Biomolekyylit I Luentorunko Jarmo Niemi 2003-2008 1
Biomolekyylit I Luennot 4 op. 2003-2008 Jarmo Niemi (jarmo.niemi@utu.fi) Biokemian ja elintarvikekemian laitos, Arcanum puh. 333 6877, 040 0789362 http://users.utu.fi/~jarnie/biomolekyylit1.doc Tavoitteet: Opiskelija tuntee keskeisten biomolekyylien, kuten proteiinien, hiilihydraattien, nukleiinihappojen ja lipidien rakenneperiaatteet ja biokemiallisen merkityksen. Oppimateriaali: Nelson ja Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4. painos, kappaleet 1-4,7,8,10. Tämä luentorunko. http://bcs.whfreeman.com/lehninger/ Suoritustavat: Luentoihin ja oppikirjaan perustuva tentti. Luentorunko Tämä moniste on luentorunko, ei oppikirja! Se on tarkoitettu luentojen seuraamisen ja kirjan lukemisen tueksi ja muistiinpanotarpeen vähentämiseksi, ei yksinomaiseksi oppimateriaaliksi. Muuta materiaalia: avainnollistavia animaatioita löytyy osoitteista http://science.nhmccd.edu/biol/ap1int.htm ja http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/animations.htm 1. Maa-planeetan elämästä yleensä elolliset organismit ovat elottomiin kohteisiin verrattuna erittäin monimutkaisia rakenteeltaan elolliset organismit käyttävät toimintaansa ympäristöstään saamaansa energiaa: auringonvaloa tai ravintoaineita elolliset organismit pystyvät tuottamaan kopioita itsestään eliöillä on mekanismeja tunnistaa ympäristönsä muutoksia ja reagoida niihin Kaikki eliöt ovat perustoimintaperiaatteiltaan samanlaisia toimivat osat ovat makromolekyylejä, jotka rakentuvat suhteellisen harvalukuisista palikoista, monomeerisistä alayksiköistä 2
nukleiinihapot ovat kahdeksan eri rakenneosan, nukleotidin muodostamia ketjuja proteiinit ovat kahdenkymmenen erilaisen aminohapon muodostamia ketjuja kaikki eliöt käyttävät samoja nukleotidejä ja aminohappoja eliöt eivät ole kemiallisessa tasapainossa ympäristönsä kanssa eliöissä olevat yhdisteet ovat dynaamisessa vakaassa tilassa; niitä tuotetaan ja hajotetaan yhtä paljon eliöt ottavat sekä ainetta, että energiaa ympäristöstään, ja käyttävät niitä oman järjestyksensä rakentamiseen ja ylläpitoon Termodynamiikan ensimmäinen pääsääntö: Termodynamiikan toinen pääsääntö: Energia ei häviä. Entropia (epäjärjestys) lisääntyy Eliöt noudattavat kaikkia fysiikan ja kemian lakeja. Eliön järjestyneisyys voidaan saavuttaa vain ympäristön epäjärjestyksen lisääntymisen kustannuksella Eliöt käyttävät hyväkseen ns. kytkettyjä reaktioita: energiaa vapauttavan (eksergonisen) reaktion avulla saadaan energiaa sitova (endergoninen) reaktio tapahtumaan Kytkentään käytetään korkeaenergisiä yhdisteitä, joista tavallisin on adenosiinitrifosfaatti, ATP Reaktioita katalysoivat soluissa entsyymit, joista muodostuu reaktioteitä Biologinen tiedonsiirto Eliön toiminnan pohjana on geneettinen informaatio, jonka täytyy kopioitua lähes virheettömästi uuteen eliösukupolveen ilmentyä suhteellisen virheettömästi eliön toiminnassa Kopioitumisen virheettömyys perustuu DNA:n kaksinauhaiseen, komplementaariseen rakenteeseen Kopioitumisessa tapahtuvat (harvat) virheet mahdollistavat evoluution Ilmentyminen perustuu lineaarisen nukleiinihappomolekyylin translaatioon, kääntämiseen, lineaariseksi proteiinimolekyyliksi Lineaarinen proteiinimolekyyli omaksuu kolmiulotteisen rakenteen, joka riippuu sen rakenneosien järjestyksestä, ja johon sen toiminta perustuu. 3
O COO - COO - COO - C C COO - 1.1. Solujen rakenne Eliön perusyksikkö on solu. (yksisoluiset/monisoluiset) Kaikkia soluja ympäröi solukalvo (plasma membrane) Solukalvon sisäpuolella on solulima, sytoplasma Sytoplasmassa on erilaisia partikkeleita, sekä nestefaasi, sytosoli, joka on olemukseltaan geelimäinen Kaikissa soluissa (pl. tumattomat) sytoplasmassa on ribosomeja, joissa proteiinisynteesi tapahtuu Solun perimä, genomi on DNA:ta sisältävässä rakenteessa Aitotumallisilla (eukaryooteilla) tätä rakennetta kutsutaan tumaksi (nucleus). Tuman erottaa solulimasta tumakalvo. Esitumallisilla (prokaryooteilla) käytetään nimitystä nukleoidi Solujen koko Eläin- ja kasvisolut 5-100 µm, bakteerisolut 1-2 µm Pienimmät mykoplasmat 300 nm -> tilavuus 10-17 litraa Solun kokoa rajoittaa ravintoaineiden ja hapen saanti Nitella-levän solu on useita senttimetrejä pitkä! Aitotumallinen, eukaryootti (eukaryote) Esitumallinen, prokaryootti (prokaryote) Tuma (nucleus) Nukleoidi (nucleoid) Mitokondrio (mitochondrion) Solukalvo (plasma membrane) C 2 C 2 Enz Solulima, sytoplasma (cytoplasm) Lysosomi (lysosome) Endoplasmakalvosto (endoplasmic reticulum, ER) Golgin laite (Golgi complex) What is true for E. coli is true for elephants, only more so. - Jacques Monod 4
Koska kaikki eliöt ovat perustoimintaperiaatteiltaan samanlaisia, voidaan niiden tutkimisessa käyttää sellaisia koeorganismeja, joiden kasvattaminen ja käsittely on mahdollisimman helppoa. bakteeri, Escherichia coli hiiva, yksinkertainen eukaryootti Saccharomyces cerevisiae yksisoluinen kasvi, levä Chlamydomonas Prokaryoottisolun evoluutio ja rakenne Prokaryootit jakautuvat eubakteereihin ( varsinaiset bakteerit ) arkkeihin (Archaea, arkkibakteerit) Kreikk. arche alkuperä, alku Arkit ovat luultavasti vanhimpia jäljellä olevia solullisia eliöitä. Nykyään tehokkaammat eubakteerit ovat syrjäyttäneet ne tavallisista olosuhteista, ja arkkeja esiintyy ääriolosuhteissa. Me eukaryootit olemme läheisempää sukua arkeille, kuin eubakteereille. Prokaryoottien elinympäristöjä Aerobinen Anaerobinen (ei happea) Eliöt saavat energiaa hapetus-pelkistysreaktioista, jotka voidaan tulkita elektronien siirroksi. Aerobiset organismit siirtävät elektroneja hapelle. Anaerobiset käyttävät elektronien vastaanottajina muita molekyylejä, kuten nitraattia, rikkiä, hiilidioksidia. Useille anaerobisille organismeille happi on myrkkyä. Prokaryoottien energian ja ravinnon hankinta Fototrofit saavat energiansa valosta Kemotrofit saavat energiansa hapettamalla ravintoaineita Autotrofit saavat tarvitsemansa hiilen hiilidioksidista eterotrofit saavat tarvitsemansa hiilen ravintoaineista Litotrofit saavat energiansa hapettamalla epäorgaanisia ravintoaineita Organotrofit saavat energiansa hapettamalla orgaanisia ravintoaineita Escherichia coli on parhaiten tutkittu prokaryootti E. coli on enimmäkseen harmiton ruoansulatuskanavan asukas. Solu on n. 2 x 1 µm. Solua ympäröi soluseinä, joka koostuu peptidoglykaaneista. E. colilla on kaksinkertainen solukalvo, jonka ulompi kerros on peptidoglykaanikerroksen ulkopuolella (Gram-negatiivinen bakteeri). 5
