NUORET TUTKIJAT 2014 Tommi Alanko Siina Alaranta Mari Alatalo Petri Antikainen Simon Christ Vesa Havurinne Jenna Jacobino Laura Kalliomäki Krista Korpi Csilla Kurdi Juha Kurkela Teemu Kustila Tiina Lehtiniemi Johanna Lilja Henri Malmi Niko Markkinen Tero Matikka Jesse Mattsson Sami Nylund Markus Palonen Mira Prinz Mihail Ruotsi Eetu Suominen Terhi Tallgren Pauli Tikka Jenna Tikkanen Natalia Tong Ochoa Pasi Tuomikoski Sanni Uotila Eerika Vuorinen Nuorten tutkijoiden työt ovat esillä myös tapahtuman verkkosivuilla: www.utu.fi/fi/yksikot/sci/yksikot/biokemia/opiskelu/nt
NUORET TUTKIJAT 2014 -OHJELMA VIIKON AVAUS TIISTAI 18.3.2014 kello 12 15 Arcanum Arc1-sali NUORET TUTKIJAT 2014 -ESITELMÄT TIISTAI 18.3.2014 - PERJANTAI 21.3.2014 alkaen kello 12 15 Arcanum Arc1-sali NUORET TUTKIJAT 2014 -POSTERINÄYTTELY TIISTAI 18.3.2014 - PERJANTAI 21.3.2014 Arcanum ala-aula POSTERITAPAHTUMA KESKIVIIKKO 19.3.2014 13 35-15 00 Arcanum ala-aula EVÄITÄ TYÖELÄMÄÄN -PUHEENVUOROT ti 18.3. klo 15 45, to 20.3. klo 15 35, pe 21.3. klo 14 35 Arcanum Arc1-sali LOPPUSANAT PERJANTAI 21.3.2014 kello 15 10 Arcanum Arc1-Sali
«I» TIISTAI 18.3.2014 12 15 13 25 Puheenjohtaja: Janne Atosuo «Viikon avaus» 12 15 FT Seppo Sarimo Nuoret tutkijat -tapahtuman isä, biokemian emeritus-lehtori «1» 12 25 Henri Malmi RNA:n sokeriosien rakenteen vaikutus RNA-polymeraasin toimintaan BIOKEMIA «2» 12 45 Markus Palonen FNR-like proteiinin tehtävät lituruohon kloroplastissa BIOKEMIA «3» 13 05 Eetu Suominen Sisäilman toksisuuden arvioinnissa käytettävän E.coli-lux - menetelmän kehittäminen BIOKEMIA 13 25 13 45 TAUKO 20 minuuttia «II» TIISTAI 18.3.2014 13 45 14 45 Puheenjohtaja: Heidi Luoto «4» 13 45 Tiina Lehtiniemi The interaction of FYCO1 with TIP49a and TIP49b in male germ cells BIOCHEMISTRY «5» 14 05 Johanna Lilja The role of Shank family proteins in integrin activation BIOCHEMISTRY «6» 14 25 Mihail Ruotsi Characterization of novel proteases in Staphylococcus pseudintermedius BIOCHEMISTRY 14 45 15 05 TAUKO 20 minuuttia
«III» TIISTAI 18.3.2014 15 05 16 20 Puheenjohtaja: Heta Mattila «7» 15 05 Vesa Havurinne Phaeodactylum tricornutum piilevän fotoinhibitio MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA JA BIOENERGETIIKKA «8» 15 25 Juha Kurkela RNA-polymeraasin -alayksikön rooli syanobakteerin Synechocystis sp. PCC 6803 sopeutumisessa eri hiilidioksidipitoisuuksiin MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA JA BIOENERGETIIKKA «Eväitä työelämään I» 15 45 Biokemian alumnin puheenvuoro FM Sinikka Tingander, PerkinElmer
«IV» KESKIVIIKKO 19.3.2014 12 15 13 35 Puheenjohtaja: Riikka Arppe «9» 12 15 Siina Alaranta Nopean RNA-testin kehitys norovirukselle MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA «10» 12 35 Laura Kalliomäki Upkonvertoivat nanopartikkelit lateraalivirtausmäärityksissä MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA «11» 12 55 Tero Matikka Nanokokoisten upkonvertoivien partikkeleiden käyttö leimana reaaliaikaisessa PCR:ssä MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA «12» 13 15 Terhi Tallgrèn Uusien eturauhassyöpämerkkiaineiden tasojen tutkiminen eturauhaskudoksessa reaaliaikaisella käänteiskopiointi-pcr:llä MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA POSTERISESSIO KESKIVIIKKO 19.3.2014 13 35-15 00 Arcanum ala-aula Opiskelijat postereidensa äärellä Tarjoilua
«V» KESKIVIIKKO 19.3.2014 15 00 16 20 Puheenjohtaja: Riina-Minna Väänänen «13» 15 00 Jesse Mattsson Developing a quantitative reverse transcription PCR assay for DLX1 and functional validation for eight genes as novel biomarkers for prostate cancer diagnosis MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS «14» 15 20 Natalia Tong Ochoa Mapping of AMACR and TMPRSS2-ERG fusion gene expression in human prostate MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS «15» 15 40 Simon Christ Luminescent chemical sensors based on upconversion particles MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS «16» 16 00 Csilla Kurdi Generation of terminal peptide tag specific binders by using phage display and synthetic antibody libraries MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS
