13. Kansallinen Massaspektrometriasymposium

Transkriptio

1 13. Kansallinen Massaspektrometriasymposium Tampere Ohjelma Abstraktit

2 Ohjelma Torstai Kahvi ja ilmoittautuminen, Kristallisali 1. krs Olli Laine, Suomen Massaspektrometrian Seura Symposiumin avaus (auditorio, pohjakerros) Risto Kostiainen, Helsingin yliopisto Pienten endogeenisten yhdisteiden massaspektrometria Lounas, Kristallisali 1. krs. Ympäristö- ja elintarvikeanalytiikka Marika Jestoi, Elintarviketurvallisuusvirasto Evira Massaspektrometria ja elintarviketurvallisuus Sami Huhtala, Suomen ympäristökeskus Isotooppilaimennuksen soveltaminen orgaanisten yhdisteiden ympäristöanalytiikkaan Martin Söderström, Helsingin yliopisto Risiinitoksiinin tunnistus nestekromatografiamassaspektrometrilla Paavo Kalo, Helsingin yliopisto Lyhytketjuisten triasyyliglyserolien regioisomeerien määrittäminen Kahvi, alalämpiö Lääke- ja huumausaineanalytiikka Tiia Kuuranne, Yhtyneet Medix Laboratoriot Massaspektrometriset sovellukset dopinganalytiikassa Anna Pelander, Helsingin yliopisto Korkean erotuskyvyn lentoaikamassaspektrometria lääkeaineiden laajoissa seulonta-analyyseissa Marko Lehtonen, Itä-Suomen yliopisto Endogeenisten kannabinoidien määritys LC/MS/MS-menetelmällä alkoholistien post-mortem aivonäytteistä Anu Flink, Helsingin yliopisto Desorptioilmanpainefotoionisaatio takavarikoitujen huumausaineiden tutkimuksessa Cocktailtilaisuus, Juhlasali (2. krs.) 2

3 Perjantai Ron Heeren, AMOLF, Alankomaat Imaging mass spectrometry in biomolecular surface analysis Kahvi, alalämpiö Uudet massaspektrometriset tekniikat Anu Vaikkinen, Helsingin yliopisto Rf-viritteisellä VUV-lampulla tehokas ionisaatio mikroilmanpainefotoionisaatiossa Keith Compson, Waters Corporation Development of a lipidomic platform based on a hybrid quadupole time-of-flight (QTof) ion mobility mass spectrometer, Synapt G2 HDMS, for both targeted and non-targeted analysis Jonas Björklund, PerkinElmer Thermogravimetric analysis gas chromatography mass spectrometry (TGA-GC/MS) Lounas, Kristallisali 1. krs. Biomolekyylien massaspektrometria Janne Jänis, Itä-Suomen yliopisto Massaspektrometria rakennebiologian työvälineenä Outi Itkonen, HUSLAB Massaspektrometrisen hepsidiinimenetelmän validointi Heli Nygren, VTT Metabolomiikkamenetelmät maksan rasvoittumista kuvaavien merkkiaineiden etsimisessä ja validoinnissa Ebba Lindgren, LECO Corporation Metabolomics using Pegasus GC- and GCxGC-TOFMS Kahvi, alalämpiö Ilja Ritamo, SPR Veripalvelu Massaspektrometria ja kantasolujen pinnan glykomiikka Symposiumin päätös 3

4 Mass Spectrometry of Small Endogenous Molecules Risto Kostiainen Division of Pharmaceutical Chemistry, University of Helsinki The analysis of small endogenous compounds or metabolites has gained increasing interest during the last few years, since many of the endogenous compounds are the direct link between the regulation of genes and the physiological response of an organism to various environmental constraints. Metabolite levels are good variables to measure cell function, as they represent the downstream amplification of even small changes occurring in mrna levels or proteome. Recently, metabolomics has emerged as a powerful approach to systems biology, providing unique insight into the physiological effects of disease, drugs, toxicants or genetic alternations. The analysis of endogenous small compounds is challenging, since they cover thousands of compounds with various physical and chemical properties and they may exist at very low concentrations or the concentrations may vary several orders of magnitude. The matrices are complex causing extra challenge for the analytical methods. Mass spectrometry (MS) is in practice the only method for the measurement of endogenous compounds at low concentration levels in complex biological matrices. The advantages of MS include a wide dynamic range, the ability to measure large range of diverse molecules and good quantitative performance. The peak capacity, sensitivity and sample throughput determines the efficiency of a MS method. The recent developments in high resolution mass spectrometry and ultra performance liquid chromatography provides high peak capacity and detection of thousands of compounds in one sample. The peak capacity can be improved further by using 2-D separation methods such as GC-GC, LC-LC, and LC-ion mobility spectrometry (IMS) combined to MS. The sensitivity is highly dependent on an ionization technique, operational parameters and ion transmission. The most used ionization techniques in LC-MS are electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI) and atmospheric pressure ionization (APPI) which covers large range of compounds from nonpolar to polar and from small to large molecules. These ionization techniques can be also used in GC in addition to commonly used electron ionization and chemical ionization. The sensitivity can be improved by improving ion transmission for example by using ion funnels. The recent developments in microchip technology have shown that analysis can be carried out from very small sample volumes making possible even single cell analysis. The high sample throughput is possible by using fast chromatography, microfluidics or IMS combined to MS. Recently introduced ambient MS provides fast analysis of small endogenous compounds without sample pretreatment from complex matrices. These techniques are also more suitable for MS imaging than MALDI, in which matrix disturbs analysis of compounds at low mass range. At present, the databases for metabolomics are incomplete and far from the wellannotated gene and protein databases. The databases are needed for identification of the compounds and to project metabolic pathways from genome sequence. Electron ionization spectral libraries are helpful for identification of volatile compounds analyzed by GC-MS. Some databases include high resolution or MS/MS data with list of known metabolite structural information. All these databases, however, are far from complete. Therefore there is still urgent need for universal metabolomics database, which is also the key to turn analytical data to metabolomic information. 4