Solun ulkopinnassa on piluksia, joilla solu tarttuu pintoihin, ja yksi tai useampi flagella, jolla solu pystyy liikkumaan uimalla. E. coli-solun sisällä on n. 15 000 ribosomia n. tuhatta erilaista entsyymiä kutakin tuhansia molekyylejä pienimolekyylisiä orgaanisia yhdisteitä epäorgaanisia ioneja n. 2000 µm:n mittainen renkaanmuotoinen DNA-molekyyli, kromosomi mahdollisesti pienempiä renkaanmuotoisia DNA-molekyylejä, plasmideja Eukaryoottien alkuperästä Eukaryootteja on ollut maapallolla n. 1,5 mrd. vuotta. Niiden esivanhempina pidetään anaerobisia arkkeja. Nykyeukaryoottien arvellaan syntyneen toisaalta anaerobisen arkin ja toisaalta aerobisen eubakteerin ja kasvien osalta vielä syanobakteerin symbioosina => ns endosymbionttiteoria. Aerobisesta bakteerista ajatellaan muodostuneen nykyeukaryoottien mitokondriot, ja syanobakteerista nykykasvien kloroplastit. Sekä mitokondriolla, että kloroplastilla on edelleen omaa DNA:ta, jota pidetään jäänteenä niiden elämästä erillisenä organismina. Eukaryoottisen solun rakenteesta ja toiminnasta Solukalvo sisältää kuljetus- ja reseptoriproteiineja Solukalvo ei läpäise useimpia molekyylejä, joten niille on tehtävä aukko. Aukot ovat erityisiä kalvon läpäiseviä proteiineja, jotka yleensä päästävät vain yhtä tai harvaa molekyyliä lävitseen. Kuljetusproteiini voi olla joko passiivinen kanava (molekyylit kulkevat konsentraatiogradientin suuntaan) tai aktiivinen pumppu (käyttää ulkoista energiaa) Reseptori on proteiini, joka välittää informaatiota solukalvon yli (ionikanava, entsyymi) Endosytoosi ja eksosytoosi kuljettavat materiaalia solukalvon läpi Endosytoosissa sisäänotettava materiaali päätyy solukalvosta kuroutuvan vesikkelin (endosomin) sisään. Endosomi kuljetetaan solun sisään, jolloin se voi sulautua jonkin toisen kalvorakkulan (esim. lysosomin) kanssa. 6
Fagosytoosiksi nimitetään endosytoosia, jossa pieniä partikkeleja otetaan solun sisään. Eksosytoosiksi puolestaan nimitetään sitä, kun solun sisältä tuleva kalvorakkula sulautuu solukalvon kanssa, vapauttaen sisältönsä solun ulkopuolelle. uomattava, että endosytoosissa materiaali ei kulje solukalvon läpi. Endoplasminen kalvosto (endoplasmic reticulum) on solun pinnalle ja ulkopuolelle tulevien proteiinien ja lipidien valmistuspaikka Suuren osan eukaryoottisolusta täyttää mutkikas kalvoista koostuva rakenne, jota kutsutaan endoplasmiseksi kalvostoksi. Karhea endoplasminen kalvosto (rough endoplasmic reticulum) sisältää suuren määrän ribosomeja, jotka valmistavat erittyviä proteiineja kalvoston sisäiseen tilaan. Sileä (smooth) endoplasminen kalvosto puolestaan on lipidien biosynteesipaikka (jossa muun muassa valmistetaan lisää solukalvoa) Golgin laite (the Golgi complex) prosessoi ja lajittelee proteiineja Endoplasmiseen kalvostoon liittyy Golgin laitteeksi kutsuttu rakennelma, joka koostuu litistyneistä onteloista. Käsiteltävät proteiinit tuodaan kalvorakkuloissa ja ne siirtyvät Golgin laitteen ontelosta toiseen samalla mekanismilla. Golgin laitteesta proteiineja sisältävät rakkulat ohjataan esim. lysosomeihin tai ulos solusta. Golgin laitteessa proteiineihin lisätään erilaisia kemiallisia ryhmiä, kuten hiilihydraatteja (glykosylaatio), sulfaattiryhmiä, lipidejä. ajotusreaktiot tapahtuvat lysosomeissa Lysosomeja on vain eläinsoluissa. sisältävät makromolekyylejä pilkkovia entsyymejä. solukalvo suojaa solua lysosomiin suljettujen hajottavien entsyymien vaikutukselta. kun makromolekyyli on hajotettu monomeereikseen lysosomissa, ne pääsevät solukalvon läpi. lysosomin p on solulimaa (n. 7) selvästi alhaisempi (n. 5) Kasvisolun vakuolin tehtävät hajottavien reaktioiden tapahtumispaikka (vrt. lysosomi) pigmenttien sijoituspaikka (kukkien väri) osmoottisen paineen avulla ylläpitää kasvisolun sisäistä painetta => pitää kasvia pystyssä 7
Peroksisomit ja glyoksisomit Jotkut hajotusreaktiot tuottavat vetyperoksidia 2 O 2, joka solussa olisi erittäin vahingollinen hapetin. Tällaiset reaktiot tapahtuvat peroksisomeissa, joissa on vetyperoksidia hapeksi ja vedeksi hajottavaa katalaasi-entsyymiä. Kasveissa on peroksisomeja, jotka sisältävät ns. glyoksylaattisyklin entsyymejä; niitä kutsutaan glyoksisomeiksi. Lysosomeja, peroksisomeja ja glyoksisomeja kutsutaan mikrobodeiksi. Tuma sisältää genomin Tumaa rajoittaa kaksinkertainen kalvo, joka on yhteydessä endoplasmiseen kalvostoon Tumakalvossa on tumahuokosia (nuclear pore) joissa on proteiineista koostuva monimutkainen rakenne, ja n. 90 nm halkaisijainen aukko Kun solu ei ole jakautumassa, tuman täyttää DNA:sta ja proteiineista koostuva kromatiini Tumajyvänen (nucleolus) on tuman alue, jossa syntetisoidaan ribosomaalista RNA:ta (rrna) Solun jakautumista (cytokinesis) edeltää tuman jakautuminen, mitoosi Ennen mitoosia solun DNA on kahdentunut. Mitoosin yhteydessä se pakkaantuu kromosomeiksi, joissa on kaksi kromatidia Sisarkromatidit erkanevat toisistaan tumasukkulan vetäminä, ja kulkeutuvat solun eri päihin Kromosomien lukumäärä ja muoto on lajityypillinen ominaisuus Useimmissa soluissa kutakin kromosomia on kaksi kappaletta (diploidi solu) Sukusoluissa kutakin kromosomia on vain yksi (haploidi solu) DNA (joka on negatiivisesti varautunut) kiertyy positiivisesti varattujen histoni-nimisten proteiinien ympärille n. 1:1 Edelleen histoni-dna-kompleksi organisoituu nukleosomeiksi ja kromatiinikuiduiksi Ihmissolussa on 2 metriä DNA:ta, mutta kromosomien yhteenlaskettu pituus on vain 200 µm Mitokondriot tuottavat suurimman osan aerobisen solun energiasta Mitokondriot ovat kaksinkertaisesta kalvosta muodostuvia organelleja Niiden muoto vaihtelee suuresti, mutta tyypillinen halkaisija on 1 µm Mitokondrion ulkokalvo on tasainen, mutta sisäkalvo muodostaa cristoiksi kutsuttuja poimuja, jotka lisäävät sen pinta-alaa Sisäkalvon sisäpuolella olevaa, runsaasti proteiineja ja aineenvaihdunnan välituotteita sisältävää ainesta kutsutaan matriksiksi 8
