(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT 11111111 1 1111111 111,11111!1,11,1 1,11111!111!11111111111 1 11111111 F (10) FI 116838 B

(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT 11111111 1 1111111 111,11111!1,11,1 1,11111!111!11111111111 1 11111111 F (10) FI 116838 B SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERINALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 15032006 (51) Kvlk - Intkl 7K 14/285 (200601) C12N 15/31 (200601) A61K 39/102 (200601) (21) Patenttihakemus - Patentansökning 944273 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 15091994 (24) Alkupäivä - Löpdag 16031993 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 15091994 (86) Kv hakemus - Int ansökan PCT/US93/02166 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 16031992 GB 9205704 P (73) Haltija - Innehavare 1 et Louis University, 221 North Grand Boulevard, St Louis, MO 63103, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Washington University, One Brookings Drive, St Louis, MO 63130, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 arenkamp,stephen J, 16 Villawood Lane, Webster Grove, MO 63119-4954, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Forssan & Salomaa Oy Eerikinkatu 2, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Tyypit-tämän haemophiluksen molekyylipainottaan suurta pintaprotefinia koodaava geeni la geeniryhmä Högmolekylär ytprotein av icke-typisk haemophilus kodande gen och genknippe (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Hansen et al, 'Immune Enhancement af Pulmonary Clearance on Nontypable Haemophilus influenzae", Infection and Immunity, tammikuu 1988, vol 56, nro 1, p 182-190, Barenkamp, 'Protection by Serum Antibodies in Experimental Nontypable Haemophilus influenzae Otitis Media, Infection and Immunity, toukokuu 1986, vol 52, nro 2, p 572-578, Young et al, "Efficient Isolation of Genes by using Antibody Probes", Proceedings of the National Academy of Siences of United States of America, maaliskuu 1983, vol80, p 1194-1198, Barenkamp et al, "Development of serum bactericidal activity following nontypable Haemophilus influenzae acute otitis media", Pediatric Infectious Disease Joumal, toukokuu 1990, vol 9, nro 5, p 333-339, Barenkamp: "DNA sequence analysis of genes for nontypable Haemophilus influenzae (NIHI) high molecular weight (HMW) outer membrane proteins which are target of bactericidal antibody" abstract nro 985, Pediatric Research, 1991, vol 29, nro 4, p 167A, Barenkamp: "Cloning and expression of genes for nontypable Haemophilus influenzae (NIHI) high molecular weight (HMW) outer membrane proteins which are target of bactericidal antibody" abstract nro 983, Pediatric Research, 1990, vol 27, nro 4, p 166A, Thomas et al, "Expression in Esterichia coli of a high - molecular - weight protective surtace antigen found in nontypeable and type b Haemophilus influenzae", Infection and Immunity, 1990,vol 58, nro 6, p 1909-1913 (57) Tiivistelmä - Sammandrag Ohessa on kuvattu tyypittömän Haemophilus influenzae:n molekyylipainoltaan suuret pintaproteiinit, joilla on irrununogeenisiä ominaisuuksia, sekä niitä koodaavat geenit Erityisesti kahta immunodominoivaa, molekyylipainoltaan suurta proteiinia, HMWI:tä ja HMW2:ta, koodaavat geenit on kloonattu ja ilmennetty ja niiden sekvenssi on määritelty, kun taas molekyylipainoltaan suuria proteiineja HMW3 ja 1-1MW4 koodaavat geenit on kloonattu ja Högmolekylära ytproteiner av icke-typisk Haemophilus influenzae som har immonogeniska egenskaper och gener som kodar dessa, beskrivs Speciellt har man kionat, uttryckt och sekvenserat gener som kodar för tvi immunodominanta högmolekylära proteiner 11MW1 och HMW2, medan gener som kodar för högmolekylära proteiner HMW3 och 11MW4 har klonats, uttryckts och partiellt sekvenserats ilmennetty ja niiden sekvenssi on määritelty osittain

116838 Tyypittömän haemophiluksen molekyylipainoltaan suurta pintaproteiinia koodaava geeni ja geeniryhmä Högmolekulär ytprotein av icke-typisk haemophilus kodande gen och genknippe 5 Keksinnön ala Oheinen keksintö liittyy tyypittömän haemophiluksen molekyylipainoltaan suuriin 10 pintaproteiineihin Keksinnön kohteena on tyypittömän Haemophilus-kannan molekyylipainoltaan suurta proteiinia koodaava eristetty ja puhdistettu geeni sekä eristetty ja puhdistettu geeniryhmä 15 Keksinnön tausta Tyypittömät Haemophilus influenzaet ovat kapseloitumattomia organismeja, joille tunnusomaista on se, ettei niillä ole reaktiivisuutta tunnettuja H influenzae kapseliantigeeneja vastaan vaikuttavien antiseerumeiden kanssa 20 Näitä organismeja esiintyy tavallisesti ihmisten hengityselinten yläosassa, ja ne aiheuttavat usein sellaisia infektioita kuten keskikorvan tulehdusta (otitis media), sivuontelotulehdusta (sinusitis), sidekalvon tulehdusta (conjunctivitis), keuhkoputkentulehdusta (bronchitis) ja keuhkokuumetta Koska näillä organismeilla ei ole polysakkaridikapselia, niin niitä ei kyetä hallitsemaan nykyisillä Haemophilus influen- 25 zae b-tyypin (Hib) rokotteilla, jotka kohdistuvat Hib-bakteerin kapselipolysakkarideihin Nämä tyypittömät kannat tuottavat kuitenkin pinta-antigeeneja, jotka voivat saada aikaan tätä bakteeria torjuvia vasta-aineita Kaksi näistä pääasiallisista ulkokalvoproteiineista, P2 ja P6, on tunnistettu ihmisseerumin bakteereja torjuvan aktiivisuuden kohteiksi Kuitenkin ollaan todettu, että P2-proteiinisekvenssi vaihte- 30 lee, erityisesti tyypittömissä Haemophilus-lcannoissa Näin ollen P2-proteiiniin perustuva rokote ei suojaa tämän organismin kaikilta kannoilta

2 116838 Barenkamp et al (Pediatr Infeet Dis J, 9:333-339, 1990) ovat tunnistaneet aikaisemmin joukon molekyylipainoltaan suuria ('high-molecular-weighf; HMW) proteiineja, jotka näyttävät olevan ihmistoipilaan seerumeissa läsnä olevien vasta-aineiden 5 pääasiallisia kohteita Tutkittaessa joukkoa keskikorvasta saatuja eristeitä todettiin yhden tai kanden tällaisen proteiinin läsnäolo useimmissa kannoissa Kuitenkin ennen oheista keksintöä näiden proteiinien rakenteet samoin kuin näiden proteiinien puhtaat eristeet olivat tuntemattomia 10 Keksinnön yhteenveto Oheisen keksinnön keksijät, jotka pyrkivät selvittämään edelleen molekyylipainoltaan suurten (MEW) Haemophilus-proteiinien tunnusomaisia piirteitä, ovat kloonanneet ja ilmentäneet prototyyppisestä tyypittömästä Haemophilus-kannasta peräisin 15 olevaa kahta immunologisesti hallitsevaa ("immunodominoivaa") HMW-proteiinia (joista käytetään merkintää HMW1 ja HMW2) koodaavat geenit sekä määrittäneet niiden sekvenssin, ja he ovat kloonanneet ja ilmentäneet toisesta tyypittömästä Haemophilus-kannasta peräisin olevaa kahta muuta immunodominoivaa HMW-proteiinia (joista käytetään merkintää HMW3 ja HMW4) koodaavat geenit sekä mää- 20 rittäneet lähes täydellisesti niiden sekvenssin Näin ollen, oheisen keksinnön erään piirteen mukaisesti aikaan on saatu sellainen eristetty ja puhdistettu geeni tai geeniryhmä, joka koodaa tyypittömästä Haemophilus-kannasta peräisin olevaa, molekyylipainoltaan suurta proteiinia, erityisesti geeni, 25 johon on koodautunut proteiini HMW1, HMW2, HMW3 tai HMW4, sekä tällaisen proteiinin mikä tahansa muunnos tai kappale, jossa on säilynyt immunologinen kyky suojata tyypittömän Haemophilus-kannan aiheuttamalta sairaudelta Oheisen keksinnön erään toisen piirteen mukaisesti aikaan on saatu valmistusmenetehnä tyypittömän Haemophilus influenzaen molekyylipainoltaan suurille proteiineille, joita nämä 30 geenit koodaavat

