Ribosomit ja valkuaisainesynteesi. Geenien tehokkuudessa eroja. RNA:n synteesi. DNA:sta proteiiniksi Geneettisen informaation kulku.

Transkriptio

1 DNA:sta proteiiniksi Geneettisen informaation kulku Ribosomit ja valkuaisainesynteesi Chapter 6 Figure 6-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Geenien tehokkuudessa eroja RNA:n synteesi Proteiinimäärissä selvä ero A:n hyväksi Figure 6-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

2 Solut tuottavat useita RNA-tyyppejä Transkription periaate Eukaryoottien transkription alkaminen tarvitsee useita proteiineja Bakteereilla vain yksi RNA-polymeraasi Templaatti DNA:n lukusuunta 3 5, polymeraasin suunta riippuu promoottorisekvenssin orientaatiosta, määrää paikan, mistä RNA-polymeraasi aloittaa transkription Table 6-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Bakteerin RNA-polymeraasin transkriptiosykli 10 nukleotidin synteesin jälkeen RNA-polymeraasi menettää vuorovaikutuksen promootteri DNA:han Figure 6-11 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Table 6-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

3 Eukaryootin geeni aloittaa transkription RNA-polymeraasi II:lla. Promoottori sisältää DNA-skevenssin = TATA-box. TBP havaitsee sen ja sitoutuu.tfiib tuodaan paikalle. Muut transkriptiotekijät ja RNA-polymeraasi tulevat paikalle. Figure 6-16 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Table 6-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) mrna:n kuljettaminen tumahuokosen läpi Ribosomit ja valkuaisainesynteesi vesikanava 1. Mikrosomit ja ribosomien löytyminen 2. Rakenne 3. Proteiinisynteesin periaate 4. Polyribosomit eli polysomit 5. Translaatio ja proteiinien jatkokäsittely 6. Virheiden minimointi 7. Proteiinien hajoaminen kypsyminen pakkaaminen Figure 6-39a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

4 Mikrosomit ja ribosomien löytyminen Ribosomit Palade & Siekevitz eristivät jaottelusentrifugaatiolla ns. mikrosomeja radioakt. aminohapot kertyivät mikrosomeihin, jotka peräisin rer:ää sisältävistä soluista proteiinisynteesi soluliman basofiilinen aines RNA:ta (hav. 40- luvulla) EM: ø 30 nm:n jyväset vastasivat basofiilista materiaalia radioakt. aminohapot osoittivat jyväset valkuaisainesynteesin paikaksi RNA:sta mikrosomeille nimitys ribosomi ribosomeja on kaikissa valk.ainesynteesiin pystyvissä soluissa prokaryooteilla hajallaan eukaryooteilla suuri osa liittynyt ER:n rer (spesifisesti proteiineja sitovat) Rakenne Ribosomit rakenne... mitokondrioissa ja viherhiukkasissa omat ribosomit perusrakenne sama kaikissa soluissa 2 osaa (subunits), joissa molemmissa RNA:ta (2/3) ja proteiineja (1/3) rakentuminen alayksiköistä itseohjautuva tapahtuma (perustuu rrna:n informaatioon) ribosomipartikkelissa aina 2 uurretta: 1. syntyvää polypeptidiketjua varten 2. lähetti-rna:ta varten nisäkässolussa n. 10x10 6 ribosomia ribosomaalinen RNA (rrna) tuotetaan tumassa, sen tumajyväsessa (nukleolus) emäkset: A, G, C, U osa nukleotideista metyloituneita

