Proteiinikoon määritys (SDS-page)

Proteiinikoon määritys (SDS-page) Johdanto SDS-pagen (sodium dodecyl sulfate) avulla määritetään proteiinien kokoja ja menetelmällä voidaan myös selvittää proteiininäytteen puhtautta. peitegeeli Menetelmässä proteiini linearisoidaan peptidiketjuksi, varataan negatiiviseksi SDS:llä ja erotetaan muista peptidiketjun pituuden perusteella. Geelissä erotusgeeli peptidiketjut näkyvät vyöhykkeinä (engl. band) ja näitä verrataan tunnettuun standardiin, joka sisältää useampaa eri proteiinia. Elintarvikevalvonnassa SDSpagea voidaan käyttää mm. jauhelihan sika-nautapitoisuuksien määrityksessä. Sianlihalla ja naudanlihalla on toisistaan poikkeavat proteiinikoostumukset ja näiden avulla voidaan saada selville esim. sisältääkö myytävä jauheliha oikeasti esim. puolet sikaa ja puolet nautaa. SDS-pagen onnistuminen vaatii huolellista laboratoriotyöskentelyä, koska työvaiheita on monia. Kaiken voit tehdä itse tai ostaa valmiina. SDS-geeli koostuu kahdesta eri osasta: alaosa (erotusgeeli) ja yläosa (peitegeeli). Peitegeelissä ei tapahdu proteiinien erottumista, vaan peitegeelin tehtävänä on koota näytteet erotusgeelin yläreunaan. Tämän johdosta proteiinit siirtyvät erotusgeeliin samanaikaisesti. SDS-pagea voi tehdä monella eri tavalla, tässä ohjeessa on esitelty perinteinen tapa työn suorittamiseen. Geelin akryyliamidiprosenttia (kuva 1) tulee muuttaa näyteproteiinin koon mukaisesti. Lisätietoja aiheesta löytyy internetistä runsaasti. SDS-pagea voi tehdä myös automaattisissa laitteistoissa, esim. minigeeleissä (kuva 2). Ei-denaturoivaa SDS-pagea eli natiiviigeeliä käytetään, jos ajon jälkeen tehdään proteiinien siirto kalvolle eli blottaus. Edwin Southern keksi DNA-blottauksen ensimmäisenä ja menetelmä sai nimekseen Southern. Tämän jälkeen keksittiin RNA ja proteiiniblottaus ja ne nimettiin ilmansuuntahengessä vastaavasti Northern blot (RNA) ja Western blot (proteiini). Kuva 1 SDS-pagegeelin työskentelyalueet erilaisilla akryyliamidipitoisuuksilla. 1

Kuva 2 Vasemmalla on perinteinen SDS-page geeli (noin 15*15 cm) yksittäisillä standardiproteiineilla. Oikealla on automaattilaitteistolla ajettuja ja hopea- sekä Coomassie-värjättyjä minigeelejä. Työssä tarvittavat reagenssit (valmistusohjeet työohjeen lopussa) 1,5 M Tris-puskuri, ph noin 8,8 (noin 10 ml) 0,5 M Tris-puskuri, ph noin 7,2 (noin 10 ml) Akryyliamidi-bisliuos (noin 15 ml) MYRKKY Dithiotreitoli (noin 15 µg) TEMED (noin 200 µl) 10 % ammoniumpersulfaatti (APS) (noin 400 µl, liuos ei säily toimintakuntoisena huoneenlämmössä, valmista uusi liuos jokaista työtä varten) 10 % SDS (noin 300 µl, Sodium Dodecyl Sulfate, natriumlauryylisulfaatti) 70 % etanoli (noin 5 ml) Näytepuskuri (noin 1 ml) Ajopuskuri (noin 500 ml) Värjäysliuos (noin 100 ml) Näytteet (noin 50 µl/näyte) Standardit (noin 50 µl/geeli) HUOM! 1. Työssä on vaarallisia kemikaaleja, kuten akryyliamidia. Muista akryyliamidin neurotoksisuus eli hanskat käteen, punnitus kohdepoiston alla ja työskentely vetokaapissa. Tutustu kemikaalien käyttöturvallisuustietoihin ja jätteiden oikeaan hävittämiseen. 2. Varmista että sähkölaitteet ovat jännitteettömiä (töpseli pois seinästä tai virtakytkin 0-asennossa) kun käsittelet avonaisia laitteistoja. 3. Käytössä on erilaisia ajolaitteistoja, joten katso ja kokeile, että osat kuuluvat varmasti samaan laitteistoon. Ole huolellinen jännitteisten laitteiden kanssa. Työn aluksi tarkista geelin tilavuus käyttämilläsi välineillä. Yhden ison (noin 15 * 10 cm) normaalikokoisen geelin kokonaistilavuus on noin 10 ml (geelin paksuus 1,5 mm). Varmista myös, että kampa ja reunapalat (engl. spacer) ovat saman paksuisia. 2

