisäinen kuljetus? Useimmat lipidit syntetisoidaan solulimakalvostossa Niitä on kuitenkin kaikissa organelleissä => Kuinka siirtyminen tapahtuu??? i) Kalvorakkulavälitteinen kuljetus 18
ii) Diffuusio soluliman kautta? iii) Proteiinivälitteinen kuljetus? 19
iiii) Kalvofuusio/kontaktit? Tunnemmeko biologisten kalvojen rakenteen? NESTEMSAIIKKIMALLI Singer Nicolson 1972 Klassinen oppikirjamalli Riittämätön LIPIDILAUTTAMALLI (Rafts) Simons Ikonen - van Meer 1988 tai 1997 Muovautuu kaiken aikaa yvin tunnettu & runsaasti referoitu Saa paljon kritiikkiä SUPERILAMALLI (Superlattice) Somerharju Virtanen Cheng 1999 Tunnettu lipidibiokemistien parissa Vähän kritiikkiä 20
e) Kalvolautat (tarua vai totta?) Simons K, van Meer G (1988) Biochemistry 27,6197-202 Vuonna 1988, Kai Simons ja Gerrit van Meer ehdottivat, että solukalvoilla on erityisiä mikroympäristöjä lipidilauttoja (lipid rafts), joissa on muuta kalvoa enemmän kolesterolia, glykolipidejä ja muita sfingolipidejä. Lipidilautat (vihreä alue) ovat muuta kalvoa paksumpia, järjestäytyneempiä ja viskoosimpia alueita Sprong (2001) Nat Rev Moll Cell Biol 2, 504-13 Kalvolauttoja on helppo havaita mallikalvokokeissa enderson RM et al (2004) News Physiol Sci 19, 39-43 Keltainen piikki = PLAP proteiini ranssi lautta = Sfingomyeliini-lautta AFM (Atomic Force Microscopy) paljastaa mallikalvojen lipidiseosten erottuvan lautoiksi, joille tietyt proteiinit asettuvat. Kuvassa istukan alkalinen fosfataasi (PLAP; GPI-akkuroitu proteiini) sfingomyeliinilautalla juoksevamman fosfatidyylikoliinin ympäröimänä. 21
Lipidilauttojen mahdollisesta merkityksestä Vuonna 1997 Kai Simons ja Elina Ikonen ymmärtävät lauttamallin merkityksen ja sen biologiset ja lääketieteelliset seuraukset: Lipidilauttojen uskotaan olevan signalointikeskuksia, proteiinien erotteluasemia ja tärkeitä kalvorakkuloiden muodostuksessa. An example for those interested: Activation of T cells by antigen presenting cells induces lipid raft dependent signaling (Zeyda M, Stulning TM, 2006) Lipid rafts in the resting state are dynamic assemblies that continuously associate and dissociate. resting activated Zeyda M, Stulning TM (2006) Progr Lipid Res 45, 187-202 Lauttojen merkitys proteiinien lajittelussa ja kuljettamisessa??? Solukalvo GLGI Sfingomyeliini Kolesteroli 22
Raftit ovat erilaisia? Lipidilauttoja on erilaisia: Kaveolit (selvä morfologia) Glykosfingolipidi-rikkaat lautat Polyfosfoinositoli (PIP) -rikkaat lautat Simons K, Ikonen E (1997) Nature 387, 569-572 Maguy A et al (2006) Cardiovasc Res 69, 798-807 Uudet näkemykset (yhteenveto) Vaihtoehdot: Kullakin mikrodomeenilla on superhilansa (E min -tila) Satunnainen Segregaatio/lautat Superhila Kyllä, jonkinlaisia dynaamisia ja pieniä Täten superhila- ja lipidilauttateoriat eivät ole ristiriidassa keskenään. [uom! Lisätietoja superhilamallista kiinnostuneille lisäsivuilla] 23
2.1. Lipidit energian varastoinnissa ja kuljetuksessa: Energiasisältö/painoyksikkö on suurempi kuin muilla biomolekyyleillä. 1 g rasvaa = 6 g hiilihydraattia Triasyyliglyseroli on pääasiallisin varastolipidi. Rasvasolu 24
Lipoproteiinit vastaavat rasvojen kuljetuksesta elimistössä. apoproteiini 3. Lipidianalyysi 25
Solun kalvojen lipidiprofiili analysoidaan nykyisin sähkösumutus-massaspektrometrillä (ESI-MS) ESI tekniikka = käänteentekevä edistysaskel Nopea ja herkkä; yksityiskohtainen 1000+ molekyylin analyysi mutta tarkka kvantitointi hankalaa Photo: National Research Council of Canada Sähkösumutusionisaatio-massaspektrometria (ESI-MS) Sähkösumutuksen periaate: Kapillaarin kärki: - 3-4 kv (tai + 3-4 kv) aihtuvia pisaroita; Varaustiheys kasvaa Lipidit ionipölynä MS:n sisäosiin Kuuma kaasuvirtaus ioneja sisältäviä pisaroita 26
Esimerkki: Solun lipidien massaspektri: A) Negatiivisesti ionisoituvat lipidit Intens. PE 18:0/18:2 BK-solu (Baby amster Kidney) 6000 PS 18:0/18:1 PE 18:0/20:4 PE 18:0/22:5 4000 PE 16:0/18:1 PE 18:0/20:4 LBPA 18:1/18:1 PI 18:0/20: 2000 PA 18:0/18:2 PI!8:0/18:2 0 700 725 750 775 800 825 850 875 m/z B) Positiivisesti ionisoituvat lipidit Intens. x10 6 BK-solu (Baby amster Kidney) PC 16:/18:1 PC 18:0/18:2 0.8 0.6 0.4 SM 16:0 PC 16:0/16:1 0.2 SM 24:1 0.0 700 720 740 760 780 800 m/z 27