5 Massaspektrometria ja elintarviketurvallisuus Marika Jestoi, Kati Hakala, Mervi Rokka Elintarviketurvallisuusvirasto Evira, Kemian ja toksikologian tutkimusyksikkö, Helsinki Ruoan laatu ja turvallisuus puhuttaa kuluttajia, tuottajia ja päättäjiä. Elintarviketurvallisuusvirasto Evirassa seurataan tutkimuksen ja valvonnan keinoin koko elintarvikeketjua, lähtien siemenistä, kasveista ja eläinten hyvinvoinnista aina varsinaisiin lopputuotteisiin saakka. Toimintaa ohjaa sekä EU että kansallinen lainsäädäntö. Massaspektrometria on laajasti mukana erilaisissa elintarviketurvallisuuteen liittyvissä tutkimuksissa ja analyyseissä. Johtuen tutkittavien yhdisteiden heterogeenisuudesta, sekä kaasukromatografiset (GC) että nestekromatografiset (LC) tekniikat ovat molemmat voimakkaasti edustettuna. Esimerkiksi ympäristöön ja eliöihin kertyvistä toksisista yhdisteistä useat pestisidit ja polyaromaattiset hiilivedyt analysoidaan tavallisesti GC/MS:llä kun taas esimerkiksi lääkeaineiden ja hometoksiinien analysoinnissa LC/MS on vallitseva tekniikka. Ominaispiirteenä elintarvike- rehu- ja kasvianalyyseissä on tutkittavien matriisien monimuotoisuus, tutkittavien analyyttien pienet pitoisuudet sekä useissa tapauksissa myös autenttisten nollamatriisien puute. Mitattavien yhdisteiden vaadittavat määritysrajat ovat usein pieniä, toisinaan jopa lähellä massaspektrometristen laitteiden suoritusrajoja. Tällöin analyysimenetelmien kehittämisessä riittää haasteita, vaikka käytössä olisi periaatteessa spesifiset ja selektiiviset LC/MS/MS- tai GC/MS/MS -tekniikat. Näytteen esikäsittely onkin erittäin tärkeässä osassa, etenkin kun tutkitaan pieniä pitoisuuksia hankalista, monimutkaisista matriiseista. Haasteellista sekä esikäsittelyn että analytiikan kannalta on myös yhä enenevä tarve kehittää kvalitatiivisia ja/tai kvantitatiivisia seulontamenetelmiä kymmenien - jopa satojen - yhdisteiden samanaikaiseen analysointiin. Esityksessä käydään läpi elintarvikkeista, rehuista ja biologisista näytteistä tehtävien massaspektrometristen analyysien ominaispiirteitä ja vaatimuksia. 5

6 Isotooppilaimennuksen (IDMS) soveltaminen orgaanisten yhdisteiden ympäristöanalytiikkaan Sami Huhtala, Noora Perkola Suomen ympäristökeskus, Laboratoriot, Tutkimus- ja innovaatiolaboratorio Johdanto. Isotooppilaimennustekniikan 1 (IDMS) käyttö on lisääntynyt massaspektrometri- laitteistojen yleistymisen myötä. IDMS-tekniikka parantaa vaikeista matriiseista tehtävien kvantitatiivisten tulosten laatua. Myös IDMS-tekniikan vaatimien massaleimattujen standardien ( 13 C- ja d-leimatut standardit) saatavuus on parantunut. Epäselvyyttä tulosten vertailuun aiheuttavat em. standardien kirjavat käyttörutiinit. Termistökään ei ole täysin vakiintunutta 2. Tässä työssä esitetään IDMS menetelmän soveltaminen yhden perfluoratun yhdisteen (PFC), perfluorooktaanisulfonaatin (PFOS), määritykseen ympäristönäytteistä ja massaleimattujen standardien erilaisten käyttövariaatioiden vaikutusta analyysitulokseen. PFCyhdisteet ovat pintakäsittelyaineita, joita on käytetty laajasti mm. paistinpannuissa, verhoilukankaissa ja ruokapakkauksissa (esim. Teflon, Goretex). PFC yhdisteiden on todettu esiintyvän laajasti ympäristössä. Materiaalit ja menetelmät. Työssä käytettiin erilaisia 13 C-leimattuja standardeja (Wellington Laboratories) PFOS:n kvantitatiiviseen määrittämiseen. Vesinäyte uutettiin käyttäen SPE-tekniikkaa. Kiinteän näytteen (liete) esikäsittelyyn käytettiin nesteuuttoa. PFOS määritettiin puhdistetuista uutteista UPLC-TQMS-laitteistolla (Waters) monitoroimalla yhdisteelle ominaisia siirtymiä (Multiple Reaction Monitoring, MRM). Näytteeseen ennen uuttoa lisättävää sisäistä standardia kutsutaan yleensä saantostandardiksi (surrogate), jonka vasteen perusteella arvioidaan esikäsittelyn onnistumista. Surrogaatin vasteen avulla voidaan tehdä myös analyyttien kvantitointi. Näytteeseen juuri ennen laiteanalyysiä lisättävää standardia kutsutaan yleensä laitestandardiksi (instrument standard), jonka vasteen avulla arvioidaan laitteen toimintaa ja matriisin vaikutusta analyytin vasteeseen. Termiä saantostandardi (recovery standard) käytetään myös sisäisestä standardista, joka lisätään näytteeseen ennen laiteanalyysiä ja usein sen vasteen avulla määritetään surrogaattina käytetyn yhdisteen saanto. Tulokset. PFOS oli mitattavissa molemmista näytteistä pitoisuuksissa 13,32 ng/l ja 13,35 ng/g (tulokset ovat saantokorjattuja). Saantostandardina (surrogaatti) käytettiin 13 C 4 -PFOS:a ja kvantitointiin laitestandardina (instrument standard) 13 C 8 -PFOS:a. Jos määritys tehtiin käyttäen saantostandardina 13 C 4 -PFDA:ta ja laitestandardina 13 C 8 -PFOS:a tulokset poikkeavat -43 % ja +66 % (vesi / liete). Jos puolestaan saantostandardina käytettiin 13 C 4 -PFOS:a ja laitestandardina 13 C 4 -PFOA:a, tulokset poikkeavat +2 % ja +2% (vesi / liete). Kun yhdisteen kvantitointi tehtiin surrogaatin 13 C 4 -PFOS avulla, olivat tulokset -13 % ja +4 % (vesi / liete) suuremmat kuin kvantitoitaessa laitestandardin 13 C 8 -PFOS avulla. Tämä osoittaa käytettävän sisäisen standardin ja käyttötavan voivan vaikuttaa analyysitulokseen. Kirjallisuusviitteet 1 Sargent M., Harrington C., Harte R., Guidelines for Achieving High Accuracy in Isotope Dilution Mass Spectrometry (IDMS), RS C, Tomy G., Halldorson T., Danell R., Law K., Arsenault G., Alaee M., MacInnis G., Marvin C., RCM 19, 2005,

