RNA-interferenssi virustautien torjuntaan?

Katsaus RNA-interferenssi virustautien torjuntaan? Kalle Saksela Käsitys RNA:sta informaation passiivisena välittäjänä on osoittautunut vanhentuneeksi. RNA-interferenssi (RNAi) on mekanismi, jolla RNA-molekyylit osallistuvat aktiivisesti moniin solujen toimintoihin, kuten virustautien torjuntaan. Nyt tämän mekanismin kokeellinen hyödyntäminen on mullistamassa lääketieteellisen tutkimuksen ja avaamassa uusia mahdollisuuksia myös sairauksien hoitoon. Sovelluksissa on erityisen mielenkiinnon kohteena nopeasti muuntuva HI-virus, jota vastaan uutta työkalua ollaan nopeasti valjastamassa. V iime vuosien RNA-tutkimus on muuttanut perusteellisesti käsityksiämme elämää ylläpitävistä ja säätelevistä mekanismeista. Luokitteluun lähetti-rna (mrna), siirtäjä- RNA (trna) ja ribosomaalinen RNA (rrna) pohjautuva totunnainen käsitys RNA:sta suhteellisen mielenkiinnottomana työjuhtana informaation siirrossa DNA:sta proteiineiksi on osoittautunut vanhentuneeksi. Uudentyyppisten RNA-molekyylien monimuotoisuus ja määrä on jo nyt osoittautunut valtavaksi, ja tietomme tältä alueelta kasvaa edelleen. Aitotumallisia organismeja tutkivien piirissä näiden uudentyyppisten RNA-molekyylien yleisnimitykseksi on vakiintunut ei-koodaava RNA (ncrna, ks. taulukko). Pienimmät tunnetut ihmisen ncrna:t, kuten alkionkehityksen aikaiseen geeninsäätelyyn osallistuvat mikro-rna:t (mirna, tunnetaan myös nimellä small temporal RNA eli str- NA), ovat vain 21 25 nukleotidin kokoisia (Grosshans ja Slack 2002, Immonen ja Sariola 2002). Tyttöalkioiden toisen X-kromosomin sattumanvaraisen inaktivaation välittävä 17 000 nukleotidin kokoinen XistRNA (Avner ja Heard 2001) edustaa toista ääripäätä. Mainittujen esimerkkien lisäksi ncrna:t välittävät lukuisia muita tehtäviä soluissa. Niillä saattaa olla katalyyttistä aktiivisuutta, tai ne voivat toimia makromolekyylikompleksien rakenteellisina elementteinä. Niiden toiminta perustuu usein, mutta ei suinkaan aina nukleotidien emäspariutumiseen RNA- tai DNA-kohdemolekyylin kanssa (Storz 2002). Toimintatapoja tuntuu löytyvän jatkuvasti lisää. ncrna:n monimuotoisuus ehkä selittää osaltaan proteiineja koodaavien geenien odotettua pienemmän määrän. ncrnageeneillä ei ole selkeitä ominaispiirteitä, ja niiden kaikkien etsintä esimerkiksi ihmisen genomista onkin melkoinen haaste bioinformaatikoille. RNAi:n»keksiminen» RNAi:n näyttävä ilmestyminen biotieteiden tutkimukseen tuo mieleen PCR-tekniikan aiheuttaman metodologisen mullistuksen kymmenisen vuotta sitten, ja se on nyt yhtäkkiä tuonut ncrna:n lääketieteen tutkijoiden tietoisuuteen. RNAi:llä tarkoitetaan ilmiötä, jossa solun tuottama tai sinne infektion tai kokeellisen manipulaation vaikutuksesta syntynyt kaksisäikeinen RNA (dsrna) estää sen kanssa homologisen Duodecim 2002;118:2191 8 2191

