(B) (11) KUSJULKAISU UULUT UTLAGG NINGSSKRIFT 86376 C t -1 n. (51) Kv.lk.5 Int.c1.5 A 61K 39/29, C 12N 7/08 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (21) Patenttihakemus - Patentansökning 861966 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 12.05.86 (24) Alkupäivä - Löpdag 18.09.85 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 12.05.86 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 15.05.92 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan US85/01769 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 19.09.84 US 652067 P (71) Hakija - Sökande 1. The United States of America, 5825 Port Royal Road, Springfield, Va. 22161, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Daemer, Richard J., 9000 Rockville Pike, Bld 29 Room 307, Bethesda, Md. 20205, USA, (US) 2. Feinstone, Stephen M., 9000 Rockville Pike, Bethesda, Md. 20205, USA, (US) 3. Purcell, Robert H., 9000 Rockville Pike, Bethesda, Md. 20205, USA, (US) 4. Gust, Ian D., Yarra Bend Road, Fairfield, Victoria 3079, Australia, (AU) (74) Asiamies - Ombud: Leitzinger Oy (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä valmistaa puhdistettu ja kolmasti kloonattu hepatiittis-a-virus Förfarande för framställning av renad och tre gånger klonad hepatitis-a-virus (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: VR2097 ATCC VR2098 ATCC VR2099 ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Infection and Immunity vol. 32 /1981 p. 388-393, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine vol. 170 (1982) p. 8-14, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine vol. 172 (1983) p. 357-363 (57) Tiivistelmä - Sammandrag ihmisen hepatiitti-a-virus (HAV) voidaan puhdistaa menelelwalld, jossa kolmasti kloonatusta viruksesta valmistetaan hepatiitti-a-viruskannasta HM-175peruseriä loppulaimentamalla läpaisytasolla noin 20 tai parhaiten vähintään 20-30. lestalut kloonit ulheultival vain minimaulisesti hepatlittiu tai ei lainkaan, vaikkakin siirrostetuissa kadellisissä kehittyi merkittävä vasta-ainereaktio. Kuvauksen kohteena on myös menetelmä, jolla valmistetaan kolmasti kloonattu rokote. Human hepatitis A virus (HAV) kan rends genom en process där basympsatser av HM-175 stammen av hepatitis A virus framställes från trippelklonat virus genom slutlig utspädning vid en passernivå av ca 20 eller företrädesvis ätminstone 20-30. Testade kloner förorsakade endast minimalt hepatitis eller icke alls, fastän betydande motkroppsreaktion utvecklades i inympåde bandjur. Uppfinningen avser även ett förfarande för framstållnin,j av trippelklon,it vaccin.
1 86376 Menetelmä valmistaa puhdistettu ja kolmasti kloonattu hepatiittis-a-virus - Förfarande för framställning av renad och tre gånger klonad hepatitis-a-virus Hepatiittis-A-virus (HAV) on levinnyt yli maailman. Se on vastuussa jopa 100.000 hepatiittis-tapauksesta vuodessa Yhdysvalloissa, jossa, kuten kehittyneen maailman pääosassa, se aiheuttaa ehkä 20-25 % kliinisistä hepatiittis-tapauksista. Se on erittäin endeeminen kaikkialla alikehittyneissä maissa ja infektoi näillä alueilla käytännöllisesti katsoen 100 % asukkaista 10 vuoden ikään mennessä. Se on picornavirus, jolla on monia enterovirusten