3 116838 Piirustusten lyhyt kuvaus Kuvio 1 on HMW1-proteiinia koodaavan geenin DNA-sekvenssi (SEQ ID NO: 1); 5 Kuvio 2 on HMW1-proteiinin päätelty aminohapposekvenssi (SEQ ID NO: 2); Kuvio 3 on HMW2-proteiinia koodaavan geenin DNA-sekvenssi (SEQ 1D NO: 3); 10 Kuvio 4 on HMW2-proteiinin päätelty aminohapposekvenssi (SEQ ID NO: 4); Kuvio 5A esittää edustavien yhdistelmäfaagien, jotka sisältävät HMW1- tai HMW2- rakennegeenin, restriktiokarttoja, joissa rakennegeenin sijainti on esitetty tummilla pylväillä; 15 Kuvio 5B esittää T7-ilmentämisvektorin pt7-7 restriktiokarttaa; Kuvio 6 sisältää hmwl-geenin tapauksessa geeniryhmän DNA-sekvenssin (SEQ ID NO: 5), käsittäen nuideotidit 351-4958 (ORF a) (kuten kuviossa 1), sekä kaksi ylimääräistä alavirran puoleista geeniä reunustavassa 3'-alueessa, käsittäen ORF:t b, 20 nukleotidit 5114-6748 ja c, nukleotidit 7062-9011; Kuvio 7 sisältää hmw2-geenin tapauksessa geeniryhmän DNA-sekvenssin (SEQ ID NO: 6), käsittäen nukleotidit 792-5222 (ORF a) (kuten kuviossa 3), sekä kaksi ylimääräistä alavirran puoleista geeniä reunustavassa 3'-alueessa, käsittäen ORF:t b, 25 nukleotidit 5375-7009 ja c, nukleotidit 7249-9198; Kuvio 8 on HMW3-proteiinia koodaavan geenin osittainen DNA-sekvenssi (SEQ ID NO: 7); 30 Kuvio 9 on HMW4-proteiinia koodaavan geenin osittainen DNA-sekvenssi (SEQ ID NO: 8); ja

116838 4 Kuvio 10 on taulukko, jossa on verrattu proteiineille HMW1, 1-IMW2, HMW3 ja HMW4 pääteltyjä aminohapposekvenssejä 5 Keksinnön yleinen kuvaus 11 HMW 1 - ja HIVINV2-proteiinia koodaavien geenien DNA-sekvenssit, jotka on esitetty vastaavasti kuvioissa 1 ja 3, osoitettiin noin 80-prosenttisesti samanlaisiksi, geenien ensimmäisten 1259 emäsparien ollessa identtiset HMW-proteiinien päätellyt amino- 10 happosekvenssit, jotka on esitetty vastaavasti kuvioissa 2 ja 4, ovat noin 70- prosenttisesti samanlaisia Edelleen, koodatut proteiinit ovat antigeenisesti Bordetella pertussis bakteerin säiemäisen hemagglutiniinipintaproteiinin kaltaisia Bordetella pertussis bakteerin säiemäistä hemagglutiruinia (FHA) vastaan muodostetun monoklonaalisen vasta-aineen todettiin tunnistavan kummankin molekyylipainoltaan 15 suuren proteiinin Näiden tulosten perusteella voidaan päätellä, että HMW- ja FHAproteiineilla voi olla samankaltaiset biologiset toiminnot HMW1- ja HMW2- proteiineille päätellyt aminohapposekvenssit on todettu samankaltaisiksi FHAproteiinin sekvenssin kanssa Edelleen ollaan osoitettu, että suurin osa näistä tyypittömistä Haemophilus-kannoista tuottaa näitä antigeenisesti samankaltaisia proteii- 20 neja HMW1-geenin ilmentämää proteiinia vastaan kehitetyt antigeenit tunnistavat sekä HMW2-proteiinin että B pertussis FHA:n Oheinen keksintö kattaa eristetyn ja puhdistetun geenin ja valmistusmenetelmän tyypittömän haemophiluksen molekyylipainoltaan suurelle proteiinille, joka on antigeenisesti B pertussis FHA:n kaltainen, jota FHA:ta voidaan saada luonnollisista lähteistä tai jota voidaan tuottaa yhdistel- 25 mä-dna-tekniikan avulla Tyypittömän Haemophilus-bakteerin tunnetun kannan perimän faagilcidasto valmis- tettiin standardimenetelmin ja tästä kirjastosta seulottiin kloonit, jotka ilmensivät molekyylipainoltaan suuria proteiineja, käyttäen HMW-proteiineja vastaan vaikutta- 30 vaa suuritiitteristä antiseerumia Joukko voimakkaasti reaktiivisia DNA-klooneja puhdistettiin plakkien avulla ja alikloonattiin T7-ilmentämisplasmidiin Todettiin,

5 116838 että ne kaikki ilmensivät jompaa kumpaa näistä kandesta, molekyylipainoltaan suuresta proteiinista, joista käytetään merkintää HMW1 ja HMW2 ja joiden näennäinen molekyylipaino on 125 ja 120 kda, vastaavasti, ja jotka olivat koodautuneet vastaavasti 4,6 kb:n ja 4,4 kb:n suuruisiin avoimiin lukukehyksiin 5 Edustavien, joko BMW 1- tai HMW2-proteiinia ihnentävien kloonien tunnusomaisia piirteitä selvitettiin edelleen ja geenit eristettiin ja puhdistettiin ja niiden sekvenssi määritettiin HMW1:n DNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 1 ja vastaava päätelty aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 2 Samoin HMW2:n DNA-sekvenssi on 10 esitetty kuviossa 3 ja vastaava päätelty aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 4 Eristettyjen proteiinien osittainen puhdistaminen ja N-päätteen sekvenssianalyysi osoittivat, että ilmentyneet proteiinit ovat katkenneet, koska niiden sekvenssi alkaa kummankin täysipituisen HMW1- ja HMW2-geenituotteen jäännöksestä numero 442 15 Alikloonaustutkimukset hmwl- ja hmw2-geenien suhteen osoittivat, että HMWprotehnien oikeaan jällcikäsittelyyn tarvittiin muiden alavirran puoleisten geenien tuotteita 011aan todettu, että sekä hmwl- että hmw2-geenejä reunustaa kaksi ylimääräistä alavirran puoleista avointa lukukehystä ('open reading frame'; ORF), joista 20 käytetään vastaavasti lyhenteitä b ja c (katso kuviot 6 ja 7) b ORF-kehysten pituus on 1635 emäsparia (bp), ja ne ulottuvat nuideotidistä 5114 nukleotidiin 6748 hmwl-geenin tapauksessa ja nukleotidistä 5375 nukleotidiin 7009 hmw2-geenin tapauksessa, niiden päätettyjen aminohapposekvenssien ollessa 99-25 prosenttisesti samanlaisia Näinä päätellyt aminohapposekvenssit on todettu samankaltaisiksi niistä kandesta geenistä, joiden koodaamia proteiineja tarvitaan P mirabilisin ja S marcescensin hemolysiinien erittymiseen ja aktivoitumiseen, päätettyjen aminohapposekvenssien kanssa 30 c ORF-kehysten pituus on 1950 bp, ja ne ulottuvat nukleotidistä 7062 nukleotidiin 9011 hmw/-geenin tapauksessa ja nukleotidistä 7249 nukleotidiin 9198 hmw2-

