Mikrobivaurion toteaminen uusien menetelmien validointi ja vaurion vakavuuden arviointi Anne Hyvärinen, Yksikön päällikkö, Dos. Asuinympäristö ja terveys -yksikkö ~ 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 1
Mikrobivaurioiden tutkiminen Perustuu ensisijaisesti rakennuksen tekniseen tutkimukseen (Kosteus- ja homevaurioituneen rakennuksen kuntotutkimus opas, päivitettävänä) Rakenteiden toteutus Rakenteiden kunto Tarkistuslistat Rakenneavaukset, mikrobimääritykset Pintakosteuskartoitus Lyhyt- ja pitkäkestoiset mittaukset Kosteusmittaukset Rakenteiden tiiveys ja epäpuhtauksien kulkeutuminen Mahdolliset sisäilmaolosuhteiden ja epäpuhtauksien mittaukset 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 2
Miksi mikrobiologisia näytteitä? Osoitetaan tai varmistetaan mikrobiologinen epäpuhtauslähde Mikrobikasvua pinnalla tai materiaalissa Epätavanomainen mikrobilähde Mikrobien kulkeutuminen sisäilmaan jostain toisesta tilasta ENSIJAISESTI rakennusmateriaalinäytteitä Käytetään apuna korjausalueen laajuuden määrittelyssä ja mahdollisesti rakenneosan kunnon määrittelyssä Tunnistetaan tavanomaisesta poikkeavia mikrobipitoisuuksia ja lajistoa rakennusmateriaali-, pinta- ja ilmanäytteistä Ohjeistus ja tulkinta tällä hetkellä vain kasvatusmenetelmään perustuville elinkykyisille mikrobeille Muiden menetelmien testauksesta lisää 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 3
Miksi kvantitatiivinen PCR? Mikrobit eivät usein elinkykyisiä, viljeltävissä ja/tai tunnistettavissa perinteisillä kasvatusmenetelmillä Myös kuolleet ja elinkyvyttömät mikrobit voivat olla merkityksellisiä Valtaosa mikrobeista ei viljeltävissä laboratorio-olosuhteissa Kasvatusalustat aina selektiivisiä tietyille lajeille Mikrobien tunnistaminen työlästä, epäspesifistä (esim. läheiset lajit), vaatii vuosien kokemuksen qpcr havaitsee myös elinkyvyttömät, ei-viljeltävissä olevat ja on objektiivinen, nopea ja herkkä, mutta. 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 4
Tärkeää qpcr-menetelmästä Yksi qpcr-assay tai qpcr sovellus mittaa yhtä asiaa Aspergillus versicolorille spesifinen aluke mittaa vain Aspergillus versicoloria Ei tietoa muista lajeista ko. näytteessä! Penicillium/Aspergillus-spesifinen aluke mittaa Penicilliumit ja Aspergillukset näytteestä = ryhmäspesifinen assay Universaalit alukkeet eli nk. yleisalukkeet mittaavat esim. koko bakteeristoa tai sienten määrää näytteessä Mitä sovelluksessa mitataan ja millä tasolla: Bakteerit / sienet ryhmä suku laji Useamman mikrobin mittaaminen vaatii monta sovellusta 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 5
qpcr-menetelmän testaus asumisterveysnäytteille Rakennusmateriaali- ja ilmanäytteille Rakennusmateriaalinäytteet viljelty Asumisterveysoppaan (2009) mukaan DNA eristetty qpcr-menetelmää varten tunnetusta määrästä viljelysuspensiota Analysoitu useita eri qpcr sovelluksia keskitytty lupaaviin Aineisto tähän mennessä: 945 rakennusmateriaalinäytettä 184 ilmanäytettä 72 kosteusvaurioituneista kohteista 70 ei-vaurioituneista kohteista 56 ulkoilmanäytettä 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 6
qpcr vs. viljely Rakennusmateriaalinäytteet Verrattiin menetelmiä käyttämällä viljelyn vaurioluokituksen raja-arvoja Rakennusmateriaalit 10 000 pmy/g ja viljelytuloksen perusteella määritettyä kolmiluokkaista aineistoa (pitoisuus ja lajisto) qpcr-analyysien optimaalisia raja-arvoja etsittiin suhteessa viljelyyn: Sensitiivisyys ja spesifisyys molemmat mahdollisimman korkeita tai ROC-käyrän AUC-arvo on mahdollisimman suuri Sensitiivisyys: qpcr-menetelmällä positiiviseksi osoitettujen näytteiden osuus kaikista viljelyssä positiivisiksi osoittautuneista näytteistä Spesifisyys: qpcr-menetelmällä negatiiviseksi osoitettujen näytteiden osuus kaikista viljelyssä negatiivisiksi osoittautuneista näytteistä 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 7