Geelin valussa tarvittavat välineet: 1. Piioksidilevy (eriste) 2. Reunapalat (spacer) 3. Valukehikko 4. Lasilevy 5. Kampa. Varmista, että kampa ja reunapalat ovat yhtä paksuja. 6. Valupohja + kiinnikkeet (10) 1 2 3 3. 4 5 6 Geelin ajossa tarvittavat välineet: 7. Kansi 8. Ajoaltaan pohja 9. Geelin ajokehikko 10. Kiinnikkeet 11. Ajokiinnikkeet 7 8 9 10 11 3

Laboratoriotyö: SDS-page ja menetelmäherkkyyden selvitys. Liuoksien valmistaminen Geelin valmistaminen Näytteiden ja standardien lataus sekä ajo Geelin värjäys Kuvantaminen ja tulosten analysointi Geelin valaminen perinteisellä SDS-page -laitteella 1. Hae tarvittavat välineet valmiiksi ja selvitä että ne kaikki kuuluvat samaan kokonaisuuteen. 2. Pyri kaikissa vaiheissa välttämään kuplien muodostumista geeliin. 3. Valmista tarvittavat reagenssit. 4. Kokoa valumuotti järjestyksessä: eristelevy reunapalat lasilevy (kuva 3). Kiristä järkevästi tämä ei ole voimalaji. Huomaa jättää levypaketti pari milliä puristuslevyn alapuolelle, jotta liuokset eivät pääse karkuun geeliä valaessa. Testaa tämän jälkeen valumuotin pitävyys vedellä yläreunaan asti. SDS-geeli koostuu kahdesta osasta: alaosa (erotusgeeli) ja yläosa (peitegeeli). 5. Valmista erotusgeeli työohjeen mukaan. Vala erotusgeeli ja odota geelin hyytymistä noin 30 minuuttia. Voit lisää geelin päälle pari tippaa 70 prosenttista etanolia pintajännityksen pienentämiseksi. Jos aines ei hyydy niin jossakin on vika - lisäaika ei auta hyytymisessä. Voit merkitä erotusgeelin yläreunan esim. tussilla lasiin, jotta erotat geelirajan ajovaiheessa. 6. Pese erotusgeelin pinnalta hyytymätön aines pois pipetoimalla pinnalle 2 kertaa vettä. Poista vesi kääntämällä laitteisto. 7. Valmista peitegeeli työohjeen mukaan. Tämän jälkeen pipetoi ylägeeli ja aseta kampa paikoilleen. Geeliä voi pipetoida melkein yläreunaan asti ja kampaa asetettaessa ylimääräinen geeli pursuaa pois. Vala ylägeeli siten, että kamman ollessa paikoillaan kamman ja geelin yläreunan väliin jää noin 5 mm. Tulevan pipetointityön helpottamiseksi voit merkitä esim. jonkun kolon alareunan tussilla lasiin. Geelin pipetoinneissa kannattaa käyttää esimerkiksi katkaistua pipetinkärkeä tai muovista pasteur-pipettiä. Odota geelin hyytymistä noin 30 minuuttia. 8. Poista kampa geelin hyytymisen jälkeen. Jos geeliä ei käytetä heti, pipetoi näytekoloihin SDSajopuskuria. Kostea geeli säilytetään tuorekelmuun käärittynä ilman kiristyspalikkaa jääkaapissa. Kuva 3 SDS-geelin valmistaminen: levypaketti, levypaketti valumuottiin kiinnitettynä, geelin valu. 4