«VI» TORSTAI 20.3.2014 12 15 13 15 Puheenjohtaja: Juho Terrijärvi «17» 12 15 Mari Alatalo Kreatiinikinaasiin perustuvan seulontamenetelmän kehittäminen Duchennen lihasdystrofialle BIOTEKNIIKKA DI «18» 12 35 Krista Korpi Upkonvertoivien nanopartikkelileimojen havainnointi ja käyttö homogeenisessa eikilpailevassa immunomäärityksessä BIOTEKNIIKKA DI «19» 12 55 Pauli Tikka The effect of mirnas to the regulation of triple negative breast cancer cells BIOTECHNOLOGY (DI) 13 15 13 35 TAUKO 20 minuuttia «VII» TORSTAI 20.3.2014 13 35 14 35 Puheenjohtaja: Tanja Savukoski «20» 13 35 Jenna Jacobino Uuden europium(iii)kelaatin karakterisointi ja soveltuvuus aikaerotteisiin fluoroimmunomäärityksiin BIOTEKNIIKKA DI «21» 13 55 Petri Antikainen Antigeeniosoitustestin kehittäminen Epstein-Barr-virukselle BIOTEKNIIKKA DI «22» 14 15 Teemu Kustila Simultaneous detection of cyanotoxin variants in a single assay BIOTECHNOLOGY (DI) 14 35 14 55 TAUKO 20 minuuttia
«VIII» TORSTAI 20.3.2014 14 55 16 00 Puheenjohtaja: Ari Lehmusvuori «23» 14 55 Sami Nylund Kliinisten näytteiden PCR-yhteensopiva konsentrointi BIOTEKNIIKKA DI «24» 15 15 Tommi Alanko Vaihtoehtoisten monistuskontrollien suunnittelu ja testaus BIOTEKNIIKKA DI «Eväitä työelämään II» 15 35 Luonnontieteiden Akateemisten Liiton puheenvuoro «IX» PERJANTAI 21.3.2014 12 15-13 15 Puheenjohtaja: Marika Kalpio «25» 12 15 Niko Markkinen Tyrnin siemenöljyn kehittyminen kasvukauden aikana ja siihen liittyvät geenien ilmenemistasot ELINTARVIKEKEHITYS DI «26» 12 55 Mira Prinz Lasten kasviksiin ja marjoihin liittyvän maistamishalukkuuden mittaaminen päiväkodissa ELINTARVIKEKEMIA «27» 12 55 Jenna Tikkanen Kasviuutteiden antimikrobinen vaikutus pilaajamikrobeihin leipomotuotteissa ELINTARVIKEKEMIA 13 15 13 35 TAUKO 20 minuuttia
«X» PERJANTAI 21.3.2014 13 35 15 10 Puheenjohtaja: Maaria Kortesniemi «28» 13 35 Eerika Vuorinen Anthocyanins and anthocyanidins in the coloured Andean potatoes FOOD CHEMISTRY «29» 13 55 Sanni Uotila Värien herättämät mielikuvat ELINTARVIKEKEMIA «30» 14 15 Pasi Tuomikoski Fosfolipidiluokkien erotusmenetelmien kehitys UHPLC-ELSD ja UHPLC-MS - laitteistoilla ELINTARVIKEKEMIA «Eväitä työelämään III» 14 35 Elintarvikekemian alumnin puheenvuoro FT Sampo Lahtinen, DuPont Danisco «Loppusanat» 15 10 Reijo Lahti Matemaattis-luonnontieteellisen tiedekunnan dekaani
«1» RNA:n sokeriosien rakenteen vaikutus RNA-polymeraasin toimintaan Henri Malmi Ohjaajat: FT Anssi Malinen, dos. Georgiy Belogurov BIOKEMIA Transkriptiossa on kolme vaihetta: initiaatiossa RNA-polymeraasi (RNAP) sitoutuu DNA:han aloittaen transkription, elongaatiossa tuotetaan RNAtranskripti ja terminaatiossa transkriptio lopetetaan. Tutkimuksessa selvitettiin, voiko sokeriosien vaihtamisella, esimerkiksi DNA:han, vaikuttaa elongaatioon tai RNAP:n pilkkomisaktiivisuuteen spesifisellä rakenteesta kertovalla tavalla. Transkription elongaatiokompleksilla (TEC) tunnetaan kolme tilaa: Posttranslokaatiotilassa transkriptin 3 -pää on RNAP:n aktiivisen keskuksen ns. i- kohdassa ja nukleotidi emäspariutuu templaatti-dna:han viereiseen i+1- kohtaan. Nukleotidin liittänyt RNAP on pre-translokaatiotilassa ja uusi 3 -pää liikkuu translokaatiossa i-kohtaan. RNAP poistaa transkriptin virheitä katkomalla sitä i- ja i+1-kohtien välistä, mitä edistää Gre-faktorit. TEC voi peruutustilassa poistaa monta, yleensä kaksi, nukleotidia kerralla ja pretranslokaatiotilassa yhden. Tutkimuksen TEC:ssa transkriptin ja tdna:n komplementaarisuus oli nukleotidin liittämisessä 9bp ja pilkkomisessa 11bp, joista hybridiä oli 9bp. Nukleotidin liittämisen ja RNA:n pilkkomisen nopeudet mitattiin eripituisten RNA:iden osuuksista ja translokaatio fluoresenssileimalla. Käytetyissä transkripteissa oli osa RNA:sta korvattu DNA:lla, LNA:lla (Locked Nucleic