Mitokondriot hapettavat ravintoaineita ilman hapen avulla, tuottaen hiilidioksidia, vettä ja ATP:tä Kloroplastit muuttavat aurinkoenergiaa kemialliseksi energiaksi Kasvit sisältävät mitokondrioiden ohella kloroplasteja Kloroplastit talteenottavat auringon energiaa ja tuottavat ATP:tä solun energiaksi Pelkistyneitä hiiliyhdisteitä CO 2 :sta appea Kloroplastien (ja kasvien) vihreä väri tulee klorofyllistä, joka on tärkein fotosynteettinen pigmentti Fotosynteesi tapahtuu tylakoideiksi kutsutuissa kalvorakenteissa Solun tukiranka (cytoskeleton) tukee, järjestää ja liikuttaa Eukaryoottisolussa on useista erilaisista proteiinikuiduista koostuva sisäinen tukiverkosto Tukirankaan kuuluu kolmentyyppisiä kuituja Mikrotubulukset, 25 nm Välikokoiset säikeet (intermediate filaments), 10 nm Mikrofilamentit (actin filaments) 5-9 nm Kukin tukikuiduista koostuu samankaltaisista proteiinialayksiköistä, joista kasaantuu dynaamisesti tasapaksuja kuituja Mikrofilamentit kasaantuvat aktiini-nimisestä proteiinista (myös lihassäikeissä) Fodriini ja filamiini proteiinit sitovat mikrofilamentteja toisiinsa Myosiiniproteiini mahdollistaa kohteiden, esim. soluorganellien liikuttamisen mikrofilamentteja pitkin Mikrotubulukset koostuvat tubuliiniyksiköistä Dyneiini ja kinesiini mahdollistavat liikkeen mikrotubuluksia pitkin Välikokoiset säikeet Rakenteeltaan ja toiminnaltaan hyvin vaihteleva ryhmä, tehtävänä tukea solun rakenteita ja lisätä solun kestävyyttä ulkoisia voimia vastaan Esim. Keratiinit toimivat hiusten ja kynsien muodostumisessa Vimentiini muodostaa sytoplasmaan pysyviä säikeitä, jotka tukevat solun muotoa Sytoplasma on ruuhkainen, järjestäytynyt ja dynaaminen Monisoluiset organismit ja solujen erilaistuminen Monisoluisilla organismeilla solut ovat erilaistuneita Kaikissa soluissa on kuitenkin sama genomi! 9
Eri soluissa genomista ilmennetään eri geenejä Erilaistumiseen liittyy geneettinen ohjelma Solut ovat yhteydessä toisiinsa erilaisilla liitoksilla - tiukka liitos -desmosomi -aukkoliitos (gap junction) -plasmodesmit 3. Biomolekyyleistä yleensä Solu koostuu 99 %:sti alkuaineista C,, N ja O pienikokoisia, atomipainot 12, 1, 14, 16 eliöissä alkuaineiden osuus hyvin erilainen, kuin maankuoressa keskimäärin => nämä 4 ovat valikoituneet ominaisuuksiensa perusteella kykenevät muodostamaan stabiileja yhdisteitä, joissa atomien välillä kovalenttiset sidokset erityisesti kykenevät (varsinkin C) muodostamaan molekyyliketjuja kovalenttisen sidoksen energia 15-170 kcal/mol keskimääräinen terminen energia 37 C:ssa 0.6 kcal/mol => kovalenttiset sidokset täysin stabiileja Stereoisomeria Kun atomiin (yleensä hiileen) on sitoutunut neljä erilaista ryhmää, muodostuu kiraalinen keskus; ryhmät voivat olla sitoutuneina kahdella eri tavalla, joita kutsutaan stereoisomeereiksi Stereoisomeerit käyttäytyvät yleensä eri tavalla biologisissa systeemeissä, ja biomolekyylit ovat tyypillisesti vain yhtä stereoisomeeriä Molekyylit, jotka ovat toistensa peilikuvia, ovat enantiomeereja Stereoisomeerit, jotka eivät ole peilikuvia, ovat diastereomeereja apetus-pelkistysreaktiot Solut saavat energiaa biomolekyylejä hapettamalla. Atomi hapettuu menettäessään elektroneja. Yleensä biologisessa hapettumisessa atomi menettää elektronien ohella siihen sitoutuneita vetyjä. 10
4. Vesi vanhin voitehista Vedellä on hyvin poikkeukselliset ominaisuudet, jotka enimmäkseen johtuvat vesimolekyylien välisistä vetysidoksista ja vesiatomin dipoliluonteesta Vetysidos syntyy, kun elektronegatiiviseen atomiin kovalenttisesti sitoutunut vety tulee lähelle toista elektronegatiivista atomia Tyypillisen vetysidoksen voimakkuus on n. 1/20 kovalenttisen sidoksen voimakkuudesta Vetysidoksella on voimakas suuntavaikutus: elektronegatiivisten atomien ja vetyatomien on oltava samalla suoralla, jotta sidos olisi voimakkaimmillaan Biologisissa makromolekyyleissä vetysidokset ovat hyvin tärkeitä, ja niitä muodostuu happi- ja typpiatomien välille, kun ko. välillä on jommankumman atomin kovalenttisesti sitoma vetyatomi Vetysidoksista muodostuvan verkoston ansiosta vedellä on nesteeksi epätavallisen paljon sisäistä rakennetta Vesimolekyylit vuorovaikuttavat liuenneiden aineiden kanssa Veteen liukenevat hyvin yhdisteet, joissa on polaarisia tai varattuja ryhmiä => pystyvät osallistumaan veden rakenteeseen. Tällaiset yhdisteet ovat hydrofiilisiä Suolat, kuten NaCl dissosioituvat vedessä ioneiksi. Vesimolekyylit ympäröivät (hydratoivat) ionit Ei-polaariset yhdisteet häiritsevät veden rakennetta => hydrofobisia Vesi pakottaa hydrofobiset aineet yhteen Ns. ei-kovalenttiset, heikot vuorovaikutukset molekyylien välillä Makromolekyyliä pitävät yhdessä vahvat kovalenttiset sidokset, mutta makromolekyylit liittyvät toisiinsa heikommilla nonkovalenttisilla vuorovaikutuksilla: ionisidokset vetysidokset van der Waalsin sidokset hydrofobiset vuorovaikutukset (vettähylkivien molekyylien yhteenliittyminen) 11
Nonkovalenttiset vuorovaikutukset pystyvät pitämään makromolekyylit yhdessä lämpöliikkeestä huolimatta, vain jos niitä on monta => makromolekyylien on oltava komplementaarisia Veden kolligatiiviset ominaisuudet Kun veteen (tai mihin tahansa yhdestä molekyylilajista koostuvaan nesteeseen) on liuenneena toista ainetta, tietyt fysikokemialliset ominaisuudet muuttuvat tavalla, joka riippuu yksinomaan liuenneiden hiukkasten (molekyylien, ionien ) lukumäärästä. Nämä ovat höyrynpaine kiehumispiste sulamispiste osmoottinen paine ja niitä kutsutaan kolligatiiviksi ominaisuuksiksi Kun kahta vesiliuosta erottaa kalvo, joka ei läpäise liuenneita aineita, mutta läpäisee vettä (kuten solukalvo), vettä siirtyy kalvon läpi, kunnes liuoksen osmolariteetti kalvon molemmilla puolilla on sama (liuokset isotoniset) vrt. hypertoninen ja hypotoninen liuos Veden ionisoituminen Puhtaassakin vedessä tapahtuu vähäisessä määrin autoprotolyysiä: 2 O + + O Vetyioni (protoni) esiintyy normaalisti hydroniumionina 3 O + ydronium- ja hydroksidi-ionilla on epätavallisen suuri liikkuvuus vedessä johtuen proton hopping -ilmiöstä Autoprotolyysireaktion tasapainovakio on Keq = [ + ][ O [ 2O] ] Koska veden konsentraatio on käytännössä vakio, voidaan yksinkertaistaa: K w = [ + ][O - ] = 1,0 * 10 14 M 2 Puhtaassa vedessä [ + ] = [O - ] = 10 7 M Merkitään p = -log[ + ] 12
