Koristeomenapuiden DNA-tutkimus: suomalaisilla taimitarhoilla lisättävien koristeomenapuiden lajikeaitous DEVEPARK

Transkriptio

1 Koristeomenapuiden DNA-tutkimus: suomalaisilla taimitarhoilla lisättävien koristeomenapuiden lajikeaitous DEVEPARK Vuorinen/DEVEPARK

2 Koristeomenapuut ja muut omput Omenapuita (Malus Mill.) on käytetty hyödyksi jo hyvin pitkään muun muassa ravinnonlähteenä Yhteisymmärrystä lajimääristä ei vieläkään ole (noin parikymmentä lajia) Nimet ovat vaihtuneet ja muutuneet. Muun muassa Malusten erottaminen Pyruksista Laji- ja lajikekuvaukset usein kovin suppeita Malus-suvun lajit hybridisoituvat vapaasti (Korban 1986, Campbell ynnä muut 1991) Koristeellisuutensa vuoksi omenapuita on jalostettu luvulta asti, Rosybloomit 1900-luvun alkupuolella Koristeomenapuulajikkeita tällä hetkellä lukematon määrä ja jokaiseen makuun (vaikkakin täällä meillä Suomessa joudumme tyytymään kapeampaan valikoimaan) Vuorinen/ DEVEPARK

3 Mikrosatelliitit Lyhyitä DNA-pätkiä joissa sama muutaman nukleotidin jakso toistuu useamman kerran (esim TATATA tai vaikkapa CATG n ) Mikrosatelliittien monimuotoisuus perustuu pituuden vaihteluun eikä sekvenssin kuten DNA:lla Hyviä puolia: DNA:n tarve vähäinen, osittainen hajoaminen ei useimmiten haittaa, alhaiset kustannukset, korkea informatiivisuus, lajispesifisyys Huonoja puolia: lajispesifisyys, homoplasia, mutaatiot kiinnittymisalueella, piikkien tulkinta Markkereina käytetyt mikrosatelliitit useimmiten DNA:n epäkoodaavalla alueella (Ellegren 2004) Vuorinen/ DEVEPARK

4 Malus-suvun tutkiminen mikrosatelliittimerkkien avulla Mikrosatelliittimerkit soveltuvat laajojenkin aineistojen tutkimiseen. Routson ynnä muut (2009) selvittivät niiden avulla historiallisten omenapuiden identiteettiä Yhdysvalloissa (280 puuta ja 109 vertailunäytettä) Myös kokoelmien tutkiminen mahdollista. Van Treuren ynnä muut (2010) selvittivät omenapuiden monimuotoisuutta Alankomaissa (695 puuta) Lajien välisiä sukulaisuussuhteita ei mikrosatelliiteilla ole saatu selvitettyä. Ne soveltuvat kuitenkin yksilöiden vanhempien tunnistamiseen (muun muassa Moriya ynnä muut 2011 ja Evans ynnä muut 2011) Vuorinen / DEVEPARK

5 Päämäärä: Suomalaisten taimistojen emopuiden lajikeaitouden selvittäminen sekä väärinnimettyjen sekä tuntemattomien näytteiden nimeäminen Miksi? Mikrosatelliittimenetelmä toimii koristeomenapuilla. Ovatko suomalaiset puut sitä mitä niiden pitäisi olla? Miten? Mikrosatelliittimerkeillä luotiin DNA-sormenjäljet kerätystä aineistosta ja verrattiin niitä toisiinsa Vuorinen/ DEVEPARK

6 Tutkimuksen tavoitteet Selvittää lajikeaitouteen liittyviä seikkoja eli: todeta tutkimuspuiden oletetut nimet oikeiksi tai vääriksi, löytää nimet nimeämättömille tai väärin nimetyille näytteille Selvittää löytyykö aineistosta viitteitä M. Hyvingiensiksen alkuperästä Selvittää löytyykö KESKAS-lajikkeille tai muille löytöpuille alkuperäisiä lajikenimiä Vuorinen/ DEVEPARK