116838 6 geenin tapauksessa, niiden pääteltyjen aminohapposekvenssien ollessa 96-prosenttisesti samanlaisia hmwl c ORF-kehystä edeltää joukko 9 bp:n suoria peräkkäisiä toistojaksoja Plasmidialiklooneissa hmwl b tai c ORF-kehyksen keskeytyminen johtaa hmwl -rakennegeenituotteen puutteelliseen jällcikäsittelyyn ja erittymiseen 5 Nämä kaksi molekyylipainoltaan suurta proteiinia on eristetty ja puhdistettu ja niiden on osoitettu suojaavan osittain korvatulehdusta vastaan chinchilloissa ja toimivan adhesiineina Nämä tulokset osoittavat, että näitä molekyylipainoltaan suuria proteiineja ja niiden kanssa rakenteellisesti samankaltaisia, muista tyypittömistä Hae- 10 mophilus influenzae -kannoista peräisin olevia proteiineja voidaan käyttää komponentteina tyypitöntä Haemophilus influenzae -bakteeria torjuvissa rokotteissa Koska ohessa aikaansaadut proteiinit ovat hyviä ristireaktiivisia antigeeneja ja koska niitä on läsnä suurimmassa osassa tyypittömän Haemophilus-bakteerin kannoista, 15 niin on ilmeistä, että näitä HMW-proteiineja voidaan käyttää yleisen Haemophilusrokotteen itsenäisinä aineosina Näin ollen näitä proteiineja ei voida käyttää ainoastaan tyypittömien Haemophilus-kantojen aiheuttamalta korvatulehdukselta, sivuontelotulehdukselta ja keuhkoputkentulehdukselta suojaavina antigeeneina, vaan niitä voidaan myös käyttää suojaavien Hib-polysakkaridien kantajina aivokalvontu- 20 lehdusta torjuvissa konjugaattirokotteissa Näitä proteiineja voidaan myös käyttää muiden, muista organismeista peräisin olevien antigeenien, hapteenien ja polysakkaridien kantajina siten, että saadaan aikaan immuniteetti tällaisille antigeeneille, hapteeneille ja polysakkarideille 25 Erilaisen tyypittömän Haemophilus-kannan kahta, molekyylipainoltaan suurta proteiinia (joista käytetään merkintöjä HMW3 ja HMW4) koodaavat nukleotidisekvenssit on selvitetty suureksi osaksi ja ne on esitetty kuvioissa 8 ja 9 HMW3:n näennäinen molekyylipaino on 125 kda, kun taas HMW4:n näennäinen molekyylipaino on 123 kda Nämä molekyylipainoltaan suuret proteiinit ovat antigeenisesti HMW1- ja 30 HMW2-proteiinien ja FHA:n kaltaisia HMW3:n sekvenssianalyysi on arviolta 85- prosenttisesti täydellinen ja HMW4:n sekvenssianalyysi on 95-prosenttisesti täydel-

116838 7 Linen siten, että kummankin geenin 5'-päinsä olevien lyhyiden pätkien sekvenssi on vielä määrittämättä Kuvio 10 sisältää pääteltyjen aminohapposekvenssien moninkertaisen sekvenssiver- 5 tailun näiden neljän ohessa tunnistetun, molekyylipainoltaan suuren proteiinin tapauksessa Kuten tästä vertailusta voidaan nähdä, peptidisekvenssiltään täysin samanlaisia pätkiä todetaan kaikkialla koko verrattavassa pituudessa, HMW3:n muistuttaessa lähemmin HMW1:tä ja HIMW4:n muistuttaessa lähemmin HMW2:ta Tämän havainnon perusteella voidaan vetää erittäin helposti se johtopäätös, että erilaisista 10 tyypittömistä Haemophilus-kannoista peräisin olevien, molekyylipainoltaan suurten proteiinien välillä esiintyy huomattavaa sekvenssihomologiaa Lisäksi tyypittömien H influenzae kantojen mutantteja, jotka ovat puutteellisia HMW1-proteiinin tai HMW2-proteiinin tai niiden molempien ilmentymisen suh- 15 teen, on muodostettu ja niiden kykyä tarttua ihmisen viljeltyihin epiteelisoluihin on tutkittu hrnwl- ja hmw2-geeniryhmät on ilmennetty E colissa ja niiden in vliro tarttuvuutta on tutkittu Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että sekä HMW1 että HMW2 välittävät kiinnittymistä ja ovat näin ollen adhesiineja, ja että tämä toirninto on läsnä myös H influenzaen muiden pintarakenteiden puuttuessa 20 Eristämällä ja puhdistamalla nämä molekyylipainoltaan suuret proteiinit oheiset keksijät kykenevät määrittämään huomattavimmat suojaavat epitoopit tavanomaisella epitooppikartoituksella, sekä syntetisoimaan näitä detenninantteja vastaavia peptidejä, joita on tarkoitus sisällyttää täysin synteettisiin rokotteisiin tai yhdistel- 25 märokotteisiin Näin ollen oheisen keksinnön kohteena on myös menetelmä sellaisen synteettisen peptidin valmistamiseksi, jonka aminohapposekvenssi vastaa tyypittömästä Haemophillis influenzae -bakteerista peräisin olevan, molekyylipainoltaan suuren proteiinin vähintään yhtä suojaavaa epitooppia Tällaisten peptidien pituus vaihtelee ja ne muodostavat osia näistä molekyylipainoltaan suurista proteiineista, 30 joita voidaan käyttää immuniteetin aikaansaamiseksi joko suoraan tai konjugaatin

8 116838 osana samankaltaisia organismeja vastaan, ja näin ollen ne toimivat rokotteina, jotka suojaavat vastaavia sairauksia vastaan Tässä keksinnössä on myös saatu aikaan sellaisten proteiinien mikä tahansa muun- 5 nos tai kappale, jossa on säilynyt mandollinen immunologinen kyky suojata tyypittömien Haemophilus-kantojen aiheuttamalta sairaudelta Nämä muunnokset voidaan muodostaa geeneissä toteutetuilla osittaisilla deleetioilla tai mutaatioilla sekä ilmentämällä tuloksena olevia muokattuja geenejä proteiinimuunnosten aikaansaamiseksi 10 ESIMERKIT Esimerkki 1 Tyypittömät H bffluenzae-kannat 5 ja 12 eristettiin puhdasviljelminä akuutista kor- 15 vatulehduksesta (otitis media) kärsivien lasten keskikorvan nesteestä Kannasta 12 peräisin oleva kromosomaalinen DNA, joka käsitti ~1- ja HMW2-proteiineja koodaavat geenit, eristettiin valmistamalla osittaiset Sau3A-restrilctiopilkkeet kromosomaalisesta DNA:sta ja fraktioimalla sakkaroosigradienttien avulla 9 20 kiloemästavun alueella olevia DNA-kappaleita sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kirjasto 20 valmistettiin ligatoimalla lambdaembl3-haaroihin Ligaatioseokset pakattiin in vilro ja ne monistettiin maljalla E coli LE392:n P2-lysogeenissa Plasmidin alikloonaustutkimuksia varten edustavasta yhdistelmäfaagista peräisin oleva DNA alikloonattiin T7-ilmentämisplasmidiin pt7-7, joka sisälsi T7 RNA- 25 polymeraasipromoottorin 01)10, ribosomien sitoutumiskohdan ja luennan aloituskohdan T7-geeni 10:n proteiinia varten ylävirran puolella moninkertaiseen kloonauskohtaan nähden (katso kuvio 5B) DNA-sekvenssianalyysi toteutettiin dideoksimenetelmällä ja HMW1-geenin kum- 30 mankin juosteen sekä HMW2-geenin yksinkertaisen juosteen sekvenssi määritettiin

9 116838 Westem-immunoblottausanalyysi toteutettiin niiden yhdistelmäproteiinien tunnistamiseksi, joita proteiineja tuotettiin reaktiivisilla faagildooneilla Faagihajotteet, joita oli kasvatettu LE392-soluissa, tai plakit, jotka oli otettu suoraan YT-maljoilla olevista, LE392-soluista muodostuvasta kerroksesta, saatettiin liukoiseen muotoon gee- 5 lielektroforeesin näytepuskuriin ennen elektroforeesia Natriumdodekyylisulfaatti(SDS)-polyalcryyliamidigeelielektroforeesi toteutettiin 7,5 %:lla tai 11 %:lla polyakryyliamidilla muokatuilla Laenunli-geeleillä Sen jälkeen, kun proteiinit oli siirretty nitroselluloosa-arkeille, arkeille lisättiin koettimeksi peräkkäin E coliin absorboitua ihmisen seeruminäytettä, joka sisälsi molekyylipainoltaan suuria proteiineja vas- 10 tustavaa suuritiitteristä vasta-ainetta, ja sitten toista, alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen anti-ihminen immunoglobuliini G (IgG) vasta-ainetta Terveistä aikuisista saatu seerumi sisältää suuritiitteristä vasta-ainetta, joka kohdistuu tyypittömän Haemophilus influenzaen pinnalla paljaana olevia, molekyylipainoltaan suuria proteiineja vastaan Yhtä tällaista seeruminäytettä käytettiin seulovana antiseerumina sen 15 jälkeen, kun sitä oli absorboitu huolellisesti LE392-soluilla Yhdistelmäplasmideilla transformoidun E colin tuottamien yhdistelmäproteiinien tunnistamiseksi mielenkiinnon kohteena olevia plasmideja käytettiin E coli BL21 (DE3)/pLysS-kannan transformoimiseksi Näitä transformoituja kantoja kasvatettiin 20 0,5 olevaan A600-arvoon L-elatusalustassa, joka sisälsi 50 tg ampisilliinia millilitraa kohden Sitten lisättiin IPTG:tä pitoisuudeksi 1 mm Yhden tunnin kuluttua solut otettiin talteen ja soluja käsiteltiin ultraäänellä Näytteiden proteiinipitoisuudet määritettiin bikinkoniinihappomenetelmällä Ultraäänellä käsitellyt solut, jotka sisälsivät 100 11g kokonaisproteiinia, saatettiin liukoiseen muotoon elektroforeesinäytepusku- 25 riin, ne käsiteltiin elektroforeettisesti SDS-polyalayyliamidigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosalle Nitroselluloosalle lisättiin sitten peräkkäin koettimiksi E coliin absorboitua aikuisen seeruminäytettä ja sitten toista, alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen anti-ihminen IgG vasta-ainetta 30 Westem-immunoblottausanalyysi toteutettiin myös siksi, että voitaisiin määrittää se, ilmensivätkö homologiset ja heterologiset tyypittömät H influenzae-kannat sellaisia