RNA:n ilmentymisen. Nimityksen RNAi otti v. 1998 käyttöön Andrew Fire. Hän selvitti työtovereineen syytä aikaisempiin paradoksaalisiin havaintoihin: tutkitun geenin ilmentyminen laakamadoissa (Caenorhabditis elegans) oli saatu estettyä paitsi tähän suunnitellulla»antisense- RNA:lla» myös siihen nähden vastakkaisen polariteetin omaavalla, negatiiviseksi vertailukohteeksi tarkoitetulla»sense-rna:lla» (Fire ym. 1998). Korostettakoon, että RNAi-ilmiötä ei pidä sekoittaa edellä mainittuun, aiemmin laajassa käytössä olleeseen mutta huomattavasti RNAi:tä tehottomampaan antisense-rna-tekniikkaan. Fire osoitti, että aiemmat koetulokset johtuivat pienestä määrästä dsrna:ta, jota C. elegans -alkioihin ruiskutetut sense- ja antisense-rna-preparaatit sisälsivät. Saman tien kävi selväksi, että RNAi on niin tehokas, että kyseessä täytyy olla jonkinlainen itseään ruokkiva tai entsymaattinen reaktio. RNAi:n kyky estää geeniekspressiota laakamadossa onkin hämmästyttävä (Fire ym. 1998). Alkioihin ruiskutetun dsrna:n estovaikutus säilyy paitsi aikuisen madon soluissa myös seuraavassa sukupolvessa. Lisäksi RNAi leviää aikuisen madon soluista ja solukoista toiseen. Tutkijoita kiinnostavan geenin ilmentyminen kokonaisissa madoissa voidaankin kätevästi estää uittamalla matoja liuoksessa, joka sisältää geeniä vastaavaa dsrna:ta, tai jopa ruokkimalla niitä bakteereilla, jotka on ohjelmoitu tuottamaan kyseistä dsrna:ta (Timmons ja Fire 1998). C. elegans kuuluu mallieliöihin, joiden perimän emäsjärjestys tunnetaan jo kokonaan, ja monet keskei- Taulukko. Englannin- Lyhenne Selitys kielinen nimi Lähetti-RNA messenger RNA mrna RNA, joka välittää geenien informaation proteiiniksi Siirtäjä-RNA transfer RNA trna translaatiossa esiintyvä rakenteellinen RNA Ribosomaalinen RNA ribosomal RNA rrna translaatiossa esiintyvä rakenteellinen RNA Ei-koodaava RNA non-coding RNA ncrna Yleisnimi uusille RNA-tyypeille, joihin myös mirna ja sirna kuuluvat Mikro-RNA micro RNA (tai mirna 21 25 nukleotidin mittaisia yksisäikeisiä RNA-molekyylejä, jotka synsmall temporal tyvät dicer-entsyymin vaikutuksesta. mirna sisältää toisin kuin sirna RNA, strna) usein 1 2 kohdegeenin kanssa ei-komplementaarista nukleotidia Pieni estävä RNA small inhibitory RNA sirna 21 23 nukleotidin mittaisia kaksisäikeisiä RNA-molekyylejä, jotka syntyvät dicer-entsyymin toimesta. sirna:ita voidaan myös käyttää kokeellisesti geenien ilmentymisen valmennukseen RNA-interferenssiin liittyviä termejä RNA-interferenssi RNA interference RNAi Jonkin tietyn geenin lähetti-rna:n vaimentaminen ncrna:n välityksellä Kaksisäikeinen RNA double-stranded RNA dsrna Kaksisäikeistä RNA:ta voi päätyä soluihin mm. virusinfektion seurauksena RNA:n indusoima vai- RNA-induced silencing RISC Kompleksi, joka sirna:n läsnäollessa pystyy pilkkomaan kohde-rna:n. mentamiskompleksi complex RISC:n kaltainen kompleksi toimii myös mirna:n vaikutusten välittäjänä RNA:n ohjaama RNA- RNA directed RNA RdRp RNA-polymeraasi, joka käyttää alukkeenaan sirna:n ja kohde-rna:n polymeraasi polymerase kompleksia ja joka näin toimii sirna:n»leviamisessä» Ribonukleaasi III:n kaltainen entsyymi, joka pilkkoo kaksisäikeistä RNA:ta sirna:ksi tai mikro-rna:ksi Kohde-RNA target RNA mirna:n tai sirna:n sitoutumiskohde, joka sitoutumisen seurauksena joko hajoaa (sirna) tai jonka translaatio estyy (mirna) 2192 K. Saksela