Puhtaan veden p = 7 p + po =14 eikon hapon (tai emäksen) vesiliuoksessa happo dissosioituu vain osittain, johon pätee tasapainoyhtälö: K eq = [ + ][A ]/[A] = K a pk a = -logk a Titrattaessa heikko happo vahvalla emäksellä havaitaan, että kun happo on puoliksi titrattu, p = pk a eikon hapon ja sitä vastaavan emäksen seos vastustaa p:n muutosta, ja sitä kutsutaan puskuriliuokseksi Jos halutaan laskea, mihin p:hon tietty puskuri puskuroi, tarvitaan enderson asselbalchin yhtälöä: p = pka + log [A ]/[A] 5. Aminohapot, peptidit ja proteiinit Aminohapot Proteiinit rakentuvat 20:sta α-aminohaposta 20 ns. proteiiniaminohappoa ovat universaaleja, kaikki maapallon eliöt käyttävät proteiineissaan niitä Näissä α-hiili (2-hiili) sitoo sekä karboksyyli- että aminoryhmää ei-ionisoituneessa muodossa: R C COO N 2 p7:ssä aminohappo esiintyy dipolaarisena ionina (zwitterion) R C COO - N 3 + Glysiiniä lukuun ottamatta α-hiili on kiraalinen keskus. Proteiiniaminohapot ovat L-muotoa 13
D ja L kuvaavat konfiguraatioita vertaamalla niitä D- ja L-glyseraldehydiin Aminohappojen funktion ratkaisee sivuketju R, jonka ominaisuuksien mukaan aminohapot myös ryhmitellään. Nonpolaariset, alifaattiset sivuketjut Glysiini, Gly (G) Glysiini on ainoa ei-kiraalinen aminohappo, jonka merkittävin ominaisuus on sen pieni koko. Sitä esiintyy proteiineissa mutkakohdissa ja ahtaissa paikoissa. Alaniini, Ala (A) Jossain mielessä ominaisuudeton aminohappo Valiini, Val (V) Leusiini, Leu (L) Isoleusiini, Ile (I) Ns. haaraketjuiset aminohapot ovat proteiineissa usein vedettömissä sisäosissa. 14
Metioniini, Met (M) Toinen rikkiä sisältävistä aminohapoista. Useimmissa tapauksissa proteiinin translaation aloittava aminohappo. Aromaattiset sivuketjut Fenyylialaniini, Phe (F) Ph=F Tryptofaani, Trp (W) isoin kirjain Tyrosiini, Tyr (Y) tyrosiini Aromaattiset aminohapot ovat hydrofobisia ja isoja, useimmiten proteiinien sisäosissa. Tyrosiinilla on myös fenolinen hydroksyyli, joka voi osallistua reaktioihin. Negatiivisesti varatut (happamat) sivuketjut O C 2 C C C O Asparagiinihappo, Asp (D) N 2 niinkuin Carboksyylihappo O O C:stä seuraava, C Glutamiinihappo Glu (E) koska pitempi hiiliketju D:stä seuraava, appamat sivuketjut vaikuttavat proteiinin varaukseen, ja osallistuvat reaktioihin. Suomen kielellä käytetään usein suolan nimeä: aspartaatti ja glutamaatti. 15
Polaariset, varauksettomat sivuketjut Asparagiini, Asn (N) asparagiini Glutamiini, Gln (Q)??? Aspartaatin ja glutamaatin amidit. Ei varausta. Seriini, Ser (S) ydroksialaniini. Usein katalyysiin osallistuva aminohappo Treoniini, Thr (T) Kysteiini, Cys (C) merkaptoseriini. Tärkeä rikkisiltojen muodostajana proteiineissa. Proliini, Pro (P) Ainoa aminohapoista, joka ei ole aminohappo vaan iminohappo. Ei pysty proteiinissa toimimaan vetysidoksen donorina, joten rikkoo sekundäärirakenteita, erityisesti α-kierrettä. Positiivisesti varatut (emäksiset) sivuketjut Lysiini, Lys (K) L:stä seuraava 16
Arginiini, Arg (R) arginiini Arginiinissa oleva guanidiiniryhmä on voimakas emäs. istidiini, is () istidiini on heikko emäs, jonka pk on lähellä neutraalia, joten se pystyy proteiineissa toimimaan sekä happona, että emäksenä. Se myös usein sitoo metalli-ioneja proteiineissa. Aminohappojen optiset ominaisuudet Aromaattiset aminohapot absorboivat valoa, eniten tryptofaani Proteiini voidaan havaita (ja sen konsentraatio mitata) 280 nm aallonpituudella; kvantitatiivisen tuloksen saamiseksi täytyy tietää proteiinin aromaattisten aminohappojen lukumäärä Aminohappojen happo-emäsominaisuudet Molekyyliä, jossa on sekä happamia, että emäksisiä ryhmiä, sanotaan amfoteeriseksi tai amfolyytiksi. Titrattaessa neutraalisivuketjuista aminohappoa, esim. glysiiniä, havaitaan kaksi puskurointipistettä (=pk 1 ja pk 2 ) Niiden välissä on piste, jossa molekyylin nettovaraus =0, isoelektrinen piste. Aminohapossa sekä karboksyyli- että aminoryhmän pk-arvot ovat tavanomaista alhaisemmat johtuen ryhmien vaikutuksesta toisiinsa. Aminohapoilla, joiden sivuketjussa on titrautuva ryhmä, havaitaan kolme puskurointipistettä. Isoelektristä pistettä ei saada suoraan pk-arvojen keskiarvona. Peptidit ja proteiinit Peptidit ovat aminohappojen muodostamia ketjuja Kaksi aminohappoa voi liittyä yhteen toisen karboksyyli- ja toisen aminoryhmän muodostamalla peptidisidoksella, jolloin samalla eliminoituu vettä Peptidisidoksen muodostumisen tasapaino on voimakkaasti lähtöaineiden puolella, joten karboksyyliryhmä täytyy kemiallisesti aktivoida, jotta reaktio tapahtuisi 17
Koska peptidillä on edelleen amino- ja karboksyyliryhmä, voidaan aminohappoja liittää lisää rajoittamattomasti. Lyhyt peptidi on oligopeptidi, pitkä peptidi on polypeptidi, ja tarpeeksi pitkää polypeptidiä nimitetään myös proteiiniksi. Peptidin aminohappojärjestys ilmoitetaan alkaen aminopäästä, eli siitä aminohaposta, jolla on vapaa α-aminoryhmä. Toinen pää on vastaavasti karboksyylipää. Peptidien happo-emäsominaisuudet Peptidisidosten muodostuessa niihin osallistuvat amino- ja karboksyyliryhmät häviävät. Peptidissä ionisoituvia ryhmiä ovat vain amino- ja karboksipää sekä sivuketjujen ionisoituvat ryhmät Ympäristö saattaa muuttaa varsinkin polypeptideissä sivuketjujen pk-arvoja Peptidillekin on olemassa isoelektrinen piste, jota käytetään hyväksi puhdistuksessa (p:n ollessa pi:n yläpuolella peptidi on negatiivisesti varautunut, ja päinvastoin) Biologisesti aktiivisten peptidien ja polypeptidin koko vaihtelee suunnattomasti (3 26000 aminohappoa) Proteiini voi muodostua yhdestä tai useammasta polypeptidistä (oligomeerirakenne) Proteiineissa esiintyy myös muita ryhmiä, kuin aminohappoja -lipidejä -hiilihydraatteja -fosfaattiryhmiä -hemi (rautaporfyriini) -flaviininukleotidit -metalli-ionit Prosteettinen ryhmä vertaa koentsyymi Proteiinin rakenteen järjestäytymistasot Proteiinin rakennetta kuvataan neljällä eri tasolla Primäärirakenne on proteiinin aminohappojärjestys Sekundäärirakenne tarkoittaa eräitä erityisen stabiileja rakenteita (α-kierre ja β-levy) joista suurin osa useimmista proteiineista koostuu Tertiäärirakenne tarkoittaa yhden polypeptidin koko kolmiulotteista rakennetta 18