10 116838 molekyylipainoltaan suuria proteiineja, jotka olivat antigeenisesti kloonatun HMW I - geenin (rhmw1) koodaaman proteiinin kaltaisia Ultraäänellä käsitellyt bakteerisolut saatettiin liukoiseen muotoon elektroforeesinäytepuskuriin, ne käsiteltiin elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosalle Nit- 5 roselluloosalle lisättiin sitten peräkkäin koettimilcsi kaniinin rhmw1 polylclonaalista vasta-ainetta ja sitten toista, alkaliseen fosfatinsiin konjugoitua vuohen anti-ihminen IgG vasta-ainetta Lopuksi, Westem-immunoblottausanalyysi suoritettiin siksi, että voitaisiin määrittää, 10 ilmensivätkö tyypittömät Haemophilus-kannat antigeenisesti Bordetella pertussis bakteerin säiemäisen hemagglutiniiniproteiinin kaltaista proteiinia Monoklonaalista vasta-ainetta X3C, joka on hiiren immunoglobuliini G (IgG) vasta-aine, ja joka tunnistaa säiemäisen hemagglutiniinin, käytettiin ultraäänellä käsiteltyjen solujen koettimena Westem-blottausmenetelmässä Ilmaisuun käytettiin toista, alkaliseen fosfa- 15 tnasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri IgG vasta-ainetta : : Yhdistelmäproteiinin antiseerumin tuottamiseksi E coli BL21 (DE3)/pLysS transformoitiin phmw1-4:11ä, ja yhdistelmäproteiinin ilmentyminen indusoitiin IPTG:llä edellä kuvatulla tavalla Ultraäänellä käsiteltyjä bakteerisoluja valmistettiin ja ne 20 erotettiin supematantti- ja kasaumajakeeksi sentrifugoimalla nopeudella 10 000 x g 30 minuuttia Yhdistelmäproteiini jaettiin fralctioilcsi kasaumajakeesta Kaniini immunisoitiin ihon alaisesti kanden viikon välein 1 mg:lla kasaumajakeesta peräisin olevaa proteiinia siten, että ensimmäinen annos annettiin yhdessä Freundin täydellisen apuaineen kanssa ja muut annokset annettiin yhdessä Freundin epätäydellisen 25 apuaineen kanssa Neljännen injektion jälkeen kaniinin veri otettiin talteen Ennen antiseenunin käyttämistä Westem-blottausmäärityksessä se absorboitiin tehokkaasti ultraäänellä käsiteltyihin, E coli kantaan kuuluviin isäntäsoluihin, jotka oli transformoitu pelkällä kloonausvektorilla 30 FIMWI lie ja säiemäiselle hemagglutiniinille yhteisten antigeenisten determinanttien määrittämiseksi entsyymiin kytkettyyn immunosorbenttiin perustuvan määrityksen

11 116838 (ELISA) levyjä (Costar, Cambridge, Mass), pinnoitettiin 60 p1:11a säiemäisen hemagglutiniinin 4 µg/m1 liuosta Dulbeccon fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa kuoppaa kohden 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa Kuoppia suojattiin 1 tunnin ajan 1 % naudan seerumin albumiinilla Dulbeccon fosfaatilla puskuroidussa suola- 5 liuoksessa ennen seerumilaimennosten lisäämistä rhmw1-antiseerumista tehtiin laimennossarja 0,1 % Brij-tuotteeseen (Sigma, St Louis, Mo) Dulbeccon fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, ja inkuboitiin 3 tunnin ajan huoneenlämpötilassa Pesun jälkeen levyillä inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kaniini IgG vasta-ainetta (Bio-Rad) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen ke- 10 hittäminen toteutettiin 2,2-atsino-bis(3-etyylibentstiatsoliini-6-sulfonihapolla) (Sigma), jota käytettiin pitoisuutena 0,54 mg/ml 0,1 M natriumsitraattipuskurissa, ph 4,2, joka sisälsi 0,03 % H202 Absorbanssit luettiin automaattisella ELISA-määrityslaitteella 15 HMWI:tä tai HMW2:ta ilmentävät yhdistelmäfaagit otettiin talteen seuraavalla tavalla Tyypittömän H influenzae kannan 12 perimästä saadusta kirjastosta seulottiin ne kloonit, jotka ilmensivät molekyylipainoltaan suuria proteiineja käyttämällä E coli-bakteeriin absorboitua ihmisen seeruminäytettä, joka sisälsi näitä molekyylipainoltaan suuria proteiineja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden suuren tiitterin 20 Lukuisia voimakkaasti reaktiivisia klooneja tunnistettiin yhdessä heikommin reaktiivisten kloonien kanssa 20 voimakkaasti reaktiivista kloonia puhdistettiin plakkien avulla ja yhdistehnäproteiinien ilmentyminen selvitettiin Western-blottauksen avulla Kukin voimakkaasti reaktiivisista klooneista ilmensi yhtä näistä kandesta erityyppi- 25 sestä, molekyylipainoltaan suuresta proteiinista, joista käytetään merkintöjä HMWI ja HMW2 HtvIW1- ja HMW2-hajotteiden tapauksessa immunoreaktiivisten proteiinien pääasialliset vyöhykkeet liikkuivat vastaavasti 125 ja 120 kda olevaa näennäistä molekyylipainoa vastaavalla tavalla Näiden pääasiallisten vyöhykkeiden lisäksi kukin hajote sisälsi vähäisempiä proteiinivyöhyldceitä, jotka vastasivat suurem- 30 paa näennäistä molekyylipainoa Protelinivyöhyklceitä, jotka todettiin HMW2- hajotteissa alle 120 kda olevien molekyylimassojen kohdalla, ei todettu säännöin-

12 116838 sesti, vaan ne edustivat oletettavasti proteolyyttisessä hajoamisessa syntyneitä tuotteita Pelkällä lambriaembl3-1doonausvektorilla infektoidun LE392n hajotteet eivät olleet reaktiivisia, kun ne seulottiin immunologisesti tällä samalla seeruminäytteellä Täten havaittu aktiivisuus ei johtunut ristireaktiivisista E coli proteiineista 5 eikä lambrlafmbl3:n koodaamista proteiineista Edelleen, yhdistelmäproteiinit eivät yksinkertaisesti sitoneet immunoglobuliinia epäspesifisesti, koska nämä proteiinit eivät olleet reaktiivisia pelkän vuohen anti-ihminen IgG-konjugaatin, kaniinin normaalin seerumin eikä lukuisista terveistä nuorista vauvoista saadun seerumin kanssa 10 Edustavien kloonien, jotka ilmensivät joko HMW1- tai HMW2-yhdistelmäproteiineja, tunnusomaisia piirteitä selvitettiin edelleen Näiden kanden faagityypin restriktiokartat erosivat toisistaan, mukaan lukien ne alueet, jotka koodasivat HMW1- ja HMW2-rakennegeenejä Kuvio 5A esittää edustavan yhdistehnäfaagin, joka sisälsi 15 HMIN1- tai HMW2-rakennegeenin, restriktiokarttoja Rakennegeenien sijainti on esitetty tummennetuilla langoilla * HMW1-plasmidialikloonit muodostettiin käyttämällä T7 ilmentämisplasmidia T7-7 (kuvio 5A ja B) Samoin muodostettiin 1-11V1W2-plasmidialikloonit, ja näillä viimeksi 20 mainituilla aliklooneilla saadut tulokset olivat samankaltaisia kuin HMW1-muodosteilla havaitut tulokset HMW1-rakennegeenin lilcimääräinen sijainti ja kopioitumissuunta määritettiin alustavasti plasmidia phmw1 (kuvio 5A) käyttäen Tämä plasmidi muodostettiin istut- 25 tamalla 8,5 kb:n BamHI-Sali-kappale lambdalilv1w1stä BamHI:llä ja Sa/1:11ä pilkottuun pt7-7-plasmidiin phimw1:11ä transformoitu E coli ilmensi immunoreaktiivista yhdistelmäproteiinia, jonka näennäinen molekyylimassa oli 115 kda, ja joka oli voimakkaasti indusoitavissa 1PTG:11ä Tämä proteiini oli merkittävästi pienempi kuin emäfaagin ilmentämä, 125 kda:n kokoinen suuri proteiini, mikä osoitti, että se 30 joko ilmentyi fuusioproteiinina tai se oli katkennut karboksipäätteestä