set biologiset kysymykset ovat kovaa vauhtia selviämässä matotutkijoiden ryhdyttyä hyödyntämään systemaattisesti ja laajasti RNAi:tä. RNAi:n mekanismi RNAi:n vaikutusmekanismi ymmärretään jo melko hyvin (kuva 1). Soluun saatettu kaksisäikeinen RNA-molekyyli esimerkiksi virusperäinen pilkkoutuu ensin»dicer»-nimisen ribonukleaasin vaikutuksesta 21 23 nukleotidin mittaisiksi pätkiksi, joita kutsutaan nimellä pieni estävä RNA (small inhibitory RNA, sirna) (Zamore ym. 2000, Bernstein ym. 2001, Elbashir ym. 2001b). sirna liittyy soluissa ns. RISC-multiproteiinikompleksiin (RNA-induced silencing complex), jonka se ohjaa katkaisemaan itselleen homologisia kohde-rna-molekyylejä solussa (Zamore 2001, Hannon 2002). RISC:n entsymaattisen luonteen lisäksi RNAi:n tehokkuutta laakamadossa selittää ilmiön ketjureaktiomaisuus. sirna:t eivät ainoastaan ohjaa kohde-mrna:nsa katkaisua vaan ne myös toimivat alukkeina RNA:n ohjaaman RNA-polymeraasin (RNA-directed RNA polymerase, RdRp) katalysoimalle dsrna:n uudistuotannolle, josta»dicer» pilkkoo yhä enemmän tätä mrna:ta vastaavaa sirna:ta (Lipardi ym. 2001, Sijen ym. 2001). RdRp:t ovat alun perin RNA-viruksista löytyneitä entsyymejä, joiden karakterisointi useiden eliölajien soluista on ollut yksi RNAi-tutkimuksen mielenkiintoisista sivujuonteista (Ahlquist 2002).»in» ja RdRp:n yhteisvaikutuksen ansiosta RNAi vahvistaa itse it- Viruksen kaksisäikeinen RNA Solun oman mikro-rna:n esiaste sirna mirna Viruksen lähetti-rna RISC Kohdegeenin lähetti-rna RISC? RdRp sirna:n monistuminen ja RNAi:n leviäminen Lähetti-RNA:n katkaisu Kohdegeenin lähetti-rna:n translaation esto Kuva 1. RNA-interferenssin mekanismi. RNA-interferenssiä voivat välittää joko sirna:t (vasen puoli) tai mikro-rna:t (oikea puoli). Vasemman puolen esimerkissä viruksen kaksisäikeinen RNA pilkkoutuu»dicer»-ribonukleaasin vaikutuksesta sirna:ksi, joka ohjaa itsensä kanssa homologisen mrna:n hajottamista. Oikean puolen esimerkissä solun oman mikro-rna-geenin luennassa rakentuva mikro-rna:n esiaste pilkkoutuu»dicerin» vaikutuksesta yksisäikeiseksi mirna:ksi. mirna sisältää tyypillisesti 1 2 kohdegeeninsä kanssa pariutumatonta nukleotidia, ja mirna:n interferenssi välittyy kohde-rna:n translaation estymisellä. Alhaalla vasemmalla esitetty sirna:n monistuminen»dicerin» ja RNA-ohjauksisen RNA-polymeraasin (RdRp) yhteisvaikutuksena tapahtuu tehokkaasti monien alempien eliöiden soluissa mutta ilmeisesti ei nisäkäsoluissa. RNA-interferenssi virustautien torjuntaan? 2193

seään ja laajenee pilkkomaan koko kohde- RNA:ta ja siirtyy sirna:n monistumisen avulla solusta toiseen. Edellä kuvattu sirna:n välittämä RNAi on kuvattu vasta hiljattain, mutta on jo paljastunut, että RNAi selittää monia eri organismeissa aiemmin havaittuja geeninsäätelymekanismeja, kuten kosuppressiona (Jorgensen 1990) ja geenin posttranskriptionaalisena vaimennuksena (Baulcombe 1996) kuvatut ilmiöt ja kasvintutkijoiden tunteman RNA-välitteisen virusresistenssin (Lindbo ja Dougherty 1992). Nämä kaikki ilmiöt näyttävät perustuvan»dicerin» katalysoimaan dsrna:n prosessointiin ja käyttävät hyväkseen ainakin osin yhteisiä geenituotteita, joista eräät ovat RISC:iin kuuluvia proteiineja. Toisin kuin sirna:n tapauksessa varsinainen kohde-rna:n ilmentymisen vaimennus voi kuitenkin välittyä myös muulla mekanismilla kuin sen tuhoamisella (Zamore 2001, Hannon 2002). Tässä suhteessa mielenkiintoisia ovat jo mainitut mirna:t, kuten ihmisenkin soluissa ilmentyvä let-7, joka alun perin löydettiin laakamadon alkionkehitystä säätelevänä tekijänä (Reinhart ym. 2000). mirna:t syntyvät lyhyisiin transkripteihin erikoistuneen RNA-polymeraasi III:n (PolIII) vaikutuksesta noin 70 nukleotidin mittaisena esiasteena (kuva 