Acid) tai 2 -O-metyyliryhmän sisältävillä nukleotideilla. GreA-faktorin edistämässä pilkkomisessa LNA:n tai 2 -O-Me-ryhmän sisältävät nukleotidit liikkuivat huonosti i-kohtaan. Rajoitetun liikkeen takia 3 - pään LNA pilkkoutui hyvin nopeasti, mutta kolme nukleotidia LNA:ta 3 -pään ribonukleotidin jälkeen esti pilkkomisen. Yksittäiset deoksiribonukleotidit heikensivät pilkkomista ympäriltään ja DNA-alue pysäytti pilkkomisen. RNAP:sta löytyi myös transkriptia oikeassa asennossa pitävä, nukleotidin liittämistä edistävä kohta. DNA-alueen vaikutusta tutkittiin transkripteilla, joissa RNA:n määrää kasvatettiin 3 -päästä alkaen. Nukleotidin liittäminen nopeutui asteittain, mutta normalisoitui vasta kahdeksannella ribonukleotidilla. Oletettavasti dsdna-alue on pidemmässä B-konformaatiossa ja työntää 3 - pään A- ja B-konformaation välimuodossa olevaa DNA-RNA-hybridiä hieman i+1-kohdan puolelle. Tulokset osoittavat deoksiribonukleotidien hidastavan transkriptiota vielä kaukana aktiivisesta keskuksesta. Täten RNAP:n sopimattomuus DNA-polymeraasiksi ei johdu vain NTP:n ja dntp:n eroista. Asiasanat: GreA, Escherichia coli, LNA, RNA-polymeraasi, translokaatio.
«2» FNR-like proteiinin tehtävät lituruohon kloroplastissa Markus Palonen Ohjaajat: FT Paula Mulo, FM Minna Koskela BIOKEMIA Kasvit kykenevät muuttamaan auringonvalon energian kemialliseksi energiaksi solujen käyttöön fotosynteesi- eli yhteyttämisreaktioiden avulla. Fotosynteesi tapahtuu kasvisolussa sijaitsevissa kloroplasteissa eli viherhiukkasissa. Viherhiukkasien sisällä olevalla tylakoidikalvostolla tapahtuvat fotosynteesin valoreaktiot. Fotosynteesin viimeisessä vaiheessa ferredoksiini:nadp(h) oksidoreduktaasi (FNR) siirtää valoreaktioissa vapautuneet elektronit ferredoksiinilta NADP + -molekyylille pelkistäen sen NADPH-molekyyliksi. Lituruohon kloroplastissa ilmentyvän toiminnaltaan tuntemattoman oksidoreduktaasin on huomattu muistuttavan FNR-proteiinia. FNR-like:ksi nimetyn proteiinin on ennustettu muistuttavan rakenteeltaan FNR:ää ja pystyvän FNR:n tavoin sitomaan sekä FAD- että NADP + -molekyylejä. Koska FNR-like proteiini muistuttaa FNR-proteiinia, joka on fotosynteesille välttämätön, tutkimuksen alkuvaiheessa keskityttiin selvittämään FNR-like proteiinin puuttumisen vaikutusta poistogeenisten fnr-like -mutanttikasvien fotosynteettiseen koneistoon. Tutkimuksessa käytettiin kahta erilaista mutanttia, joista FNR-like proteiinia koodaava tuman geeni oli inaktivoitu T- DNA insertion avulla sekä yhtä mutanttilinjaa, jossa FNR-liken tuotanto oli yliekspressoitu. Muutoksia mutanttikasvien kasvussa ja kehityksessä tarkasteltiin mittaamalla rosettien tuore- ja kuivapainot ja mittaamalla lehtien klorofyllipitoisuus. Muutoksia fotosynteesiin, Calvin-kiertoon ja muihin kloroplastissa tapahtuviin prosesseihin liittyvien proteiinien ilmentymisessä tutkittiin Western blot menetelmällä ja fotosynteettisten proteiinikompleksien muodostumista ja määriä tutkittiin lpbn (large pore Blue Native) geelillä. Tutkimuksessa havaittiin, että FNR-like geenin keskeyttäminen johtaa kasvin hitaampaan kasvuun ja klorofyllipitoisuuden pienenemiseen, kun taas yliekspressiossa ei nähty mainittavaa eroa. Fotosynteesin valoreaktioihin liittyvien proteiinikompleksien (valoreaktio I ja II, sytokromi b 6 f-kompleksi) määrä ja koostumus pysyivät samana kaikissa kasvilinjoissa, eikä muutoksia fotosynteesiin liittyvien proteiinien ilmentymisessä havaittu. Sen sijaan Calvinkiertoon osallistuvan Rubisco-aktivaasi-entsyymin kertyminen oli häiriintynyt yliekspressiokasveissa, minkä takia mutanttien kykyä sitoa hiilidioksidia tullaan jatkossa tutkimaan tarkemmin. Asiasanat: Arabidopsis thaliana, FNR-like, kloroplasti, fotosynteesi