5 Ribosomit rakenne rrna-geenit esiintyvät monistuneina, n. 200 kopiota/geeni transkriptio tehokasta (huom! rrna on lopputuote!) bakteerit eukaryosyytit koko 21x29 nm, 70S MW 2,5 milj. 22x32 nm, 80S MW 4,2 milj. alayksiköt 50S + 30S 60S + 40S suurempi alayksikkö pienempi alayksikkö 50S, MW 1,6 milj. 5S rrna 0,12 kb 23S rrna 2,9 kb 34 proteiinia 30S, MW 0,9 milj. 16S rrna 1,54 kb 21 proteiinia 60S, MW 2,8 milj. 5S rrna 0,12 kb 28S rrna 4,7 kb n. 49 proteiinia 40S, MW 1,4 milj. 18S rrna 1,9 kb n. 33 proteiinia (S = sedimentaatiovakio, koon, muodon ja tiheyden funktio, ei additiivinen esim. 30S + 50S = 70S, kb = kilobase = 1000 nukleotidia) Proteiinisynteesin periaate 1 tapahtuu aina polyribosomeissa eli polysomeissa (lähetti-rna:n eli mrna:n toisiinsa liittämiä ribosomeja) tuma mrna mrna:n 1 kodoni (3 emästä) 1 aminohappo prot. synteesissä ribosomi liukuu pitkin urassaan olevaa mrna:ta mrna määrää aminohappojärjestyksen eli proteiinin primaarirakenteen ribosomi käyttää 4 ATP:tä/peptidisidos Figure 6-63 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

6 Proteiinisynteesin periaate 2 Proteiinisynteesin periaate 3 aminohapon tuo paikalle trna (siirtäjä eli transfer RNA) aminohappo + trna aminoasyyli-trna (AA-tRNA), korkeaenerginen tuottaa osan synteesin vaatimasta energiasta ah:n ja trna:n kytkee yhteen entsyymi, spesifinen tunnistus trna käsittää n. 80 nukleotidia muod. polynukleotidiketju kiertyy 2-kierteeksi (komplementaariset emäkset) poikkeavat emäkset taipuminen apilanlehtikuvioon aminohapon paikan tunnistaa trna eikä aminohappo itse mrna:ta muokataan ennen proteiinisynteesiä mrna:n synteesi = transkriptio mrna:n viestin lukeminen ( kääntäminen ) = translaatio trna trna modifioidaan kovalenttisesti ennen kuin poistuu tumasta RNA-polymeraasi III syntetisoi eukaryoottien trna:t Aluksi isompi, joka trimmataan pienemmäksi Joissakin introneita, jotka poistetaan leikka ja liimaa systeemillä trna:n voi olla väärin laskostunut splicing and trimming trna Kaikki trna:t modifioidaan ensin, 1-10 nukleotidia muutetaan Tunnetaan yli 50 trna:n modifikaatiota

7 trna:n syntetaasin editoiminen varmistaa laadun Geneettinen koodi käännetään kahden adaptorin avulla Varmistetaan, että syntetaasi liittää oikean aminohapon trna:han Oikeaan ah:oon suurin affiniteetti Aminohapon liittäminen kovalenttisesti AMP:hen Hydrolyytin editoinnin avulla estetään virheet, 1/ tarkkuus Poistetaan virheellisesti kiinnittyneet aminohapot Figure 6-58 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Hydrolyytin editointi Translaatio kolme vaihetta: 1. Initiaatio eli aloitus mrna + 40S osa (pienempi osa) kolmen proteiinin (initiaatiofaktorit) avustamana energia GTP:stä solussa initiaatiokoodi aina AUG; koodaa aminohappo metioniinin bakteereissa, mitokondrioissa, kloroplasteissa; formylmetioniini kun met. kiinnittynyt paikoilleen 60S-osa kiinnittyy metioniinin jälkeen Figure 6-59 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

8 Initiaatio 1 Suunta vasemmalta oikealle! Small ribosomal subunit Pienemmän alayksikön rooli? Peptidiketju jatkuu 2 ah/s Upstream nucleotide sequence distinguishes initiation AUG sequence Initiator trna Figure 6-64 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Initiaatio 2 Initiaatio 3 Mikä on suuremman yksikön rooli? 30S Initiation complex (mrna aligned, amino terminal Met in place) Large ribosomal subunit