7 Risiinitoksiinin tunnistus nestekromatografiamassaspektrometrilla Martin Söderström, Paula Vanninen Helsingin yliopisto, Kemian laitos, VERIFIN Johdanto. Risiini on ribosomeja inaktivoiva proteiinitoksiini (RIP), jota löytyy risiinikasvin (Ricinus communis) siemenistä. Risiinitoksiini on erittäin myrkyllinen ja siksi sitä on tutkittu potentiaalisena kemiallisena aseena. Lisäksi risiiniä viljellään laajamittaisesti siitä saatavan öljyn takia. Näistä syistä risiinitoksiini on lisätty kemiallisen aseen kieltosopimuksen valvottavien yhdisteiden listalle. Viime aikoina risiinitoksiinia on myös pidetty mahdollisena yhdisteenä käytettäväksi kemiallisessa terrorismissa. Kaikista näistä syistä risiinitoksiinille on kehitettävä luotettava ja selektiivinen analyysimenetelmä. Risiinin siemenissä on myös Ricinus communis Agglutinin (RCA) -proteiinia, joka on aminohappojärjestykseltään hyvin lähellä risiinitoksiinia. Kaikki saatavilla olevat risiinin vasta-aineet sitoutuvat ainakin osittain myös RCA:han, joten immunologisilla menetelmillä ei pystytä selektiivisesti tunnistamaan risiinitoksiinia. Massaspektrometrisella tunnistuksella taas voidaan tunnistaa yksinomaan digestoidulle (esim. käyttäen trypsiiniä) risiiniproteiinille tunnusomaiset peptidit. Materiaalit ja menetelmät. Menetelmien kehityksessä olemme käyttäneet affiniteettikromatografialla puhdistettua risiiniä sekä vertailuyhdisteinä kaupallisia RCAn sekä risiinin A- ja B-ketjujen standardeja. Määrityksissä olemme käyttäneet Thermo TSQ Quantum Ultra -kolmoiskvadrupolia sekä Finnigan LXQ -lineaari-ioniloukkua. Edelliseen oli liitetty UHPLC-tyyppinen Thermo Accela nestekromatografi ja jälkimmäiseen tavanomainen Finnigan Surveyor -nestekromatografi. Tulokset. Risiinin tunnistuksessa olemme käyttäneet kolmea lähestymistapaa: digestoitujen peptidien automaattinen haku LC MS/MS-ajosta tietokantaa vasten (ns. peptide mapping ), valittujen digestoitujen peptidien tunnistus UHPLC MRMmenetelmällä sekä molekyylipainon määritys LC MS-ajosta. Molemmilla LC MS/MS-menetelmillä voidaan risiinitoksiini tunnistaa luotettavasti niistä tryptisistä peptideistä, joissa se eroaa RCAsta. Lisäksi voidaan saada tietoa siitä ovatko A- ja B-ketju olleet liittyneenä toisiinsa. Molekyylipainon määrityksellä voidaan varmistaa kokonaisen toksiinin läsnäolo ja lisäksi nähdä sen erilaiset glykosyloituneet muodot. Mielestämme UHPLC-MRM soveltuu herkkyytensä, selektiivisyytensä ja nopeutensa ansiosta hyvin risiininäytteiden seulontaan. Menetelmää testattiin 2009 Robert Koch - instituutin järjestämässä risiinitoksiinin kansainvälisessä pätevyystestissä, johon osallistui yhteensä 17 laboratoriosta. Testin kuudesta näytteestä viiteen oli lisätty risiiniä pitoisuustasoilla 0,0001, 0,001, 10, 500 ja 1000 µg/ml. Kahdesta alimmasta näyteestä yksikään laboratorio ei pystynyt havaitsemaan risiiniä muilla kuin immunokemiallisilla menetelmillä (ELISA). UHPLC-MRM menetelmämme määritysraja oli testissä 0,08 2 µg/ml riippuen käytetyistä tunnistuskriteereistä, joihin esitelmässä myös otetaan kantaa. 7

8 Lyhytketjuisten triasyyliglyserolien regioisomeerien määrittäminen Paavo Kalo Helsingin Yliopisto, Soveltavan Kemian ja mikrobiologian laitos Johdanto. Maitorasvan lyhytketjuiset triasyyliglyserolit sisältvät runsaasti samamassaisia molekyyli-lajeja, regioisomeerejä ja asyyliketjuisomeerejä. Kallion ym. 1 kehittämää negatiivisten ionien kemiallisen ionisaation tandemmassaspektrometristä menetelmää, on käytetty useiden rasvojen ja öljyjen regioisomeerien rakenteiden määritykseen. Tällä menetelmällä ei kuitenkaan voida erottaa samamassaisia triasyyliglyseroleja toisistaan. Tarkastelen seuraavassa vaihtoehtoista julkaistua menetelmää, jossa lyhytkejuisten triasyyliglyserolien regioisomeerit on erotettu normaali-faasi nestekromatografialla ja tunnistettu ja kvantitoitu positiivisella sähkösumutus-tandem-massaspektrometrialla. 2 Materiaalit ja menetelmät. Voirasva kuivattiin alle 3.3 kpa:n vakuumissa. Randomisoitu voirasva saatiin vaihtoesteröimällä kuivattua voirasvaa ja 1% natriummetoksidi katalyyttiä 1 h C:ssa. NP-LC-ESI tandem MS. Kolonnit: 3 Phenomenex Luna 3 µm 100 x 2 mm silica-kolonnia sarjassa. Eluointiliuokset: heksaani (A), heksaani/metyyli-tert-butyylieetteri/ etikkahappo (B). Massaspektrometri: 3D ion trap Bruker Esquire LC MS. Reagenssiliuotin: kloroformi/metanoli/ammoniakki 20:10:3. Molaariset korjauskertoimet: Randomisoitua voirasvaa analysoitiin NP LC ESI MS:lla. 105 eri TAG ammonium adduktin ionikromatogrammia ekstrahoitiin MS datasta. Nämä samamassaisten TAG:ien ionikromatogrammit integroitiin ja samamassaiset TAG:it identifioitiin tandem MS:eistä. Näytteiden sisältämän sisäisen standardin (trinonanoiini) avulla laskettiin jokaisen integroidun piikin (jokaisessa ionikromatogrammissa) korjaamaton moolimäärä (pinta-ala moolimäärä). Pinta-ala-mol% laskettiin tietyn TAG lajin korjaamattomasta moolimäärästä ja kaikkien pinta-ala moolien summasta. Molaarinen korjauskerroin laskettiin jakamalla triasyyliglyserolin satunnaisjakaantuman mukaan laskettu mol% pinta-ala mol% :lla. Tulokset. ACN alueella tunnistettiin regioisomeerejä, joissa 2 tai 3 lyhyttä asyylia (C 2, C 4, C 6 ). Näiden osuus oli %. Esim. ACN 26:0:ssa tunnistettiin 12:0/10:0/4:0 (14:8:0/4:0), 16:0/6:0/4:0, 6:0/16:0/4:0, 18:0/4:0/4:0. ACN aluella tunnistettiin regioisomeerejä, joissa 1 lyhyt asyyli. Näiden osuus oli 37:5 %. Esim. ACN 36:1:ssä tunnistettiin 18:1/10:0/8:0,18:1/12:0/6:0+16:0/14:1/6:0+14:0/16:1/6:0+14:0/10:1/12:0+14:0/12:0/1 0:1, 18:1/14:0/4:0 (16:0/16:1/4:0+16:1/16:0/4:0), 16:0/18:1/2:0+18:1/16:0/2:0. Kirjallisuusviitteet 1 Kallio, H. ja Currie, G. Lipids , Kalo, P., Kemppinen, A. ja Ollilainen, V. Lipids , Kalo, P., Kemppinen, A., Ollilainen, V. ja Kuksis, A. Lipids , Kalo, P., Kemppinen, A., Ollilainen, V. ja Kuksis, A. Int J. Mass Spectrom ,