«3» Sisäilman toksisuuden arvioinnissa käytettävän E.coli-lux - menetelmän kehittäminen Eetu Suominen Ohjaajat: FM Janne Atosuo, dos. Esa-Matti Lilius BIOKEMIA Kosteus- ja homevaurioista aiheutuvat taloudelliset ja terveydelliset haitat ovat merkittäviä niin Suomessa kuin muuallakin maailmassa. Tämän erikoistyön tarkoituksena oli testata ja kehittää rekombinanttien Escherichia coli bakteerien käyttöön perustuvaa, ja mahdollisesti kenttäkäyttöön soveltuvaa sisäilman toksisuusanalyysiä. E.coli-lux - bakteereihin on siirretty Photorhabdus luminescensin bakteerilusiferaasigeeni konstitutiivisen promoottorin alle. Bakteerilusiferaasin katalysoimassa reaktiossa syntyy bioluminesenssisignaalia, jonka suuruus on suoraan verrannollinen elossa olevien solujen määrään. Erikoistyön hypoteesina oli, että kosteus- ja homevaurioista kärsivien rakennusten sisäilman pöly on homeista tai muista lähteistä peräisin olevien yhdisteiden johdosta toksisempaa kuin vauriottomien rakennusten pöly. E.colilux soluja altistettiin pyyhintäpölynäytteistä tehdyille rinnakkaisille vesi- ja dimetyylisuloksidi (DMSO) - uutoksille pitoisuuksissa 2500 µg/ml 4 µg/ml, minkä jälkeen näytteistä mitattiin luminometrisesti bioluminesenssisignaalin mahdollista alenemista. Tästä alenemasta laskettiin kullekin näytteelle mahdolliset EC 50 -arvot kahden tunnin kohdalta. Kyseisiä arvoja verrattiin keskenään, samoin vertailtiin rinnakkaisten vesi- ja DMSO-uutosten antamia tuloksia. Tuloksista määritettiin raja-arvot, jotka erottavat bakteerisoluille toksisen ja ei toksisen uutoksen toisistaan. Tutkimuksessa havaittiin, että pölyuutosten pitoisuudet 250-50 µg/ml riittävät käytetyssä solupitoisuudessa erottamaan toksiset näytteet ei toksisista. Tutkittujen, 200 näytteen perusteella, toksisuuden raja-arvoksi asetettiin EC 50 = 100 µg/ml. Vesi- ja DMSO-uutosten tulokset korreloivat keskenään 84 % tarkkuudella, mikä tarkoittaa, että jatkossa jompikumpi uutoksista on mahdollista jättää tutkimuksesta pois. Näytteenottomenetelmää on tarkoitus kehittää niin, että jatkossa käytettäisiin suoraan hengitysilmasta suodattamalla saatuja pölynäytteitä. Toksisuusmittausten tuloksia tullaan myös vertaamaan näytteenottopaikoista saatuihin terveyskyselyihin. Asiasanat: kosteusvauriot, bioluminesenssi, E.coli-lux, EC 50
«4» The interaction of FYCO1 with TIP49a and TIP49b in male germ cells Tiina Lehtiniemi Supervisors: M.Sc. Matteo Da Ros, assistant professor Noora Kotaja BIOCHEMISTRY Male germ cells have an exceptionally diverse transcriptome. During the time of highest transcriptional activity in haploid round spermatids, a cytoplasmic ribonucleoprotein structure called the Chromatoid Body (CB) appears. The CB forms a dynamically moving structure that closely interacts with membraneous structures and participates in the regulation of RNAs in haploid male germ cells. Our group has previously set up a novel isolation method which enabled the identification of the CB proteins by mass spectrometric analysis. FYCO1, known to have a role in autophagocytosis and microtubule related vesicle transport in cultured cells, was identified as a novel CB component. TIP49a and TIP49b in turn were identified as main interaction partners of non-cbassociated FYCO1. They belong to the family of (AAA+) proteins with diverse cellular functions, including the regulation of RNA quality control pathway. The aim of this study was to characterize the interaction between FYCO1 and TIP49a/TIP49b complex. First, immunofluorescence experiments were conducted in order to determine the localization of both FYCO1 and TIP49a/TIP49b in HeLa cells. Both proteins localized predominantly in the cytoplasm. Furthermore, overexpressed FYCO1 localized in vesicular structures, but was not able to recruit endogenous or overexpressed TIP49a/TIP49b to these structures. This may indicate that their interaction is very transient and/or occurs at specific subcellular sites. Second, coimmunoprecipitation assay was set up to study if FYCO1 and TIP49 proteins form stable complexes in Hela cells. Preliminary results argue against the direct interaction between these proteins and suggest that FYCO1-TIP49 complex formation requires some male germ cell-specific factors. Future experiments include the validation of FYCO1-TIP49 interactions in spermatocytes and round spermatids isolated by centrifugal elutriation and shrna construct design to knockdown FYCO1 in cultured cells. Altogether, these studies will help us to understand the novel connection between the ribonucleoprotein granule-mediated RNA regulation and vesicular transport system in male germ cells. As the CB function is required for normal sperm production, the results will provide novel important insights into the factors involved in the maintenance of male fertility. Keywords: Spermatogenesis, Chromatoid Body, FYCO1, TIP49a, TIP49b
Se alkuperäinen tyrniöljy kasviskapselissa Kun silmiä tai suuta kuivaa Tuote ylläpitää limakalvojen ja ihon terveyttä Tuotteen moninaisia terveysvaikutuksia on tutkittu laajasti Turun yliopiston biokemian ja elintarvikekemian laitoksella. www.omega7.fi Omega7 on saatavana myös nestemäisenä pullossa sekä hoitavana ihovoiteena. Flavo C Tyrnin flavonolit ja C-vitamiini Kun flunssa tai stressi iskee Tuote ylläpitää vastustuskykyä ja auttaa jaksamaan 2 tablettia vastaa 100 grammaa tuoretta tyrniä www.aromtech.com
«5» The role of Shank family proteins in integrin activation Johanna Lilja Supervisors: professor Johanna Ivaska, adjunct professor Jeroen Pouwels BIOCHEMISTRY Integrins are cell adhesion receptors important in cell-matrix interactions. Regulation of integrin activation is essential for cell adhesion, motility and tissue homeostasis. Shank family proteins (Shank1, Shank2 and Shank3) are multidomain scaffolding proteins best known to organize protein complexes at the postsynaptic density. The aim of our project was to study the role of Shank family proteins in integrin activation and improve our knowledge about the interaction between proteins Shank and Sharpin. Using an RNAi kinase screen Sharpin was identified as an important inhibitor of β1-integrin activity in prostate cancer cells. Shank family proteins were found in the same screen but the role of Shank proteins in integrin activation is unknown. Moreover, it has been shown that Sharpin binds to the ankyrin repeats of Shank. Integrin activation involves conformational changes that result in an increase affinity for ligand. We used the fluorescence-activated cell sorting (FACS) to measure β1 integrin activation state. Active integrin FACS was performed both with labeled fibronectin and active β1 conformation sensitive antibodies. The expression levels of Shank and Sharpin in different cell lines were studied by using quantitative reverse transcription PCR (qrt-pcr) and western blot. Confocal microscopy was used to visualize the localization of Sharpin and Shank. The interaction of these proteins was also observed by immunoprecipitation. We showed that overexpression of Shank3 and Sharpin individually or in compination decreased beta1 integrin activity in chinese hamster ovary cells (CHO). We also observed that Shank3 and Sharpin co-localize to the nucleus and lamellipodium of CHO cells. Thus, our findings suggest that the Shank family proteins might have an important role in β1 integrin activation together with Sharpin. We are also studing the integrin activation in Shank-silenced prostate cancer cells. For reliable conclusion this requires further research. Keywords: integrin activation, Shank, Sharpin