ominaisuuksia, ja se on tällaiseksi luokiteltukin. Se leviää pääasiallisesti uloste-oraalisen kontaminaation kautta, ja se on ollut syynä moniin taiitiepidemioihin, jotka levittyvät veden tai elintarvikkeiden kautta. Se leviää kuitenkin tavallisimmin henkilöiden välisen kosketuksen kautta. Haava-viruksen välittyminen parenteraalisesti on erittäin harvinaista. US-patentissa 4,165,566 (Provost et al) on esitetty hepatiittis-a-viruksen in vitro kehittäminen soluviljelmissä. Provost et al on kuitenkin käyttänyt eri HAV-kantaa, jonka on kuljettava vähintään viisi kertaa sub-humaanin kädellisen läpi tuottaakseen HAV-viruksen. Keksijöiden US-patenttihakemuksen 366.165 keksinnön tarkoituksena on osoittaa, että HAV voidaan eristää ja johtaa sarjana primäärien MMK (African green monkey kidney)-soluviljelmien läpi otettuna suoraan ihmisen kliinisistä näytteistä. Daemer et al, Infection and Immunity, Vol. 32, No. 1, huhtikuu 1981, s. 388-393. Purcell et al, "Hepatitis A Virus". Hepatiittis-A-viruksen HM-175 kanta on tallennettu ATCC (American Type Culture Collection)-kokoelmaan patenttisään-
2 86376 nösten alaisuuteen ennen tämän hakemuksen jättämistä. Kanta on näin tallennettu pysyvästi ja on yleisön käytettävissä patentin myöntämisen jälkeen. Hepatiittis-A-viruksen HM-175 kannan peruserien (master seed lots) kolminkertainen kloonaus on johtanut ylivoimaiseen rokotteeseen, joka simpansseissa ja muissa kädellisissä, kuten marakateissa, tuottaa vasta-aineita, mutta ei aiheuta tautia. Villityyppisellä virukselle haastettujen simpanssien suojansaanti on rokotteen merkittävä indiisi. Soluviljelmä, joka oli adaptoinut humaanin HM-175 hepatiittis- A-viruksen 10 ja 20 kasvusykleillä primaarin AGMK (African green monkey kidney)-soluviljelmissä, havaittiin heikentyneen simpanssien suhteen, mutta aiheuttavan sero-muunnoksia, mistä on osoituksena hepatiittis-a-vasta-aineen indusoituminen ilman biokemiallista osoitusta maksataudista, taulukko 1. Simpanssit, jotka oli edeltäkäsin infektoitu heikennetyllä kannalla ja jotka tuottivat hepatiittis-a-vasta-ainetta, saivat suojan kehittyvää hepatiittista vastaan, kun ne haastettiin infektiokykyisellä hepatiittis-a-viruksella, ellei haastaminen tapahtunut toipilaisuuden alkuvaiheen aikana, jolloin kehittyi primaarinen immuunivaste, talukko 2. Samalla materiaalilla siirrostetut marakatit tosin kehittivät hepatiittiksen, vaikkakin vähemmän voimakkaan kuin villityyppisellä viruksella (taulukko 1 ja kuvio 1). Kudosviljelmässä kasvusykeljä läpikäyneen viruksen heikentymisen pysyvyys osoitettiin siirrostamaila (perkutaanisti, parhaiten intravenöösisti) lisää simpansseja aikaisemmin siirrostettujen eläinten akuutissa vaiheessa olevilla ulosteilla, taulukko 3. Kohde-eläimet eivät kehittäneet mitään biokemiallista osoitusta maksataudista, mutta tuottivat hepatiittis-a-vasta-ainetta.. Hepatiittis-A-viruksen HM-175 kannan peruserät on kloonattu kolminkertaisesti laimentamalla terminaalisesti kasvusykleillä 10, 20 ja 30 (kuvio 2). Syklejä 20 läpäisseistä klooneista on kandesta arvioitu heikentyminen simpansseilla. Siirrostetuissa
