(B) (11)KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT 81452 C ( ) (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 _ G O1N 33/571, C 07K 7/04, A 61K 39/00 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 854839 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 05.12.85 SUOMI-FINLAND (24) Alkupäivä - Löpdag 04.04.85 (FI) (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 05.12.85 Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 29.06.90 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan US85/00565 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 06.04.84 US 597434 P (71) Hakija - Sökande 1. Scripps Clinic and Research Foundation, 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, Cal., USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. So, Magdalene Y.H., 1710 Somerset, Cardiff, Cal., USA, (US) 2. Deal, Carolyn D., 1592 Summit Avenue, Cardiff, Cal., USA, (US) 3. Hagblom, Per 0., 4951 New Haven Road, San Diego, Cal., USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Diagnostinen järjestelmä Neisseria gonorrhoeae-bakteerin pilusproteiinin toteamiseen Diagnostiskt system för bestämning av pilusproteinet av Neisseria gonorrhoeae-bakterie (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Chemical Abstracts vol. 98 (1983) Abstr.nro 196097c (57) Tiivistelmä - Sammandrag Tässä hakemuksessa esitetään polypeptidi, joka on pienempi kuin luonnossa esiintyvä gonokokki-bakteerin piluksen proteiini, mutta joka kykenee jäljittelemään immunologisesti pysyvää antigeenisyyden determinanttikohtaa gonokokki-bakteerin piluksen proteiinissa sen karboksipään puoleisessa vaihtelevalla alueella, sekä rokotteet, siirrosteet, immunointimenetelmät ja tällaista polypeptidiä käyttävät diagnostiset menetelmät, sekä tämän polypeptidin vaikutuksesta muodostuneet vasta-aineet. I ansökningen beskrives en polypeptid som är mindre än ett naturligt förekommande gonokockalt pilusprotein, men förmår immunologiskt efterlikna ett konserverat antigeniskt determinantläge inom ett varierande område i den karboxiterminala halvan av ett gonokockalt pilusprotein, sant vacciner, ympmedel, immuniseringsmetoder och diagnostiska prover med användning av en sådan polypeptid liksom även antikroppar alstrade medelst polypeptiden.
1 81452 Diagnostinen järjestelmä Neisseria gonorrhoeae -bakteerin pilusproteiinin toteamiseen Tämä keksintö kohdistuu polypeptidin muodossa olevien antigeenien tai immunogeenien vaikutuksesta muodostuneisiin vasta-aineisiin perustuvaan diagnostiseen järjestelmään tippurin toteamiseksi. Neisseria gonorrhoeae-bakteerin aiheuttamia tulehdustapauksia todetaan vuosittain arviolta noin kaksi miljoonaa kappaletta. Gonokokin aiheuttama tulehdus miehissä johtaa tavallisesti suhteellisen yksinkertaiseen virtsatiehyeen ja sukupuolielinten tulehdukseen. 1-3 % tippuritapauksista ovat sellaisia, että gonokokin aiheuttama infektio on levinnyt laajalle alueelle, mutta tähän tautiin sairastuminen nykyisiä hoitokeinoja sovellettaessa on vähäistä. Toisaalta tippuribakteerin infektoimissa naisissa 10-20 % tapauksista johtaa virtsaputken tulehdukseen, ja jopa asianmukaisesti hoidettunakin tämä infektio voi johtaa toistuviin virtsaputken tulehduksiin, virheraskauksiin sekä steriilisyyteen. Arvioidaan, että virtsaputken tulehduksen johdosta vuosittain Yhdysvalloissa 1,8 miljoonaa tapausta käy yksityislääkäreiden vastaanotoilla ja 220 000 ohjataan sairaalaan. Lukuisissa, tehokkaan rokotteen kehittämiseen tähtäävissä tutkimuksissa on selvitetty gonokokin pinnan komponentteja, kuten esim. lipopolysakkaridia (LPS), peptidiglykaania, ulomman kalvon proteiineja, kapseleita, IgAl-proteaasia ja värekarvoja. Edellä mainituista värekarvojen epäillään toimivan tippurirokotteen olennaisina komponentteina, ja näiden värekarvojen esitetään olevan ihmisissä immunogeenisiä ja ihmisille myrkyttömiä. Yleisesitys on löydettävissä julkaisusta Schoolnik et al., "A Pilus Peptide Vaccine For The Prevention Of Gonorrhea", Prog. Allergy 33:314-331 (1983).
2 81452 Bakteereiden värekarvat ovat bakteerin pintaan liittyviä, proteiinien kaltaisia osia, jotka edistävät bakteerin infektointikykyä helpottamalla bakteerisolun kiinnittymistä isännän epiteelikudoksiin. N. gonorrhoeae-bakteerin tapauksessa värekarvan proteiini on tärkein pinnan antigeeni. Kukin värekarva on rakenteeltaan ripsimäinen, ja muodostuu toistuvista, samanlaisista alayksiköistä (piliini), joiden kunkin molekyylipaino on noin 18 000 daltonia. N. gonorrhoeae-bakteerin värekarvoja on olemassa useita serotyyppejä; kuitenkin antigeenisesti ja immunogeenisesti erilaisten piliiniproteiinien peptidikarttaa selvittävät tutkimukset osoittavat, että niillä kaikilla on yhteinen, proteiinin aminopäässä sijaitseva alue. Toisaalta proteiinin karboksipään muodostavan alueen on todettu vaihtelevan serotyypistä toiseen. Yleiskuvaus tästä värekarvan proteiinista on löydettävissä julkaisusta Meyer et al., Cell 30:45:52 (1982). Edellä mainitussa Schoolnik'in et al. julkaisussa ehdotetaan sellaisen immunogeenisen värekarvan peptidin käyttöä, joka peptidi käsittää proteiinin aminopäässä sijaitsevan pysyvän alueen. Päinvastoin kuin edellä esitetyssä, on todettu, että N. gonorrhoeae-bakteerin piliiniproteiinin vaihteleva alue, joka sijaitsee lähellä proteiinin karboksipäätä, käsittää sekä erittäin vaihtelevia peptidiketjuja että pysyviä, antigeenisyyden determinanttikohdat määrittäviä peptidiketjuja, joita determinanttikohtia voidaan käyttää sellaisten antigeenien ja/tai immunogeenien valmistamiseen, jotka antigeenit ja/tai immunogeenit jäljittelevät näitä antigeenisyyden determinanttikohtia, ja jotka saavat aikaan vasta-aineiden tuotannon isäntänä toimivissa nisäkkäissä. Tässä keksinnössä tarkastellaan polypeptidiä, joka on pienempi kuin luonnossa esiintyvä gonokokki-bakteerin värekarvan proteiini, sekä tämän polypeptidin farmaseuttisesti
3 81452 hyväksyttäviä suoloja, jolla peptidillä ja suoloilla voidaan jäljitellä immunologisesti pysyvää antigeenisyyden determinanttikohtaa gonokokki-bakteerin värekarvan proteiinin karboksipään puoleisella vaihtelevalla alueella, ja jotka täten kykenevät toimimaan antigeeninä tai immunogeeninä gonokokin aiheuttamaa infektiota vastaan. Edelleen tässä keksinnössä tarkastellaan diagnostista koetta, jossa käytetään hyväksi tämän keksinnön mukaista polypeptidiä ja/tai reseptoria, kuten esim. tämän polypeptidin vaikutuksesta muodostunutta vasta-ainetta. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. Tämän keksinnön mukainen polypeptidi käsittää vähintään yhden aminohappojäännösten ketjun, joka muodostuu vähintään viidestä aminohappojäännöksestä ja korkeintaan noin 60 aminohappojäännöksestä, ja joka määrittää sellaisen ketjun, joka kykenee jäljittelemään immunologisesti gonokokki-bakteerin piliiniproteiinin antigeenisyyden determinanttikohtaa. Tämä aminohappojäännösten ketju voi toistua yhden tai useamman kerran samassa polypeptidimolekyylissä. Tämän keksinnön suoritusmuodon mukaisessa yhdessä polypeptidimolekyylissä voi olla läsnä enemmän kuin yhtä tyyppiä olevia toistuvia yksiköitä sekä enemmän kuin yksi samanlainen toistuva yksikkö. Tällainen proteiini voidaan valmistaa yhteensulautettuna proteiinina, joka syntetoidaan yhdistelmä-dna-tekniikan menetelmillä, tai se voidaan muodostaa erillisistä aminohappojäännöksistä tai aminohappojäännösten muodostamista kokonaisuuksista.