9 Massaspektrometriset sovellukset dopinganalytiikassa Tiia Kuuranne Dopingtestauslaboratorio, Yhtyneet Medix laboratoriot, Helsinki Kansainvälisestä dopingvalvonnasta vastaa Maailman Antidopingtoimisto (WADA), joka ylläpitää maailmanlaajuista antidopingsäännöstöä ja dopingnäytteitä analysoivien laboratorioiden valtuutus- eli akkreditointijärjestelmää. Dopingtestauslaboratorioiden toiminnan perustana ovat ISO/IEC17025 standardi, WADAn kansainvälinen laboratorio-standardi sekä toimintaa yksityiskohtaisemmin ohjaavat tekniset dokumentit. Akkreditoinnin säilyttäminen edellyttää laboratorioiden täyttävän henkilökunnan, tieto-taidon, työskentelytapojen ja laitteistojen suhteen WADAn asettamat laatuvaatimukset, WADAn eettisen koodin noudattamista, aktiivista tutkimus- ja julkaisutoimintaa sekä jatkuvaa virheetöntä osallistumista ulkoiseen laaduntarkkailuun. Vaikka verestä ja seerumista tehtävien dopinganalyysien määrä on kasvanut viime vuosina, tehdään testit pääasiassa virtsasta. WADA ylläpitää kiellettyjen aineiden ja menetelmien listaa, jonka yhdisteistä osa on kielletty kaikissa tilanteissa, osa ainoastaan kilpailutilanteessa. Listaa päivitetään vuosittain ja nimeltä mainittuja yhdisteitä on yli kolmesataa, mutta tunnettujen yhdisteiden aineenvaihdunnan ja uusien ns. designer-aineiden myötä analyyseissä seurattavien yhdisteiden lukumäärä on vielä paljon suurempi. Tämän vuoksi laboratorioilla on oltava käytössään tehokkaat seulonta-menetelmät kiellettyjen aineiden nopeaan ja luotettavaan havainnointiin pienestä näytemäärästä. Dopingtestauslaboratorioiden analytiikka perustuu suurelta osin kromatografisiin menetelmiin ja etenkin varmistusanalytiikassa yhdisteiden tunnistaminen tehdään ensisijaisesti massaspektrometrisesti. Menetelmät ovat perinteisesti perustuneet kaasukromatografis-massaspektrometrisiin (GC/MS) sovelluksiin, mutta anabolisten yhdisteiden, kortikosteroidien, proteiinin ja peptidien analytiikka on erityisesti hyötynyt nestekromatografis-massaspektrometristen (LC/MS) rutiinimenetelmien käyttöönotosta. Mahdollisuuksien mukaan laboratorioissa hyödynnetään myös korkean resoluution (HRMS) tai tandemmassaspektrometrian (MS/MS) sovelluksia riittävän herkkyyden saavuttamiseksi. Eräissä lentoaika-analysaattorisovelluksissa on kuvattu myös mittaus- ja tietojenkäsittelymenetelmien hyödyntämistä dopinganalytiikassa siten, että mikäli laboratoriot havaitsevat merkkejä uusien dopingyhdisteiden käytöstä, voidaan aikaisemmin kerätty kattava seulonta-analyysin mittaustieto käsitellä uudestaan sen sijaan, että vanhojen näytteitä jouduttaisiin jälleen analysoimaan. Dopinganalyysien tulosten tulkinnassa on identifioinnin lisäksi pystyttävä varmistumaan siitä, ettei löydös aiheudu poikkeavasta fysiologisesta tai patologisesta tilasta, joten erityisen haasteen asettavat sellaiset elimistön omat yhdisteet, joita voidaan käyttää dopingaineina. Esimerkiksi testosteronin dopingkäytön toteamiseen ei riitä pelkkä kvantitatiivinen määritys vaan synteettisen yhdisteen olemassaolo todetaan steroidiaineen-vaihdunnan kohdeyhdisteiden 13 C/ 12 C-isotooppien suhteesta ns. isotooppisuhdemassa-spektrometrilla (IRMS). 9

10 Korkean erotuskyvyn lentoaikamassaspektrometria lääkeaineiden laajoissa seulonta-analyyseissa Anna Pelander Helsingin yliopisto, Hjelt-instituutti, Oikeuslääketieteen osasto, Helsinki Johdanto. Tarkan massan mittaukseen perustuvat menetelmät pienten molekyylien tunnistamisessa yleistyvät. Lentoaikamassaspektrometriaa (TOFMS) käytettäessä nykylaitteiden rajoituksena on ollut keskinkertainen MS-erotuskyky: tyypillinen erotuskyky on suuruusluokkaa moolimassalle 600 Da. Jos tunnistettavien yhdisteiden moolimassojen ero on pienempi kuin laitteen erotuskyvyn asettama rajaarvo (pienille molekyyleille tyypillisesti suuruusluokka mda), ei tarkan massan mittausta voida käyttää tunnistamiseen: mittaustuloksen massavirhe on suuri summapiikkien muodostumisesta johtuen. Korkean erotuskyvyn TOFMS-laite on ollut markkinoilla vuodesta Esityksessä kootaan tulokset korkean erotuskyvyn TOFMS-laitteen testauksesta, ja pohditaan erotuskyvyn merkitystä analyysituloksen luotettavuuden näkökulmasta. Materiaalit ja menetelmät. Laite oli MaXis (Bruker Daltonik, Bremen, Saksa) korkean erotuskyvyn TOFMS. Laitevalmistajan spesifikaatio suorituskyvylle oli erotuskyky moolimassalle 922 Da (FWHM, puolikorkeuden leveyden perusteella laskettu). Testaukseen valittiin 460 yhdisteen vertailuainetietokannasta 8 kahden tai kolmen yhdisteen lähekkäin eluoituvaa yhdistelmää (yhteensä 17 yhdistettä, moolimassat Da), joiden tunnistaminen perinteisellä TOF-laitteella on vaikeaa tai mahdotonta johtuen moolimassojen pienistä eroista (23,5 mda tai pienempi). MaXiksen erotuskykyä arvioitiin kriittisten yhdistelmien suorasyötöllä (kaksi toistoa/yhdistelmä). Mittaustaajuuden vaikutusta erotuskykyyn, massatarkkuuteen ja isotooppijakauman vastaavuuteen arvioitiin 15 min gradienttierotuksessa PFP-kolonnilla mittaustaajuuksilla 1, 2, 5,10 ja 20 Hz (kolme toistoa/mittaustaajuus, kaikki yhdisteet samassa seoksessa). Tulokset. Testattaville yhdistelmille vaadittu teoreettinen erotuskyky vaihteli välillä Suorasyöttökokeissa mitatut erotuskyvyt (FWHM) vaihtelivat välillä Laitevalmistajan spesifikaatio oli realistinen ja uskottava. Mittaustaajuuskokeissa massatarkkuuden keskiarvo oli 0,33 ppm ja erotuskyvyn Mittaustaajuuskokeissa erotuskyvyn rinnakkaisten suhteellinen standardipoikkeama oli 1,8 %. Mittaustaajuus ei vaikuttanut erotuskykyyn, massatarkkuuteen tai isotooppijakauman vastaavuuteen. MaXiksen toiminta oli toistettavaa, ja kaikki kriittiset yhdistelmät voitiin tunnistaa vaikeuksitta sekä suorasyöttökokeissa, että mittaustaajuuskokeissa. 10