Näytteiden ja standardien valmistus Näytteet määräävät käytettävän akryyliamidiprosentin (kuva 1) ja standardin. Tarkista näiden yhteensopivuus ja selvitä minkälainen käsittely näytepuskurille tarvitsee tehdä ennen käyttöä. 1. Näytteet käsitellään seuraavasti: Lisää näytepuskuriin juuri ennen käyttöä dithiotreitolia!!! (0,0155 g dithiotreitolia/1 ml näytepuskuria). Pipetoidaan 50 µl kutakin näytettä eppendorf-putkiin ja lisätään 50 µl kohdassa 1 valmistettua näytepuskuria. 2. Näytteet sekoitetaan ja kuumennetaan korkit kiinnitettyinä noin sadassa asteessa lämpöblokissa 3 minuuttia. Voit varmistaa korkkien kiinnipysymisen käyttämällä korkinsulkijaa (kts. viereinen kuva). Kuumennuksen jälkeen proteiinit ovat valmiit pipetoivaksi geelille. Työ kannattaa tehdä vetokaapissa käryjen välttämiseksi. Joissakin SDS-reagensseissa on esim. pahanhajuista merkaptoetanolia. 3. Varmista minkälaisia standardeja käytetään, koska osa on valmiiksi värjättyjä jne. Standardien esikäsittely tapahtuu ohjeen mukaan. 4. Standardia ja näytteitä pipetoidaan geelille yleensä 10 µl/kaivo. Usein myös 5 µl standardia riittää. Geelin lataus ja ajo 1. Kiinnitä valumuotti kiinnikkeillä ajolaitteeseen lasilevy ulospäin. Tiivisteisiin kannattaa sivellä ohuelti esim. silikonirasvaa tiiveyden varmistamiseksi. 2. Täytä kammio ja alaosa ajopuskurilla. Kammiot kuuluu täyttää lasilevyn yläreunaan asti. Näytteiden pipetointi tapahtuu nesteen pinnan alla. Käytä tarvittaessa käänteistä pipetointia. 3. Tee pipetointisuunnitelma ja pipetoi näytteitä ja standardeja 10 µl/kaivo (kuva 4). 4. Pipetointien jälkeen aseta kansi paikoilleen, säädä jännite aluksi 140 volttiin ja aja proteiinit peitegeelin läpi (kesto noin 10 min). Erotusajo voi alkaa kun kaikki proteiinit ovat geelien rajapinnassa. Säädä jännite tällöin 200 volttiin. Aja kohti positiivista napaa. Varmista ettei ajopuskurin nestepinta tipu eristyslevyn alapuolelle ajon aikana. Muista katkaista laitteen virta ennen ajolaitteen purkamista. 5. Lopeta ajo, kun väririntama on saavuttanut geelin alareunan (yleensä ajo kestää noin 30 min). 6. Irrota geeli lasi- ja eristelevystä varovasti esim. spaattelia ja vettä apuna käyttäen. Yläosaa ei tarvita eli sen voi poistaa. Poista jokin erotusgeelin nurkka, jotta tiedät jatkossa miten päin geelin kuuluu olla kuvattaessa. 7. Ajopuskuria voidaan käyttää maksimissaan 5 kertaa, jonka jälkeen se tulee hävittää. Muista merkitä käyttökerrat pulloon. Kuva 4 SDS-geelin pipetointi. 5

Geelin värjäys, värin poisto ja analysointi Geelin värjäysmenetelmiä on monia ja uusimpien värien kanssa on päästy nopeampaan ja turvallisempaan laboratoriotyöskentelyyn kuin aikaisemmilla. Samalla myös menetelmäherkkyys on parantunut. Uusia värjäysmenetelmiä kannattaa mahdollisuuksien mukaan käyttää. Seuraavassa on kuvattu perinteinen Coomassie-väriin perustuva värjäys kaupallisella värillä suoritettuna. 1. Irrota geeli ajolaitteistosta. Poista lasi ja eristelevy. Tämä onnistuu helpoiten juoksevan veden alla. Varo vääntämästä eristelevyjen kulmia rikki. Nämä hajoavat myös iskuista herkästi (kts. viereiset rikotut eristelevyt). 2. Pese geeli vedellä ajon jälkeen kolme kertaa, jotta geeliin ei jää SDS:ää, joka häiritsee värin tarttumista geeliin. 3. Geeli värjätään värjäysliuoksessa sekoittaen noin 15 min välillä mikroaaltouunissa lämmittäen. Varo kiehuttamasta geeliä. 4. Värin poisto: Liuota geeliä vedessä mielellään yön yli. Älä anna geelin kuivua. Alla olevassa kuvassa on geeli ennen ja jälkeen värinpoiston. 5. Analysoi geeli heti tai varastoi kosteana tuorekelmussa jääkaapissa. Merkitse tuloskuvaan pipetoinnit ja määritä näytteiden koko. Kuvassa 5 nähdään, että albumiinistandardin vieressä on monta proteiinia sisältävä näyte ja tästä seuraavan puhtaan näytteen koko on noin 60 kda. Kuvassa 6 on tulosanalysointi tehty tietokoneohjelmalla: ensin on määritetty standardit ja sen jälkeen on merkitty näytteet. Ohjelma laskee tulokset tämän jälkeen automaattisesti. Kuvissa 7 ja 8 on standardisuora tehty taulukkolaskentaohjelmalla käsin ja sen jälkeen voidaan määrittää näytekoot. 6. Geelin pitkäaikaista säilytystä varten geelin voi tyhjiöpakata. Kuva 5 SDS-geeli värinpoiston ja analysoinnin jälkeen. Kuvan geelissä on yksi standardiproteiini/kaivo. 6