13 116838 no : : : Rakennegeenin 3'-pään täsmällisemmäksi paikantamiseksi ylimääräisiä plasmideja muodostettiin phmw1-muodosteen 3'-päätä asteittain hävittäen Plasmidi phmw1-1 muodostettiin pilkkomalla phmw1 PstI:11ä, eristämällä tuloksena ollut 8,8 kb:n kappale ja ligatoimalla uudestaan Plasmidi phmw1-2 muodostettiin pilkkomalla 5 phmw1 HindlII:11a, eristämällä tuloksena ollut 7,5 kb:n kappale ja ligatoimalla uudestaan E coli, joka oli transformoitu jommallakummalla plasmidilla phmw1 tai phmw2, ilmensi myös immunoreaktiivisen yhdistehnäproteiinin, jonka näennäinen molekyylimassa oli 115 kda Nämä tulokset osoittivat, että rakennegeenin 3'-pää sijaitsee 5' HindlII-kohdan suhteen 10 Plasmidit phmw1-4 ja phmw1-7 muodostettiin, jotta tämän geenin 5'-pää saataisiin paikannettua vieläkin täsmällisemmin Plasmidi phmw1-4 muodostettiin kloonaamalla 5,1 kb:n BamHI-HindIII-kappale lambdahmw1:stä pt7-7:stä peräisin olevaan plasmidiin, joka sisälsi ylävirran puoleisen 3,8 kb:n EcoRI-BamHI-kappa- 15 leen phmw1-4:11ä transformoitu E coli ilmensi immunoreaktiivisen proteiinin, jonka näennäinen molekyylimassa oli noin 160 kda Vaikka proteiinituotanto voitiinkin indusoida IPTG:11ä, niin proteiinituotannon taso näissä transformanteissa oli olennaisesti pienempi kuin edellä kuvattujen phmw1-2-transformanttien tapauksessa Plasmidi phmw1-7 muodostettiin pilkkomalla phmw1-4 NdeI:llä ja 20 SpeI:11ä Tämän kaksinkertaisen pilkkomisen tuottama 9,0 kbp:n kappale eristettiin, päät tehtiin tylpiksi ja se ligatoitiin uudestaan Myös phmw1-7:11ä transformoitu E coli ilmensi immunoreaktiivisen proteiinin, jonka näennäinen molekyylimassa oli 160 kda, ja joka proteiini oli kooltaan samanlainen kuin phmw1-4- transfonnanttien ilmentämä proteiini Tämä tulos osoitti, että HMW1-rakennegeenin 25 aloituskodoni sijaitsi 3' SpeI-kohtaan nähden DNA-sekvenssianalyysi varmisti tämän johtopäätöksen Kuten edellä on mainittu, lambdahmw1-faagildoonit ilmensivät 125 kda:n suuruisen pääasiallisen immunoreaktiivisen vyöhykkeen, kun taas HMW1-plasmidikloonit 30 phmw1-4 ja phmw1-7, jotka sisälsivät täysipituiseksi oletetun geenin, ilmensivät immunoreaktiivisen proteiinin, jonka koko oli noin 160 kda Tämä kokoero oli

14 116838 hämmentävä Eräs mandollinen selitys oli, että se lisägeeni tai ne lisägeenit, joita tarvittiin HMW1-geenituotteen oikeata jälkikäsittelyä varten, olivat hävinneet alikloonaustoimenpiteessä Tämän mandollisuuden selvittämiseksi muodostettiin plasmidi phmw1-14 Tämä muodoste tehtiin pilkkomalla phmw1 NdeI:llä ja Mlulalä 5 ja istuttamalla phmw1-4:stä eristetty 7,6 kbp:n NdeI-MluI-kappale Tällainen muodoste sisältää täysipituisen HMW1-geenin sekä DNA:n, joka sijaitsee 3' HMW1- geenin suhteen, joka geeni oli läsnä alkuperäisessä HIMW1-faagissa Tällä plasmidilla transformoitu E coli ilmensi suuria immunoreaktiivisia proteiineja, joiden näennäinen molekyylimassa oli 125 ja 160 kda, sekä ylimääräisiä hajoamistuotteita 10 Nämä 125 ja 160 kda:n vyöhykkeet olivat samanlaiset kuin HMW1-faagihajotteissa todetut suuret ja pienet immunoreaktiiviset vyöhykkeet Mielenkiintoista oli todeta, että phmw1-14-muodoste ilmensi samoin merkittäviä määriä proteiinia indusoimattornissa olosuhteissa, mitä tilannetta ei todettu aikaisemmilla muodosteilla I 15 125 ja 160 kda-proteiinien välinen riippuvuus on edelleen jokseenkin epäselvä Jäljempänä kuvattu sekvenssianalyysi paljastaa, että HMW1-geenin voidaan ennustaa koodaavan 159 kda:n suuruista proteiinia Oletetaan, että 160 kda:n proteiini on kypsän 125 kda:n proteiinin esiastemuoto siten, että yhden proteiinin muuttuminen toiseksi riippuu näiden kanden alavirran puoleisen geenin tuotteista 20 HMW1-geenin sekvenssianalyysi (kuvio 1) paljasti 4608 bp:n suuruisen avoimen lukukehyksen (ORF), joka alkaa ATG-kodonista nukleotidin 351 kohdalta ja päättyy TAG-pysäytyskodoniin nukleotidin 4959 kohdalle Oletettu ribosomien sitoutumiskohta sekvenssissä AGGAG alkaa oletettuun aloituskodoniin nähden 10 bp:n verran 25 ylävirran puolelta Viisi muuta kehyksessä sijaitsevaa ATG-kodonia sijaitsee ORF:n alkuun nähden 250 bp:n puitteissa, mutta yhtäkään niistä ei edellä tyypillinen ribosomien sitoutumiskohta ORF:n 5'-reunustava alue sisältää joukon suoria tandemtoistoja, 7 bp:n sekvenssin ATCMC toistuessa 16 kertaa Nämä peräkkäiset toistojaksot päättyvät 100 bp:n päässä 5' oletetusta aloituskodonista Läsnä on 8 bp:n kään- 30 tynyt toisto, joka on tunnusomainen rho:sta riippumattomalle kopioinnin päättäjälle, alkaen nukleotidistä 4983, 25 bp:n päässä 3' oletetusta luennan päättäjästä Näissä

116838 15 kaikissa kolmessa lukukehyksessä on läsnä lukuisia päättäjäkodoneita sekä ORF:n ylä- että alavirrassa 11/V1 -W1-geenin koodaaman proteiinin päätellyn aminohapposekvenssin (kuvio 2) molekyylipaino on 159 000, mikä pitää hyvin yhtä HMW1-4- ja HMW1-7-transformanttien ilmentämien proteiinien näennäisten molekyylipaino- 5 jen kanssa Aminopäätteelle päätellyssä aminohapposekvenssissä ei todeta tyypilliselle signaalisekvenssille tunnusomaisia piirteitä phmw1:n muodostamiseen käytetty Bam1-11 käsittää nukleotidisekvenssin emäsparit 1743-1748 BamHI-kohdan suhteen alavirran puolella sijaitsevan ORF:n voidaan ennustaa koodaavan 111 kda:n suuruisen proteiinin, mikä pitää hyvin yhtä phmwi:n koodaamalle fuusioproteii- 10 nille 115 kda:ksi arvioidun näennäisen molekyylimassan kanssa HMW2-geenin sekvenssi (kuvio 3) koostuu 4431 bp:n ORF-kehyksestä, alkaen ATG-kodonilla nukleotidin 352 kohdalta ja päättyen TAG-pysäytyskodoniin nukleotidin 4783 kohdalle ~2-geenin ORF-kehyksen ensimmäiset 1259 emäsparia 15 ovat samanlaiset kuin HMW1-geenissä Tämän jälkeen sekvenssit alkavat erottua toisistaan, ollen kuitenkin kokonaisuudessaan 80-prosenttisesti samanlaisia Lukuunottamatta yhden emäksen lisäystä HMW2-sekvenssissä nukleotidin 93 kohdalle, HMW1- ja HIVIW2-geenien reunustavat 5'-alueet ovat samanlaisia 310 bp:n verran ylävirran puolella vastaavista aloituskodoneista Niinpä HMW2-geeniä edeltää 20 samanlainen joukko peräkkäisiä toistojaksoja sekä sama oletettu ribosomin sitoutumiskohta, joka sijaitsee 5' HMW1-geeniin nähden Samoin todettiin oletettu kopioinnin päättäjä, joka on samanlainen kuin H/VIWI:n ORF-kehyksen suhteen 3' tunnistettu päättäjä, alkaen nuideotidistä 4804 Näiden kanden geenin pituuksien ero voidaan selittää periaatteessa HMW2-sekvenssissä esiintyvästä 186 bp:n aukosta, 25 joka alkaa nuideotidiasemasta 3839 HMW2-geenin koodaamalle proteiinille päätellyn aminohapposekvenssin (kuvio 4) molekyylipaino on 155 000, ja se on 71- prosenttisesti samanlainen kuin HMW1-geenistä päätelty aminohapposekvenssi Sekä HMW1- että HMW2-geeneistä päätelty aminohapposekvenssi (kuviot 2 ja 4) 30 osoittivat sekvenssin samanlcaltaisuuden Bordetella pertussis bakteerin säiemäiselle hemaggjutiniinille päätellyn aminohapposekvenssin kanssa, joka hemagglutiniini on

16 116838 tämän organismin pintaan liittyvä proteiini Alkuperäiset ja optimoidut TFASTApisteet HMW1:n ja säiemäisen hemagglutiniinin sekvenssivertailun tapauksessa olivat 87 ja 186, vastaavasti, sanakoon ollessa 2 Tässä vertailussa z-pisteitä oli 45,8 Alkuperäiset ja optimoidut TFASTA-pisteet HMW2:n ja säiemäisen hemaggluti- 5 minin sekvenssivertailun tapauksessa olivat 68 ja 196, vastaavasti Tässä viimeksi mainitussa vertailussa z-pisteitä oli 45,8 Alkuperäisten ja optimoitujen TFASTApisteiden ja z-pisteiden suuruuksien perusteella voitiin päätellä, että biologisesti merkittävä riippuvuus esiintyi 1-EVIW1- ja HMW2-geenituotteiden sekä säiemäisen hemagglutiniinin välillä Kun HMW1:n, HMW2:n ja säiemäisen hemagglutiniinin 10 geenistä päätellyt aminohapposekvenssit asetettiin rinnakkain ja kun niitä verrattiin toisiinsa, niin samankaltaisuudet olivat kaikkein selvimmät näiden kolmen sekvenssin aminopäätteen päissä Näissä ennustetuissa peptidisekvensseissä 12 ensimmäisistä 22 aminohaposta olivat samanlaisia Lisäksi sekvensseissä todettiin yhteinen viiden aminohapon pätkä, Asn-Pro-Asn-Gly-Ile, sekä useampia lyhyempiä pätkiä, joi- 15 den sekvenssit olivat samanlaisia, ensimmäisten 200 aminohapon keskuudessa Esimerkki 2 HIVIW1:n ja säiemäisen hemagglutiniinin välisen riippuvuuden lisäselvittämistä var- 20 ten HMW1-4-yhdistehnäproteiinia (rhmvv1) vastaan valmistetun antiseerumin kyky tunnistaa puhdistettu säiemäinen hemagglutiniini määritettiin rlimw1- antiseenunilla todettiin ELISA-reaktiivisuutta säiemäisen hemagglutiniinin kanssa annoksesta riippuvalla tavalla Ennen immunisointia otetulla kaniinin seerumilla oli hyvin vähäistä reaktiivisuutta tässä määrityksessä rhmw1-antiseerumia tutkittiin 25 myös Westem-blottausmäärityksessä ja sillä todettiin heikkoa mutta kuitenkin positiivista reaktiivisuutta puhdistetun säiemäisen hemagglutiniinin kanssa myös tässä järjestelmässä HMW1-geenituotetta vastaavan luonnollisen Haemophilus-proteiinin tunnistamisek- 30 sija sen määrittämiseksi, missä määrin antigeenisesti Idoonatun HMW1-geenin tuot- teen kaltaiset proteiinit olivat yleisiä muiden tyypittömien H influenzae kantojen

17 116838 keskuudessa, joukko Haemophilus-kantoja seulottiin Western-blottauksen avulla rhmw1-antiseerumia käyttäen Tämä antiseerumi tunnisti sekä 125 että 120 kda:n proteiinivyöhykkeen homologisessa kannassa 12, jotka vyöhykkeet olivat vastaavasti HIVIW1- ja HMW2-geenien oletettuja kypsiä proteiinituotteita 5 Kun rhmw1-antiseerumia käytettiin heterologisten tyypittömien H influenzae kantojen seulomiseen, tämä antiseerumi tunnisti molekyylipainoltaan suuria proteiineja 75 %:ssa 125 epidemiologisesti toisistaan poikkeavista kannoista Yleisesti, antiseerumi reagoi yhden tai kanden proteiinivyöhykkeen kanssa 100-150 kda- 10 alueella kussakin heterologisessa kannassa tuottaen kuvion, joka oli samankaltainen, ei kuitenkaan samanlainen kuin homologisen kannan tapauksessa todettu kuvio Monoklonaalinen vasta-aine X3C on hiiren IgG-vasta-aine, jonka vaikutus kohdistuu B pertussis bakteerin säiemäistä hemagglutiniiniproteiinia vastaan Tämä vasta- 15 aine kykenee estämään B pertussis solujen sitoutumisen kiinanhamsterin munasarjasoluihin ja HeLa-soluihin viljelmässä, ja se estää erytrosyyttien hemagglutinaation, jota puhdistettu säiemäinen hemagglutiniini aiheuttaa Westem-blottausmääritys toteutettiin, jossa määritylcsessä tämä monoklonaalinen vasta-aine seulottiin tyypittömien H influenzae kantojen samaa, edellä tarkasteltua ryhmää vastaan Mono- 20 klonaalinen vasta-aine X3C tunnisti molemmat molekyylipainoltaan suuret proteiinit tyypittömässä H influenzae kannassa 12, jotka proteiinit yhdistelmäproteiinin antiseerumi tunnisti Lisäksi tämä monoklonaalinen vasta-aine tunnisti proteiinivyöhykkeet heterologisten tyypittömien H influenzae kantojen alajoukosta, jotka vyöhykkeet olivat samanlaisia kuin yhdistelmäproteiinin antiseerumin tunnistamat vyö- 25 hykkeet Tilanteen salliessa säiemäisen hemagglutiniinin monoklonaalinen vastaaine näytti tunnistavan ainoastaan yhden niistä kandesta vyöhykkeestä, jotka yhdistelmäproteiinin antiseerumi oli tunnistanut Yhteenvetona, monoklonaalinen vastaaine X3C tunnisti molekyylipainoltaan suuria proteiineja vastaavat vyöhykkeet, jotka olivat samanlaisia kuin rhmw1-antiseerumin tunnistamat vyöhykkeet noin 35 30 %:ssa tapauksista tyypittömien H influenzae kantojen kokoelmassamme