7 Aineisto Aineisto koottiin vuosien 2009 ja 2010 aikana Tutkimukseen kertyi yhteensä 201 näytettä 200 eri puusta Näytteitä saatiin yhteensä 36 eri kohteesta Tutkimusnäytteitä 99kpl ja verrannenäytteitä 102kpl Suurin osa tutkimusnäytteistä suomalaisilta taimistoilta Verrannenäytteet tilattiin kirjallisuudessa esiintyneiden tietojen perusteella, historiallisia lajikkeita Vertailunäytteitä saatiin ulkomailta muun muassa Yhdysvalloista, Kanadasta ja Iso-Britanniasta Vuorinen/ DEVEPARK

8 Menetelmät Yhdeksän tarhaomenalle kehitettyä mikrosatelliittialukeparia (käytetty myös Juntheikki-Palovaaran maisterintyössä 2008) Alukeparit kopioivat yhteensä 12 lokusta Näytteistä eristetty DNA ajettiin alukeparien kanssa pcr:llä Toimivuuden varmistus agaroosigeelielektroforeesilla Valmiit levyt toimitettiin MTT:lle Jokioisille Kapillaarisekvensointi MTT:n tiloissa Anneli Virran toimesta (MegaBACE 4000, Amersham Biosciences) Aalleelipituudet tulkittiin lukusuoralta näyte ja aluke kerrallaan Genetic Profiler-ohjelmistolla (Mega Bace 2.2, Amersham Biosciences 2003) Tarvittavat uusinnat (DNA:n eristys, PCR, kapillaarisekvensointi) Jatkuu Vuorinen/ DEVEPARK

9 Alleellitietojen tulkintaa Vuorinen/ DEVEPARK

10 Menetelmät jatkuu Alleelipituudet kirjattiin Excel-taulukkoon ja pyöristettiin Valmiit alleelipituuksiin perustuvat DNA-sormenjäljet! DNA-sormenjäljet muutettiin binääriseen muotoon analysointia varten Geneettiset etäisyydet laskettiin aineistolle GenAlEx ohjelmalla (Peakall ja Smouse 2006) UPGMA-sukupuu ajettiin MEGA ohjelmistolla (Tamura ynnä muut 2007) Sukupuuta tarkennettiin vielä määrittämällä hyväksyttävä geneettinen etäisyys vertailemalla samalla nimellä toimitettuja tutkimus- ja verrannenäytteitä keskenään Korjaamattomista etäisyyksistä ajettiin myös pääkomponenttianalyysi GenAlEx ohjelmalla (Peakall ja Smouse 2006) Vuorinen/ DEVEPARK

11 Tulokset Aineistolle saatiin luotua DNA-sormenjäljet! DNA-sormenjäljet näytteille Aluke 1 Aluke 2 Aluke 3 Aluke 3 Aluke 5 Aluke 6 Aluke 6 Aluke 7 aluke 8 Aluke 8 Aluke 9 Aluke 10 CH01d03 CH01g12 CH01h02A CH01h02B CH02c09 CH02c11A CH02c11B CH02d08 CH04c06A CH04c06B CH04e05 COL Näyte/Sample 56 Malus coronaria 130: : : : : : : : : : : : Malus Elise Rathke 152: : : : : : : : : : : : Malus Hyvingiensis 140: : : : : : :229: : : : : : Malus prattii 140:150: : : : : : : : : : Malus x zumi var calocarpa 138: :115: : : : : : : : : : : Malus Hyvingiensis 140: : : : : : :229: : : : : : Malus punertavakk riippuva 152: : : :239: : : : : : : : : Malus punakukkainen 132: : : : : : : : : : : Malus floribunda Rosea 138: : : : : : : : : : : Malus toringo M sieboldii var arborescens 155: : : : : : : : : : : : M x gloriosa Oekonomierat Echtermeyer 191: : : : : : : : : : : Malus Profusion 132: : : : : : : : : : : : M x purpurea Lemoinei 138: : : : : : : : : M Dorothea 130: : : : : : : : : : : M x soulardii 138: : : : : : : : : : : M sieboldii M x zumi 132: : : : : : : : : : : :235 Maatalous-metsätieteellinen tiedekunta /Katariina Vuorinen/DEVEPARK