9 Initiaatio 4 Proteiinisynteesi Elongaatio eli piteneminen uusien ah:jen liittyminen n. 2 ah/s keskikokoinen proteiini syntyy n. 60 sekunnissa ah:t liittyvät peptidiketjun karboksyylipäähän 3. Terminaatio eli lopetus lopetuskoodi: UAA, UAG, UGA ribosomi hajoaa alayksiköikseen (dissosioituu) prot. irtoaa mrna vapautuu irtoamiseen tarvitaan kaksi terminaatiofaktoria ja vielä yksi GTP 70S initiation complex (ready for elongation) Elongaatio 1 Elongaatio 2 ELONGATION Aminoacyl-tRNA P site Peptidyl-tRNA A-puoli on oikealla

10 Elongaatio 3 Elongaatio 4 Peptide bond Uncharged-tRNA Peptidyl-tRNA Terminaatio TERMINATION Peptidyl-tRNA Polypeptide mrna Link between polypeptide and trna broken Terminationn complex mrna Stop codon Release factors Lopetuskoodi: UAA, UAG, UGA Stop codon

11 Released polypeptide Elongaatiofaktorit ohjaavat translaatiota ja lisäävät sen tarkkuutta Lopuksi ribosomi dissosioituu alayksiköikseen 2 elongaatiofaktoria (EF) tuovat ribosomiin aminohapon ja jättävät ribosomin kunkin syklin aikana GTP hydrolysoituu konformaatiomuutoksia prosessin aikana Bakteereilla: EF-Tu ja EF-G Eukaryooteilla: EF1 ja EF2 Ribosomal subunits dissociate Translaatiosykli yksityiskohtaisesti Vielä kerran proteiinisynteesin vaiheet yhdessä kuvassa Growing polypeptide Completed polypeptide Incoming ribosomal subunits Start of mrna (5 end) End of mrna 3 end) Figure 6-67 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

12 trna:n rakenne, bakteerin suurempi yksikkö (rtg-kristallografi) 23S rrna kaavamainen rakenne. Emästen pariutuminen. Figure 6-69a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 6-69b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) SRP receptor Signal recognition particle (SRP) Signal sequence (hydrophobic) Ribosome mrna Protein synthesis begins Lumen of rough eendoplasmic reticulum Protein synthesis inhibited Signal peptidase Protein synthesis resumes Mikä suuntaa polypeptidit ja sopivat signaalipeptidit esim. endoplasmakalvoston lumeniin? Docking proteiiniksi tai signaaliproteiiniksi sanottu reseptori (SRP) vetää polypeptidin lumeniin.

13 Virheiden minimointi 1 Virheiden minimointi 2 mrna kodoni ja trna:n antikodoni virhe 1/100 sidoksen löystyminen virheet vähenevät 1/2000 mrna:n kodonin lisäksi trna:n mutkalla 3 sitoutumispaikkaa (A,R,P) trna heilahtaa A R, jos sidos mrna:n ei riittävän luja, sidos irtoaa vapaiden ribosomien syntetisoimat proteiinit suoraan solulimaan osittain sytosolin ribosomeissa, pääasiassa rer:n kalvoihin kiinnittyneissä ribosomeissa rer membraanin läpi ER:n onteloihin rer proteiineissa signaalisekvenssi alussa (leikataan myöhemmin pois) usein glykosylointi ER:n onteloissa Ks. edelliset luentokerrat: Signaalijakso ohjaa ER sisällä, SRP, tyypin I ja II kalvoproteiinit, dolikolin merkitys glykoproteiinin synteesissä. Laskostuminen voi alkaa synteesin aikana Chaperonit auttavat laskostumisessa Heat shock proteins HSP60 ja HSP70 (BIP) Endoplasmakalvostossa ks. edelliset luentokerrat Figure 6-82 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