18 116838 Esimerkki 3 Mutantit, jotka eivät ilmentäneet HMW1:tä, HMW2:ta tai ei kumpaakaan näistä proteiineista, muodostettiin, jotta voitaisiin selvittää näiden proteiinien merkitys bak- 5 teereiden tarttuvuudelle Seuraavaa strategiaa käytettiin phmw1-14 (katso esimerkki 1, kuvio 5A) pilkottiin BamHl:llä ja ligatoitiin sitten kanamysiinikasettiin, joka oli eristetty puc4k:sta peräisin olevassa 1,3 kb:n BamHI-kappaleessa Tuloksena saatu plasmidi (phmw1-17) tehtiin lineaariseksi pilkkomalla XbaI: llä ja se transformoitiin tyypittömään K influenzae kantaan 12, minkä jälkeen kanamysiinil- 10 le vastustuskykyiset pesäkkeet valikoitiin Tällaisten pesäkkeiden erään joukon Southem-analyysi osoitti kaksi transformanttien populaatiota, yhden, jossa istutus oli tapahtunut HMW1-rakennegeeniin ja toisen, jossa istutus oli HMW2-rakennegeenissä Yksi mutantti kustakin näistä luokista valittiin lisätutkimuksia varten 15 Mutantit, jotka eivät ilmentäneet kumpaakaan proteiinia, saatiin talteen seuraavalla menetelmällä Sen jälkeen, kun kanden EcoRI-kohdan välissä sijaitseva, 2,1 kb:n suuruinen DNA-kappale, joka kattoi HMW1-rakennegeenin 3'-osan phmw-15:ssa, oli hävitetty, puc4k:sta peräisin oleva kanamysiinikasetti istutettiin 1,3 kb:n suuruisena EcoRI-kappaleena Tuloksena ollut plasmidi (phmw1-16) tehtiin lineaariseksi 20 pilkkomalla Xbal:llä ja transformoitiin kantaan 12, minkä jälkeen valikoitiin jälleen kanamysiinille vastustuskykyiset pesälckeet Näistä pesäkkeistä otettujen edustavien näytteiden Southem-analyysi osoitti, että seitsemässä kandeksasta tapauksesta istutus oli tapahtunut sekä HMW1- että HMW2-sijaintikohtaan Yksi tällainen mutantti valikoitiin lisätutkimuksia varten 25 Tavoiteltujen fenotyyppien varmistamiseksi mutanttikannat tutkittiin Westemblottausanalyysillä käyttäen polyklonaalista antiseerumia yhdistelmä-hmw1- proteiinia vastaan Emäkanta ilmensi sekä 125 kd:n HMW1-protelinin että 120 kd:n HMW2-proteiinin Sitä vastoin HMW2-mutantti ei ilmentänyt 120 kd:n proteiinia ja 30 HMW1-mutantti ei ilmentänyt 125 kd:n proteiinia Kaksoismutantti ei ilmentänyt kumpaakaan proteiinia Kokosoluhajotteiden, ulkokalvoprofiilien ja pesäkkeiden

19 116838 morfologian perusteella villityypin kanta ja mutantit olivat muuten keskenään samanlaisia Tarkastelu transmissioelektronimikroskoopilla osoitti, ettei yhdessäkään neljässä kannassa esiintynyt värekarvoja 5 Villityypin kannan 12 kyky tarttua Chang-epiteelisoluihin selvitettiin Tällaisissa määrityksissä bakteereita siirrostettiin elatusalustaan ja niiden annettiin kasvaa siten, että tiheydeksi saatiin noin 2 x 10 9 pesäkettä muodostavaa yksikköä/ml (efu/m1) Noin 2x107 cfu ta siirrostettiin epiteelisolujen ylesikerrosten päälle ja maljoja sentrifugoitiin hellävaroen nopeudella 165 x g 5 minuuttia helpottamaan bakteereiden ja 10 epiteelipinnan välistä kosketusta Maljoja inkuboitiin 30 minuuttia 37 C:ssa 5 % 2:sqa, minkä jälkeen yksikerrokset huuhdottiin 5 kertaan PBS-liuoksella tarttumatta jääneiden organismien poistamiseksi ja niitä käsiteltiin trypsiini-edta:11a (0,05 % trypsiiniä, 0,5 % EDTA:ta) PBS-liuoksessa niiden irrottamiseksi muovialustalta Kuoppien sisältö sekoitettiin ja laimennokset maljattiin kiinteälle alustal- 15 le, jotta voitaisiin määrittää tarttuneiden bakteereiden lukumäärä yksikerrosta kohden Prosentuaalinen tarttuvuus laskettiin jakamalla tarttuneiden cfu-yksiköiden lukumäärä yksikerrosta kohden siirrostettujen cfu-yksiköiden lukumäärällä Kuten alla olevassa taulukossa 1 on esitetty (taulukot ovat kuvauksen lopussa), tämä 20 kanta tarttui sangen tehokkaasti, siirrosteen tarttuessa lähes 90-prosenttisesti yksikerrokseen HMW1-proteiinia ilmentävän mutta HMW2-proteiinia ilmentämättömän (HMW2) mutantin tarttuvuus oli myös sangen tehokasta ja verrattavissa villityyppiä olevan kannan tarttuvuuteen Sitä vastoin HMW2-proteiinia ilmentävän mutta HMW1-proteiinin ilmentämisen suhteen puutteellisen (HMW1) kannan tarttuvuus 25 oli pienentynyt noin 15:een osaan villityyppiin verrattuna 1Calesoismutantin (HMW171-IMWT) tarttuvuus oli vieläkin pienempi, arviolta 50 osa villityyppiin verrattuna ja noin 1/3 HMW1-mutanttiin verrattuna Kokonaisuutena tarkastellen näiden tulosten perusteella voidaan päätellä, että sekä 111v1W1-proteiinilla että HMW2-proteiinilla on vaikutusta tarttuvuuteen Chang-epiteelisoluihin On mielen- 30 kiintoista todeta, että optimaalinen tarttuvuus tähän solulinjaan näyttää vaativan HMW1-proteiinia muttei HMW2:ta

20 116838 Esimerkki 4 Plasmideja phimw1-16 ja phimw1-17 (katso esimerkki 3) käyttämällä ja esimer- 5 iässä 3 kuvattua, kannan 12 tapauksessa käytettyä menettelyä noudattamalla kolme tyypittömän Haemophilus-kannan 5 mutanttia eristettiin, mukaan lukien yksi sellainen mutantti, jossa kanamysiinigeeni oli istutettu hmwl:n kaltaiseen (josta käytetään merkintää hmw3) sijaintikohtaan, toinen sellainen mutantti, jossa istuttaminen oli tapahtunut hmw2:n kaltaiseen (josta käytetään merkintää hmw4) sijaintikohtaan, ja 10 kolmas, jossa istuttaminen oli tehty molempiin sijaintikohtiin Ennusteen mukaisesti Westem-blottausanalyysi osoitti, että mutantissa, jossa kanamysiinikasetti oli istutettu hmwl:n kaltaiseen sijaintikohtaan, oli menetetty HMW3 125 kd proteiinin ilmestyminen, kun taas mutantti, jossa istuttaminen oli tehty hmw2:n kaltaiseen sijaintikohtaan, ei kyennyt ilmentämään HMW4 123 kd proteiinia Mutantti, jossa istutta- 15 minen oli tehty kahteen kertaan, ei kyennyt ilmentämään kumpaakaan molekyylipainoltaan suurta proteiinia Kuten alla olevasta taulukosta 1 nähdään, villityypin kannan 5 tapauksessa todettiin hyvä tarttuvuus, siirosteen tarttuessa lähes 80-prosenttisesti ylcsikerrokseen Mutan- 20 tin, joka ei kyennyt ilmentämään HMW2:n kaltaista proteiinia, tarttuvuus oli myös melko suuri Sitä vastoin mutantin, joka ei kyennyt ilmentämään HMW1:n kaltaista proteiinia, tarttuvuus oli pienentynyt noin viidenteen osaan villityypin tarttuvuudesta, ja kaksoismutantin tarttuvuus oli pienentynyt vieläkin enemmän (noin 25:een osaan) Giemsa-värjättyjen näytteiden tarkastelu varmisti nämä havainnot (ei esitetty) Täten 25 kannalla 5 saadut tulokset tukevat kannalla 12 sekä HMW1- ja HMW2-proteiineilla saatuja tuloksia Esimerkki 5 30 Jotta voitaisiin varmistaa HMW1- ja HMW2-proteiinien merkitys tarttuvuudelle ja jotta voitaisiin tutkia HMW1:n ja HMW2:n vaikutusta H influenzaen muista pintarakenteista riippumatta, hmw I- ja hmw2-geenirylunät istutettiin E coli DH5a-