Kvaternäärirakenne tarkoittaa sitä, miten useasta polypeptidistä koostuva proteiini rakentuu osistaan Proteiinien puhdistus- ja tutkimusmenetelmät Tärkeimmät proteiinien puhdistusmenetelmät perustuvat kokoon varaukseen ja hydrofobisuuteen biologiseen aktiivisuuteen Kokoon perustuvat kalvosuodatusmenetelmät ja geelisuodatuskromatografia. Varaukseen ja hydrofobisuuteen perustuvat saostusmenetelmät (esim. ammoniumsulfaattisaostus) ja adsorptiokromatografia. Biologiseen aktiivisuuteen perustuvat erilaiset affiniteettikromatografiamenetelmät. Jotta proteiini voitaisiin puhdistaa, on oltava jokin keino mitata sen määrää -entsyymiaktiivisuus -sitoutuminen johonkin kohdemolekyyliin -antibodin (vasta-aineen) sitominen - Proteiinien puhdistus Proteiinit ryhmänä (ainakin liukoiset proteiinit) on suhteellisen helppo erottaa muista solun molekyyleistä, mutta varsinainen ongelma tulee siinä vaiheessa, kun on erotettava yksi proteiini muista. Puhdistusprosessi on johdonmukaista jakaa vaiheisiin: raakauutteen teko jossa solut hajotetaan, ei-liukoiset epäpuhtaudet poistetaan ja proteiiniliuos esikäsitellään puhdistusta varten pääpuhdistus jossa käytetään mahdollisimman harvoja, tehokkaita puhdistusmenetelmiä, jotta suurin osa epäpuhtauksista saadaan poistettua loppupuhdistus (polishing, kiillotus ) jossa preparaatin puhtaus nostetaan tarvittavalle tasolle Pääosa puhdistuksessa on nykyään erilaisilla kromatografisilla menetelmillä: ioninvaihtokromatografia (anionin- tai kationinvaihto): proteiinit tarttuvat vastakkaisen varauksen omaavaan kiintoaineeseen ja saadaan irtoamaan siitä suolakonsentraatiota nostamalla. Eri p:ssa eri proteiinit irtoavat luonteenomaisessa suolakonsentraatiossa. Ioninvaihtokromatografia edellyttää alhaista suolapitoisuutta: näyte voi olla laimea, koska se konsentroituu ioninvaihdossa 19
hydrofobinen interaktiokromatografia (IC): proteiinit tarttuvat hydrofobisilla osillaan (esim. aktiivisen keskuksen tasku ) kiintoaineeseen kiinnitettyihin hydrofobisiin ryhmiin korkeassa suolapitoisuudessa, ja irtoavat suolapitoisuutta laskettaessa affiniteettikromatografia perustuu proteiinin voimakkaaseen affiniteettiin ligandinsa kanssa. Esim. substraattianalogi tai muu spesifisesti proteiiniin sitoutuva molekyyli on liitetty kiinteään kantajaan; haluttu proteiini tarttuu siihen kiinni. Irti se saadaan lisäämällä ligandia liukoisessa muodossa tai esim. reversiibelisti denaturoivaa kemikaalia lisäämällä tavallisin viimeinen puhdistusvaihe on proteiinit koon mukaan erotteleva geelisuodatus eli geeliekskluusiokromatografia Proteiinien analysointi Tavallisin proteiinien analyysimenetelmä on elektroforeesi. Siinä proteiinit eroavat sähkökentässä kulkemalla eri nopeuksilla (pi:nsä yläpuolella proteiinit ovat negatiivisesti varattuja ja kulkevat kohti positiivista napaa ) Denaturoimalla proteiinit natriumdodekyylisulfaatilla (SDS) saadaan lähes kaikki proteiinit kulkeutumaan molekyylipainonsa mukaisella nopeudella, jolloin niiden molekyylipaino saadaan selville. Useammasta polypeptidistä koostuvat proteiinit hajoavat alayksiköikseen Isoelektrisessä fokusoinnissa käytetään erikoispuskuria (amfolyyttiseos), joka muodostaa p-gradientin. Kukin proteiini liikkuu, kunnes on pi:tään vastaavassa p:ssa (varaus, ja liikkuvuus sähkökentässä =0) Kaksiulotteisessa elektroforeesissa suoritetaan ensin isoelektrinen fokusointi, ja sitten SDS-geelielektroforeesi. Näin saadaan selville proteiinin pi ja molekyylipaino. Polypeptidin aminohappojärjestys ja sen selvittäminen Proteiinin aminohappojärjestys määrää proteiinin kolmiulotteisen rakenteen ja toiminnan Monien perinnöllisten sairauksien osalta geneettinen vika on voitu paikantaa yhden aminohapon vaihtumiseen yhdessä elimistön proteiinissa Sirppisoluanemia oli ensimmäinen perinnöllinen sairaus, jonka osoitettiin johtuvan aminohappomuutoksesta (hemoglobiinin β-ketjussa Glu-6 vaihtunut valiiniksi) Eri lajeilla samat proteiinit eroavat toisistaan aminohappojärjestykseltään; aminohappojärjestysten perusteella voidaan laatia sukupuu 20
Peptidin aminohappojärjestys voidaan määrittää ns. Edman-hajotuksella (Edman degradation), jossa peptidin aminopäästä saadaan joka syklillä yksi aminohappo irtoamaan fenyylitiohydantoini(pt-)-johdannaisena PT-aminohapot tunnistetaan nestekromatografialla (PLC) ajotukseen ja tunnistukseen käytetään nykyään automaattilaitteita, joiden herkkyys riittää polyakryyliamidigeeliltä eristettyjen bändien sekvenointiin (muutama µg) Laitteella pystytään määrittämään N 2 -päästä max. 50 aminohappoa Suurempien proteiinien aminohappojärjestys on määritettävä palasina. Disulfidisidokset katkaistaan pelkistämällä tai asetyloimalla Polypeptidi voidaan pilkkoa esim. spesifisten proteaasien tai kemikaalien, esimerkiksi syanogeenibromidin, avulla. Käytettäessä useampaa eri pilkkomistapaa saadaan koko sekvenssi koottua päällekkäisyyksien avulla Aminohapposekvenssi voidaan myös saada selville sekvensoimalla vastaava geeni (nykyään tavallisin!) massaspektrometrialla (pääasiassa proteiinitäplien tunnistukseen) Aminohapposekvenssi antaa runsaasti tietoa proteiinin rakenteesta ja toiminnasta. Tieto saadaan vertailulla rakenteeltaan ja funktioltaan tunnettujen proteiinien kanssa. Sekvenssiltään samankaltaiset proteiinit muodostavat proteiiniperheitä Pieniä peptidejä ja proteiineja voidaan valmistaa synteettisesti Ns. Merrifieldin synteesissä peptidi rakennetaan polystyreenihelmen pinnalle aminohappo kerrallaan käyttäen aktivoituja ja suojattuja aminohappoja. Syklit perustuvat siihen, että peptidisidoksen muodostuminen, ja suojaryhmien poisto tapahtuvat eri olosuhteissa Lopuksi peptidi irrotetaan hartsista hydrolyyttisesti ja puhdistetaan kromatografisesti Peptidisynteesiinkin on automaattisia laitteita saatavissa; lisäksi peptidisynteesiä voi tilata palveluna Pieniä biologisesti aktiivisia peptidejä ja niiden variantteja voidaan suoraan syntetisoida tutkimusta varten 6. Proteiinien kolmiulotteinen rakenne 21
Puhdistetut proteiinit voidaan saada kiteytymään. Tämä osoittaa, että kaikki samaa proteiinia olevat molekyylit ovat kolmiulotteiselta rakenteeltaan samanlaisia. Molekyylin atomien kolmiulotteista sijoittumista toistensa suhteen nimitetään konformaatioksi. Proteiinin stabiili konformaatio (natiivi konformaatio) on se, jolla on pienin vapaa energia G Purkautuneen (denaturoituneen) ja natiivin konformaation vapaan energian ero on suhteellisen pieni, vain 20-65 kj/mol vrt. kovalenttinen sidos 200-460 kj/mol, ei-kovalenttinen sidos 4-30 kj/mol Natiivin konformaation määräävät lukuisat ei-kovalenttiset vuorovaikutukset ydrofobiset aminohapot muodostavat proteiinin sisuksen, joka ei ole kontaktissa veteen Proteiinin sisällä muodostuu mahdollisimman paljon vetysidoksia Peptidisidos on tasomainen Peptidisidoksessa C-N sidoksella on osittainen kaksoissidosluonne. Tämän seurauksena kiertyminen sidoksen ympäri on estynyt, ja sidos on tasomainen Peptidiketju voi kiertyä ainoastaan α-hiilen muodostamien C-N ja C-C sidosten ympäri Kiertokulmaa C α -N sidoksen ympäri merkitään φ (fii). Kiertokulmaa C α -C sidoksen ympäri merkitään ψ (psii) Proteiinin pääketjun konformaatio on periaatteessa täysin tunnettu, jos kaikkien aminohappojen φ ja ψ -kulmien arvot tunnetaan Peptidiketjun ja sivuryhmien steeristen esteiden vuoksi kaikki φ ja ψ -kulmien yhdistelmät eivät ole mahdollisia. Kuvaajaa, jossa on esitetty kunkin aminohappotähteen φ-kulma x-akselilla, ja ψ-kulma y-akselilla kutsutaan Ramachandran in kuvaajaksi. Kullakin sekundäärirakenteella on oma paikkansa Ramachandranin kuvaajassa; lisäksi kuvaaja toimii proteiinirakenteen selvittämisessä laaduntarkkailuna. 22