4 81 452 Tämän keksinnön mukaisten polypeptidien voidaan esittää olevan peptidejä, joiden sisältämien aminohappojäännösten järjestys, vasemmalta oikealle kirjoitettuna ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän, vastaa kaavaa -X 1 -X 2 -X 3 -X 4 -X 5 - jossa X 1 on sellainen aminohappojäännös, jonka sivuketju on positiivisesti varautunut, ja joka kuuluu histidiinistä (HIS), lysiinistä (LYS) ja arginiinista (ARG) muodostuvaan ryhmään, X 2 ja a X 3 voivat olla samoja tai erilaisia, ja ne ovat polaarittornia aminohappojäännöksiä ja ne kuuluvat vastaaviin, leusiinista (LEU), proliinista (PRO), tryptofaanista (TRP), fenyylialaniinista (PHE), valiinista (VAL), alaniinista (ALA) ja isoleusiinista (ILE) muodostuviin ryhmiin, ja X 4 ja X 5 voivat olla samoja tai erilaisia ja ne ovat polaarisia, mutta varauksettomia aminohappojäännöksiä, jotka kuuluvat vastaaviin, seriinistä (SER), treoniinista (THR), kysteiinistä (CYS) ja glysiinistä (GLY) muodostuviin ryhmiin. Ne suositeltavimmat aminohappojäännösten ketjut, jotka määrittävät toivotun antigeenisyyden determinanttialueen, sisältyvät seuraavien kaavojen mukaisiin ketjuihin, jotka on kirjoitettu vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän: -LYS-HIS-LEU-PRO-SER-THR-CYS-ARG-ASP-; -THR-LYS-HIS-LEU-PRO-SER-THR-CYS-ARG-ASP- LYS-ALA-SER-ASP-ALA-LYS-; ja -GLY-SER-VAL-LYS-TRP-PHE-CYS - GLY - GLN - PRO - VAL-THR-ARG-, sekä näiden ketjujen antigeenisyytensä suhteen samanlaiset muunnokset. Suositeltavia ovat myös itse vastaavat polypeptidit, toisin sanoen polypeptidit H-LYS-HIS-LEU-PRO-SER-THR-CYS-ARG-ASP-OH; LYS-ALA-SER-ASP-ALA-LYS-OH; ja H-THR-LYS-HIS-LEU-PRO-SER-THR-CYS-ARG-ASP- H-GLY-SER-VAL-LYS-TRP-PHE-CYS-GLY-GLN-PRO- VAL-THR-ARG-OH,
5 81452 niiden farmakologisesti hyväksyttävät suolat ja niiden antigeenisyytensä suhteen samanlaiset muunnokset. Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit ovat pienempiä kuin luonnossa esiintyvä gonokokki-bakteerin värekarvan proteiini (piliini), ja ne käsittävät vähintään viidestä ja korkeintaan noin 60 aminohappojäännöksestä muodostuvan aminohappojäännösten ketjun, mieluiten viidestä kahteenkymmeneen aminohappojäännöstä, joka vastaa immunologisesti pysyvää antigeenisyyden determinanttikohtaa gonokokki-bakteerin piliini-proteiinin karboksipään puoleisessa vaihtelevassa alueessa. Nämä polypeptidit ovat käyttökelpoisia sellaisenaan, tai farmaseuttisesti hyväksyttävinä suoloina, rokotteen aktiivisena komponenttina, siirrosteena tai diagnostisessa kokeessa. Ohessa käytetyllä käsitteellä "antigeenisyyden determinantti" tarkoitetaan molekyylin sellaista rakenteellista komponenttia, joka saa aikaan spesifisen reaktion vastaavien vasta-ainemolekyylien (immunoglobuliinin) kanssa, jotka vasta-aineet ovat muodostuneet tämän saman tai samankaltaisen antigeenin aiheuttamina. Antigeenisyyden determinantit oheisissa polypeptideissä käsittävät aminohappojäännöksistä muodostuneita, kemiallisesti aktiivisia pinnan ryhmittymiä. Ohessa käytetyllä käsitteellä "antigeeni" tarkoitetaan kokonaisuutta, jonka vasta-aine sitoo. Ohessa käytetyllä käsitteellä "immunogeeni" tarkoitetaan kokonaisuutta, joka indusoi isäntäeläimessä vasta-aineiden tuotannon. Joissakin tapauksissa antigeeni ja immunogeeni ovat sama kokonaisuus, kun taas joissakin tapauksissa nämä kaksi kokonaisuutta eroavat toisistaan. Ohessa käytetyllä sanonnalla "jäljittelee immunologisesti" tarkoitetaan sitä, että tämän keksinnön mukainen immunogeeninen polypeptidi ei ole luonnollinen proteiini eikä luonnollisesta proteiinista pilkottu kappale, vaan se on synteettisesti kiinteän
6 81452 faasin tekniikalla tai yhdistelmä-dna-tekniikan menetelmillä valmistettu polypeptidi, joka indusoi sellaisten vasta-aineiden tuotannon, jotka vasta-aineet sitoutuvat tähän indusoivaan polypeptidiin sekä vastaavaan piliiniin tai piliini-proteiinin johonkin polypeptidiosaan. Kaikki ohessa mainitut aminohappojäännökset ovat luonnollisessa L-konfiguraatiossa, ellei toisin mainita. Aminohappojäännöksistä käytetään ohessa seuraavia lyhenteitä, jotka ovat peptidien tavanomaisten nimitysten mukaiset: Lyhenne 1-kirjaiminen 3-kirjaiminen Aminohappo Y TYR -L-tyrosiini G GLY -glysiini F PHE -L-fenyylialaniini M MET -L-metioniini A ALA -L-alaniini S SER -L-seriini I ILE -L-isoleusiini L LEU -L-leusiini T THR -L-treoniini VAL -L-valiini P PRO -L-proliini K LYS -L-lysiini N ASN -L-asparagiini H HIS -L-histidiini Q GLN -L-glutamiini E GLU -L-glutaamihappo W TRP -L-tryptofaani R ARG -L-arginiini D ASP -L-asparatiinihappo C CYS -L-kysteiini Ohessa käytetyllä käsitteellä "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" tarkoitetaan farmaseuttisessa teollisuudessa tavallisesti käytettyjä, myrkyttömiä alkalimetallien ja maa-alkalimetallien suoloja sekä ammoniumsuoloja, kuten esimerkiksi natriumin,