1). Sisäisen komplementaarisuutensa ansiosta tämä esiaste muodostaa hiuspinniä muistuttavan rakenteen, josta»dicer» pilkkoo 21 22 nukleotidin pituisen, sirna:ta muistuttavan mirna-molekyylin. Myös mirna:t toimivat soluissa osana RISCiä, joka tosin näyttäisi olevan jossain määrin erilainen kuin sirna:ta sisältävä RISC. Toisin kuin soluissa kaksisäikeisinä tavattavat sirna:t»dicerin» muokkaamat mirna:t esiintyvät soluissa yksisäikeisessä muodossa. Toinen merkittävä ero näiden pienten ncrna-molekyylien välillä on se, että sirna:t vastaavat aina identtistä emäsjaksoa kohde-rna:ssaan, mutta mirna:t sisältävät tyypillisesti muutamia emäksiä, jotka eivät kykene Watson Crickin pariutumiseen säätelemänsä RNA:n kanssa. Tämä ero näyttää sanelevan niiden erilaisen vaikutusmekanismin: mirna:t eivät yleensä ohjaa mrna:n hajottamista toisin kuin sirna:t vaan estävät sen translaation proteiiniksi (Grosshans ja Slack 2002). Vaikka edellä esitetyt sirna:n ja mirna:n erot pitävät yleensä paikkansa, vastikään löydettiin lituruohosta mirna-molekyylejä, jotka toimivat kuten sirna pariutumalla koko pituudeltaan kohde-rna:n kanssa ja tuhoamalla sen (Llave ym. 2002). Näin sirna:n ja mirna:n välittämässä RNAi:ssä näyttää olevan enemmän yhteistä kuin aluksi uskottiin (ks. Hutvagner ja Zamore 2002). RISCin komponenttien ja muiden RNAi:hin osallistuvien proteiinien karakterisoimiseen tähtäävä tutkimus on nopeasti tuomassa lisävaloa vielä tuntemattomiin RNAi:n molekyylimekanismeihin. Samalla selvinnevät myös erilaisten evoluution aikana kehittyneiden dsrna-välitteisten geeninsäätelymekanismien yhtäläisyydet ja erot. Tässä yhteydessä on syytä huomauttaa kirjallisuudessa esiintyvästä vaihtelevasta käytännöstä määritellä RNAi. Tällä menetelmällä tarkoitetaan usein kaikkia edellä kuvattuja dsrna:n välittämiä säätelymekanismeja mutta toisinaan vain sirna:n ohjaamaa kohde- RNA:n tuhoamista (kuva 1). RNAi:n hyödyntäminen nisäkässoluissa RNAi:n käyttökelpoisuus matotutkijoiden työkaluna herätti pian kysymyksen, voisiko ilmiötä hyödyntää myös nisäkässoluilla tehtävässä tutkimuksessa. Esimerkiksi ihmisen soluihin vietynä dsrna käynnistää kuitenkin ohjelmoituneen solukuoleman tai geeniekspression yleiseen lamaantumiseen johtavan interferonivälitteisen antiviraalisen reaktion. Niinpä RNAi ei aluksi vaikuttanut kovinkaan lupaavalta menetelmältä nisäkässoluissa. Läpimurto asiassa tapahtui, kun havaittiin, että»dicerin» normaalisti pilkkoman sirna:n kaltaisia, synteettisesti valmistettuja sirna-molekyylejä voitiin transfektoida ihmisen ja hiiren soluihin käynnistämättä interferonivastetta (kuva 2). Mikä tärkeämpää, soluihin saatetut synteettiset sirna:t saivat aikaan niille homologisen mrna:n hajottamisen (Elbashir ym. 2001a). Seuraava edistysaskel oli, kun onnistuttiin kehittämään plasmideja, jotka soluihin transfektoituna tuottavat toimivaa sirna:ta (Brummelkamp ym. 2002). Nämä plasmidit ohjaavat PolIII:n katalysoimaa mirna-esiasteiden kaltaisten, hiuspinniä muistuttavien RNA-mole- 2194 K. Saksela