3 86376 simpansseissa kehittyi minimaalisesti tai ei lainkaan hepatiittista näillä kandella testatulla kloonilla. Kloonilla no 1 vasta-ainetta muodostui kolmessa eläimessä kuudesta ja kloonilla no 2 vasta-ainetta muodostui kolmessa eläimessä neljästä siirrostetusta. Tässä selityksessä ja vaatimuksessa käytetty termi "kloonattu" tarkoittaa yksittäisen virushiukkasen infektoiman soluviljelmän talteenoton erityisellä sarjalaimennuksella ja käyttämällä sitä tuoreen soluviljelyn innukoloimiseen, joka sitten laimennetaan tiettyyn laimennukseen saakka. Käytetty termi "kolmasti kloonattu" tarkoittaa sitä tuotetta, joka on saatu edellä mainitun kloonimenetelmän kolmen toison jälkeen. Hepatiittis-A-viruksen HM-175 kannan kolmasti kloonatun virusmateriaalin hyödyksikäyttö havainnollistaa sitä, että se on tehokas rokote simpansseille elävänä HAV-viruksena. Tätä rokotetta voidaan käyttää hyödyksi nisäkkäillä tai korkeammilla kädellisillä, joihin kuuluvat ihminen, simpanssit ja marakatit. Kolmasti kloonattu virusmateriaali (3X) on yhtenäisesti parempi kuin kandesti kloonattu (2X) virus rokotteeksi sopivana yhtenäisenä viruspreparaattina. Tässä yhteydessä selvitetty viruksen peruserä valmistetaan kolmasti kloonatusta viruksesta päätelaimentamalla kasvusykleillä 10 ja 20 (Cunningham, A Laboratory Guide, Virology, 5. pain., Bugess Pub. Co., 1963, s. 144-145). Laimentamisen tarkoituksena on, että korkein positiivinen laimennusputki saadaan yhdestä ainoasta virushiukkasesta, jolloin tuote on biologisesti yhtenäinen. Viruksen tai rokotteen yhtenäisyyden kannalta optimaalinen kloonauksen päätelaimennus näytti olevan 3X. Tämä valinta 3X vastaa seuraavia kirjallisuusviitteitä: Lennet ja Schmidt, "Diagnostic procedure for Viral and Ricksettial Infections", American Public Helat Association, 5. pain., 1979, sivu 102; ja Dulbecco ja Vogt, "Paluque Formation
4 86376 and Isolation of Pure Lines with Poliomyelitis Viruses", J. Exp. Med., 99:167-182, 1954. Humaanin hepatiitti-a-viruksen HM-175 kanta tuotiin tähän maahan, ja se on kuvattu julkaisussa: Infection and Immunity, 32(1), huhtikuu 1981, sivut 388-393. Esimerkki 1 Virus kloonattiin seuraavasti: Kloonaamaton virus sarjalaimennettiin 10-1 - 10-8. Jokaisella laimennuksella siirrostettiin 9 putkellista primääristä AGM (African green monkey) soluviljelmää. Solujen annettiin kasvaa, ja soluissa kasvanut virus otettiin talteen 8 viikon kuluttua. Jokai:3esta koeputkesta määritettiin tällä hetkellä hepatiitti-a-viruksen antigeeni. Putkien, joissa oli korkeimmat laimennukset, so. 10-8, joukossa oli joitakin negatiivisia ja joitakin positiivisia putkia. Tilastollisen analyysin perusteella positiiviset putket olivat tässä laimennuksessa peräisin yhdestä ainoasta viruspartikkelista. Negatiiviset putket eivät sisältäneet lainkaan virusta. Positiivisista putkista kerättiin talteen kaksi koeputkea jokaisesta loppulaimennussarjasta. Ne vuorostaan vietiin saman kloonaustapahtuman läpi toisen ja kolmannen kerran. Kolmannessa kloonauksessa kerättiin talteen kaksi koeputkea loppulaimennuksesta ja siirrostamaton kontrolli. Nämä positiiviset putket, jotka olivat peräisin yhdestä ainoasta viruspartikkelista, kasvatettiin peruseräksi. Sen jälkeen kasvatettiin peruseriä ja käytettiin sinipanssikokeissa (kuvio 2). Esimerkki 2 Perusmateriaalin käyttö. Simpanssit siirrostettiin joko kolmasti kloonatulla laimentamattomalla perusmateriaalilla tai saman materiaalin laimennuksilla. Laimentamaton