7 81452 kaliumin, litiumin, kalsiumin ja magnesiumin suoloja sekä ammoniumsuoloja ja muita vastaavia, jotka valmistetaan alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä. Tämä käsite sisältää myös happojen myrkyttömät additiosuolat, joita valmistetaan tavallisesti siten, että tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden annetaan reagoida sopivan orgaanisen tai epäorgaanisen hapon kanssa. Tällaisia suoloja ovat hydrokloridi, hydrobromidi, sulfaatti, bisulfaatti, asetaatti, oksalaatti, valeraatti, oleaatti, lauraatti, boraatti, bentsoaatti, laktaatti, fosfaatti, tosylaatti, sitraatti, maleaatti, fumaraatti, sukkinaatti, tartraatti ja muut vastaavat. Edellä esitetyt ehdot täyttävät polypeptidit saavat aikaan isäntänä toimivassa nisäkkäässä vasta-aineita, ja niiden oletetaan kykenevän muodostamaan beeta-käänteisen rakenteen, joka mandollistaa sen, että tämä polypeptidi voi jäljitellä immunologisesti toivottua pysyvää antigeenisyyden determinanttikohtaa piliiniproteiinin karboksipään vaihtelevassa alueessa. Tämä polypeptidi ei mielellään ole pitempi kuin noin 60 aminohappojäännöstä, ja se sisältää kussakin määrätyssä antigeenisyyden determinanttikohdassa vähintään yhden sellaisen aminohappojäännöksen, jossa on positiivisesti varautunut sivuketju. Yksi tai useampi, edellä esitetyt edellytykset täyttävä aminohappojäännösten ketju voi olla läsnä polypeptidissä toistuvina yksikköinä. Lisäksi yhden tai useamman tällaisen aminohappojäännösten ketjun sisältävistä polypeptideistä voidaan muodostaa suhteellisesti suurempia synteettisiä kokonaisuuksia liittämällä erilliset polypeptidit päistään yhteen (yhden peptidin karboksipää toisen peptidin aminopäähän) tai liittämällä ne polypeptidien välisillä kysteiinin disulfidisidoksilla. Näiden polypeptidien voidaan esittää olevan tunnettuja siitä, että ne sisältävät aminohappojäännösten ketjuja, jotka kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän, vastaavat kaavaa 1 2 3 4 5 -X -X -X -X -X -
81 452 jossa kukin X tarkoittaa aminohappojäännöstä. Lisäksi X 1 on sellainen aminohappojäännös, jossa on positiivisesti varautunut sivuketju, kuten HIS, LYS tai ARG. X 2 ja X 3 voivat olla samoja tai erilaisia, mutta ne ovat polaarittomia aminohappojäännöksiä, jotka valitaan aminohappojäännösten LEU, PRO, TRP, PHE, VAL, ALA ja ILE muodostamasta ryhmästä. Samoin X 4 ja X 5 voivat olla samoja tai erilaisia, mutta ne ovat polaarisia, varauksettomia aminohappojäännöksiä, jotka valitaan aminohappojen SER,THR, CYS ja GLY muodostamasta ryhmästä. Edellä mainitut varaukset tarkoittavat aminohappojäännösten ionivarauksia, kun nämä jäännökset ovat vesiliuoksessa, jonka ph on 7,0. Katso esimerkiksi teos Lehninger, Short Course in Biochemistry, sivu 37, Worth Publishers, Inc., New York, New York (1973). Erityisen suositeltavia, edellä mainittuun ryhmään kuuluvia aminohappojäännösten ketjuja, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän, ovat seuraavat: -LYS-HIS-LEU-PRO-SER-THR-CYS-ARG-ASP-; -THR-LYS-HIS-LEU-PRO-SER-THR-CYS-ARG-ASP- LYS-ALA-SER-ASP-ALA-LYS-; ja -GLY-SER-VAL-LYS-TRP-PHE-CYS-GLY-GLN-PRO- VAL-THR-ARG-, joiden aminohappojäännösten ketjujen on todettu pysyvän muuttumattomina piliiniproteiinien karboksipään puoleisessa vaihtelevassa alueessa, jotka piliiniproteiinit olivat peräisin kuudesta erilaiseeta, N. gonorrhoeae-kannan MS 11 serotyypistä, kuten esitetään julkaisussa Meyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1984): 81:6110-6114, kuten myöskin näiden peptidien antigeenisyydeltään samankaltaiset muunnokset, kuten jäljempänä esitetään. Samassa polypeptidissä voi olla läsnä enemmän kuin yksi tällainen edellä esitetty aminohappojäännösten ketju, jotka tavallisesti sijaitsevat tietyllä etäisyydellä toisistaan, muunlaisten aminohappojäännösten ketjujen sijaitessa niiden välissä. Lisäksi tämä sama polypeptidi, joka sisältää yhden tai useamman edellä
9 81452 mainitun aminohappojäännösten ketjun, voi myös käsittää muita sellaisia aminohappojäännösten ketjuja jotka jäljittelevät immunologisesti gonokokki-bakteerin värekarvan proteiinissa olevaa immunoresessiivistä antigeenisyyden determinanttikohtaa. Tämän keksinnön mukaisten, suositeltavien, ja ketjujen sisäisiä (polypeptidin sisäisiä) disulfidisilmukoita sisältämättömien polypeptidien toista ryhmittymää voidaan kuvata polypeptideillä, joista kukin muodostuu ainoastaan yhdestä, edellä erityisesti määritellystä aminohappojäännösten ketjusta, toisin sanoen peptidit H-LYS-HIS-LEU-PRO-SER-THR-CYS-ARG-ASP-OH; H-THR-LYS-HIS-LEU-PRO-SER-THR-CYS-ARG-ASP- LYS-ALA-SER-ASP-ALA-LYS-OH; ja H-GLY-SER-VAL-LYS-TRP-PHE-CYS-GLY-GLN-PRO- VAL-THR-ARG-OH. Biokemialliset tulokset, jotka on saatu immunokokeista, sekä kahden proteiinin välisen pysyvän vuorovaikutuksen analogian perusteella röntgensäteillä selvitettyinä kiderakenteina, erilaisia ketjuja käyttäen, kuten esimerkiksi oligomeeristen entsyymien dimeerisissä kytkeytymisissä, osoittavat, ettei kanden proteiinin välisen tunnistamisreaktion säilyminen edellytä sitä, että ketju pysyy täydellisesti muuttumattomana ollakseen tunnistettavissa. Yhden aminohappojäännöksen muuttuminen voi vaikuttaa hyvin eri tavoilla tällaisessa tunnistamisessa, riippuen tämän substituution luonteesta, yleisesti ottaen kanden erilaisen aminohappoketjun keskinäinen samankaltaisuus proteiini-proteiinitunnistamista (ja antigeenin ja/tai immunogeenin tunnistamista) ajatellen voidaan esittää aminohappoihin liittyvän seitsemän perusparametrin avulla: (1) hydrofobisuus; (2) kehityksestä johtuvat muutokset tunnetuissa ketjuissa; (3) sivuketjun koko; (4) varaus ja polaarisuus; (5) taipumus käänteiseen sekundääriseen rakenteeseen;