Oheisessa kuvaajassa on erään todellisen proteiinin (lysotsyymin) Ramachandran in kuvaaja. Sinisellä merkityt alueet ovat ns. sallittuja alueita joilla esiintyvillä φ ja ψ - kulmien arvoilla useimmat aminohapot mahtuvat esiintymään. Rasteilla on merkitty muut aminohapot, neliöillä glysiinit. Proteiinin sekundäärirakenteet Sekundäärirakenteet ovat säännöllisiä ja yleisiä rakenteita proteiineissa. Tärkeimmät ovat α-kierre ja β-levy Sekundäärirakenteita stabiloivat peptidisidosten väliset vetysidokset. α-kierre (α-helix) α-kierre syntyy, kun peptidiketju kiertyy spiraaliksi siten, että kunkin aminohapon N muodostaa vetysidoksen neljän aminohapon päässä olevan C=O ryhmän kanssa kierteen nousu on 5,4 Å (0,54 nm), 3,6 aminohappotähdettä 23
α-kierteeseen osallistuvien aminohappojen φ-kulma on -60 ja ψ-kulma -45-50 α-kierre on teoriassa mahdollinen sekä oikea- että vasenkätisenä, mutta vain oikeakätistä esiintyy luonnossa Proliini ei sovi α-kierteeseen, eikä myöskään pysty muodostamaan stabilointiin tarvittavaa vetysidosta Myös glysiini on harvinainen α-kierteessä taipuisuutensa takia Negatiivisesti varatut aminohapot kierteen aminopäässä, ja positiivisesti varatut kierteen karboksipäässä stabiloivat kierrettä β-levy (β-sheet) β-levyssä vierekkäiset, suhteellisen suorat polypeptidiketjut sitoutuvat toisiinsa vetysidoksin. β-levy voi olla samansuuntainen (parallel) tai vastakkaissuuntainen (antiparallel) Lähekkäin oleviin β-levyihin mahtuvat parhaiten pienisivuketjuiset aminohapot (Gly ja Ala) β-käännös (β-turn) Vastakkaissuuntaissa β-levyssä nauhojen välissä on usein β-käännös 24
Ketju kääntyy 180 neljän aminohapon matkalla, joista 2 keskimmäistä eivät osallistu vetysidoksiin Gly ja Pro ovat tavallisia β-käännöksissä Proliinin harvinainen cis-konformaatio esiintyy β-käännöksissä Sekundäärirakenteilla on luonteenomaiset kiertokulmat ja aminohappokoostumus Proteiinien tertiääri- ja kvaternäärirakenteet Kuitumaiset ja globulaariset proteiinit Kuitumaiset proteiinit ovat rakenteellisia komponentteja Kuitumaiset proteiinit ovat liukenemattomia sekä kokonsa, että hydrofobisuutensa takia α-keratiini (hiukset, villa, kynnet, sarvikuonon sarvi ) rakentuu kahdesta toistensa ympärille kiertyvästä α-kierteestä (coiled coil rakenne) Tällaisista yksiköistä koostuu protofilamentteja ja edelleen protofibrillejä Kohdassa, jossa α-kierteet ovat kosketuksissa, on hydrofobisia aminohappoja (Ala, Val, Leu ) Keratiinin alayksikköjen välillä on disulfidisidoksia Kollageenissa on poikkeuksellinen kolmen aminohappoketjun muodostama kierteinen rakenne collagen triple helix α-kierrettä loivempaa kierrettä kutsutaan α-ketjuksi 25
Kollageeni koostuu suurimmaksi osaksi aminohapoista Gly, Ala, Pro ja ypro (hydroksiproliini). Glysiinit ovat kolmoiskierteen sisäpuolella Kollageeni on poikkipinta-alaa kohden yhtä lujaa, kuin teräs. Kollageenissa ketjujen välille tehdään kovalenttisia ristisidoksia Nisäkkäillä on n. 30 erityyppistä kollageenia Perinnölliset häiriöt kollageenin rakenteessa liittyvät eräisiin sidekudossairauksiin. Fibroiini koostuu tiiviisti pakkautuneista antiparalleelisista β-levykerroksista Silkkiperhoset ja hämähäkit tuottavat tätä venymätöntä ja äärimmäisen lujaa kuitua. Globulaariset (pallomaiset) proteiinit Globulaarisessa proteiinissa pitkä polypeptidiketju laskostuu kompaktiksi rakenteeksi Myoglobiini - ensimmäinen kolmiulotteiselta rakenteeltaan tunnettu proteiini Myoglobiini on lihaksen proteiini, jonka biologinen tehtävä on ilmeisesti toimia hapen puskurivarastona. Myoglobiini oli ensimmäinen proteiini, jonka kolmiulotteinen rakenne selvitettiin röntgenkristallografialla. Molekyylipaino 16700, 153 aminohappotähdettä Prosteettisena ryhmänä hemi, rauta-porfyriinikompleksi Kaskelotin myoglobiini kiteytyy helposti ja sitä oli (valaanpyynnin ollessa vielä sallittua) runsaasti saatavissa. 26
Myoglobiini on hyvin kompakti proteiini; 45 X 35 X 25 Å. Rakenne on n. 75%:sesti α-heliksiä. eliksejä on proteiinissa 8. Kolme helikseistä loppuu proliiniin (joka ei voi osallistua α-heliksiä ylläpitäviin peptidiketjun sisäisiin vetysidoksiin). Proteiinin sisäosa koostuu lähes kokonaan ei-polaarisista aminohappopäätteistä, ja siellä on hyvin vähän tyhjää tilaa. Ainoat polaariset aminohapot molekyylin sisäosissa ovat 2 sitoutumiskeskukseen kuuluvaa histidiiniä. emi on sitoutuneena hydrofobiseen taskuun Pelkkä hemi vesiliuoksessa ei sido happea, koska happi hapettaa sen raudan ferromuotoon reaktiossa, johon liittyy kahden hemin ja happimolekyylin muodostama hemi-happi-hemi -sandwich-kompleksi. emin sitoutuminen myoglobiiniin estää tällaisen hapettumisen. Proteiinin kolmiulotteisen rakenteen määrittäminen Vaikka aminohapposekvenssi määrää kolmiulotteisen rakenteen, emme pysty sitä laskemaan (vielä? ns. folding problem ) Kokeellisesti kolmiulotteinen rakenne määritetään röntgendiffraktiolla tai NMR:llä ( ydinmagneettinen resonanssi ) Röntgendiffraktiossa proteiini täytyy saada kiteytymään, mikä on usein aikaavievää, eikä kaikille proteiineille onnistu lainkaan Proteiinikiteessä on runsaasti vettä, joten rakenne ei paljonkaan poikkea rakenteesta vapaassa nesteessä. 27