Erotuskykyä voidaan parantaa yhdistämällä nestekromatografi (LC) ja ESI-MS (on-line) Lipidit erottuvan retentioajan ja massan (m/z) suhteen; 3D-lipidikarttojen tietokoneavusteinen analyysi. iiren isojen aivojen lipidomi, LC-ESI-MS ermansson M et al (2005) Anal Chem 77, 2166-75 LIPIDMIIKKA? Lipidomiikka = Lipidien ja niiden kanssa vuorovaikuttavien molekyylien systeemitason analyysi. Genomiikka Proteomiikka Metabolomiikka DNA RNA Proteiinit Lipidit Sokerit Toksiinit Geneettinen perusta Vaikuttavien entsyymien ja proteiinien identifiointi Lipidomiikka Metabolisten reittien selvittäminen Tilastolliset monimuuttuja- ja verkkoanalyysit Yksityiskohtainen lipidiprofiili (ESI-MS) Lipidien uutto 28
Usein käytettyjä lipidien lyhenteitä: SM = sfingomyeliini PC = fosfatidyylikoliini LPC = lysofosfatidyylikoliini PE = fosfatidyylietanoliamiini PS = fosfatidyyliseriini PI = fosfatidyyli-inositoli PIP = fosforyloitu fosfatidyyli-inositoli (ns. fosfoinositidi) PA = fosfatidihappo Lisämateriaalia kiinnostuneille A)Miksi lipidilauttoja muodostuu? (in English) B) Lipidikalvojen rakentumista kuvaava superhilamalli (in English) C) Miksi lipidomiikkaa? 29
A) Why should lipid rafts exist?? Degree of unsaturation i.e. melting point missmatch Chain length i.e. hydrophobicity missmatch That is why separated lipid phases are easy to observe in low temperatures.. Why should lipid rafts exist? Lipids complementary in shape to each other go to the same phase e.g. Cholesterol and sphingolipids are complementary 30
B) SUPERLATTICE MDEL Somerharju P et al (1999) Biochim Biophys Acta 1440, 32-48 In 1999, Pentti Somerharju, Jorma Virtanen and Kwan on Cheng reviewed their papers since 1995, and suggested that all lipid microdomains tend to adopt regular superlattice-like distributions, which idea was based on the physicochemical differences of different membrane lipids. Membrane phospholipids are: Negatively charged - Phosphatidylserine - Phosphatidylinositol - Phosphatidic acid - Phosphatidylglycerol - Cardiolipin Neutral (no net charge) Large-head lipids - Phosphatidylcholine - Sphingomyelin Small-head lipids - Phosphatidylethanolamine - (cholesterol; embedded) Towards superlattice: geometric fit When mixed with phosphatidylethanolamine rotation entrophy of phosphatidylcholine polar head group is increased. phosphatidylcholine phosphatidylcholine + phosphatidylethanolamine ne phosphatidylethanolamine molecule affects the rotations of six phosphatidylcholine molecules. 31
Towards superlattice: electric repulsion It is logic to assume that negatively charged lipids repel each other. Coulombic repulsion Negatively charged phospholipid Neutral phospholipid Superlattice: any evidence? uter membrane of red blood cell according to the superlattice model Inner membrane of red blood cell according to the superlattice model Choline phospholipid (large heads) 88.9 / 88.9 mol% Phosphatidylethanolamine (small heads) 11.1 / 11.1 mol% Choline phospholipid (large heads) 22.2 / 23.1 mol% Phosphatidylethanolamine (small heads) 44.4 / 43.9 mol% Negatively charged lipid Purple values: model Blue values: measured in human RBC Negatively charged lipid 33.3 / 32.9 mol% 32
Superlattice, and still free lateral movements Superlattice and fluid mosaic models both allow free lateral movements in large scale. Superlattice is NT rigid! T e.g. quick raising of the temperature induces disorganization until new superlattice is settled. In superlattice stretching, shrinking, and lateral sliding of the rows requires little energy, and thus no long distance order is expected. C) Missä korkean erotuskyvyn ESI-MS lipidianalyysiä ja lipidomiikkaa voidaan hyödyntää? Perustutkimuksessa Solukalvojen sekä niiden mikroympäristöjen lipidikoostumuksen säätely Lipidikuljetuksen mekanismit Kliinisessä lääketieteessä Taudin määritys ja hoidon seuranta Biotekniikassa Lipaasien spesifisyyden analyysi ja räätälöinti Rasvojen muokkauksen seuranta ( on-line ) Lue lipidomiikasta vielä lisää? Wenk MR (2005) The emerging field of lipidomics. Nat Rev Drug Discov 4, 594-610 33