10 81452 (6) taipumus beeta-juosteen sekundääriseen rakenteeseen; ja (7) taipumus kierteiseen sekundääriseen rakenteeseen. Antigeeniseen ja/tai immunogeeniseen tunnistamiseen liittyvän ketjun identtisyysasteen ja täten antigeenisesti samankaltaisten muunnosten määrittämiseen voidaan käyttää apumatriisia, jossa samankaltaisuutta selvittävän tarkastelun kohteena olevien ketjujen kullekin aminohappoparille annetaan numeerinen arvo. Tämän keksinnön tavoitteisiin voidaan käyttää seuraavaa apumatriisia, jossa yksittäiset aminohappojäännökset on esitetty yksikirjaimisina koodeina lyhyyden vuoksi: A RNDCQEGH I L R M F P S T W Y V A 7-5 -1-2 0 0-1 2-1 0 1-2 2-1 0 0 0-3 -3 1 R -5 10 0-1 -3 2-1 -5 5-4 -4 5-3 -2-3 0 0-1 -1-4 N -1. 0 6 3 1 3 0 1 3-2 -2 2-1 -3 1 4 2-3 0-2 D -2-1. 3 7-2 1 4 0 0-3 -3 0-2 -4 0 1 0-5 -2-3 C 0-3 1-2 7 1-2 1 0 0 0-2 0 0 0 3 4-2 2 0 Q 0 2 3 1 1 6 2-1 4 0 0 2 0 0 0 1 3-1 0 0 E -1-1 0 4-2 2 7-3 1-3 -2 0-1 -3-2 0 0-5 -3-3 G 2-5 1 0 1-1 -3 8-2 -3-3 -2-2 -5 2 3 1-6 -2-2 H -1 5 3 0 0 4 1-2 8-1 0 4 0 0 0 1 2 0 2-1 I 0-4 -2-3 0 0-3 -3-1 5 4-3 2 2-2 -2 0 0 0 4 L 1-4 -2-3 0 0-2 -3 0 4 6-2 4 3-1 -2 0 1 0 3-2 5 2 0-2 2 0-2 4-3 -2 8-1 -3-1 0 0-4 -2-3 M 2-3 -1-2 0 0-1 -2 0 2 4-1 6 2 0-1 0 0-1 2 y -1-2 -3-4 0 0-3 -5 0 2 3-3 2 7-2 -3 0 4 3 2 P 0-3 1 0 0 0-2 2 0-2 -1-1 0-2 7 2 1-4 -1-1 S 0 0 4 1 3 1 9 3 1-2 -2 0-1 -3 2 5 3-3 0-1 T 0 0 2 0 4 3 0 1 2 0 0 0 0 0 1 3 6-2 1 0 W -3-1 -3-5 -2-1 -5-6 0 0 1-4 0 4-4 -3-2 9 2 0 Y -3-1 0-2 2 0-3 -2 2 0 0-2 -1 3-1 0 1 2 8 0 V 1-4 -2-3 0 0-3 -2-1 4 3-3 2 2-1 -1 0 0 0 5
11 81452 Edellä esitettyä apumatriisia käyttäen tapahtuva ketjujen vertailu käsittää kaikkien mandollisten rivien määrittämisen, jonka jälkeen nämä rivit pisteytetään matriisin avulla. Tämän jälkeen kahta ketjua verrataan laskemalla suurin mandollinen yhteensopivuuden pistemäärä tästä apumatriisista. Standardipoikkeaman yksikköinä oleva vertaileva pistemäärä voidaan määrittää siten, että määritetään suurimman mandollisen yhteensopivuuden pistemäärän ja keskimääräisen, suurimman mandollisen yhteensopivuuden pistemäärän erotus näiden kanden ketjun satunnaisessa permutaatiossa, joka erotus jaetaan tämän jälkeen tämän satunnaisen pistemäärän standardipoikkeamalla. Tämän keksinnön puitteissa, apumatriisilla saatu pistemäärä, joka on suurempi kuin kolme standardipoikkeamaa (keskimääräinen arvo on suurin piirtein noin 3 jäännöstä kohden), osoittaa merkittävää samankaltaisuutta yli 99,7 % luotettavuustasolla. Tämä on rajoittava kriteeri, sillä se antaa kaikkien 5 jäännöksestä muodostuvien peptidien esiintymistiheydeksi 0,005, ja kaikkien 13 jäännöksestä muodostuvien peptidien esiintymistiheydeksi 0,0014, jotka peptidit esiintyvät 2222 tunnetussa proteiiniketjussa. Samoin, apumatriisilla saatu pistemäärä, joka on suurempi kuin kaksi standardipoikkeamaa (keskimääräinen arvo on suurin piirtein noin 2 jäännöstä kohden), osoittaa merkittävää samankaltaisuutta yli 95,4 prosentin luotettavuustasolla. Kun samankaltaisuus määritetään tämän keksinnön puitteissa, niin tällöin apumatriisin pistemäärä lasketaan varmistamalla kunkin rivillä olevan, tarkasteltavan aminohappojäännösten parin matriisiarvo, jonka jälkeen kunkin tällaisen parin yksittäiset arvot lasketaan yhteen. Sitten tätä saatua summaa verrataan standardipoikkeamien lukumäärään, jotka standardipoikkeamat ovat merkittävät toivotulle luotettavuustasolle. Mikäli saatu summa on suurempi kuin standardipoikkeamien valitun lukumäärän ja tarkasteltavien aminohappojäännösten parien lukumäärän tulo, niin tällöin verrattavat aminohappojäännösten ketjut ovat antigeenisesti samankaltaisia mainitulla luotettavuustasolla.
12 81452 Esimerkiksi, aminohappojäännösten järjestysten -LYS-TRP-PHE-CYS-GLYja -ARG-ILE-PHE-CYS-GLYantigeenisen samankaltaisuuden toteamiseksi apumatriisista saadaan seuraavat arvot -LYS- & -ARG- tai K & R -TRP- & -1LE- tai W & I -PHE- & tai F & F -CYS- & -CYS- tai C & C -GLY- & -GLY- tai G & G Arvo 5 0 7 7 8 Yhteensä 27 Antigeeninen samankaltaisuus 99,7 prosentin luotettavuustasolla edellyttää, että apumariisin pistemäärä ylittää luvun, joka saadaan, kun tarkasteltavien aminohappojäännösten parien lukumäärä kerrotaan kolmella, eli 5 x 3, tai 15. Koska todellakin pätee 27 > 15, niin toivottu antigeeninen samankaltaisuus pätee. Tämän keksinnön tavoitteita ajatellen, tämän keksinnön mukaisten polypeptidien välinen antigeeninen samankaltaisuus pätee mielellään vähintään noin 95 prosentin luotettavuustasolle saakka, ja mieluiten vähintään noin 99 prosentin luotettavuustasolle saakka. Edellä mainittujen polypeptidien, ne polypeptidit mukaan lukien, joissa on edellä määritellyn kaltaisia antigeenisesti samankaltaisia alueita, seoksia voidaan myös käyttää gonokokkibakteerin infektiota vastaan vaikuttavan rokotteen tai tällaisen infektion osoittavan diagnostisen kokeen valmistamiseen, ja/tai siirrosteena vasta-aineiden aikaansaamiseksi.