qpcr vs. viljely Rakennusmateriaalinäytteet Kriteerejä: Mahdollisimman suuret, yhtäaikaiset sensitiivisyyden ja spesifisyyden arvot Receiver operating characteristic (ROC)-käyrät kaksiluokkaista viljelytulosta vastaan käyrän AUC- (area under curve) arvon suurinta arvoa käytettiin yhtenä raja-arvojen valintakriteerinä Raja-arvot, jotka tuottivat korkean spesifisyyden yksittäiselle määritykselle ( 90%) Kumulatiivisten jakaumien tarkastelu 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 8
Korkea toistettavuus rakennusmateriaalinäytteiden qpcr -analyysissä (ICC>0.98) Samat RM-näytteet (n=21) eristetty 5 kertaa Näistä (n=105) tehty 3 rinnakkaista qpcr-määristystä (yht. 315 reaktiota) 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 9
qpcr rakennusmateriaaleista - johtopäätös Paras yhdistelmä: Sienten yleisaluke (nk. unifungi ) + Penicillium/Aspergillus/Paecilomyces varioti-ryhmän aluke PenAsp > 40.000 CE/g tai Unifung >500.000 CE/g Sensitiivisyys: 90%, spesifisyys: 64% Streptomyces spp. määritys tarpeen myös Ei lisää spesifisyyttä/sensitiivisyyttä Joskus tilanteita, joissa ei homekasvua, mutta runsas sädesienipitoisuus 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 10
Menetelmät ilmanäytteet Viljelynäytteet Andersen-keräimellä 10 minuutin ajan qpcr-analyyseihin tulevat näytteet Button-keräimellä suodattimille vähintään 60 minuutin ajan Analysoitiin useita (23 kpl) eri qpcr-sovelluksia; Useimmissa lajispesifisissä analyyseissä runsaasti alle määritysrajan olevia näytteitä Keskityttiin seuraaviin kahteen qpcr-sovellukseen: Sienten yleissovellus (nk. unifungi) Penicillium, Aspergillus ja Paecilomyces variotii-ryhmät monistavaan sovellus (nk. PenAsp) 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 11
Menetelmien välinen kyky erottaa vaurio ja vertailu Viljelyllä ei selkeää eroa ulkoilmapitoisuus korkea Sienten yleisaluke erottelee vaurio-vertailu, mutta ulkoilma korkeampi kuin vertailu Pen/Asp: vauriokodit erottuvat vertailukodeista JA ulkoilmasta 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 12
Vuodenaikaisvaihtelu Viljely; vauriokodit erottuvat ei-vauriokodeista vain talvella Pen/Asp-qPCR; vauriokotien Pen/Asp-pitoisuus ulkoilmaa ja vertailukoteja korkeampi kaikkina vuodenaikoina 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 13
qpcr ilmanäytteistä - johtopäätös qpcr:lla analysoitaessa Pen/Asp-sovelluksen pitoisuus 250 CE/m 3 tuottaa suurimman sensitiivisyyden ja spesifisyyden eli erottelee parhaiten vauriokodit vertailukodeista tässä aineistossa 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 14
Mycometer -menetelmä Sienten biomassa voidaan määrittää mittaamalla β-n-asetyyliheksoaminidaasi (NAHA) entsyymin aktiivisuutta NAHA entsyymiä esiintyy sekä sienen rihmastossa että itiöissä ja sitä on havaittu aktiivisissa, lepotilassa ja elinkykynsä menettäneissä soluissa Eri sienissä eri määriä NAHA-entsyymiä Mycometer-menetelmällä mitataan fluorometrisesti NAHA-entsyymiä Ei kerro lajistosta! 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 15
Pintanäyte valmistajan antama tulosten tulkinta 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 16