12 Tulokset Sukupuun avulla 47 tutkimusnäytteelle kyettiin löytämään tai varmistamaan nimi (aineistosta 47,8 % eli 96 näytettä oli identtisiä jonkin toisen näytteen kanssa) 21 tutkimusnäytettä oli nimetty oikein ja 23 väärin Alun perin nimettöminä lähetetyistä näytteistä 17 kyettiin nimeämään 52 tutkimusnäytettä jäi nimettömiksi tai niiden nimeä ei voitu varmistaa (esimerkiksi kuusi varmasti siemenistä kasvatettua yksilöä) Polyploidiaa esiintyi 35 näytteellä, mutta vain kymmenellä useammassa kuin yhdessä lokuksessa (ainoastaan eroavien alleelien paljastama polyploidia kyettiin havaitsemaan) Pääkomponenttianalyysissä aineistosta ei erottunut suuresti eroavia ryhmiä Kahdelle KESKAS-lajikkeelle löydettiin todennäköinen nimi: Kadetti on oikealta nimeltään Cowichan ja Kirjailija puolestaan Almey Hyvingiensis jäi yhä mysteeriksi Vuorinen / DEVEPARK

13 Malus sp 66 M x gloriosa Oekonomierat Echtermeyer 129 Malus Oekonomierat Echtermeyer 136 Malus x purpurea Jadwiga 86 Malus Prunifolia-ryhma Scugog 167 Malus Scugog 93 Malus Red Tip 50 SW 172 Malus sp 196 Malus Wabiscawa 249 Makamik 251 tuntematon valkoinen UPGMA-sukupuu tutkimusaineistosta 199 Malus Paavo 63 Malus punakukkainen 67 Malus Profusion 68 M x purpurea Lemoinei 198 Malus Tammisaari 117 Malus sp 118 Malus sp 149 Malus Cowichan 178 Malus sp 190 Malus Kadetti 193 Malus Makamik vaiko Hopa 210 Malus Cowichan 235 Linnanmaki 157 Malus baccata var flavescens 70 M x soulardii 121 Malus prunifolia f pendula 98 Malus prunifolia var xanthocarpa 17 S 159 Malus prunifolia var xanthocarpa 108 Malus Rosilda 96 Malus prunifolia var costata 50 SE 142 Malus prunifolia Fastigiata 135 Malus Kobendza 81 Malus prunifolia 56 Malus coronaria 229 Rautatienomena 58 Malus Hyvingiensis 61 Malus Hyvingiensis 84 Malus Hyvingiensis 222 Malus Hyvingiensis 109 Malus domestica Chestnut Malus Kirjailija 202 Malus Red River 179 Malus sp 116 Malus sp 115 Malus sp 114 Malus sp 73M x adstringens Almey 170 Malus sp 64 Malus floribunda Rosea 247 marjaomenapensas 153 Malus Pink Perfection 236 Kadetti 245 marjaomenapuu 185 Malus Aamurusko 171 Malus sp 173 Malus sp 233 Kirjailija 237 Aamurusko 248 Hopa 194 Malus Rixi 239 Oppio 90 Malus Jay Darling 29 SE 152 Malus Evelyn 207 Malus x atrosanguinea 209 Malus x atrosanguinea 85 Malus Purpurea-ryhma Royal Beauty 132 Malus Royal Beauty 139 Malus Royal Beauty 165 Malus Royal Beauty 168 Malus Royal Beauty 169 Malus Royal Beauty 204 Malus sp riippakoristeomena 65 Malus toringo M sieboldii var arbores 238 Hopa 216 Malus prunifolia Cheals Crimson 183 Malus Dolgo tai Erstaa 206 Malus x robusta Red Siberian 223 Malus Prunifolia-ryhma 225 Malus prunifolia 195 Malus Royalty 231 Royalty 144 Malus Royalty 82 Malus Purpurea-ryhma Royalty 130 Malus x adstringiensis Ramona 227 Malus Venla 124 Malus Marjatta 224 Malus Marjatta 122 Malus sp 218 Malus Simcoe 88 Malus Purpurea-ryhma Makamik 119 Malus sp 123 Malus cf Makamik 164 Malus Makamik 166 Malus Makamik 189 Malus Hopa vaiko Makamik 230 Makamik 250 Hopa 74 Malus rockii 186 Malus baccata 161 Malus x purpurea Kornicensis 83 Malus Purpurea-ryhma Wierdak 176Malus sp 66 M x gloriosa Oekonomierat Echtermeyer 129 Malus Oekonomierat Echtermeyer 136 Malus x purpurea Jadwiga 86 Malus Prunifolia-ryhma Scugog 167 Malus Scugog 93 Malus Red Tip 50 SW 172 Malus sp 196 Malus Wabiscawa 249 Makamik 251 tuntematon valkoinen 199 Malus Paavo 63 Malus punakukkainen 67 Malus