kyylien tuotantoa. Solujen»dicer»-entsyymi pilkkoo sitten nämä molekyylit toimivaksi sirna:ksi (kuva 2). Vaikka RNAi toimii hyvin myös nisäkässoluissa, on ilmeistä, ettei sen teho ole niissä yhtä hyvä kuin laakamadoissa. Yksi tätä eroa selittävä tekijä on, ettei RNAi-mekanismi ainakaan ihmisen soluissa näyttäisi kykenevän vahvistamaan itseään RdRp-välitteisellä mekanismilla (kuva 1). Ei ole myöskään viitteitä siitä, että RNAi leviäisi nisäkässolusta toiseen, mikä RNAi:tä käyttävien tutkijoiden työturvallisuuden näkökulmasta voidaan nähdä myös positiivisena asiana. Lisäksi ihmisen tai hiiren soluissa saadaan usein RNAi:n avulla eliminoitua vain noin 90 % kohde-mrna:sta, mikä tosin yleensä riittää aiheuttamaan kyseisen geenituotteen puutokseen liittyvän ilmiasun. Omien kokemustemme (K. Saksela ja A. Manninen, julkaisematon havainto) ja RNAi-tekniikkaa käyttävien kollegoiden kanssa käymieni keskustelujen perusteella vaikuttaa siltä, että ainakin kaksi kolmesta näennäisen asianmukaisesti suunnitellusta sirna-rakenteesta on täysin vailla tehoa. Syyt tähän voivat olla moninaiset, eivätkä ne luultavasti liity ainoastaan nisäkässolujen ominaispiirteisiin. Koska toistaiseksi ei voida ennustaa, mitkä sirna:t esimerkiksi ihmisen soluissa mahdollisesti toimivat, kannattaa RNAi-menetelmän käyttöä suunnittelevien varautua useampien sirna-rakenteiden tarpeeseen. Edellä esitetyistä varauksista huolimatta RNAi on jo epäilemättä ehtinyt mullistaa myös nisäkäsoluilla tehtävän tutkimuksen. Menetelmän avaamat lupaavat tutkimusnäkymät on nopeasti ymmärretty, ja RNAi:n käyttöön perustuvien tutkimusten määrä solubiologian alan julkaisusarjoissa kasvaa eksponentiaalisesti. Kuten Inder Verma esitti Helsingin Biomedicumissa 13. 14.9.2002 pidetyssä Paulo-symposiumissa, hiljattain on jo tehty ensimmäiset»knockdown»-hiiret, joissa on estetty vastaavan kohdegeenin ilmentyminen sirna:ta tuottavan siirtogeenin avulla. RNAi luonnon antiviraalisena mekanismina Solun omaa geeniekpression säätelyäkin keskeisempi tehtävä, johon RNAi näyttää evoluutiossa kehittyneen, on solun suojaaminen virusinfektioilta ja sen perimän varjeleminen sinne jo pesiytyneiden virusten ja muiden liikkuvien geneettisten elementtien lisääntymiseltä. RNAi:tä onkin osuvasti kuvattu perimän immuunijärjestelmäksi (Plasterk 2002). Kuten jo mainittiin, RNAi osoittautui kasveissa aiemmin kuvatun RNA-välitteisen RNA-virusresistenssin mekanis- Virukset Kokeellinen dsrna Yksisäikeinen ongelma-rna Kokeellinen sirna-geeni? RdRp Kaksisäikeinen RNA pre-sirna Synteettinen sirna-dupleksi sirna Kuva 2. RNAi:n käynnistyminen. Kuvassa on esitetty tapoja, jotka johtavat sirna:n muodostumiseen soluissa. On esitetty, että soluissa olisi myös mekanismi, joka tunnistaisi yksisäikeistä»ongelma-rna:ta» ja ohjaisi sen muuttamisen kaksisäikeiseksi RdRppolymeraasin avulla. Kokeellisesti RNAi on käynnistettävissä viemällä soluihin geenirakenne plasmidissa, joka tuottaa esi-sirna:n. Tämän jälkeen»dicer»-entsyymi pilkkoo tämän sirna:ksi. Toisaalta soluihin voidaan viedä koeputkessa syntetisoituja kaksisäikeisiä sirna-molekyylejä, jolloin tätä entsyymiä ei tarvita. RNA-interferenssi virustautien torjuntaan? 2195