Materiaalinäyte valmistajan antama tulosten tulkinta 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 17
Mycometer edut ja heikkoudet Menetelmä on herkkä havaitsemaan homeen entsyymiaktiivisuutta Ei havaitse hiivoja, bakteereja, aktinomykeettejä + - Kenttäkäyttöinen (pieni, kevyt) Nopea (tulos jo kentällä) Käy eri näytetyypeille (pinta-, ilma-, materiaalinäytteet) Ei riittävästi käyttökokemusta Ei asumisterveysasetuksen mukainen menetelmä! Ei suomalaisia vertailuaineistoa vielä Reagenssit melko hinnakkaita Entsyymiä voi esiintyä mm. kasveissa ja niistä saaduissa elintarvikkeissa (esim. jauhot), eläimissä (mm. hyönteisten osat), veressä, ihossa, ihossa, siitepölyssä 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 18
THL testaa - alustavia tuloksia Mycometer vs. Viljely: Rakennusmateriaalit Näytteiden sijoittuminen eri luokkiin, kun viljelytulos jaoteltu yli ja alle 10 000 pmy/g sienten kokonaispitoisuuden mukaan (n=289) vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia Viljelytulos pmy/g Mycometer kategoria A Mycometer kategoria B Mycometer kategoria C alle 10 000 133 (71,9 %) 28 (15,1 %) 24 (13,0 %) BDL=36 (alle määritysrajan) BMQL=25 (alle laskennallisen rajan) yli 10 000 30 (28,9 %) 38 (36,5 %) 36 (34,6 %) BDL=4 (alle määritysrajan) BMQL=1 (alle laskennallisen rajan) 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 19
THL testaa alustavia tuloksia Mycometer vs. Viljely: Pintanäytteet vaurio-vertailuasetelma Yhteensä 82 vaurio-vertailuparia Mycometer erotteli vauriopinnat vertailupinnoista viljelymenetelmää paremmin (vertailu A kategoriassa, vaurio B tai C kategoriassa) Vain 11 näytettä yli viljelyn vaurioluokituksen (>1000 pmy/cm 2 ) Mycometer Viljely N Vertailu Vaurioepäily Vertailu Vaurioepäily (yht. 82) Mycometer-kategoria Mycometer-kategoria (pmy/cm 2 ) (pmy/cm 2 ) 52 (63,4 %) A A alle 1 000 alle 1 000 10 (12,2 %) A B alle 1 000 alle 1 000 2 (2,4 %) B B tai C alle 1 000 alle 1 000 1 (1,2 %) C A alle 1 000 alle 1 000 6 (7,3 %) A C alle 1 000 alle 1 000 2 (2,4 %) A B alle 1000 yli 1000 8 (9,8 %) A C alle 1 000 yli 1 000 1 (1,2 %) B C alle 1 000 yli 1 000 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 20
THL testaa alustavia tuloksia Mycometer vs. viljely: Ilmavuotokohdista otetut näytteet Vaurio-vertailu asetelma Yhteensä 108 vaurio-vertailuparia Erot ilmavuoto- ja vertailunäytteiden välillä olivat selvemmin nähtävissä Mycometer menetelmällä 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 21
Mitä alustavien tulosten perusteella voi sanoa? Mycometerillä analysoidut rakennusmateriaalit suhteessa viljelyyn: vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia Näytteen epähomogeenisuus? Pieni näytemäärä? Toimisiko paremmin joillakin materiaaleilla? Viljelyyn verrattaessa pitää muistaa, että menetelmät mittaavat eri asiaa Pintanäytteiden viljelyssä vaurioluokitusraja 1000 pmy/cm 2 korkea Pintanäytteiden vertailu-vaurio-asetelmassa Mycometermenetelmä vaikuttaa lupaavalta Erottelee paremmin vaurio- ja vertailupinnat kuin viljely Ilmavuotokohdista otetut näytteet erosivat vertailupinnoista paremmin Mycometer -menetelmällä 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 22
Entäs muut menetelmät? Mikrobien haihtuvia aineenvaihduntatuotteita (MVOC) (homeen haju) myös muita lähteitä ei mikrobivaurioiden toteamiseen Mikrobitoksiinit yleisyyttä ja pitoisuuksia selvitetään, ei tiedetä normaalipitoisuuksia ei mikrobivaurioiden toteamiseen Toksisuustestaus myös muut kuin mikrobitekijät voivat aiheuttaa toksisuutta pölynäytteen toksisuuden mittausta ei tule käyttää kosteusvaurion vakavuuden arviointiin eikä mikrobivaurioiden toteamiseen 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 23