13 81452.Täten ohessa erilaisissa kieliopillisissa muodoissaan käytetyllä käsitteellä "rokote" viitataan isäntänisäkkään suojaamiseen. Ohessa erilaisissa kieliopillisissa muodoissaan käytetyllä käsitteellä "siirroste" pyritään kuvaamaan sellaista seosta, joka sisältää aktiivisena komponenttinaan tämän keksinnön mukaista polypeptidiä, ja jota käytetään gonokokki-bakteerin värekarvojen proteiiniin immunologisesti sitoutuvien vasta-aineiden valmistamiseen. Täten rokote ja siirroste voivat sisältää samat valmistusaineet, mutta niiden käyttö on erilaista. Polypeptidit, jotka tässä keksinnössä ovat sopivia antigeeneja tai immunogeeneja, tai molempia, voidaan valmistaa synteettisesti tai yhdistelmä-dna-tekniikan menetelmin, ja ne voivat olla monomeerisessa tai multimeerisissa muodoissa, kun niitä käytetään rokotteissa, siirrosteissa tai diagnostisina aineina. Kun polypeptidiä käytetään rokotteessa tai siirrosteessa, sitä voidaan käyttää yksinään, kuten oligomeerin tai multimeerin tapauksessa, tai sitä voidaan käyttää johonkin kantajakokonaisuuteen sidottuna konjugaattina. Kun tämän keksinnön mukaista polypeptidiä käytetään sellaisenaan immunogeenina, niin se sisältää tällöin tyypillisesti yhteensä noin 20-35 aminohappojäännöstä. Lyhyemmät polypeptidit kytketään mieluiten kantajaan. Erityisen käyttökelpoisia konjugaattien kantajia ovat esimerkiksi keyhole limpet-etanan hemosyaniini (KLH), tetanustoksoidi, poly-l-(lys:glu), maapähkinän agglutiniini, ovalbumiini, soijapavun agglutiniini, naudan seerumin albumiini (BSA), ihmisen seerumin albumiini, ja muut vastaavat. Ohessa käytettävät synteettiset polypeptidit kytketään mieluiten keyhole limpet-etanan hemosyaniiniin (KLH) seuraavaa hyvin tunnettua menetelmää käyttäen. KLH-kantaja aktivoidaan ensin m- maleimidobentsoyyli-n-hydroksisukkinimidin esterillä, jonka jälkeen se liitetään polypeptidiin kysteiinijäännöksen välityksellä, joka kysteiinijäännös on lisätty polypeptidin aminopäähän
14 81452 tai karboksipäähän Michael'in additioreaktiolla, kuten esitetään julkaisussa Liu et al., Biochem. 80: 690 (1979). Tämän keksinnön mukainen polypeptidi voidaan myös kytkeä kantajaan jollakin muulla tavalla, ja se voidaan kytkeä muihinkin kantajiin kuin KLH:hon, kuten edellä on mainittu. Esimerkiksi polypeptidi voidaan kytkeä tetanustoksoidin muodostamaan kantajaan vapaiden aminoryhmien välityksellä, käyttäen tunnetulla tavalla 0,04 prosenttista glutaraldehydin liuosta. Katso esimerkiksi julkaisu Klipstein et al. J. Infect. Dis. 147: 318 (1983). Synteettisen polypeptidin amino- ja karboksipäähän lisätyt kysteiinijäännökset on todettu erityisen käyttökelpoisiksi muodostettaessa konjugaatteja disulfidisidosten ja Michael'in additioreaktion tuotteiden avulla, mutta konjugaattien valmistamiseen voidaan käyttää myös muita alalla tunnettuja menetelmiä. Esimerkkeinä muista sitomis-(liittämis-) toimenpiteistä mainittakoon dialdehydien kuten glutaraldehydin (esitetty edellä) ja muiden vastaavien käyttö, tai karbodi-imiditekniikan käyttö, kuten esimerkiksi siinä tapauksessa, jossa kantajan ja polypeptidin välille muodostetaan amidisidoksia vesiliukoisen karbodi-imidin, esimerkiksi 1-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodiimidin avulla. Kuten alalla hyvin tunnetaan, synteettinen polypeptidi on usein edullista sitoa kantajaansa välittävän, liittävän ryhmän avulla. Edellä mainittu glutaraldehydi on eräs tällainen liittävä ryhmä. Kuitenkin, mikäli kysteiiniä käytetään peptidin liittämiseksi kantajaan, niin tällöin välittävä, liittävä ryhmä on mieluiten, samoin edellä mainittu, m-maleimidobentsoyyli-n-hydroksisukkinimidin esteri(mbs). MBS liitetään tyypillisesti ensin kantajaan esteri-amidi-vaihtoreaktiolla. Tämän jälkeen voi seurata edellä mainittu Michael'in reaktio, tai MBS:n liittämistä voi seurata suojatun merkaptoryhmän, kuten tiolietikkahapon (CH 3COSH) liittäminen Michael'in additioreaktiolla maleimido-kaksoissidoksen poikki. Suojaavan asyyliryhmän irrottamisen jälkeen
15 81452 disulfidisidos muodostuu suojaamattoman, liittävän merkaptaaniryhmän ja synteettiseen polypeptidiin lisätyn kysteiinijäännöksen merkaptaanin välille. Kantajan valinta riippuu enemmän tämän immunogeenisen polypeptidin lopullisesta käyttötarkoituksesta kuin immunogeenin determinanttiosasta, ja tämä kantajan valinta perustuu kriteereihin, jotka eivät erityisesti liity tähän keksintöön. Esimerkiksi mikäli siirrostetta aiotaan käyttää eläimissä, esim. kun tarkoituksena on tuottaa tätä polypeptidiä vastaan vaikuttavia vasta-aineita, joita käytetään gonokokki-bakteerin piliiniproteiinin läsnäolon testaamiseen, niin tällöin tulisi valita sellainen kantaja, joka ei tässä kyseisessä eläimessä saa aikaan haitallisia reaktioita. Ohessa käytetyllä käsitteellä "synteettisesti valmistettu" tarkoitetaan sitä, että polypeptidimolekyyli tai polypeptidin muodostama toistuva yksikkö on muodostettu synteettisesti kemiallisin keinoin, ts. se on syntetoitu kemiallisesti tai ihmisen kehittämillä biologisilla menetelmillä, esim. yhdistelmä-dna-tekniikkaa käyttäen. Täten tämän keksinnön mukaiset synteettisesti valmistetut polypeptidit eivät sisällä luonnossa esiintyviä proteiineja tai proteiinien kappaleita. Suositeltavin synteesimenetelmä, joka kuvataan jäljempänä yksityiskohtaisemmin, on hyvin tunnettu kiinteän faasin kemiallinen synteesi, jossa suojatut aminohappojäännökset lisätään toinen toisensa jälkeen toivotun polypeptidin saamiseksi. Kuten edellä esitetään, tämän keksinnön tarkoituksiin soveltuvat polypeptidit voidaan syntetoida hyvin tunnetulla kiinteän faasin
16 81 452 menetelmällä. Katso esimerkiksi julkaisut Houghten et al., Int. J. Pept. Proc. Res. 16:311-320 (1980), sekä Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963), jotka julkaisut liitetään tähän hakemukseen tällä viittauksella. Polypeptidien synteesi kiinteän faasin menetelmällä voidaan toteuttaa Beckmanyhtiön peptidisyntetisaattorilla, malli 990B, joka on kaupallisesti saatavana yhtiöstä Beckman Instruments Co., Berkeley, CA, USA. Kun tämän keksinnön mukaisia synteettisiä polypeptidejä valmistetaan edellä mainitulla kiinteän faasin menetelmällä, niin tällöin aminohappojäännökset kytketään hartsiin (kiinteä faasi) karboksipään jäännöksestään esterisidoksella. Mikäli polypeptidi on tarkoitus kiinnittää kantajaan CYS-jäännöksen välityksellä, niin tällöin on tavallista käyttää tätä CYS-jäännöstä tänä karboksipään jäännöksenä, joka sidotaan edelleen esterisidoksella hartsiin. Kunkin aminohapon alfa-aminoryhmä suojataan tyypillisesti tertiäärisellä butoksikarbonyyliryhmällä (t-boc) ennen aminohapon liittämistä kasvavaan polypeptidiketjuun. Tämän jälkeen tämä t -BOC-ryhmä poistetaan ennen seuraavan aminohapon liittämistä tähän kasvavaan polypeptidiketjuun. Samoin aminohappojen reaktiiviset sivuketjut suojataan polypeptidin synteesin aikana. Jäljellä olevien aminohappojäännöksien tavallisia, sivuketjun suojaamiseen käytettyjä ryhmiä ovat seuraavat: tyrosiinin tapauksesea 0-(p-bromibentsioksikarbonyyli), treoniinin, seriinin, asparatiinihapon ja glutaamihapon tapauksessa 0-bentsyyli, ja kysteiinin tapauksessa S-metoksi-bentsyyli. Suojatut aminohapot kiteytetään uudestaan sopivista liuottimista siten, että ohutkerroskromatografialla saadaan yksi ainoa täplä. Kytkemisreaktioiden toteuttamisessa käytetään tavallisesti sekä suojatun aminohapon että disykloheksyyli-karbodi-imidin kymmenkertaista molaarista ylimärää alkuperäisen N-päätteisen aminohapon milliekvivalenttien lukumäärään verrattuna. Molempien reagenssien kaksinkertaista molaarista ylimäärää voidaan myös käyttää.