miksi. RNA-virusten replikaatiossa syntyvästä dsrna:sta syntyy»dicerin» vaikutuksesta virus-rna:n hajottamista ohjaavaa sirna:ta, joka edelleen monistuu ja leviää vielä infektoitumattomiin kasvisoluihin (Zamore 2001, Hannon 2002). Kasvivirukset ovat kuitenkin kehittäneet omia vastamekanismejaan tämän tehokkaan antiviraalisen puolustuksen harhauttamiseksi, ja niistä on löydetty useita geenejä, joiden tehtävä liittyy RNAi:n eri vaiheiden estämiseen (Baulcombe 2002). Hiljattain raportoitiin myös esimerkki sirna:n antiviraalista vaikutusta inaktivoivasta geenistä (banaanikärpäsen FH-viruksen B2-geeni), joka on välttämätön eläinviruksen kyvylle lisääntyä kohdesoluissaan. RNAi näyttää siten olevan evoluutiossa laajalle levinnyt RNA-virusinfektioilta suojaava mekanismi (Li ym. 2002). Vaikka ei ole selvää, että syynä on nimenomaan RNAi:n luoma valintapaine, mainittakoon, että myös ihmispatogeeni»respiratory syncytial» -viruksella (RSV) tehdyt kokeet ovat osoittaneet, että tämän viruksen nukleokapsidi pystyy varsin hyvin suojaamaan sen replikoituvaa RNA-genomia sirna:n ohjaamalta tuhoamiselta (Bitko ja Barik 2001). RNA-virusten lisääntyessä syntyvä dsrna on ilmeinen RNAi:n laukaiseva tekijä. Sen sijaan edelleen on epäselvää, mikä mekanismi ohjaa RNAi:n vastustamaan monien muiden sellaisten vieraiden geenien ilmentymistä, jotka uhkaavat solujen hyvinvointia. Tällaisia geenejä ovat esimerkiksi transposonit. Ne leviävät genomissa RNA-välivaiheen kautta, ja niiden määrän on havaittu lisääntyvän dramaattisesti laakamadoissa, joiden RNAi-järjestelmään osallistuvia geenejä on vaurioitettu (Ketting ym. 1999). Sama koskee eräissä tapauksissa tutkijoiden eri organismien genomeihin saattamia, voimakkaasti ilmentymään tarkoitettuja siirtogeenejä (Hannon 2002). Mahdollista on, että näiden geenien ilmentymisen estävä RNAi kehittyy niiden RNA-tuotteissa syystä tai toisesta spontaanisti esiintyvien,»dicerin» substraatiksi soveltuvien dsrna-rakenteiden vaikutuksesta. Todennäköisempänä selityksenä kuitenkin pidetään soluissa olevaa toistaiseksi tuntematonta mekanismia, joka kykenee tunnistamaan vieraita ja mahdollisesti haitallisia yksisäikeisiä RNA-molekyylejä ja muokkaamaan ne RNAi:n käynnistäväksi dsrna:ksi (kuva 2) (Ahlquist 2002, Plasterk 2002). Koska vaarallisen geneettisen materiaalin ilmentymistä rajoittavan koneiston täytynee perustua RdRp-aktiivisuuteen, on solujen RdRp-entsyymien karakterisointi parhaillaan huomattavan mielenkiinnon kohteena. RNAi:n käyttö aseena virusinfektioita vastaan Uudet havainnot RNAi:n osuudesta alempien eliöiden antiviraalisessa puolustuksessa ja edistysaskeleet ilmiön hyödyntämisessä nisäkässoluissa ovat aiheuttaneet huomattavaa innostusta ja toimeliaisuutta myös ihmisen virusinfektioita tutkivissa laboratorioissa. Tänä vuonna on julkaistu joukko mielenkiintoisia tutkimuksia, joissa on kuvattu RNAi:n lupaava kyky vastustaa eräiden merkittävien virusten varsinkin HI-viruksen kykyä lisääntyä ihmisen soluissa kudosviljelmissä (Coburn ja Cullen 2002, Gitlin ym. 2002, Hu ym. 2002, Jacque ym. 2002, Lee ym. 2002, Novina ym. 2002). Transfektoimalla soluihin joko synteettisiä HIvirukselle spesifisiä sirna-molekyylejä tai vastaavia sirna:ta tuottavia geenirakenteita on voitu tukahduttaa tehokkaasti HI-viruksen geeniekspressio ja siten myös sen leviäminen soluviljelmässä. Jacque ym. osoittivat lisäksi, että myös HIV:n RNA-genomi on mahdollista tuhota sirna-välitteisesti ennen sen käänteiskopiointia ja integraatiota proviruksena solun perimän pysyväksi osaksi ja siten estää solun infektio kokonaan. Toisaalta Novina ym. pystyivät estämään HIV-infektion myös sirna:lla, joka oli suunniteltu estämään itse viruksen sijasta HIV:n reseptorinaan käyttämän isäntäsolun proteiinin (CD4) ilmentyminen. Vakuuttavan todistuksen sirna:n antiviraalisesta tehosta ihmisen soluissa hankki myös Raul Andinon työryhmä käyttämällä poliovirusinfektiota tutkimusmallina (Gitlin ym. 2002). Tämän nopeasti lisääntyvän ja voimakkaasti sytopaattisen RNA-viruksen aiheuttama solutuho voitiin estää hämmästyttävän tehokkaasti sirna:n avulla. 2196 K. Saksela