Vaurioiden/epäpuhtauslähteen vakavuuden arviointi Ei ole olemassa yhtä yksittäistä mittausta/tutkimusta, joka kertoo vaurioiden vakavuuden tason Tulee myös perustua kokonaisuuden arviointiin, jossa huomioidaan Vaurioiden/epäpuhtauslähteen esiintyminen, laajuus/vakavuus Altistumisen todennäköisyys Toteutuneet terveyshaitat (oireet ja sairaudet): huomioiminen haastavaa, koska yksittäisen asukkaan kokeman oireilun merkitystä on vaikea arvioida - herkkyys vaihtelee voimakkaasti Toimenpiteiden kiireellisyyden määrittelyssä merkittävää myös Altistumisen välttämisen mahdollisuudet ja siitä seuraavat olosuhteet Noudattaa samoja periaatteita, mitä kuvattu Toimintaohje työpaikkojen sisäilmasto-ongelmien selvittämiseen 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 24
Vaurioiden esiintyminen, laajuus / vakavuus Onko toteutuneita kosteusvaurioita? Onko kosteusvaurioille alttiita riskirakenteita, onko riskit toteutuneet? Ovatko vauriot rajallisia, helposti korjattavia vai koskevat kokonaisia rakenneosia ja/tai laajoja alueita? Ovatko kosteusvauriot johtaneet mikrobikasvustoon? Miten voimakasta/laajaa kasvustoa esiintyy? 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 25
Altistumisen todennäköisyys ja määrä Rakennuksessa on vaurio/epäpuhtauslähde, josta vapautuu hiukkasmaisia ja haihtuvia epäpuhtauksia Vaurion/epäpuhtauslähteen sijainti ja laajuus vaikuttaa, esim. Tilat, joissa oleskellaan toistuvasti vs. joissa ei oleskella Pinnoilla, sisäpuolisissa vai ulkopuolisissa rakenteissa Ilmanvaihtokanavissa Onko ilmayhteys vaurioituneisiin rakenteisiin tai tiloihin, muuhun epäpuhtauslähteeseen Paine-erot Hallittavissa / ei hallittavissa Toistuva ja/tai merkittävä alipaineisuus Mikrobialtistuminen havaittavissa ilmanäytteissä vahvistaa altistumisen todennäköisyyttä, mutta EI heikennä sitä, että altistumista ei tapahtuisi, jos vaurioita havaittu ja on olemassa altistumisreitti HUOMIO ns. puhtaat ilmanäytteet EIVÄT poissulje altistumista! 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 26
Oireilun rooli Oireilu ja sairastavuus saavat erityisesti kosteus- ja homevaurioiden arvioinnissa usein erityisen painon Toistaiseksi ei tiedetä oireilun aiheuttajaa kosteus- ja homevauriorakennuksessa Toisaalta ei myöskään selvää hometalosairautta, eikä diagnostisia työkaluja osoittaa sairastumista Sisäilmakyselyjä voidaan käyttää toteutuneiden oireiden ja sairastuvuuden arvioinnissa esim. TTL:n kyselyä ei suositella käytettäväksi, jos vastaajia < 20 Asunnoissa voi ylittyä, jos ongelma koskettaa asunto-osakeyhtiötä Yksittäisen asukkaan kokeman oireilun merkitystä on vaikea arvioida - herkkyys vaihtelee voimakkaasti 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 27
Terveyshaitasta toimenpiteisiin Toimenpidesuositusten ja niiden kiireellisyyden tulee perustua kokonaisuuteen, jossa huomioidaan terveyshaitan esiintyminen altistumisen todennäköisyys, määrä, laatu ja kesto altistumisen välttämisen ja poistamisen mahdollisuudet rakennuksen käyttäjien kokema oireilu ja sairastavuus Altistumisen todennäköisyyteen ja määrään vaikuttavat lähteen laajuus, sijainti ja ominaisuudet epäpuhtauksien vapautuminen ja leviäminen sisäilmaan sekä niihin vaikuttavat tekijät, kuten ilmanvaihto ja ilmavuotoreitit 16.5.2016 Esityksen nimi / Tekijä 28