Profusion 68 M x purpurea Lemoinei 198 Malus Tammisaari 117 Malus sp 118 Malus sp 149 Malus Cowichan 178 Malus sp 190 Malus Kadetti 193 Malus Makamik vaiko Hopa 210 Malus Cowichan 235 Linnanmaki 157 Malus baccata var flavescens 70 M x soulardii 121 Malus prunifolia f pendula 98 Malus prunifolia var xanthocarpa 17 S 159 Malus prunifolia var xanthocarpa 108 Malus Rosilda 96 Malus prunifolia var costata 50 SE 142 Malus prunifolia Fastigiata 135 Malus Kobendza 81 Malus prunifolia 56 Malus coronaria 229 Rautatienomena 58 Malus Hyvingiensis 61 Malus Hyvingiensis 84 Malus Hyvingiensis 148 Malus Chestnut 138 Malus pumila Niedzwetzkyana 104 Malus sp 228 Malus Kainuun Kaunotar 105 Malus Prunifolia-ryhma Dolgo 146 Malus Dolgo 150 Malus Dolgo 187 Malus Dolgo 232 Malus sp 112 Malus Purpurea-ryhma Ranetka Malus Ranetka Purpurovaja 156 Malus baccata forma jackii 107 Malus Purpurea-ryhma Renown Malus Hollola 145 Malus Erstaa 244 Tumma Kaunotar 113 Malus Purpurea-ryhma Rescue Aamurusko 175 Malus sp 203 Malus Jarvenpaan Sylttyomena 103 Malus x soulardii 51 NE 174 Malus sp 155 Malus Veitchs Scarlet 219 Malus Veitchs Scarlet 200 Malus Perapohjola 220 Malus Perapohjola 240 Rixi 87 Malus x robusta 106 Malus Purpurea-ryhma Martha Makamik 163 Malus sp 76 Malus x scheideckeri Hillieri 91 Malus John Downie 50 SE 143 Malus Redflesh 111 Malus Anisik 158 Malus prunifolia Microcarpa Lutea 60 Malus x zumi var calocarpa 126 Malus pumila Montreal Beauty 177Malus sp 180 Malus sp 147 Malus sp 94 Malus Whitney 50 SE 213 Malus Dartmouth 214 Malus Dartmouth 212 Malus Dartmouth 211 Malus Dartmouth 208 Malus pumila Dartmouth 127 Malus Hyslop 120 Malus prunifolia-ryhma Erstaa 181 Malus sp 184Malus Erstaa 188 Malus Erstaa I 197 Malus Erstaa III 221 Malus Erstaa 242 Martha 95 Malus hupehensis 22 NE 77 Malus baccata var mandshurica 78 Malus baccata cf Gracilis 80 Malus prunifolia 154 Malus Red Jade 125 Malus baccata Gracilis 131 Malus Red Jade 137 Malus prunifolia Pendula 57 Malus Elise Rathke 62 Malus punertavakk riippuva 133 Malus sp riippamuoto 134 Malus sp riippamuoto 217 Malus prunifolia Pendula 92 Malus Katherine 23 NW 160 Malus spectabilis var plena 97 Malus prunifolia var rinkii 32 NE 71 M sieboldii M x zumi 162 Malus x robusta var xanthocarpa 72 M sieboldii x zumi Professor Sprenger 252 Malus Golden Hornet 69 M Dorothea 102 Malus x scheideckeri 51 NW 89 Malus Hillier 23 NW 243 Erstaa 192 Malus Linnanmaki 234 Dolgo 79 Malus coronaria 140 Malus baccata var jackii 205 Malus pumila Aldenhams Purple 151 Malus Elise Rathke 215 Malus Elise Rathke 182 Malus sp 253 Malus domestica Newtown Pippin syn L 100 Malus sikkimensis Rockii 55 SE 101 Malus toringoides 32 NE 254 Malus domestica Renown 255 Malus domestica Fairy syn Cormack 99 Malus sargentii Rosea 17 SW 128 Malus sargentii 201 Malus sargentii Marleena 75 Malus toringoides 256 Malus prunifolia Maruba syn Yellow S 141 Malus halliana var spontanea 59 Malus prattii Sukupuu ajettiin geneettisistä etäisyyksistä, joissa oli otettu huomioon hyväksytty geneettinen etäisyys 222 Malus Hyvingiensis 109 Malus domestica Chestnut Malus Chestnut 138 Malus pumila Niedzwetzkyana 104 Malus sp 228 Malus Kainuun Kaunotar 105 Malus Prunifolia-ryhma Dolgo 146 Malus Dolgo Vuorinen / DEVEPARK 150 Malus Dolgo 187 Malus Dolgo Malus sp 112 Malus Purpurea-ryhma Ranetka Malus Ranetka Purpurovaja 156 Malus baccata forma jackii 107 Malus Purpurea-ryhma Renown 2