Edellä kuvatut tutkimukset antavat aihetta varovaisiin odotuksiin siitä, että RNAi:stä voisi olla tulevaisuudessa merkittävää apua myös ihmisen virustautien torjunnassa ja hoidossa. Mahdollisuudet kohdistaa sirna:t virusten perimän kaikkein säilyneimpiin kohtiin, yhdistää useita eri sirna-molekyylejä ja estää niillä myös viruksen tarvitsemien solun geenituotteiden ilmentymistä tuntuisivat antavan menetelmälle hyvät mahdollisuudet toimia myös virusten osalta esimerkkinä HIV, joka nopean muuntelukykynsä turvin pyrkii karkaamaan immuunipuolustukselta ja lääkehoidolta. Huomattavaa kuitenkin on, että yhden ainoan emäksen vaihtuminen kohde-rna:ssa riittää suojaamaan sen sirna:n ohjaamalta katkaisulta. Mainitsemisen arvoinen etu RNAi:n käytössä olisi lisäksi, että itse antiviraalista hoitoa kohtaan kehittyvä immuunireaktio ei liene RNA:n tehoa uhkaava ongelma, toisin kuin erilaisiin estäviin proteiineihin perustuvissa geeniterapeuttisissa sovelluksissa on odotettavissa. RNAi:n antiviraalisen käytön kannalta verrattomia näköaloja tarjoava, joskin samalla monin tavoin pulmallinen mahdollisuus on, että RNAi onnistutaan saamaan leviämään myös ihmisen kudoksissa kuten laakamadossa. Toistaiseksi tämä ei kuitenkaan ole onnistunut, ja antiviraaliset sirna-molekyylit tai niitä tuottavat geenirakenteet olisi saatava toimitettua erikseen jokaiseen suojattavaan soluun tai näiden kantasoluihin. Vaikka mm. virusvektoreihin perustuvat geeniterapian menetelmät ovat nopeasti kehittymässä, on tämä keskeinen rajoitus ainakin vielä lähivuosina esteenä RNAi:n laajamittaiselle kliiniselle käytölle ihmisten terveyttä uhkaavien virustautien torjunnassa. Erinomaisena uutena tutkimusvälineenä virusten ja niiden isäntäsolujen välisten molekyylitason vuorovaikutusten selvittämisessä RNAi on kuitenkin jo nyt merkittävänä apuna taistelussa virustauteja vastaan. Vauhti RNAi:n tutkimuksessa on ollut viime aikoina hurjaa. Tieto RNAi:n vaikutusmekanismeista ja niiden hyödyntämismahdollisuuksista niin tutkimustyössä kuin infektioiden tai muidenkin sairauksien hoidossa on nopeasti lisääntymässä. Tulevaisuus näyttää, saadaanko RNAi:stä uusi ase virustautien hoitoon. Kirjallisuutta Ahlquist P. RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silencing. Science 2002;296:1270 3. Ambros V. micrornas: tiny regulators with great potential. Cell 2001; 107:823 6. Avner P, Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation. Nat Rev Genet 2001;2:59 67. Baulcombe D. Viral suppression of systemic silencing. Trends Microbiol 2002;10:306 8. Baulcombe DC. RNA as a target and an initiator of post-transcriptional gene silencing in transgenic plants. Plant Mol Biol 1996;32:79 88. Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001;409:363 6. Bitko V, Barik S. Phenotypic silencing of cytoplasmic genes using sequence-specific double-stranded short interfering RNA and its application in the reverse genetics of wild type negative-strand RNA viruses. BMC Microbiol 2001;1:34. Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 2002; 296:550 3. Coburn GA, Cullen BR. Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference. J Virol 2002;76:9225 31. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001(a);411:494 8. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev 2001(b);15:188 200. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998;391:806 11. Gitlin L, Karelsky S, Andino R. Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells. Nature 2002;418:430 4. Grosshans H, Slack FJ. Micro-RNAs: small is plentiful. J Cell Biol 2002; 156:17 21. Hannon GJ. RNA interference. Nature 2002;418:244 51. Hu W, Myers C, Kilzer J, Pfaff S, Bushman F. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Curr Biol 2002;12:1301. Hutvagner G, Zamore PD. A microrna in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science 2002;297:2056 60. Immonen T, Sariola H. Mikro-RNA:t uusi tapa säädellä proteiinien tuottoa. Duodecim 2002;118:661 2. Jacque JM, Triques K, Stevenson M. Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature 2002;418:435 8. Jorgensen R. Altered gene expression in plants due to trans interactions between homologous genes. Trends Biotechnol 1990;8:340 4. Ketting RF, Haverkamp TH, van Luenen HG, Plasterk RH. Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNaseD. Cell 1999;99:133 41. Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li MJ, Ehsani A, Salvaterra P, Rossi J. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat Biotechnol 2002;20:500 5. Li H, Li WX, Ding SW. Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus. Science 2002;296:1319 21. Lindbo JA, Dougherty WG. Untranslatable transcripts of the tobacco etch virus coat protein gene sequence can interfere with tobacco etch virus replication in transgenic plants and protoplasts. Virology 1992;189:725 33. Lipardi C, Wei Q, Paterson BM. RNAi as random degradative PCR: sirna primers convert mrna into dsrnas that are degraded to generate new sirnas. Cell 2001;107:297 307. Llave C, Xie Z, Kasschau KD, Carrington JC. Cleavage of Scarecrow-like mrna targets directed by a class of Arabidopsis mirna. Science 2002;297:2053 6. Novina CD, Murray MF, Dykxhoorn DM, ym. sirna-directed inhibition RNA-interferenssi virustautien torjuntaan? 2197

of HIV-1 infection. Nat Med 2002;8:681 6. Plasterk RH. RNA silencing: the genome s immune system. Science 2002;296:1263 5. Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, ym. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 2000;403:901 6. Sijen T, Fleenor J, Simmer F, ym. On the role of RNA amplification in dsrna-triggered gene silencing. Cell 2001;107:465 76. Storz G. An expanding universe of noncoding RNAs. Science 2002; 296:1260 3. Timmons L, Fire A. Specific interference by ingested dsrna. Nature 1998;395:854. Zamore PD. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol 2001;8:746 50. Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, Bartel DP. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mrna at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 2000;101:25 33. KALLE SAKSELA, professori kalle.saksela@uta.fi Lääketieteellisen teknologian instituutti 33014 Tampereen yliopisto 2198