11 Endogeenisten kannabinoidien määritys LC/MS/MS-menetelmällä alkoholistien post-mortem aivonäytteistä Marko Lehtonen, 1 Hanna Malinen, 2 Petri Hyytiä, 2 Markus Storvik, 1 Merja Lakso, 3 Seppo Auriola, 1 Garry Wong, 3 James C. Callaway 3 1 Itä-Suomen yliopisto, Farmasian laitos, Kuopio 2 Terveyden ja hyvinvoinnin laitos, Helsinki 3 Itä-Suomen yliopisto, Neurobiologian laitos, Kuopio marko.lehtonen@uef.fi Johdanto. Endogeeninen kannabinoidijärjestelmä (EC) on liitetty useaan fysiologiseen tilaan ja neurodegeneratiiviseen sairauteen. Alkoholin vaikutusta ECjärjestelmään on tutkittu eläinkokeilla, mutta alkoholin vaikutus ihmisen ECjärjestelmään ei ole laajemmin tutkittu. Tämän tutkimuksen tarkoitus oli kehittää kvantitatiivinen nestekromatografimassaspektrometrimenetelmä (LC/MS/MS) ECjärjestelmän ligandien määritykseen ja mitata alkoholistien post-mortem aivonäytteistä yleisimpien endokannabinoidien pitoisuudet. Materiaalit ja menetelmät. Tässä tutkimuksessa määritettiin kuuden eri aivoalueen endokannabinoidipitoisuudet Cloninger tyyppi 1 (n=9) ja tyyppi 2 (n=8) alkoholistien post-mortem näytteistä ja saatuja tuloksia verrattiin kontrolliryhmän (n=10) tuloksiin. Tutkittavat yhdisteet (n=9) eristettiin näytteestä lipofiilisille yhdisteille tarkoitetulla neste-nesteuutolla. Näytteen sisältämät analyytit erotettiin toisistaan isograattisella käänteisfaasinestekromatografialla ja detektoitiin elektrosprayionisaatio kolmoiskvadrupolimassaspektrometrillä. Menetelmän toimivuus ja luotettavuus tutkittiin selektiivisyys-, lineaarisuus-, toistettavuus-, oikeellisuus- ja saantokokeiden avulla. Lisäksi tutkittiin analyyttien säilyvyys. Tulokset. Tutkittavien yhdisteiden endogeenisyyden vuoksi menetelmän selektiivisyys tutkittiin mm. keinotekoisen matriisin, standardin lisäysmenetelmän, laimennossarjan, on-line infuusion ja in-source fragmentaation avulla. Lisäksi selektiivisyys osoitettiin C. Elegans matojen fat-3 mutantteilla, jotka eivät kykene tuottamaan pitkäketjuisia tyydyttymättömiä rasvahappoja. Kyseisiin rasvahappoihin kuuluu myös arakidonidihappo (20:4(n-6)), joka on rakenneosana kahdessa yleisimmässä endokannabinoidissa (2-arakidonyyliglyseroli ja anandamidi). Uuttomenetelmän saanto ja analyyttien säilyvyys olivat hyvät. Lisäksi menetelmällä saatiin toistettavia ja oikeellisia tuloksia testatuilla laadunvalvontapitoisuuksilla. Menetelmän dynaaminen alue oli riittävä tarkoitukseensa, ja yhdistettynä edellä mainittuihin menetelmä todettiin soveltuvaksi post-mortem aivonäytteiden endokannabinoidipitoisuuksien määrittämiseen. Analysoitaessa post mortem aivonäytteitä havaittiin tilastollisesti merkittäviä eroja endokannabinoidipitoisuuksissa kontrolliryhmän ja Cloninger tyyppi 1 ja 2 ryhmien välillä 1. Kirjallisuusviitteet 1 Lehtonen, M., Storvik, M., Tupala, E., Hyytiä, P., Tiihonen, J., ja Callaway, J.C., Eur. Neuropsychopharmacol. 20, 2010,

12 Desorptioilmanpainefotoionisaatio takavarikoitujen huumausaineiden tutkimuksessa Anu Flink, 1 Ulla-Maija Laakkonen, 2 Laura Aalberg, 2 Raimo A. Ketola, 3 Tiina J. Kauppila 1 1 Helsingin yliopisto, Farmaseuttisen kemian osasto, Helsinki 2 Keskusrikospoliisi, Rikostekninen laboratorio, Vantaa 3 Helsingin yliopisto, Lääkkeentutkimuksen keskus, Helsinki tiina.kauppila@helsinki.fi Johdanto. Desorptioilmanpainefotoionisaatio (engl. desorption atmospheric pressure photoionization, DAPPI) on erittäin nopea massaspektrometrin ionisaatiotekniikka, jolla voidaan tutkia yhdisteitä suoraan erilaisilta pinnoilta [1]. DAPPI:ssa käytetään lämmitettyä mikrosirua, joka suihkuttaa höyrystynyttä liuotin- ja kaasuvirtausta kohti näytettä. Näytteen pinnan komponentit desorboituvat lämmön vaikutuksesta, jonka jälkeen ionisoituminen tapahtuu kryptonlampun emittoimien fotonien avulla. Molemmissa tekniikoissa desorptio ja ionisaatio tapahtuvat massaspektrometrin ulkopuolella, mikä mahdollistaa näytteen liikuttelun analyysin aikana ja nopeuttaa näytteensyöttöä. Materiaalit ja menetelmät. Tässä työssä tutkittiin DAPPI:n soveltuvuutta takavarikoitujen huumausaineiden rutiinitestaukseen sekä kartoitettiin DAPPItekniikan mahdollisuuksia ja rajoituksia erilaisille näytematriiseille. DAPPI:lla analysoitiin mm. huumekasveja (khat, oopium, kannabis), sieniä, tabletteja ja jauheita. Näytteet analysoitiin pääasiassa sellaisinaan, ilman homogenisointia, uuttoa tai muuta esikäsittelyä. Öljymäisiä näytteitä pipetoitiin 1 µl talouspaperille, joka analysoitiin DAPPI:lla. Jauheet ripoteltiin kaksipuoliselle teipille ja analysoitiin siltä. Tulokset. DAPPI osoittautui nopeaksi ja yksinkertaiseksi menetelmäksi takavarikoitujen huumausaineiden analysoimisessa, joka nopeuttaa ja helpottaa erityisesti huumekasvien ja öljymäisten steroidiliuosten tutkimusta. Näytteen esikäsittely ei minkään näytteen kohdalla ollut tarpeen. Laitteen likaantuminen pystyttiin ehkäisemään säätämällä näytteen etäisyyttä massaspektrometrin suuaukosta. Likaantumista ei havaittu huolimatta näytteiden korkeista konsentraatioista ja useita kuukausia jatkuneista mittauksista. Kirjallisuusviitteet 1 Haapala, M.; Pól, J.; Saarela, V.; Arvola, V.; Kotiaho, T.; Ketola, R. Franssila, S.; Kauppila, T.J. ja Kostiainen, R. Anal. Chem. 79, 2007,