5 86376 perusvirus saatiin kolmasti kloonatusta putkesta; tässä materiaalissa lisättiin sen jälkeen viruksen määrää siirrostamalla lisää soluja ja sen jälkeen nämä siirrostetut viljelmät kerättiin talteen, jolloin saatiin suurempi viruserä. Tämä materiaali muodosti kasvatetun perusviruserän. Tällä materiaalilla siirrostettiin myöhemmin simpanssit käyttämällä joko laimentamatonta materiaalia tai peruserän kymmenenkertaisia laimennuksia. Esimerkki 3 Eläinten siirrostaminen. Simpanssit siirrostettiin joko intravenöösisti tai suun kautta. Simpansseista otettiin verta jokainen viikko 4-6 kuukauden ajan ja määritettiin kohonneet maksan entsyymit (ALT, alaniiniaminotransferaasi) + anti-hav-vasta-aine. Kohonneet entsyymitasot viittaisivat eläinten hepatiitti-a-sairauteen ja vastaaineen mukanaolo merkitsisi suojauksen saantia (taulukko 4). Klooni n:o 1 (kudosviljelyjen määrä 20 tai 21) infektoi 15 altistetusta simpanssista, jotka oli siirrostettu intravenöösisti tai suun kautta, 11 simpanssia ja aiheutti lievän hepatiitim vain kandessa näistä. Nämä 11 infektoitua simpanssia reagoivat suojaavalla vasta-aineella 3-8 viikon kuluttua rokottamisesta. Klooni n:o 2 (kudosviljelyjen määrä 20) siirrostettiin intravenöösisti neljään altistettuun simpanssiin. Vain yhdellä näistä neljästä eläimestä oli hyvin lievä, rajatapauksena pidettävä hepatiitti. Kaikki neljä muodostivat suojaavaa vastaainetta. Samoin kandesta altistetusta simpanssista, jotka oli siirrostettu intravenöösisti kloonilla n:o 4 (kudosviljelyjen määrä 9) simpanssi infektoitui muodostumatta hepatiittia mutta kehittämällä suojaavaa vastaainetta.
6 86376 TAULUKKO 1 HAV HM-175-KANNAN HEIKENTYMINEN: ELAINTUTKIMUKSET Simpanssit Kudosvilje- ALT lyjen määrä N:o (Väli) Keskim.maks. Marakatit ICD N:o (Väli) Keskim.maks. 0 7 314 (109-419) 10' 4777 (1,631-15.980) 10 7 62 (41-75) N.T. 20 5 48 (37-61) 7 3516 (1.062-10.230) 20 ja 21 * 10 60 (38-87) 3 2936 (2.263-3,799) No HAV } 6 57 ' (41-81) 4 610 (483-927) * Kolmasti kloonattu + NAV-viruksen ei-infektoivat laimennokset TAULUKKO 2 IMMUNISOITUJEN SIMPANSSIEN REAKTIO HAASTAMISEEN VILLITYYPPISELLÄ HAV:LLA SX111-m, panssi Esinaastav rokote Haastava Anti-HAV (P/N) Haastamisen jälkeen Maks. Ali Anti-HAV (Maks. ) P/N A-8 TC P-10 9,5 64 22,8 947 TC P-20 9,1 65 28,3 A-53 TC P-20 11,4 280 28,1 A-54 TC P-20 4,8 57 14,3 A-55 Ei. 1,3 402 26.0 * HM-175 villityyppi 10 3 CID
7 86376 TAULUKKO 3 YRITYKSET VÄLTTÄÄ HEIKENNETTY HAV ROKOTETUISTA SIMPANSSEISTbk Siirroste Lähde Kohde Maks. ALT Anti- HAV Akuutti Simpanssi 992 Simpanssi A-136 57 uloste (TC P-10) Akuutti Simo. 947, A-11 uloste- A-53, A-54 Simpanssi 992 46 + pooli (TC P-20) TAULUKKO 4 HAV, KANTA HM-175, KOLMASI KLOONATTU, SIMPANSSIN RAKTIO S impanssi Siirroste TCID Maks. Maks. Koh. ents. ents. esi- tason aika 1.poikk. taso ents. (vk) (vk) 993 cl#1.1)-20 1.0-1 1v 73 65 A-6 75 71 A-5I 192 50 A-178 10 IV 42 43 A-47 CI# P-21 10 5 IV 57 43 A-150 129 42 A-19 praali 47 54 A-169 50 32 A-60 10 IV 72 70 A-232 40 36 1 A-67 C1#2 P-20 10 - '1V 78 68 A-113 A -I18 38 44 45 51 A-218 10 IV 87 36 A-68 C1#4 P-9 10-1 1V 50 54 A-52 55 51 1 2 5 3 1 3 8 2 6 6 5 6 4 2 5 4