Kiteeseen kohdistetaan yksitaajuinen röntgen- tai synkrotronisäteily, aallonpituudeltaan 0.7 1.5 Å (samaa suuruusluokkaa, kuin atomien välinen etäisyys molekyylissä) Röntgensäteily siroaa kiteestä ja muodostaa diffraktiokuvion Ns. Fourier-analyysillä saadaan diffraktiokuviosta laskettua kolmiulotteinen ns. elektronitiheyskartta, johon mallinnusohjelmalla sovitetaan proteiinin rakennemalli Yksi diffraktiokuvio ei riitä, vaan ns. vaiheongelman ratkaiseminen edellyttää, että saadaan myös aikaan johdannainen, jossa proteiinikiteessä on spesifisessä kohdassa proteiinia raskasmetalliatomi tai atomeja Pienten proteiinien tai proteiinidomeenien rakenne voidaan selvittää myös NMR-tekniikalla NMR tuottaa tietoa spinin omaavien atomien ( 1, 13 C) sijainnista toistensa suhteen. 2-ulotteinen NMR tuottaa tietoa atomien keskinäisistä etäisyyksistä, joiden perusteella voidaan ratkaista 3-ulotteinen rakenne NMR-tekniikka tuottaa yleensä joukon lähisukuisia rakenteita, joiden voi sanoa olevan yhtä hyviä likiarvoja todellisesta rakenteesta NMR-rakenne on aito liuosrakenne. Kun samojen proteiinien rakenteita on selvitetty röntgendiffraktiolla ja NMR:llä, on havaittu niiden vastaavan hyvin toisiaan. Jos aminohapposekvenssiltään samankaltaisen proteiinin kolmiulotteinen rakenne tunnetaan, voidaan myös proteiinimallituksella (protein modelling) tehdä suhteellisen luotettavia johtopäätöksiä Muita pienten proteiinien tertiäärirakenteita 28
Sytokromi C on mitokondrion hengitysketjun osa, mp. 12400, 100 ah emi prostettisena ryhmänä, kuten myoglobiinissa α-kierrettä vain 39 % Lysotsyymi on bakteerien soluseinää hajottava entsyymi, jota on runsaasti mm. kananmunissa ja kyynelnesteessä α-kierrettä 40 %, β-levyä 12 % Ribonukleaasi on haiman erittämä ruuansulatusentsyymi, joka hajottaa RNA:ta α-kierrettä 26 %, β-levyä 35 % 29
Pienissä proteiineissa on usein kovalenttisia sidoksia vakauttamassa rakennetta (cyt C:ssä hemi kovalenttisesti sitoutunut); erittyvissä proteiineissa rikkisiltoja Proteiineissa usein toistuvat rakenteet Proteiini on helpompi hahmottaa, jos sitä ajatellaan sekundäärirakenneelementteinä ja niitä yhdistävinä jaksoina (RdmC-proteiinin topologiakaavio) Supersekundäärirakenteet, motiivit (motifs), foldit (folds) ovat usein toistuvia sekundäärirakenteiden yhdistelmiä 30
airpin-β (RdmC:n β-nauhat β1 ja β2) β-α-β -silmukka (RdmC:n β5, αc ja β6) Monet isommat polypeptidit muodostavat useampia globulaarisia alayksikköjä, joita sanotaan domeeneiksi (domains) Usein domeeni säilyttää kolmiulotteisen rakenteensa silloinkin, kun se esim. proteolyyttisesti katkaistaan irralleen muusta proteiinista. Usein monidomeenisessa proteiinissa kukin biologinen funktio on yhden domeenin toteuttama. Proteiinissa voi olla esimerkiksi substraatin tunnistava domeeni ja katalyyttinen domeeni. Motiivien yhdistelminä saadaan suurempia kokonaisuuksia. Esim. βαβ motiiveista voi rakentua TIM-tynnyri. Proteiinien kolmiulotteisten rakenteiden luokittelu Proteiinirakenteiden luokittelu perustuu sekundäärirakenteisiin, ja niiden muodostamiin motiiveihin SCOP (Structural Classification of Proteins) tietokanta: neljä pääluokkaa, all α, all β α/β ja α + β Proteiinit, joilla on merkittävää sekvenssin samankaltaisuutta, muodostavat proteiiniperheen. Proteiiniperheen jäsenet ovat evolutionaalisesti yhteistä alkuperää. Globulaaristen proteiinien kvaternäärirakenteet Proteiinin koostumisella useista alayksiköistä saadaan etua -kullekin alayksikölle voi olla oma geeninsä, joita säädellään tilanteen mukaan, esimerkki: sikiöaikainen hemoglobiini Varhaisella sikiöllä α-alayksikön tilalla on ζ (zeta) ja β-alayksikön tilalla ensin ε, sitten γ joka vasta syntymän jälkeen korvautuu β:lla 31
-alayksiköt voivat liittyä yhteen (assosioitua) ja irrota (dissosioitua) tilanteen mukaan -assosiaatiossa voidaan eliminoida huonot alayksiköt; virheiden korjaus Protomeeri monialayksikköisen proteiinin yksittäinen osa Oligomeeri muutamista protomeereistä koostuva proteiini Multimeeri lukuisista, jopa sadoista protomeereistä koostuva proteiini emoglobiini koostuu neljästä (2 α, 2 β) myoglobiinin kaltaisesta happea sitovasta alayksiköstä. Samanlaisista alayksiköistä koostuvalla proteiinilla voi olla joko kiertosymmetria (rotational symmetry) tai kierresymmetria (helical symmetry) Kiertosymmetria voi olla syklistä tai dihedraalista emoglobiinin kaksi αβ-paria ovat toistensa suhteen kiertosymmetrisessa C 2 asetelmassa Virusten kuorissa löytyy monimutkaisempia rakennelmia, esim ikosahedraalinen (20-tahokas) Polypeptidiketjun kokoa rajoittaa geenin koko, ja proteiinisynteesikoneiston virhefrekvenssi (n. 1/10 000 ah). Yleensä yli 100 000 daltonin proteiini koostuu useista alayksiköistä Proteiinien denaturaatio ja laskostuminen (folding) Koska proteiinien rakennetta stabiloivat ei-kovalenttiset sidokset, olosuhteet ja kemikaalit, jotka häiritsevät niitä, johtavat proteiinin rakenteen hajoamiseen, denaturaatioon (Denaturoituessa polypeptidiketju siis pysyy ehjänä) Lämpötilan nosto yleensä johtaa proteiinin denaturaatioon. Denaturaatio voi tapahtua äkillisesti, kun ylitetään kynnyslämpötila, mikä osoittaa, että kyseessä on ko-operatiivinen prosessi Denaturaation aiheuttavat myös p:n muutokset, orgaaniset liuottimet (heikentävät hydrofobisia vuorovaikutuksia) tietyt suolat ja yhdisteet (joita kutsutaan kaotrooppisiksi), detergentit (hydrofobiset vuorovaikutukset) Denaturaation seurauksena proteiini menettää biologisen aktiivisuutensa Joidenkin proteiinien (varsinkin puhtaiden) denaturaatio on reversiibeli Renaturaatio osoittaa aminohapposekvenssin määräävän kolmiulotteisen rakenteen Proteiini, esim ribonukleaasi voidaan denaturoida konsentroidulla urealiuoksella, johon on lisätty merkaptoetanolia pelkistämään rikkisillat 32
Kun urea ja merkaptoetanoli poistetaan hitaasti, proteiini palautuu alkuperäiseen, entsymaattisesti aktiiviseen muotoonsa Myös alkuperäiset rikkisillat muodostuvat (Jos proteiinin rikkisiltojen annetaan muodostua poistamatta ureaa, ne muodostuvat satunnaisesti, ja urean poistosta huolimatta ei aktiivista konformaatiota enää löydy) Sama koe on onnistuneesti tehty myös kemiallisesti syntetisoidulla ribonukleaasilla. Polypeptidit laskostuvat vaiheittain Pelkästään todennäköisyyksiä ajatellen proteiinin oikean kolmiulotteisen rakenteen löytyminen on mahdotonta! (Lewinthalin paradoksi) Koska se kuitenkin tapahtuu (muutamassa sekunnissa), pelkkä todennäköisyyksien arviointi on ilmeisesti virheellistä Tietokonesimulaatioiden mukaan muodostuvat ensin sekundäärirakenteet. Niiden muodostuminen on ko-operatiivista (yhden sidoksen muodostuminen edistää seuraavan muodostumista) Välimuotona on arveltu esiintyvän osittain laskostuneen, mutta vielä epästabiilin rakenteen, josta on käytetty nimitystä sula möykky (molten globule) Jotkut mutaatiot saattavat aiheuttaa pikemminkin vian proteiinin laskostumisprosessissa, kuin lopullisessa rakenteessa. Proteiini jää ikään kuin roikkumaan virheelliseen rakenteeseen. Todennäköisesti evoluutiossa valintapaine kohdistuu paitsi oikeaan loppurakenteeseen (energiaminimi), myös nopeaan laskostumiseen, eli että proteiini löytää lopullisen konformaationsa nopeasti! Joitain proteiineja täytyy auttaa laskostumisessa Monien proteiinien oikeaa ja nopeaa laskostumista auttavat soluissa kaperoneiksi (molecular chaperones) kutsutut proteiinit Kaperonit ovat oikeastaan proteiinien laskostumista katalysoivia entsyymejä. sp70 ryhmän proteiinit (eat Shock Protein 70 000 dalt) sitoutuvat laskostumattomien proteiinien hydrofobisiin alueisiin estäen niiden virheellisen aggregoitumisen sp70 proteiinit edistävät proteiinien oikeaa laskostumista kuluttaen samalla ATP:tä 33