21 116838 kantaan, käyttäen vastaavasti plasmideja phmvv1-14 ja phiviw2-21 Vertailun mandollistamiseksi kloonausvektori pt7-7 transformoitiin myös E coli DH5akantaan Westem-blottausanalyysi osoitti, että hmwl-geenit sisältävä E coli DH5a ilmensi 125 kda:n proteiinin, kun taas tämä sama kanta, joka sisälsi hmw2-geenit, 5 ilmensi 120 kda:n proteiinin pt7-7:n sisältävä E coli DH5a ei kyennyt reagoimaan yhdistelmä-hiviw1dä vastaan vaikuttavan antiseerumin kanssa Tarkastelu transmissioelektronimikroskoopilla ei paljastanut värekarvojen tai muiden pintalisäkkeiden läsnäoloa yhdenkään E coli kannan pinnalla 10 E coli kantojen tarttuvuus kvantitoitiin ja sitä verrattiin villityyppiä olevan tyypittömän H influenzae kannan 12 tarttuvuuteen Kuten alla olevasta taulukosta 2 nähdään, pelkän vektorin sisältävän E coli DH5a:n tarttuvuus oli vähemmän kuin 1 % kannan 12 tarttuvuudesta Sitä vastoin E coli DH5a, joka sisälsi hmwl-geeniryhmän, tapauksessa todettiin tarttuvuustasoja, jotka olivat verrattavissa kannan 12 ta- 15 pauksessa todettuihin tarttuvuustasoihin E coli DH5a:n, joka sisälsi hmw2-geenit, tarttuvuus oli noin kuudesosa kannan 12 tarttuvuudesta, ollen kuitenkin 20 kertaa suurempi kuin pelkän pt7-7:n sisältävän E coli DH5a:n tarttuvuus Nämä tulokset osoittavat, että HMW1- ja HMW2-proteiinit kykenevät välittämään itsenäisesti tarttuvuutta Chang-sidekalvosoluihin Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä esimerkeissä 3 ja 20 4 H influenzae mutanteilla saatujen tulosten kanssa, osoittaen edelleen, että Changepiteelisolujen tapauksessa HMW1 on tehokkaampi adhesiini kuin HMW2 25 E coli HB101:11ä, joka käsitti pt7-7:n, pfllv1w1-14:n tai phmw2-21:n, toteutetut kokeet vahvistivat DH5a-johdannaisilla saadut tulokset (katso taulukko 2) Esimerkki 6 HMW1 ja HMW2 eristettiin ja puhdistetiin tyypittömästä H influenzae (NTI-H) kannasta 12 seuraavalla tavalla Pakastetusta varastoviljelmästä saatuja tyypittömiä 30 Haemophilus-bakteereita vedettiin suldaamaljalle ja niitä kasvatettiin yön yli 37 C:ssa lämpökaapissa, joka sisälsi 5 % 2da 50 ml:aan aloitusviljelmää eli aivo-

22 116838 sydän-infuusioelatusalustaa (BHI), jota oli täydennetty sekä hemiinillä että NAD:illa kulloinkin pitoisuudeksi 10 µg/ml, siirrostettiin suldaamaljan kasvua Tätä aloitusviljelmää kasvatettiin niin kauan, kunnes optiseksi tiheydeksi (OD - 600 nm) saatiin 0,6-0,8, ja sitten tämän aloitusviljelmän bakteereita siirrostettiin kuuteen 500 ml:n 5 pulloon, joissa oli täydennettyä BHI-elatusalustaa, käyttäen 8-10 ml pulloa kohden Bakteereita kasvatettiin 500 ml:n pulloissa vielä 5-6 tuntia, jossa ajassa OD oli noussut arvoon 1,5 tai sitä suuremmaksi Viljelmiä sentrifugoitiin nopeudella 10 000 rpm 10 minuutin ajan 10 Bakteerikasautumat suspendoitiin uudestaan 250 ml:n kokonaistilavuuteen uuttoliuosta, joka käsitti 0,5 M NAC1, 0,01 M Na2EDTA, 0,01 M Tris, 50 JIM 1,10-fenantroliinia, ph 7,5 Soluja ei käsitelty ultraäänellä eikä niitä rikottu muulla tavalla Uudelleensuspendoidut solut laitettiin jäihin 0 C:ssa 60 minuutiksi Uudelleensuspendoituja soluja sentrifugoitiin nopeudella 10 000 kierr/min 10 minuuttia 4 C:ssa 15 siten, että suurin osa kokonaisista soluista ja solujätteestä saatiin poistetuiksi Supernatantti kerättiin talteen ja sitä sentrifugoitiin nopeudella 100 000 x g 60 minuuttia 4 C:ssa Jälleen supematantti otettiin talteen ja sitä dialysoitiin yön yli 4 C:ssa natriumfosfaattia (0,01 M, ph 6,0 vastaan) 20 Näytettä sentrifugoitiin nopeudella 10 000 kierr/min 10 minuuttia 4 C:ssa dialyysin aikana liuoksesta saostuneen liukenemattoman jätteen poistamiseksi Supematantti laitettiin 10 ml:n CM Sepharose-pylvääseen, jota oli tasapainotettu edeltäkäsin 0,01 M natriumfosfaatilla, ph 6 Sen jälkeen, kun supematantti oli laitettu tähän pylvääseen, pylvästä pestiin 0,01 M natriumfosfaatilla Proteiinit eluoitlin pylväästä 0 -> 25 0,5 M KC1-gradientilla 0,01 M Na-fosfaatissa, ph 6, ja jakeita kerättiin talteen geelitutkimusta varten Pylväästä saatujen jakeiden Coomassie-geelit toteutettiin molekyylipainoltaan suuria proteiineja sisältävien jakeiden tunnistamiseksi Näitä molekyylipainoltaan suuria proteiineja sisältävät jakeet yhdistettiin ja väkevöitiin siten, että tilavuudeksi saatiin 1-3 ml, geelisuodatuspylvästä varten tarkoitetun näytteen 30 valmistamiseksi

23 116838 Sepharose CL-4B-geelisuodatuspylväs tasapainotettiin fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, ph 7,5 Väkevöity, molekyylipainoltaan suurta proteiinia sisältävä näyte laitettiin geelisuodatuspylvääseen ja pylväästä kerättiin jakeita Coomassie-geelit toteutettiin pylväästä saaduilla jakeilla niiden jakeiden tunnistamiseksi, jotka jakeet 5 sisälsivät molekyylipainoltaan suuria proteiineja Pylväästä saadut, molekyylipainoltaan suuria proteiineja sisältävät jakeet yhdistettiin : : Proteiinit testattiin, jotta saataisiin määritetyksi se, suojaavatko ne homologisella kannalla aiheutetulta kokeelliselta korvatulehdukselta 10 Chinchilloille annettiin kerran kuukaudessa ihon alaisena injektiona 40 µg HMW1- HMW2 -proteiiniseosta Freundin apuaineessa yhteensä kolme kertaa Sen jälkeen, kun viimeisestä injektiosta oli kulunut yksi kuukausi, eläimet altistettiin intrabullaarisesti 300 cfu-yksikölle NTHI-kantaa 12 15 Infektio kehittyi 5 vertailueläimessä viidestä, ja 5 immunoidussa eläimessä 10:stä Infelctoitujen eläinten keskuudessa keskikorvan nesteessä esiintyvän bakteerilukumäärän geometrinen keskiarvo 7 vuorokautta altistamisen jälkeen oli 7,4 x 10 6 vertailueläimissä ja 1,3 x 10 5 immunoiduissa eläimissä 20 Seerumin vasta-ainetiitterit immunisoinnin jälkeen olivat toisiinsa verrattavissa infektoitumattomissa ja infektoiduissa eläimissä Immunisoiduissa eläimissä esiintyvään infektioon liittyi kuitenkin yleisesti sellaisten bakteereiden ihnaantumista, joiden bakteereiden tapauksessa HMW-proteiinien ilmentyminen oli tukahtunutta, 25 minkä perusteella voidaan päätellä, että bakteerit olivat valikoituneet vasteena immunologiselle paineelle Vaikka nämä tulokset osoittavatkin, ettei suoja inununisoinnin jälkeen ollut täydellistä, niin kuitenkin näiden tietojen perusteella voidaan päätellä, että HMW-ad- 30 hesiiniproteiinit ovat mandollisesti tärkeitä suojaavia antigeeneja, jotka voivat toimia yhtenä komponenttina monta komponenttia käsittävässä NTHI-rokotteessa