Patenttivaatimukset 8 86376 1. Menetelmä valmistaa kolme kertaa kloonattua hepatiittis-arokotetta, joka aikaansaa suojaavan vasta-ainereaktion sitä ruiskutettaessa korkeimpiin kädellisiin, tunnettu siitä, että HM-175-kanta kloonataan kolmasti seuraavilla vaiheilla: a) laimennetaan kloonamaton hepatiittis-a-virus, b) primaarisen AGM (African green monkey)-munuaissoluviljelmään siirrostetaan kloonamaton virus, c) annetaan apinan munuaissoluviljelmä kasvaa, d) apinan munuaissoluviljelmät otetaan talteen, e) apinan munuaissoluviljelmää tutkitaan hepatiittisvirusantigeenin läsnäolon toteamiseksi, f) valitaan primaarinen apinan munuaisviljemä, jolla on suurin hepatiittis-a-viruslaimennus ja tuottaa viljelmässä hepatiittis-a-viruksen antigeenin, g) toistetaan edellä esitetty kloonausmenetelmä toisen ja kolmannen kerran. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmasti kloonatulla HM-175-viruksella on viruksen kasvusyklejä vähintään 10-30. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmasti kloonattu HM-175-viruskannan talletusnumero on ATCC VR 2097, VR 2098 ja VR 2099. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kloonamaton hepatiittis-a-virus on HM-175, jonka talletusnumero on ATCC VR 2093. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmasti kloonattu hepatiittis-a-rokote tuotetaan elävästä HM-175-viruksesta.
9 86376 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmasti kloonattu hepatiittis-a-rokote tuotetaan heikennetystä HM-175-viruksesta.
1 0 86376 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av tre gånger klonad hepatitis-a-vaccin, som åstadkommer en skyddande anti-kroppsreaktion vid dess injicering i högre däggdjur, k ä n n e t e c k n a t därav, att en HM-175-stam klonas tre gånger med följande steg: a) ett oklonat hepatitis-a-virus utspäds, b) en primär AGM (African green monkey)-njurcellsodling inockuleras med oklonad virus, c) apnjurcellsodlingen tillåts gro, d) apnjurcellsodlingarna tas tillvara, e) apnjurcellsodlingarna undersöks för påvisande av närvaron av hepatitisvirusantikroppar, f) den primära apnjurcellsodling, som uppvisar den största hepatitis-a-virusutspädning och som i odling producerar antikroppar till hepatitis-a-virus, utväljs, g) det ovan beskrivna kloningsförfarandet upprepas en andra och tredje gäng. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det tre gånger klonade HM-175-viruset uppvisar åtminstone 10-30 virusväxtcykler. 3. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det tre gånger klonade HM-175-virusstammens deponeringsnummer är ATCC VR 2097, VR 2098 och VR 2099. 4. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det oklonade hepatitis-a-viruset är HM-175, vars deponeringsnummer är ATCC VR 2093. 5. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det tre gånger klonade hepatitis-a-vaccinet produceras av ett levande HM-175-virus.
11 86376 6. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att det tre gånger klonade hepatitis-a-vaccinet produceras av ett försvagat HM-175-virus.
HAV,,KANT/ HM-175 3 AGMK-20 1 MID 30 20 10 22 30 D 20 10? 6 30 20 10 10 11 12 13 14
8 6 3 7 AGMKTC 10 11b. pio P-10: P-28: FIG.2