13 Imaging mass spectrometry in biomolecular surface analysis Ron M.A. Heeren FOM-Institute for Atomic and Molecular Physics, Science park 104, 1098 XG Amsterdam, The Netherlands The analysis of biological surfaces with imaging mass spectrometry is an analytical science that experiences a rapid growth as a result of many new fundamental insights and instrumental innovations. The prospect of a capability to directly analyze biomolecular distributions related to societal relevant diseases incited a huge interest by a number of new disciplines. Among those are biomedical sciences, molecular biology, genomic, proteomics and even systems biology. They all share a common interest: obtaining the quantitative spatial distribution of as many biomolecules as possible on a tissue surface preferably on a cellular level. Unfortunately there is no single technique that can provide all of this detail in concert. New, innovative methods are discussed that bring together experimental results from different imaging MS approaches, for example SIMS and MALDI. Combined they provide new molecular visualization tools for medical researchers. The common histological tools typically only provide generic morphological information unless immunohistochemistry is used to determine the distribution one specific known protein. Imaging mass spectrometry has evolved to bring these two disciplines, mass spectrometry and histology. This approach, sometimes referred to as molecular histology, can take great benefit from the use of either high resolution mass spectrometry or gas-phase ion mobility separation. Both approaches combined with imaging mass spectrometry can reveal new tissue details that remain hidden with conventional molecular imaging approaches. In this contribution we will discuss the development and applications of these new chemical microscopes. 13

14 Rf-viritteisellä VUV-lampulla tehokas ionisaatio mikroilmanpainefotoionisaatiossa Anu Vaikkinen, Markus Haapala, Risto Kostiainen, Tiina J. Kauppila Helsingin yliopisto, Farmaseuttisen kemian osasto, Helsinki Johdanto. Mikro-ilmanpainefotoionisaatio (µappi) 1 on miniatyrisoitu massaspektrometrian ionisaatiotekniikka, jota voidaan käyttää mm. yhdistettynä kapillaari- tai nanonestekromatografiaan. Tekniikassa näytevirta höyrystetään kuumennetussa mikrosirussa ja ionisaatioon käytetään 10 ev:n fotoneja emittoivaa kryptonpurkauslamppua kuten ilmanpainefotoionisaatiossa (APPI). Tässä tutkimuksessa on käytetty tehokasta radiotaajuusviritteistä (rf) fotoionisaatiolamppua aiemmin käytetyn tasajännitelampun (dc) sijaan ja vertailtu lamppujen ionisaatiotehokkuuksia. Materiaalit ja menetelmät. Tutkimuksessa vertailtiin dc-lampun ja rf-lampun tehokkuuksia positiivisten ja negatiivisten ionien tuottamisessa µappi:ssa eri liuottimia käytettäessä. Tutkittuja liuottimia ovat mm. APPI-dopantit asetoni ja tolueeni, heksaani ja metanoli sekä metanolin ja veden seos (1:1). Näytteenä oli positiivipuolella parasetamolin, nikotiinin, antraseenin, bentso[a]pyreenin, midazolamin, verapamilin, fluoreseiinin, tetrasyklonin ja testosteronin seos. Negatiivipuolella näytteenä oli parasetamolin, 1,4-dinitrobentseenin ja naftoehapon seos. Lamppuja vertailtiin myös ilmanpaine desorptiofotoionisaatiossa (desorption atmospheric pressure photoionization, DAPPI) 2. Tulokset. Rf-lamppua käytettäessä ionisaatiotehokkuus oli molemmilla polariteeteilla ja kaikkia tutkittuja liuottimia käytettäessä 1 3 kertaluokkaa suurempi kuin dclamppua käytettäessä. Analyyttien signaali kohina-suhteet eivät kuitenkaan kasvaneet rf-lamppua käytettäessä µappi:ssa, paitsi kun ns. dopanttia ei ollut läsnä. Rf-lampulla saatu korkeampi ionisaatiotehokkuus mahdollistaa SRM-mittaukset ja MS/MS-analyysit negatiivipuolella µappi:ssa kasvaneen ionisaatiotehokkuuden ansiosta. Myös DAPPI:ssa ionisaatiotehokkuus oli suurempi rf-lamppua ja kaikkia tutkittuja liuottimia käytettäessä ja DAPPI:ssa saatiin aiempaa suuremmat signaali kohina-suhteet negatiivipuolella. Dc-lamppu vaatii DAPPI:ssa ja µappi:ssa dopantin käytön, mutta rf-lampulla saadaan siis riittävä ionisaatiotehokkuus myös ilman dopanttia. Kirjallisuusviitteet 1 Kauppila T.J., Östman P., Marttila S., Ketola R.A., Kotiaho T., Franssila S., Kostiainen R., Anal.Chem., 76, 2004, Haapala M., Pol J., Saarela V., Arvola V., Kotiaho T., Ketola R.A., Franssila S., Kauppila T.J. ja Kostiainen R., Anal. Chem. 79, 2007,