«6» Characterization of novel proteases in Staphylococcus pseudintermedius Mihail Ruotsi Supervisor: Ph.D. Benedykt Wladyka BIOCHEMISTRY Staphylococcus genus bacterial species are silent inhabitants of human and other warm-blooded animals on the epithelium. When given a chance, opportunistic pathogen species have ability to overcome hosts defence mechanisms and colonise the body. S. pseudintermedius is a close relative of S. aureus and it has been linked to be originated from canine species pathogen. Lately, it has been recognised that it also carries the capability to develop antibiotic resistance, and more so, there have been cases of cross-species infection of S.pseudintermedius. The genus Staphylococcus secretes wide variety of distinct exoenzymes which correlates with high pathogen virulence. One of S. aureus exoenzymes group is under the Spl (serine protease-like) operon. Spl proteases have been researched over the past years and have been recognised as a strong contributor for SSSS (Staphylococcal scalded skin syndrome), it is also called Ritter s disease. Through bioinformatical gene mining we have found similar operon in S. pseudintemedius with 10 theoretical structural genes. The aim was to clone operon s structural genes. Moreover, to produce, purify and specify the activity of the Spl-proteases. In the project we designed primers and cloned the genes into intermediate vector ptz. After determining that the cloning of the genes from S. pseudintermedius was successful with sequencing, we further cloned the genes into production vector pgex. We tested the induction and production of the proteins. We optimised the production for maximising the solubility and the yield of the protein for purification. We purified the protein with a GST- and a Ni-NTA column in natural and denatured conditions. Protease activity and specificity of the cleavage was tested by zymography method. Because of the high amount of insoluble protein we performed a refolding buffer assay. We were able to clone 9 of the genes in pgex. For confirmation we performed PCR with specific primers. Induction in BL21 with IPTG was proven to work with SDS-PAGE. Most proteins were produced in insoluble form, but we were able to purify small amounts of the most auspicious protein and do a zymography for the activity. The results were inconclusive. Refolding buffer assay showed some promising results for purification of the protein in denatured conditions. Keywords: Staphylococcus pseudintermedius, Spl-protease, SSSS
«7» Phaeodactylum tricornutum piilevän fotoinhibitio Vesa Havurinne Ohjaaja: Dos. Esa Tyystjärvi MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA JA BIOENERGETIIKKA Valon ajamassa elektroninsiirrossa syntyy paljon haitallisia sivutuotteita, kuten esimerkiksi singlettihappea, jotka vahingoittavat fotosynteesikoneistoa sen toimiessa. Valon aiheuttamasta vahingosta seuraavaa yhteyttämiskyvyn heikkenemistä kutsutaan fotoinhibitioksi, ja yksikään fotosynteettinen eliö ei ole välttynyt sen vaikutukselta. Piilevät ovat yksi menestyneimmistä yksisoluisista leväryhmistä, ja jopa 25 % maapallon primaarituotannosta on piilevien fotosynteesiä. Tutkituin piilevälajeista on Phaeodactylum tricornutum, joka on kuitenkin vielä biofysikaalisesti nuori tutkimuskohde. Kyseisen levän valonkeruukompleksien sisältämä harvinainen klorofylli c tekee siitä fotosynteesitutkimuksen kannalta hyvin mielenkiintoisen. Erikoistyön tarkoituksena oli määrittää fotoinhibition aktiospektri P. tricornutum piilevässä in vitro sekä ultraviolettisäteilyn että näkyvän valon alueella altistamalla leväkasvatus yhteensä 17 eri aallonpituuskäsittelylle (fotosynteettisen fotonivuon tiheys 100-300 µmol m -2 s -1 ). Kasvatuksiin lisättiin linkomysiiniä ennen valokäsittelyjä kloroplastien proteiinisynteesin inhiboimiseksi. Käsittelyjä jatkettiin kunnes Clark-tyypin O 2 -elektrodilla mitattu hapentuotto oli inhiboitunut vähintään 25 % diklooribentsokinonin toimiessa elektronin vastaanottajana. Pulssiamplitudimodulaatiofluorometrilla mitattua vaihtelevan fluoresenssin ja maksimifluoresenssin suhdetta käytettiin tulosten vahvistamiseksi. Fotoinhibition reaktionopeusvakiot määritettiin sovittamalla mittaustulokset ensimmäisen kertaluvun reaktioyhtälöön. Tuloksistani käy ilmi, että vaikka P. tricornutum levällä onkin erikoinen pigmenttikoostumus, on sen fotoinhibition aktiospektri melko samanlainen kuin korkeammilla kasveilla. Ultraviolettisäteily on selvästi vahingollisempaa kuin näkyvä valo, mikä osoittaa happea vapauttavan