Chaperoniinit (GroEL/GroES) puolestaan muodostavat monimutkaisen koneiston, jonka sisään puutteellisesti laskostunut proteiini sitoutuu hierottavaksi 9. iilihydraatit monosakkaridit disakkaridit - oligosakkaridit polysakkaridit Monosakkaridit (C 2 O) 3-7 aldoosit (C=O ryhmä ketjun päässä) vs ketoosit (C=O ryhmä useimmiten hiilessä 2) heksoosit (6 hiiltä) vs. pentoosit (5 hiiltä) pyranoosit (6-rengas) vs furanoosit (5-rengas) Yksinkertaisin monosakkaridi on glyseraldehydi. 2-hiili on kiraalinen, joten on olemassa D- ja L-glyseraldehydi: D-glyseraldehydi Fischerin projektio O C C O C 2 O Perspektiivikuva O C C O C 2 O L-glyseraldehydi O C O C C 2 O O C O C C 2 O Muut monosakkaridit nimetään niin, että jos karbonyylihiilestä kauimpana olevan hiilen konfiguraatio on sama, kuin D-glyseraldehydissä, molekyyli on D-sarjaa, ja päinvastainen konfiguraatio L-sarjaa. Fischerin projektiossa D-sarjassa hydroksyyli on oikealla. Muiden hiilien konfiguraatio määrää monosakkaridin nimen. Näin ollen on olemassa kaksi neljähiilistä (tetroosia) aldoosia (ja molemmista D- ja L- muodot), neljä viisihiilistä (pentoosia), 8 kuusihiilistä (heksoosia) Ketooseissa on yksi kiraalinen hiili vähemmän. Kaksi monosakkaridia, jotka eroavat vain yhden hiilen konfiguraation suhteen, ovat toistensa epimeerejä. 34
Sykliset rakenteet Useimmat monosakkaridit ovat enimmäkseen rengasmuodossa, joka syntyy molekyylin karbonyyliryhmän reagoidessa saman molekyylin jonkin hydroksyyliryhmän kanssa, jolloin muodostuu hemiasetaali tai hemiketaali. Riippuen siitä, minkä hydroksyylin kanssa reaktio tapahtuu, muodostuu viisirengas (furanoosi) tai kuusirengas (pyranoosi), joista kuusirengas on stabiilimpi. Rengasrakenteen muodostuessa syntyy yksi kiraalinen keskus lisää (anomeerinen hiili); muodostuu kaksi stereoisomeeriä α ja β, jotka pystyvät muuttumaan toisikseen avoketjuisen muodon kautta. yleisin glukoosi: C 6 12 O 6 O CO C O C 2 O C O C O O C O O O C 2 O O aworthin kaavio Kuusirengas on todellisuudessa ei-tasomainen, tavallisesti tuolikonformaatiossa, jolloin substituentit ovat aksiaalisia tai ekvatoriaalisia. Tavallisimpia monosakkarideja: glukoosi on aldoheksoosi fruktoosi on ketoheksoosi riboosi on aldopentoosi Monosakkaridien johdannaiset Aminosokerit ja niiden johdannaiset Deoksisokerit Sokerihapot (esim glukonihappo ja glukuronihappo) Fosforyloidut sokerit Pelkistävät sokerit Monosakkaridit ja tietyt polysakkaridit voivat hapettua vastaaviksi karboksyylihapoiksi. (Esim. Fehlingin reaktio). Aldoosit hapettuvat suoraan, ketoosit tautomerisoituneena aldoosiksi. 35
Glykosidisidos emiasetaalin muodostumisen jälkeen muodostunut hydroksyyliryhmä voi reagoida toisen hydroksyylin kanssa, jolloin eliminoituu vesi, ja muodostuu asetaali. Asetaalin muodostuessa anomeerisen hiilen α tai β konfiguraatio jää pysyväksi (avoketjuinen muoto ei mahdollinen). Jos molekyylissä on jonkin sakkaridiyksikön anomeerinen hiili on vapaana, on kyseessä pelkistävä sokeri. Disakkaridit esim. sakkaroosi. C 12 22 O 11 C 2 O O C 2 O O O O O O C 2 O O O β-d-fruktofuranosyyli(β2 1α)α-D-glukopyranosidi Koska sakkaroosissa anomeeriset hiilet ovat reagoineet keskenään, kyseessä ei ole pelkistävä sokeri. Polysakkaridit eli glykaanit ovat monosakkaridien muodostamia polymeerejä Polysakkaridit voivat koostua samanlaisista (homopolysakkaridit) tai erilaisista (heteropolysakkaridit) sakkaridiyksiköistä. Ketjut voivat olla suoria tai haaroittuneita. Polysakkaridien koko vaihtelee. Ominaisuudet riippuvat yksiköiden tyypistä, määrästä ja sitoutumistavasta. Tärkkelys ja glykogeeni Tärkkelys ja glykogeeni ovat periaatteessa samanlaisia (α1 4) glukoosipolymeerejä. Tärkkelystä on kasveissa, sitä on kahta tyyppiä Amyloosi koostuu pitkistä, haaroittumattomista ketjuista (muodostaa spiraalin) Amylopektiini on haaroittunutta; 24-30 glukoosiyksikön välein on (α1 6) sidoksellinen haarakohta 36
Glykogeeniä on eläimissä maksassa ja lihaksissa (α1 6) haaroja 8-12 yksikön välein Molekyylissä vain yksi pelkistävä pää, mutta useita ei-pelkistäviä päitä Molekyyliä hajotetaan ei-pelkistävistä päistä. Selluloosa ja kitiini Selluloosa on myös polyglukoosia, mutta sillä on aivan erilaiset ominaisuudet Yksiköiden väliset sidokset (β1 4) sidoksia Yksiköiden välille muodostuu runsaasti vetysidoksia, jotka tekevät molekyylistä liukenemattoman. Selluloosa on massaltaan yleisin biomolekyyli. Vain eräät mikrobit pystyvät tuottamaan selluloosaa hajottavaa entsyymiä sellulaasia, kun taas tärkkelyksen ja glykogeenin hajotuskyky on erittäin yleinen. yönteisten tukirangan kitiini on N-asetyyli-D-glukosamiinin (β1 4) polymeeri. Kuten selluloosa, se on lujaa, liukenematonta ja vaikeasti hajotettavaa, johtuen sidoksen β-konfiguraatiosta ja siitä seuraavasta yksikköjen välisten vetysidosten muodostumisesta. Bakteerien soluseinän peptidoglykaanit Bakteerien soluseinän runkona on polysakkaridi, jossa on vuorotellen N- asetyyliglukosamiini- ja N-asetyylimuramiinihappoyksiköitä (β1 4)-sidoksilla liitettynä. Polysakkaridiketjuja yhdistää peptidiketju, jossa on myös D-aminohappoja. Gram+ ja Gram- -bakteereilla peptidiketjun rakenteessa on eroa. Soluväliaineen glykosaminoglykaanit Solujen välissä olevassa tilassa on soluväliainetta extracellular matrix tarjoten soluille kiinnittymispinnan. Soluväliaine koostuu kuitumaisista proteiineista (kollageeni, elastiini, fibronektiini ja laminiini y.m.) sekä polysakkarideista Glykosaminoglykaanit koostuvat toistuvista disakkaridiyksiköistä, joissa toinen sokeri on N-asetyyliglukosamiini tai N-asetyyligalaktosamiini. Glykosaminoglykaanit liittyvät solunulkoisiin proteiineihin muodostaen proteoglykaaneja. 37