14 Tulosten tarkastelu Menetelmä oli toimiva, eli näytteille saatiin luotua DNAsormenjäljet Tulokset soveltuvat yksilöiden identifiointiin kohtuullisesti Sukulaisuussuhteita ei selvitetty Aikaisemmissakin tutkimuksissa on esiintynyt nimien sekaannuksia (muun muassa Guarino ynnä muut 2006, Hokanson ynnä muut 2001) Vaikka löytöomenapuille ei löytynyt mahdollisia alkuperäisiä nimiä ne saattavat olla jotakin vanhaa lajiketta Luodut DNA-sormenjäljet eivät ole täysin varmoja Alleelipituuksissa esiintyvien pienten erojen vuoksi eri aineistoja ei voida vertailla täysin luotettavasti ilman kalibrointinäytteitä Jatkuu Vuorinen / DEVEPARK

15 Tulosten tarkastelu jatkuu Lajikekuvausten puutteellisuus kävi ilmi vertailtaessa KESKAS-lajikkeita Kadetti ja Kirjailija oletettuihin alkuperäislajikkeisiin Cowichan ja Almey (Kuvaukset pätevät osittain, mutta puutteitakin on) Nimistössä tapahtuneet sekaannukset mahdollisesti vanhaa perua, mutta myös uudet KESKAS-lajikkeet sekaisin Virhelähteitä lukuisa määrä (jotka on listattu myös muun muassa Bonin ynnä muiden artikkelissa 2004). Virheitä on tapahtunut mahdollisesti kaikissa tutkimuksen vaiheissa. Mahdollisista virhelähteistä huolimatta on selvää, että koristeomenapuita on nimetty väärin! Vuorinen / DEVEPARK