kompleksin mangaaniionien toimivan fotoinhibition valoreseptoreina myös piilevällä. Näkyvällä alueella fotoinhibition aktiospektri seuraa levästä eristettyjen pigmenttien absorptiospektriä osoittaen selkeitä piikkejä 480 ja 680 nm:n kohdalla (klorofyllit a ja c). Havaittu kohouma 520 nm:n kohdalla on vielä selittämättä. Tutkimuksessani aion tulevaisuudessa selvittää singlettihapen tuoton ja fotoinhibition yhteyden samoilla aallonpituuksilla P. tricornutum piilevässä fotoinhibition vielä ratkaisemattomien syntymekanismien selventämiseksi. Asiasanat: fotosynteesi, fotoinhibitio, Phaeodactylum tricornutum, näkyvä valo, ultraviolettisäteily
«8» RNA-polymeraasin -alayksikön rooli syanobakteerin Synechocystis sp. PCC 6803 sopeutumisessa eri hiilidioksidipitoisuuksiin Juha Kurkela Ohjaaja: FT Taina Tyystjärvi MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA JA BIOENERGETIIKKA Synechocystis sp. PCC6803 on syanobakteerien malliorganismi. Sen RNApolymeraasin ytimen muodostavat -, - ja -alayksiköt, kaksi -alayksikköä, sekä -alayksikkö. Pieni -alayksikkö ei ole välttämätön, sillä mutanttikannan ( rpoz) solut, joilta on inaktivoitu -alayksikköä tuottava rpoz-geeni, kasvavat hyvin. Mutanttikannan geenien ilmenemisessä on kuitenkin paljon muutoksia villityyppiin verrattuna. Monien hiilenkuljetukseen ja sidontaan osallistuvien geenien ilmeneminen oli vähäisempää rpoz:lla kuin villityypillä, mikä johti 20 % laskuun fotosynteesitehokkuudessa, vaikka valoreaktioiden toiminta pysyi muuttumattomana. Työssäni testasin, korvaako CO 2 :n lisäys rpoz-kannan hiilimetabolian puutteet. Tutkimuksessa havaittiin, että 3 %:n CO 2 :n lisäys kasvatuskaapin ilmaan nopeutti viilityypin kasvua, mutta rpoz-kannan kasvu ei kiihtynyt. Kaiken lisäksi mutanttikannan solut kuolivat kolmen päivän kasvatuksen jälkeen. Vuorokauden korkeassa CO 2 :ssa kasvaneista soluista mitattiin fotosynteettistä tehokkuutta happielektrodilla, fotosynteettisen koneiston proteiinien ilmenemistä Western blot-menetelmällä, valoreaktioiden toimintaa 77K fluoresenssin avulla ja pigmenttien suhteet laskettiin absorptiospektreistä. Testasimme myös miten ph:n muutos vaikuttaa rpoz:n kasvuun, koska ajattelimme, että CO 2 -lisäys muuttaisi kasvatusliuoksen ph:ta. Fotosynteettisen koneiston proteiinit ilmenivät rpoz:lla vähemmän kuin villityypillä ja fotosynteesitehokkuus oli laskenut 50 %:iin villityypin arvosta. 77K fluoresenssispektrissä havaitsimme valoreaktio I:n piikin siirtymisen, mikä voisi viitata valoreaktio I:n vaurioitumiseen. rpoz-kannan korkea karotenoidipitoisuus suojaa soluja hapettavalta stressiltä normaaliolosuhteissa, jolloin 3 %:ssa CO 2 :ssa havaittu karotenoidien väheneminen altisti solut hapettavalle stressille. Fykobiliinin määrä lisääntyi enemmän ja nopeammin viilityypillä kuin rpoz:lla, mikä viittaa siihen, että villityyppi reagoi tehokkaammin ylimääräisen CO 2 saantiin. Mutanttikanta kasvoi paremmin ph:ssa 8,3 kuin ph:ssa 7,5, mutta se ei kasvanut yhtä hyvin kuin villityyppi kummassakaan ph:ssa. Yllätykseksemme ylimääräinen CO 2 ei korvannut hiilimetabolian puutteita vaan olikin soluille letaali. Asiasanat: Synechocystis, RNA-polymeraasi, hiilensidonta
«9» Nopean RNA-testin kehitys norovirukselle Siina Alaranta Ohjaaja: FT Ari Lehmusvuori MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Nopealla diagnostiikalla on merkittävä rooli sairaanhoidossa, sillä se mahdollistaa nopean diagnoosin ja hoidon aloittamisen. Tästä on erityisesti hyötyä tapauksissa, joissa pyritään esimerkiksi estämään epidemian leviämistä. Yksi yleisimmistä vatsatautiepidemioiden aiheuttajista on norovirus (NoV). Viruksella on stabiili ikosahedraalinen viruskapsidi, joka suojaa 7,5 kb:n kokoista, yksinauhaista RNA-juostetta. Isoterminen NASBAmonistustekniikka (engl. Nucleic acid sequence based amplification) kykenee monistamaan suoraan RNA-templaatista monivaiheisen monistusmekanismin kautta. Käytännössä tekniikka on kuitenkin yksinkertaisempi verrattuna