17 81452 Asparagiinin tapauksessa suojatun aminohapon joukkoon lisätään vhtäsuuri moolimäärä N-hydroksi-bentsotriatsolia, ja liuottimina käytetään dimetyyli-formamidia. Kaikki kytkeytymisreaktiot ovat tyypillisesti yli 99-prosenttisesti täydellisiä pikriinihappokokeen perusteella katso julkaisu Gisin, Anal. Chem. Acta, 58:248-249 (1972). Osa tuloksena olevasta, suojatusta, hartsiin sidotusta polypeptidistä (1 gramma) käsitellään kandella millilitralla anisolia, ja 20 millilitraa vedetöntä vetyfluoridia tiivistetään reaktioastiaan hiilihappojään lämpötilassa. Tuloksena olevaa seosta sekoitetaan 4 C:n lämpötilassa 1,0 tunnin ajan suojaavien ryhmien irrottamiseksi, sekä polypeptidin irrottamiseksi hartsista. Sen jälkeen, kun vetyfluoridi on haihdutettu 4 C:n lämpötilassa typpivirran avulla, jäännös uutetaan vedettömällä dietyylieetterillä kolmeen kertaan anisolin poistamiseksi, ja jäännös kuivataan vakuumissa. Vakuumissa kuivattu materiaali uutetaan ensin 5-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella (3 kertaa, kulloinkin 50 millilitraa), jonka jälkeen se uutetaan 50-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella (4 kertaa 50 millilitraa). Ensimmäisellä uutolla poistetaan molekyylipainoltaan alhaiset polypeptidit sekä tyrosiini, jota käytetään joissakin valmistuksissa CYS-jäännöksen merkaptoryhmien suojaamiseen. Toinen uutto erottaa vapaan polypeptidin hartsista. Sen jälkeen kun tämä seos on laimennettu vedellä siten, että etikkahapon pitoisuus on 10-20 %, tuloksena oleva liuos lyofilisoidaan, jolloin saadaan monomeeristä, hapettumatonta polypeptidiä. Tämän polypeptidin multimeerejä voidaan valmistaa siten, että syntetoidun polypeptidin monomeerejä sidotaan peräkkäin, yhden polypeptidin aminopää seuraavan karboksipäähän ("head-to-tail") käyttäen edellä mainittua kiinteän faasin menetelmää, eli yksi täydellinen polypeptidiketju voidaan syntetoida hartsiin kiinnittyneenä, jonka jälkeen syntetoidaan yksi tai useampi
18 81452 samanlainen tai erilainen polypeptidiketju, jonka jälkeen tämä koko multimeerinen yksikkö irrotetaan hartsista ja käytetään ohessa kuvatulla tavalla. Vaihtoehtoisesti, synteettiset polypeptidin monomeerit, joiden sekä amino- että karboksipäähän on liitetty kysteiinijäännös (dicys-polypeptidit), voidaan liittää toisiinsa molekyylin sisäisillä, polypeptidien välisillä kysteiinin disulfidisidoksilla käyttäen hapetusmenetelmää, jolloin saadaan immunogeeninen polymeeri. Tämä täten valmistettu polymeeri sisältää lukuisia tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä toistuvina yksikköinään. Nämä toistuvat yksiköt ovat sitoutuneet toisiinsa edellä mainittujen hapettuneiden kysteiinijäännösten välityksellä. Tämän keksinnön mukaisen polypeptidin päähän tai päihin liitetyn, yhden tai kanden CYS-jäännöksen läsnäoloa, joka mandollistaa tämän polypeptidin sitomisen kantajaan, tai polymeerin valmistamisen, ei pidä tulkita aminohappoketjun muuttumisena polypeptidistä muodostuvissa toistuvissa yksiköissä verrattuna siihen ketjuun, joka jäljittelee immunologisesti gonokokki-bakteerin piliiniproteiinin antigeenisyyden determinanttikohtaa. Tyypillisessä laboratoriossa suoritetussa valmistuksessa 10 milligrammaa dicys-polypeptidiä (jonka amino- ja karboksipäässä on hapettumaton kysteiinijäännös) liuotetaan 250 millilitraan 0,1-molaarista ammoniumbikarbonaattipuskuria, jonka ph-arvo on noin 8. Tämän jälkeen liuennut dicys-polypeptidi hapetetaan ilman avulla sekoittamalla tuloksena olevaa liuosta varovaisesti noin 18 tunnin ajan, tai niin kauan, ettei Ellman'in kokeella voida enää todeta vapaita merkaptoryhmiä. /katso julkaisu Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77 (1959)7. Tämän jälkeen täten valmistettu polymeeri eristetään tyypillisesti pakastekuivaamalla, uudestaan liuottamalla, ja kromatografisesti puhdistamalla. Tyypillisiä menetelmiä, joita voidaan käyttää yhteensulatettujen proteiinien valmistamiseksi yhdistelmä-dna-tekniikkaa käyttäen, on kuvattu julkaisuissa Berman, BioTechniques 1(4):178-183 (1983), Silhavy et al., Microbiological Reviews 47(3):313-344
19 81452 (1983), sekä Young et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 80:1194-1198 (1984). Tämän keksinnön mukaiset siirrosteet käsittävät yhtä tai useampaa edellä kuvattua polypeptidiä sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää laimenninta, esim. fysiologista suolaliuosta, fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS) tai jotakin muuta injektoitavaa nestettä. Haluttaessa niissä voi samoin olla läsnä lisäaineita, joita tavallisesti käytetään siirrosteissa. Esimerkkeinä tällaisista lisäaineista mainittakoon stabilisaattorit, kuten laktoosi tai sorbitoli, ja apuaineet, kuten alumiinihydroksidi, sulfaatti tai fosfaatti, aluna tai alginaatti. Täydellistä Freund'in apuainetta (CFA) ja epätäydellistä Freund'in apuainetta käytetään mielellään siirrosteissa.