15 Development of a lipidomic platform based on a hybrid quadrupole time-of-flight (QTof) ion-mobility mass spectrometer, Synapt G2 HDMS, for both targeted and non-targeted analysis Keith Compson, 1 Richard Lock, 1 John P Shockcor, 1 Jose M Castro-Perez, 1 Kate Yu, 1 Emma Marsden-Edwards, 1 Henry Shion, 1 Robert Vreeken, 2 Thomas Hankemeier 2 1 Waters Corporation, Milford, MA USA 2 The Netherlands Metabolomics Centre, Leiden, The Netherlands richard_lock@waters.com Lipids are broadly defined as any fat-soluble (lipophilic), naturally-occurring molecule, and include fats, oils, waxes, cholesterol, sterols, monoglycerides, diglycerides triglycerides, and phospholipids. The main biological functions of lipids are energy storage, as structural components of cell membranes, and as important signaling molecules. Mass spectrometry plays an important role in the study of lipid biochemistry. Recent technological advances have yielded hybrid instruments such as the quadrupole time-of-flight (QTof) ion-mobility mass spectrometer, Synapt G2 HDMS which is an ideal platform for lipid analysis. This instrument possesses clear analytical advantages over conventional tandem quadrupole and linear ion-traps in full scan sensitivity, mass accuracy, spectral resolution and fragmentation. It can also provide an added dimension of separation to the analysis via ion-mobility. With the hybrid QTof it is possible to conduct class specific precursor and neutral loss acquisitions over a single experimental run using an instrument acquisition mode called elevated-energy mass spectrometry (MSE). MSE is a term which is used to describe a strategy which performs data-independent fragmentation experiments. Both parent and product ions are measured in accurate mass mode. The specificity and reliability of this strategy allows us to use this technology as a 'shotgun' LC/MS approach to search for phospholipids, diacylglycerides (DAG) and trigacylycerides (TAG) in an unbiased robust manner. Applying this technology allowed the specific detection of intact molecular ions, precursor ions and neutral losses in either positive or negative ionization mode that upon collision-induced dissociation generated characteristic diagnostic fragment and neutral loss ions. For instance, in positive ion mode phosphocholines and sphingomyelins are readily detected as protonated molecular cations. Upon CID they both generate the m/z fragment ion corresponding to the polar head group, [(CH3)3N+C2H4OP(OH)2O]+. However, ions yielding structural information about the fatty acid side-chains are of low abundance and typically other solvents such as LiOH (post column or addition to the mobile phase) are used to obtain structural information about them. Utilizing the unique characteristics of the IMS sector of the instrument we are able to perform timealigned parallel fragmentation experiments which yield fragment ions that facilitate assignment of the fatty-acid side chains. In this presentation, a robust LC/MS platform for detection and characterization of multiple classes of phospholipids, diacylgylercides and triacylgylercides will be discussed and illustrated with data from extracted human plasma samples. 15

16 Thermogravimetric Analysis Gas Chromatography Mass Spectrometry (TGA-GC/MS) Greg Johnson, Jonas Björklund PerkinElmer, Johanneslundsvägen 2, Upplands Väsby, Sweden Introduction. Thermogravimetric analysis (TGA) measures the change in the weight of a sample as a function of temperature. A limitation of TGA is that it cannot identify what material is lost at a specific temperature. The analysis of gases evolved during a TGA experiment by gas chromatography mass spectrometry (GC/MS) provides laboratories with a way to identify the compound or groups of compounds evolved during a specific weight-loss event in a TGA analysis. This presentation discusses the utility of TG-GC/MS with an example application the identification of specific organic acids evolved during TGA analysis of switchgrass. Materials and methods. The instrumentation used in this study was a PerkinElmer Pyris 1 TGA interfaced to the PerkinElmer Clarus 600 GC/MS with the S- Swafer micro-channel flow splitting device. Results. TG-GC/MS is demonstrated to be a valuable technique in the separation and identification of complex mixtures of gas evolved during a TGA analysis. The S- Swafer device is demonstrated as a means to interface a TGA to GC/MS. The main benefits are its simplicity and the inertness of the entire sample path. 16

17 Massaspektrometria rakennebiologian työvälineenä Janne Jänis Itä-Suomen yliopisto, Kemian laitos, Rakennebiologian tutkimuskeskus (BCK), Joensuu Massaspektrometrian (MS) rooli rakennebiologian eli suurten biomolekyylien, erityisesti proteiinien rakennetutkimuksen työvälineenä on selvästi korostunut viime vuosina. Tästä hyvänä osoituksena on EU:n 7. puiteohjelman Instruct"-hanke, Euroopan laajuisen rakennebiologian infrastruktuuriverkoston kehittämiseksi, jossa yhtenä omana osa-alueenaan on MS. Käytetyistä tekniikoista erityisesti natiivi massaspektrometria (natiivi-ms), jossa proteiinimolekyylejä analysoidaan natiiveina (ei-denaturoituneina), on lisännyt menetelmän merkittävyyttä. Rakennebiologian tärkeimmiksi työvälineiksi on perinteisesti luettu röntgenkristallografia (XRD), ydinmagneettinen resonanssispektroskopia (NMR) ja kryoelektronimikroskopia (cryo- EM). MS täydentää erinomaisesti näistä menetelmistä saatavaa informaatiota, mutta myös paikkaa monia niiden merkittävistä puutteista. Perinteisesti proteiinien analysointi MS:lla tapahtuu käyttäen orgaanisia liuottimia (tai niiden vesiseoksia), jolloin proteiinimolekyylit denaturoituvat. Tämä on usein toivottavaa, sillä denaturoituneilla proteiineilla on yleisesti korkea ionisoitumistehokkuus ja lisäksi useasti varautuneet proteiini-ionit pilkkoutuvat tehokkaasti tandemmassaspektrometrian (MS/MS) menetelmillä. Näissä olosuhteissa proteiinit kuitenkin menettävät kolmiulotteisen laskostuneen rakenteensa sekä mahdolliset vuorovaikutukset muiden molekyylien kanssa. Natiivi- MS:ssa proteiinit mitataan käyttäen orgaanisten liuottimien sijasta puskuriliuoksia tai vettä. Tällöin ne säilyttävät natiivin laskostuneen rakenteensa, jolloin on mahdollista tutkia niiden vuorovaikutuksia peptidien, proteiinien, hiilihydraattien, nukleiinihappojen tai metalli-ionien kanssa tai selvittää rakenteissa tapahtuvia konformaatiomuutoksia. MS:n etuja muihin rakennebiologian menetelmiin verrattuna ovat sen ylivoimainen herkkyys, spesifisyys, heterogeenisuuden sietokyky sekä monipuolisuus. Lisäksi vuorovaikutusten stoikiometria on suoraan ja yksiselitteisesti määritettävissä. Perinteisessä proteomiikassa käytetyt menetelmät proteiinivuorovaikutusten tutkimiseksi (mm. hiivan 2-hybridi-tekniikka) ovat epäkäytännöllisiä (fuusioproteiinien tuotto), antavat huomattavan määrän vääriä positiivisia tai negatiivisia identifikaatioita ja ovat luonteeltaan kvalitatiivisia. Vuorovaikutusten stoikiometriasta tai proteiinikompleksien topologiasta ne eivät kerro mitään. Natiivi-MS vastaa erityisesti haasteisiin, joita on vaikea tai mahdoton ratkaista perinteisillä proteomiikan menetelmillä. Natiivi-MS:n menetelmät ovat myös automatisoitavissa, joten suuren mittakaavan analyysit ovat myös mahdollisia. Tässä esityksessä tarkastellaan MS:n käyttöä rakennebiologian monipuolisena työvälineenä, erityisesti käyttäen ultra-korkean erotuskyvyn laitteistoja. Esimerkkejä tarjotaan muun muassa rekombinanttiproteiinien laadun tarkkailusta, proteiiniproteiini-vuorovaikutusten karakterisoinnista sekä vety/deuterium (H/D)- vaihtoreaktioiden käytöstä proteiinien konformaatiomuutosten ja stabiilisuuden analysoinnissa. 17