perinteiseen polymeraasiketjureaktioon (PCR), sillä monistus tapahtuu yhdessä lämpötilassa ilman erillistä lämpösyklauslaitetta. Työssä kehitetään NoV-testi, joka perustuu NASBA-monistustekniikkaan ja kelaattikomplementaatioon. Lantanidikelaattikomplementaatio mahdollistaa luotettavan reaaliaikaisen detektoinnin, sillä signaalitasot nousevat vain monistustuotteen ollessa läsnä. Norovirustestin kehitys aloitettiin suunnittelemalla alukkeet ja koettimet sekä NoV:lle että sisäiselle monistuskontrollille. Kontrolliksi suunniteltiin synteettinen RNA-templaatti, jonka sekvenssiä ei löydy luonnosta. Monivaiheinen NASBA-monistustekniikka sisältää käänteiskopiointi- ja RNAsynteesivaiheen. Määritys on myös riippuvainen RNaasiH-entsyymin toiminnasta. NASBA-tekniikan monivaiheisuudesta johtuen alukkeiden ja koettimien toimintaa tutkittiin aluksi reaaliaikaisessa käänteiskopiointi- PCR:ssä. Käänteiskopiointi-PCR:ssä havaittiin, että kontrollina käytetty synteettinen templaatti monistui tehokkaasti ja komplementaatiokoettimet detektoivat monistustuotteen. NoV-näytteiden monistuminen oli hyvin heikkoa. Näytteiden monistumista testattiin myös NASBA-tekniikalla ja havaittiin, että tulokset olivat PCR:n kanssa yhtenevät. Syitä tähän ovat esimerkiksi RNA-templaatin sekundäärirakenteet, jotka häiritsevät NASBA-tekniikassa käytetyn T7 RNApolymeraasin toimintaa. Seuraavaksi työssä on tarkoitus monistaa kontrollia NASBA-tekniikalla ja havainnoida signaalikehitystä reaaliajassa. Asiasanat: Norovirus (NoV), NASBA, lantanidikelaattikomplementaatio, reaaliaikainen käänteiskopiointi-pcr, T7 RNA-polymeraasi
«10» Upkonvertoivat nanopartikkelit lateraalivirtausmäärityksissä Laura Kalliomäki Ohjaajat: FM Etvi Juntunen, FM Riikka Arppe ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Lateraalivirtausmääritykset ovat yksinkertaisia ja helppokäyttöisiä, joten niitä voidaan käyttää olosuhteissa, joissa ei ole laboratoriolaitteistoa tai koulutettua laboratoriohenkilökuntaa. Yleensä lateraalivirtausmäärityksissä testituloksen havainnointi perustuu leimamolekyylien signaalitason kvalitatiiviseen mittaamiseen määrityslastulta. Herkemmän määrityksen kehittämiseksi tarvitaan leimamolekyylejä, joiden signaalitaso voidaan mitata lastulta kvantitatiivisesti. Upkonvertoivat nanopartikkelit (engl. upconverting nanoparticles, UCNP) ovat lantanideja sisältäviä fosforeita, joiden signaali voidaan mitata kvantitatiivisesti. Koska niiden viritysaallonpituus on korkeampi kuin emissioaallonpituus, niitä käyttämällä vältetään myös korkeilla aallonpituuksilla esiintyvästä autofluoresenssista johtuva taustasignaali. Työssä kehitettiin UCNP-leimoja lateraalivirtausmäärityksiin. UCNP:t pinnoitettiin kahdella menetelmällä. Erikokoisten UCNP-leimojen liikkuvuutta määrityslastulla verrattiin toisiinsa ja leimojen liikkuvuutta pyrittiin parantamaan muuttamalla määrityspuskurin komponentteja. UCNP-leimojen analyyttinen herkkyys määritettiin seerumi- ja plasmanäytteissä. Mallianalyytteina määrityksissä käytettiin vapaata eturauhasspesifistä antigeenia (engl. free prostate-specific antigen, fpsa) ja sydänperäistä troponiini-i:tä (engl. cardiac troponin I, ctni). Leimojen signaalitasot mitattiin kannettavalla fluorometrilla. Suurimmista, halkaisijaltaan 45 88 nm UCNP:ista vedettömällä pinnoitusmenetelmällä valmistettujen leimojen epäspesifinen sitoutuminen määrityslastulle oli vähäisintä, eli niiden havaittiin liikkuvan määrityslastulla parhaiten. Määrityspuskurin komponentteja muuttamalla leimojen liikkuvuutta ei pystytty parantamaan. Parhaiten liikkuvia UCNP-leimoja käyttämällä analyyttiset herkkyydet olivat fpsa-määrityksessä seeruminäytteessä 5,8 ng/ml ja plasmanäytteessä 1,3 ng/ml sekä ctni-määrityksessä vastaavasti 0,4 ng/ml ja 0,4 ng/ml. Tulosten perusteella UCNP-leimojen todettiin soveltuvan kvantitatiivisiin lateraalivirtausmäärityksiin. Asiasanat: lateraalivirtausmääritys, leimamolekyyli, upkonvertoivat nanopartikkelit, liikkuvuus