Kuva 6 Geelin tulosanalysointi tietokoneohjelmalla. Yhdessä standardissa on nyt 7 eri proteiinia. Kuva 7 SDS-tuloslaskentaa taulukkolaskentaohjelmalla. SDS-page 1000000 Proteiinin koko (kda) 100000 10000 SDS-standarisuora y = 4E+06x -2,1331 R 2 = 0,9452 1000 0,0 5,0 10,0 15,0 Proteiinin kulkumatka (cm) Kuva 8 SDS-tuloslaskentaa taulukkolaskentaohjelmalla. 7

SDS-pagen herkkyys SDS-pagen yksi ongelma on ollut menetelmäherkkyys eli se kuinka pienen proteiinimäärän menetelmällä voi havaita. Perinteisillä Coomassie-väripohjaisilla värjäyksillä herkkyys on ollut suuruusluokkaa 500 ng/vyöhyke. Hopea-, kulta-, SYPRO- ja uusien Coomassie-värien avulla voidaan nyt jopa havaita proteiinipitoisuudet 1 ng/vyöhyke. Geelin paksuus vaikuttaa tähän merkittävästi. Kuvassa 9 on sama geeliajo 1,5 ja 0,75 mm paksuilla geeleillä. Menetelmäherkkyys on hyvä testata aika ajoin, jotta varmistutaan töiden toimivuus. Standardiproteiinista voi laimentaa sopivat näytteet testaamiseen (kuva 10). Herkkyysmääritykseen liittyvät esimerkkilaskut löytyvät seuraavalta sivulta. Esimerkkitulokset löytyvät kuvasta 11. Kuva 9 Sama SDS-ajo 1,5 ja 0,75 mm paksuilla geeleillä. Kuva 10 SDS-pagen herkkyysmääritykseen tarvittavien standardilaimennosten laskeminen. Kuva 11 SDS-pagen herkkyysmääritykseen esimerkkitulokset. 8

Esimerkki BSA-proteiinistandardin laimennoksesta ja pipetoinnista kaivoihin. 2000 µg / ml 114 µl H 2 O 6 µl 45 µl 56 µl 45 µl H 14 µl 6 µl 2 O H 2 O 54 µl H 2 O 100 µg / ml 50 µg / ml 10 µg / ml 1 µg / ml V = 120 µl V = 90 µl V = 70 µl V = 60 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl näytepuskuri 50 µl näytepuskuri 50 µl näytepuskuri 50 µl näytepuskuri 50 µg / ml 25 µg / ml 5 µg / ml 0,5 µg / ml V = 100 µl V = 100 µl V = 100 µl V = 100 µl Pipetointi kaivoihin 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl Proteiinimäärät 500 ng 250 ng 50 ng 5 ng Esimerkki pipetoinneista geelin kaivoihin Kaivo 1 Kaivo 2 Kaivo 3 Kaivo 4 Kaivo 5 Kaivo 6 Kaivo 7 Kaivo 8 Kaivo 9 Kaivo 10 BSA BSA BSA BSA Std 1 Näyte 1 Näyte 2 Näyte 3 Näyte 4 Std 2 5 ng 50 ng 250 ng 500 ng 9