20 81452 Siirroste sisältää tätä immunogeeniä "tehokkaan määrän", joka tehokas määrä riippuu useista, immunologiassa hyvin tunnetuista tekijöistä, kuten immunoitavan nisäkkään ruumiin painosta, käytetystä kantajakokonaisuudesta, käytetystä apuaineesta, tavoiteltavan suojan kestoajasta, sekä immunointiin käytettävästä toivotusta aikataulusta. Tämän keksinnön mukaisen polypeptidin vaikutuksesta muodostuneet kokonaiset vasta-aineet sekä olennaisesti kokonaiset vasta-aineet, sekä tällaisista vasta-aineista saatavat vasta-aineen sitoutumiskohdat muodostavat lisäksi tämän keksinnön erään muun piirteen. Näitä molekyylejä kutsutaan yhteisellä nimellä "reseptori". Reseptoreita voidaan muodostaa nisäkkäissä, kuten kaniineissa, vuohissa, hevosissa ja muissa vastaavissa, immunoimalla ne edellä kuvatuilla siirrosteilla. Immunoinnissa käytettävät menetelmät ovat olennaisesti samat kuin rokotuksissa käytetyt menetelmät, paitsi että eläimille annettavissa siirrosteissa voidaan käyttää voimakkaita apuaineita, kuten CFA:ta ja/tai IFA:ta, jotka eivät ole hyväksyttäviä ihmisessä käytettäviksi. Tyypilliset siirrosteen varastoliuokset valmistetaan CFA:ta, IFA:ta tai alumaa käyttäen seuraavasti: polypeptidiä, synteettisen polypeptidin konjugaattia tai polymeeristä polypeptidiä liuotetaan PBS:ään, jonka ph-arvo on 7,2, sellainen määrä, jolla siirrosteeseen saadaan toivottu, tehokas määrä polypeptidiä. Tämän jälkeen tähän polypeptidiliuokseen sekoitetaan yhtäsuuri tilavuus CFA:ta tai IFA:ta, jolloin saadaan aikaan siirroste, joka sisältää polypeptidiä, vettä ja apuainetta, ja jossa veden ja öljyn välinen suhde on noin 1:1. Sitten tämä seos homogenoidaan, jolloin saadaan siirrosteen varastoliuos. Käytettäessä alumaa noin 200 mikrogrammaa konjugaattia absorboidaan noin 4 milligrammaan alumaa, jolloin saadaan aikaan siirrosteen varastoseos. Kaniineja voidaan käyttää näitä polypeptidejä vastaan vaikuttavien vasta-aineiden tuottamiseen. Kaniineja käytettäessä
21 81452 isäntäkaniiniin injektoidaan tavallisesti ihon alaisesti siirrostetta, joka käsittää 200 mikrogrammaa CFA:han emulgoitua polypeptidin konjugaattia (polypeptidi plus kantaja); 200 mikrogrammaa IFA:ssa olevaa polypeptidin konjugaattia; ja 200 mikrogramaa polypeptidin konjugaattia yhdessä 4 milligramman alumaa kanssa injektoidaan vatsaontelon sisäisesti immunointiaikataulun 0., 14. ja 21.vuorokautena, vastaavasti. Kukin siirrostus (immunointi) muodostuu neljästä siirrosteen injektoinnista. Hiiret voidaan immunoida samalla tavalla käyttäen kussakin injektoinnissa yhtä kymmenesosaa edellä esitetyistä annoksista. Eläimistä otetaan verta talteen tyypillisesti 4 ja 15 viikon kuluttua ensimmäisestä injektiosta. Vertailuna toimivaa, immunointia edeltävää seerumia saadaan kustakin eläimestä ottamalla niistä verta talteen välittömästi ennen ensimmäistä immunointia. Vertailuna toimivia, siirrosteen varastoliuoksia voidaan valmistaa myös käyttäen keyhole limpet-etanan hemosyaniinia (KLH), CFA:ssa tai IFA:ssa olevaa KLH:ta, alumaan absorboitua KLH:ta, alumaan absorboitua KLH:ta ja hinkuyskän toksiinia, edestiiniä, tyroglobuliinia, tetanustoksoidia, tetanustoksoidia IFA:ssa, koleratoksoidia sekä koleratoksoidia IFA:ssa, ja muita vastaavia. Edellä esitetyn immunointimenetelmän tehokkuus määritetään tyypillisesti ELISA-kokeella, jossa tämän keksinnön mukaista immunogeenista polypeptidiä käytetään antigeenina, jolla määritetään edellä mainituista verinäytteistä saadussa laimennetussa seerumissa läsnäolevien vasta-aineiden määrä. Niitä seerumeita, joilla saadaan aikaan suuruudeltaan vähintään noin 1:160 olevia anti-polypeptidisiä vasta-ainetiittereitä (laimennoksia), pidetään käyttökelpoisina tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden tuotannossa. Tyypillisesti käytetty ELISA-koe on kuvattu yksityiskohtaisemmin julkaisussa Bittle et al., Nature 298: 30-33 (1982), joka liitetään tähän hakemukseen tällä viittauksella.
22 81452 Sopivia monoklonaalisia reseptoreita, tyypillisesti kokonaisia vasta-aineita, voidaan valmistaa myös hybridomitekniikkaa käyttäen, kuten esitetään julkaisussa Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:4949-4953 (1983), joka esitys liitetään tähän hakemukseen tällä viittauksella. Ei ole välttämätöntä, että monoklonaaliset reseptorit on saatu hybridomin supernatantista, vaan niitä voidaan myös saada, tavallisesti suurempina määrinä, nisäkkäiden vatsaan keräytyneestä seerumiperäisestä nesteestä, joihin nisäkkäisiin tämä toivottu hybridomi istutettiin. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen vatsaan kerääntynyttä nestettä käyttäen on hyvin tunnettua, eikä sitä käsitellä ohessa tämän enempää. Tämän keksinnön mukainen reseptori sitoutuu sekä siihen polypeptidiin, joka sai aikaan reseptorin muodostumisen, että myöskin vastaavaan piliiniproteiiniin, jonka antigeenisyyden determinanttikohtaa tämän keksinnön mukainen polypeptidi jäljittelee immunologisesti. Täten tämän keksinnön mukainen polypeptidi voi olla sekä immunogeeni että antigeeni. Tämän keksinnön mukaiset reseptorit ovat vähintään oligoklonaalisia luonnossa esiintyviin polyklonaalisiin vasta-aineisiin verrattuna, koska ne ovat muodostuneet sellaisen immunogeenin vaikutuksesta, jossa immunogeenissa on suhteellisen vähän epitooppeja täydellisen piliinimolekyylin epitooppeihin verrattuna. Näin ollen tämän keksinnön mukaiset reseptorit sitoutuvat polypeptidin epitooppeihin, kun taas luonnossa esiintyvät, gonokokin piliiniproteiinin vaikutuksesta muodostuneet vastaaineet sitoutuvat kaikkiin, piliinimolekyylin epitooppeihin. Tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä, sekä näiden polypeptidien avulla saatuja vasta-aineita ja vasta-aineen sitoutumiskohtia, sekä tämän keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan myös käyttää diagnostisina kokeina, kuten esimerkiksi immunokokeina. Tällaisia diagnostisia menetelmiä ovat esimerkiksi entsymaattiset immuunikokeet, entsymaattiset kerrannaiset immunokokeen menetelmät (EMIT), entsyymiin sidotun immunosorbentin koe