16 Johtopäätökset Mikrosatelliittimerkeillä voidaan luoda DNAsormenjäljet, joita voidaan käyttää lajikeaitouden selvittämisessä Lajikenimet ovat Suomessakin osittain sekoittuneet Tehtävää ja parannettavaa lajikeaitouden saralla olisi paljonkin Virheet on mahdollista korjata! Vuorinen / DEVEPARK

17 Lähteet: Bonin, A., Bellemain, E., Bronken Eidesen, P., Pompanon, F., Brochmann, C. & Taberlet, P How to track and assess genotyping errors in population genetics studies. Molecular Ecology 13: Ellegren, H Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Reviews Genetics 5: Evans, K. M., Patocchi, A., Rezzonico, F., Mathis, F., Durel, C. E., Fernández-Fernández, F., Boudichevskaia, A., Dunemann, F., Stankiewicz- Kosyl, Gianfranceschi, L., Komjanc, M., Lateur, M., Madduri, M., Noordijk, Y. & Weg, W. E. van de Genotyping of pedigreed apple breeding material with a genome-covering set of SRRs: trueness to type of cultivars and their parentages. Molecular Breeding 28: Campbell, C., S., Greene, C., W. & Dickinson, T., A Reproductive biology in subfam. Maloideae (Rosaceae). Systematic Botany 16: Guarino, C., Santoro, S., Simone, De., L., Cipriani, G. & Testolin, R Genetic diversity in a collection of ancient cultivars of apple (Malus domestica Borkh.) as revealed by SSR-based fingerprinting. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 81: Hokanson, S., C., Lamboy, W., F., Szewc-McFadden, A., K. & McFerson, J., R Microsatellite (SSR) variation in a collection of Malus (apple) species and hybrids. Euphytica 118: Juntheikki-Palovaara, I Helsingin kaupungin koristeomenakantojen (Malus Mill.) identifiointi mikrosatelliittimerkkien avulla. Puutarhatieteen Pro Gradu- tutkielma. Helsingin Yliopisto, soveltavan biologian laitos. 61 s. Korban, S., S Interspecific hybridization in Malus. HortScience 21: Moriya, S., Iwanami, H., Okada, K., Yamamoto, T. & Abe, K A practical method for apple cultivar identification and parent-offspring analysis using simple sequence repeat markers. Euphytica 177: Peakall, R. & Smouse, P.E GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6, Versio: GenAlEx Ohjelmisto saatavilla osoitteesta: Routson, K.J, Reilley, A.A, Henk, A.D. & Volk, G. M Identification of historic apple trees in the Southwestern United States and implications for conservation. HortScience 44: Tamura K., Dudley J., Nei M. & Kumar S MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: Treuren, R. van., Kemp, H., Ernsting, G., Jongejans, B., Houtman, H. & Visser, L Microsatellite genotyping of apple (Malus domestica Borkh.) genetic resources in the Netherlands: application in collection management and variety identification. Genetic Resources and Crop Evolution 57: Vuorinen / DEVEPARK

18 Kiitos mielenkiinnosta ja ajasta M. Hyvingiensis M. Royalty M. Hopa M. Makamik Kuvat otettu Helsingin yliopiston kasvitieteellisessä puutarhassa Kaisaniemessä keväällä 2011 Vuorinen / DEVEPARK

19 Pääkomponentti 2 Tutkimusaineisto pääkomponenttianalyysissä Näytteiden asettuminen pääkomponenttianalyysissä Almey Cowichan Dartmouth Dolgo Elise Rathke Erstaa Hopa Hyvingiensis Makamik Muut Pendula Royal Beauty Royalty Pääkomponentti 1 Vuorinen / DEVEPARK

20 Geneettinen etäisyys Kappalemäärä Hyväksyttävän geneettisen etäisyyden määrittäminen Etäisyydet nimiverrokkien välillä Geneettinen etäisyys Nimiverranteiden välinen geneettinen etäisyys Verranneparin numero verranneparien välinen geneettinen etäisyys Vuorinen/ DEVEPARK