14 Figure 6-84 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 6-85 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) HSP70 chaperonina Hydrofobiset alueet proteiinien laadun kontrolloimisessa Figure 6-86 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 6-87 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

15 Proteiinien hajoaminen Vain oikein laskostuneet proteiinit ja oikein muodostuneet proteiiniyhdistelmät pääsevät eteenpäin ER:ssa Virheellisesti laskostuneet hajoavat endoplasmakalvostoon liittyvä proteiinien hajotus, ERAD (endoplasmic reticulum associated protein degradation) Ylijääneet alayksiköt hajotetaan samalla mekanismilla Hajotettavat proteiinit poistetaan ER:sta Hajotus sytoplasman proteasomeissa Figure 6-88 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Proteasomi Proteiinien hajoaminen Proteasomi on suuri useiden proteiinien muodostama entsyymiyhdistelmä, holoentsyymi. Ubikitiinin ja proteasomin osuus hajoamisessa Figure 6-89 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

16 Proteiinin hajoaminen 1 Proteiinin hajoaminen 2 Vaihe 1 Hajotettava proteiini kulkeutuu ulos endoplasmakalvostosta sytoplasmaan Vaihe 2 Hajotettava proteiini merkitään useilla ubikitiineillä ja viedään proteasomille Proteiinin hajoaminen 3 Vaihe 3 Ydinkappaleessa hajotettava proteiini pilkotaan peptideiksi Muut proteaasit ja aminopeptidaasit viimeistelevät hajotustyön Proteasomi koostuu säätelykappaleesta (19 S) ja ydinkappaleesta (20 S) 7 -alayksikkö, 7, 7, 7. Proteolyyttiset kohdat alayksiköissä. Figure 6-90 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

17 Ubikitiiniin liittyminen proteiineihin Kolmivaiheinen entsyymijärjestelmä 1) E1-entsyymi aktivoi ubikitiinin, 2) E2 siirtää sen ubikitiiniligaasin-ryhmän entsyymille, 3) joka siirtää sen hajotettavaksi määrättyyn proteiiniin Figure 6-91b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Ubikitinaatio Ubikitiinin 3D-malli Ubikitinaatio on erittäin keskeinen osa solunsisäistä tiedonsiirtoa. solujen viestinvälityksessä solunjakautumisessa solukuolemassa Figure 6-92a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

18 Ubikitiini merkkaa proteiinin Figure 6-92b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 6-92c Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Epänormaalisti laskostuneet proteiinit monien sairauksien syynä Sirppisoluanemia -1-antitrypsiini puutos maksasairaus ja enfysema Mutantti proteiini pääsee läpi solujen laatukontrollista Kriittisten makromolekyylien aggregaatit tuhoavat soluja ja aiheuttavat solukuolemia Mutantti alleeli saattaa periytyä Figure 6-93 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

19 Ihmisen sairauksiin liittyviä proteiiniaggregaatteja Ristikkäisiä betafilamentteja Yleinen tyyppi proteaasi resistentistä proteiini aggregaatista Liittyy eräisiin ihmisen neurologisiin tauteihin Amyloidikasaumia Mikä sairaus? Figure 6-95a,b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 6-95c Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Prionitauteja -helix muuttuu neljäksi suoraksi rakenteeksi ( -strands) Huntington, Alzheimer Leviävät organismista toiseen, yksilöstä toiseen Scrapie lampailla Creutzfeldt-Jacob (CJD) ihmisellä Bovine spongiform encephalopathy (BSE) naudoilla Johtuu PrP-proteiinin epätäydellisestä laskostumisesta (PrP = prioniproteiini) PrP on normaalisti neuronien solukalvon ulkopinnalla Figure 6-95d Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

20 Prioni-kannan luominen Eukaryootin solun proteiinituotanto Uusien alayksiköiden lisääminen amyloidityypit Figure 6-96 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 6-97 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)