18 Validation of a mass spectrometric method for hepcidin Outi Itkonen, 1,2 Esa Hämäläinen 1,2 1 HUS, HUSLAB, 2 Helsinki University, Department of Clinical Chemistry, Helsinki outi.itkonen@hus.fi Introduction. The peptide hormone hepcidin is the key regulator in systemic iron homeostasis. It is synthesized mainly by the hepatocytes, secreted into blood and excreted into urine. Hepcidin expression is induced by high serum iron level and proinflammatory cytokines (IL-6), and suppressed by the so called erythroid factor. Hepcidin acts as a negative regulator of iron absorption by inducing the degradation of ferroportin, a protein which transfers iron from enterocytes to circulation. It also regulates the recycling of iron through macrophages. Hepcidin determination has a role in diagnosis of inflammation and iron deficiency anaemia, hemochromatosis, thalassemia, hepatitis and renal insufficiency. In clinical laboratories, serum hepcidin can be analyzed with a commercial ELISA method. Recently, Li et al. described an LC-MS method for hepcidin 1 and the method was validated according to FDA guidelines. Materials and methods. We have set up a slightly modified method of Li et al. 1 and validated this LC-MS assay for hepcidin using an Applied Biosystems API 4000 QTRAP mass spectrometer. In addition, we have analysed hepcidin levels in patients with inflammation and elevated serum C reactive protein (CPR) and in patients with suspected iron deficiency anaemia and elevated serum transferrin receptor (TfR) and the results were compared to the levels in healthy individuals. Results. The validation parameters of our method were: limit of detection 0.2 nmol/l, limit of quantification 0.4 nmol/l, within assay variation 2.5% - 5.0%, between assay variation 6.2% - 7.0%, recovery 102% - 120% and linear range nmol/l. Compared to healthy individuals, circulating hepcidin levels were increased in patients with increased CRP and the levels were low in patients with increased TfR as expected. Our method is convenient, robust and reliable. More than 50 samples can easily be analyzed per day. The method is thus well suited for serum hepcidin quantification in clinical laboratories. Reference 1 Li H et al. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 59, 2009,

19 Discovery and validation of plasma markers of liver fat content: Metabolomics approach Heli Nygren, 1 Tuulikki Seppänen-Laakso, 1 Ismo Mattila, 1 Tuulia Hyötyläinen, 1 Anna Kotronen, 2 Matej Orešič, 1 Hannele Yki-Järvinen 2 1 VTT Technical Research Centre of Finland, Tietotie 2, Espoo, FI VTT, Finland 2 Department of Medicine, Division of Diabetes, University of Helsinki, Helsinki, Finland heli.nygren@vtt.fi Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common liver disorder in affluent societies, representing the hepatic metabolic consequence. It is in many cases is linked to obesity or overweight. At present, there is a lack of accurate and sensitive diagnostic tests for NALFD that do not involve invasive procedures. For the development of diagnostic tools for NALFD information on the metabolic profiles associated with the NALFD is important. In this study, potential biomarkers for the prediction of liver fat content in NAFLD were studied using two analytical platforms, covering large range of lipids and polar metabolites. Sample set included over 900 plasma samples from ~800 individuals, which were divided into discovery and validation groups. Liver fat content was measured using proton magnetic resonance spectroscopy or histology. In addition, detailed clinical information was available for all subjects. For determination of molecular lipids, ultra high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOFMS) was applied. For further identification of unknown lipids, fractions collected from UPLC run were infused to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer by a TriVersa Nanomate using chip-based nanoelectrospray in positive and negative ionisation mode. Identifications were based on the exact mass and MS 2 and MS 3 spectra. For the determination of polar metabolites, comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry (GCxGC-TOFMS) was used. Statistical analyses were performed using a freely available R package. In the discovery series of samples several lipids, including many triacylglycerols, and several amino acids were found to significantly correlate with liver fat content. On the contrary a strong negative correlation was observed with certain phospholipids. Using these marker lipids in addition to the routinely available clinical and laboratory data may increase the accuracy of the prediction of liver fat content in NAFLD. The validation series of samples will be used to confirm these results. 19

20 Metabolomics using Pegasus GC- and GCxGC-TOFMS Ebba Lindgren, 1 Lorraine Kay 2 1 LECO Corporation Svenska AB, Upplands Väsby SWEDEN 2 LECO Corporation UK, Manchester UK ebba_lindgren@lecoswe.se Samples analysed in metabolomic studies are by their very nature extremely complex. The ability to detect biomarkers of disease from samples such as human breath, blood and urine or uncover metabolites in plants that have potential medicinal properties is an exciting concept. However, the complete metabolite characterization of a biological system is an enormous challenge for any analyst irrespective of the starting material. Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GCMS) is an ideal tool that can assist in the huge task of analysing the metabolites in these various matrices. Nonetheless, following chromatographic separation of thousands of compounds and dozens of different chemical families, identification and quantification is also necessary. Although GCMS is widely used in this field many methods are limited in their capacity to give anything more than target analysis in a single chromatographic run. Modern methods that use Time of Flight mass spectrometers (TOFMS) such as GC- & GC GC-TOFMS vastly increase the information gleaned from a single sample injection and help to fill this gap [1]. Dallüge et al. [2] reported that only detectors able to acquire fifty or more spectra per second enable effective reconstruction of the two dimensional chromatogram and subsequent quantification. Currently, the only compatible MS is time-of-flight mass spectrometry (TOFMS). Additionally, O Hagan et al have reported the optimisation, automation and high throughput essential for metabolomic studies using GC-TOFMS [3] & GC GC-TOFMS [4]. Furthermore, Dallüge et al. [5] and Shellie et al. [6] concluded that GC GC TOFMS provides a reliable basis for the automated analysis of complex samples. It is possible to achieve both non-target and target analysis in one sample run by acquiring all the peak information initially. Once data are acquired they are processed accordingly, whether this be looking for specific biomarkers or alternatively to provide metabolic profiles/footprints in order to search for unexpected or unknown metabolites. Both GC- & GCxGC-TOFMS as tools for metabolomic analyses are discussed here. [1] P. J. Schoenmakers, J.L.M.M. Oomen, J. Blomberg, W. Genuit, G. Van Velzen, J. Chromatogr. A., 892 (2000) 29 [2] J. Dallüge, R.J.J. Vreuls, J. Beens. U.A.Th. Brinkman, J. Sep. Sci., 25 (2002) 201 [3] S. O Hagan, W.B. Dunn, M. Brown, J.D. Knowles, D.B. Kell. Anal. Chem. (2005), 77, [4] S. O Hagan, W.B. Dunn, J.D. Knowles, D. Broadhurst, R. Williams, J.J. Ashworth, M. Cameron, D.B. Kell. Anal. Chem. (2007), 79, [5] J. Dallüge, L.L.P. van Stee, X. Xu, J. Williams. J. Beens, R.J.J. Vreuls, U.A.Th. Brinkman, J. Chromatogr. A, 974 (2002) 169 [6] R. Shellie, Ph, Marriot, J. Flavour Fragr. 18 (2003)