Reagenssit Geelissä tarvittavat liuokset 1,5 M Tris-puskuri, ph 8,8 0,5 M Tris-puskuri, ph 6,8 10 % ammoniumpersulfaatti (APS) (Liuos ei säily toimintakuntoisena lämpimässä) 10 % SDS (natriumlauryylisulfaatti) Ajopuskuri, 500 ml 7,2 g glysiiniä 1,51 g Tris-Base 0,5 g natriumlauryylisulfaattia (SDS) 500 millilitraksi H 2 O:lla Näytepuskuri, 100 ml 600 mg Tris-Base 2,0 g natriumlauryylisulfaattia (SDS) 100 mg Bromofenol Blue 10 % glyseroli (laimennos alkuperäisen liuoksen pitoisuuden mukaan) 100 millilitraksi H 2 O :lla. Erotusgeeli (riittää kahteen geeliin) 6 ml akryyliamidi-bisliuosta (30 % akryyliamidia ja 0,8 % N,N -metyleenibisakryyliamidia liuotettuna veteen). 4,9 ml H 2 O 3,7 ml 1,5 M Tris-puskuri, ph 8,8 0,15 ml 10 % SDS Liuokseen lisätään 150 µl 10 % ammoniumpersulfaattia ja 15 µl TEMEDiä (neste). Sekoita kevyesti. Tämän jälkeen alkaa polymeroituminen eli geelin valun on syytä tapahtua ripeästi. Älä kaada jähmettymätöntä ylijäämägeeliainesta viemäriin. 10

Peitegeeli (riittää kahteen geeliin) 1,5 ml akryyliamidi-bisliuosta (30 % akryyliamidia ja 0,8 % N,N -metyleenibisakryyliamidia liuotettuna veteen) 2,5 ml 0,5 M Tris-puskuri, ph 6,8 5,8 ml H 2 O 0,1 ml 10 % SDS Liuokseen lisätään 100 µl 10 % ammoniumpersulfaattia ja 10 µl TEMEDiä. Sekoittamisen jälkeen alkaa polymeroituminen eli toimi taas ripeästi. Värjäysliuos Voit valmistaa värjäys- ja värinpoistoliuoksen itse internetistä löytyvien ohjeiden avulla, mutta kaupallinen väri esim. PageBlue (Fermentas) on turvallisempi ja ympäristöystävällisempi kuin perinteinen väri, koska värinpoisto tapahtuu pelkällä vedellä. Suosittelen lämpimästi käyttämään jotakin kaupallista väriä, koska myös menetelmäherkkyys on kaupallisilla väreillä huomattavasti parempi kuin itse tehdyillä. Varmista mitä väriä käytetään, koska laboratoriossa voi olla monia eri reagensseja samaan tarkoitukseen. Usein värjäysliuoksen lämmittäminen esim. mikroaaltouunissa parantaa tuloksen herkkyyttä (geeli ei kestä kiehumista). Väriä voidaan käyttää uudelleen. Merkitse käyttökerrat pulloon. Mahdollisia ongelmia ja ratkaisuja: Geeli ei jähmety. Ajopuskuri kiehuu ajon aikana. Geelillä ei näy mitään. Geelin tulos suttuinen (kuva 12). Näytteet eivät pysy geelin koloissa. Tarkista kemikaalit, erityisesti akryyliamidi ja APS. Tarkista myös liuoslaskut sekä pipettien toimivuus. Jännite liian suuri, geeli on liian tiukka, ajopuskuri virheellinen. Värjäys on epäonnistunut, väärät reagenssit. Näytteissä on liikaa proteiinia. Sähköjohdot on kytketty väärin, näytepuskurissa ongelmia, näytteissä paljon esim. etanolia. Kuva 12 Epäonnistunut SDS-page. Näytteissä on liikaa proteiinia. Seuraavaan ajoon näytteistä laimennoksia niin tulee parempi lopputulos. 11

Kysymyksiä/tehtäviä 1. Miksi näytteisiin lisätään näytepuskuria? Miksi näytteitä lämmitetään ennen ajoa? 2. Näytteesi ei etene ajossa. Missä vika? 3. Mitä tapahtuu jos ajojännite on liian suuri? 4. Miksi työvaiheet tulee tehdä vetokaapissa? 5. Haluat varmistaa näytteesi proteiinikoon (GFP, noin 30 kda). Minkälainen standardi kannattaa valita ajoon? Selvitä asia reagenssivalmistajien, esim. Invitrogen, Sigmaaldrich, Fermentas, Bio-Rad, Pierce www-sivuilta. 12