23 81452 (ELISA), radio-immuunikokeet (RAI), fluorosenssiin perustuvat immuunikokeet, joko yksin- tai kaksinkertaisen vasta-aineen menetelmät, ja muut sellaiset tekniikat, joissa joko vastaaineen sitoutumiskohta tai antigeeni on merkitty jollakin ilmaistavissa olevalla aineella tai ryhmällä. Yleinen esitys on löydettävissä julkaisuista Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, Ohio (1981), sekä Goldman, M., Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, N.Y. (1980). Tätä keksintöä havainnollistava diagnostinen järjestelmä N. gonorrhoeae-bakteerin toteamiseksi käsittää reseptorimolekyylejä, jotka on saatu muodostumaan tämän keksinnön mukaisen polypeptidin vaikutuksesta, kuten vasta-aineita, olennaisesti kokonaisia vasta-aineita tai vasta-aineen sitoutumiskohtia. Tämä järjestelmä käsittää samoin indikaattorin, joka osoittaa reseptorin ja antigeenin välisen immunoreaktion tapahtumisen. Immunoreaktio voidaan ilmaista tämän indikaattorin avulla. Kun reseptorimolekyyleihin sekoitetaan ruumiinnäytettä, esimerkiksi kohdunkaulasta tai virtsatiehyeestä-sukupuolielimistä saatua tahnaa, niin nämä reseptorimolekyylit immunoreagoivat piliiniantigeenin kanssa, jolloin muodostuu immunoreaktion tuote, ja läsnäoleva indikaattori viestittää tällöin immunoreaktion tapahtumisen. Eräs tällainen havainnollistava suoritusmuoto on immunofluoresenssikoe, jossa kohdunkaulasta tai virtsatiehyeestä-sukupuolielimistä saatu tahna kiinnitetään asetonilla tavalliselle mikroskooppilevylle. Tämän keksinnön mukaisesti aikaansaatujen vasta-aineiden, jotka on muodostettu esimerkiksi kaniineissa, näytteitä, tavallisesti noin 10 mikrogrammasta noin 500 mikrogrammaan, inkuboidaan näillä levyillä tunnettuja menetelmiä käyttäen. Sen jälkeen, kun kaikki immunoreagoimattomat vasta-aineet on huuhdottu pois ja kun levyllä olevat epäspesifiset sitoutumiskohdat on suojattu proteiinilla, esimerkiksi BSA:lla, niin toista
24 81452 vasta-ainetta, kuten vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta voidaan sitten toivottaessa inkuboida tällä koelevyllä. Tämä toinen vasta-aine on merkitty merkkiaineella siten, että se on liitetty fluorokromaattiseen väriin, kuten esimerkiksi fluoreseiini-isotiosyanaattiin (FITC). Tämän toisen inkuboinnin jälkeen ylimääräinen osa toisesta vastaaineesta huuhdotaan pois, jolloin koelevylle jäävät ensimmäiseen vasta-aineeseen sitoutuneet, FITC:llä merkityt, vuohen antikaniini-vasta-aineet. FITC:llä merkittyjen vasta-aineiden läsnäolo voidaan todeta fluoresoivalla mikroskoopilla, jolloin N. gonorrhoeae-infektion läsnäolo saadaan osoitetuksi. Reseptorimolekyylejä vastaavien, kokonaisten, vahingoittumattomien, biologisesti aktiivisten vasta-aineiden käyttäminen ei ole välttämätöntä useissa diagnostisissa järjestelmissä, kuten esimerkiksi edellä kuvatussa immunofluoresenssikokeessa. Näissä kokeissa voidaan käyttää ainoastaan vasta-ainemolekyylissä olevaa, immunologisesti aktiivista, idiotyypin sisältävää, antigeeniin sitoutuvaa ja tunnistavaa reseptorikohtaa, eli vasta-aineen sitoutumiskohtaa. Esimerkkinä tällaisista vasta-aineen sitoutumiskohdista mainittakoon alalla Fab- ja F(abfl 2-1yhenteillä tunnetut vasta-aineen osat, jotka voidaan valmistaa alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä. Toinen tämän keksinnön mukainen diagnostinen menetelmä on ELISA-koe. Tässä kokeessa tämän keksinnön mukainen, polypeptidin muodostama antigeeni sidotaan kiinteään kantajaan, kuten esimerkiksi mikrotiitterilevyn koloihin. Tämän jälkeen mikrotiitterilevyn kolojen seinämillä olevat epäspesifisen sitoutumisen kohdat suojataan proteiinilla, kuten BSA:lla. Sitoutumaton polypeptidi ja BSA poistetaan mikrotiitterilevyn koloista huuhtomalla. Esimerkiksi edellä mainitun kaltainen ruumiin näyte sekoitetaan tämän keksinnön mukaisen vasta-aineen vesiliuoksena olevaan ylimäärään, ja tätä seosta seisotetaan niin kauan, että immuno-
25 81452 reaktio vasta-aineen ja läsnäolevan, gonokokin piliiniantigeenin välillä ehtii tapahtua. Tämän jälkeen tämä nestemäinen seos kaadetaan edellä kuvatun, kiinteään kantajaan sitoutuneen polypeptidin päälle, jolloin muodostuu toinen seos, joka käsittää kiinteän ja nestemäisen faasin. Tätä kiinteän ja nestemäisen faasin seosta seisotetaan niin kauan, että aikaisemmassa vaiheessa reagoimatta jääneet vasta-aineet ehtivät immunoreagoida polypeptidin muodostaman antigeenin kanssa. Sitten nestefaasi erotetaan kiinteästä faasista. Tämän jälkeen tähän kiinteään faasiin sekoitetaan liuos, joka sisältää toista, merkkiaineella merkittyä, ensin mainitun vastaaineen kanssa reagoivaa vasta-ainetta. Esimerkkinä tällaisesta toisesta vasta-aineesta mainittakoon peroksidaasiin kytketty vuohen anti-kaniini-vasta-aine, jolloin ensin mainitut vastaaineet on saatu muodostetuiksi kaniineissa. Kiinteän faasin ja tämän toisen, merkityn vasta-aineen liuoksen muodostamaa seosta seisotetaan niin kauan, että näiden kanden vasta-aineen välillä ehtii tapahtua immunoreaktio. Tämän jälkeen kiinteä ja nestemäinen faasi erotetaan. Sitten tähän kiinteään faasiin sekoitetaan liuos, joka sisältää mainitun entsyymin substraattia, kuten vetyperoksidia, sekä värin muodostavan väriaineen esiastetta, kuten o-fenyleenidiamiinia. Näytteen optinen tiheys voidaan määrittää edeltäkäsin valitulla aallonpituudella (esimerkiksi 405 nanometriä) edeltäkäsin määrätyn pituisen ajanjakson kuluttua, ja tätä optista tiheyttä verrataan vertailun optiseen tiheyteen, jolloin saadaan selvitetyksi se, oliko ruumiinnäytteessä läsnä gonokokista peräisin olevaa antigeeniä vai ei. Tätä keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavien yksityiskohtaisten esimerkkien avulla.
26 81452 Esimerkki 1 Polypeptidien synteesi Sarja lyhyitä synteettisiä polypeptidejä, joiden aminohappojäännösten järjestys vastaa gonokokin piliiniproteiinin pieniä osia, syntetoitiin julkaisussa Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) esitetyn menetelmän muunnoksella, joka on esitetty julkaisussa Houghten et al., Int. J. Pept. Proc. Res., 16:311-320 (1980), käyttäen Beckman-yhtiön peptidisyntetisaattoria, malli 990B (Beckman Instruments Co., CA, USA). Polypeptidin kuvaus, sekä niiden vastaavien aminohappojäännösten ketjujen sijainti gonokokin värekarvan proteiinissa on esitetty alla olevassa taulukossa I. Taulukko I Synteettiset polypeptidit, jotka vastaavat osia gonokokkibakteerin piliiniproteiinissa Kuvaus Sijainti 2 Aminohappojäännösten ketju 44 1 140-159 KEIDTKHLPSTCRDKASDA GC4 1 145-153 KHLPSTCRD GC5 1 144-159 TKHLPSTCRDKASDAK GC6 1 115-127 GSVKWFCGQPVTR 1 Polypeptidit on kytketty tetanustoksoidiin käyttäen esimerkissä 2 kuvattua glutaraldehydimenetelmää. Sijainti vastaa aminohappojäännösten asemia gonokokki-bakteerin piliiniproteiinin ketjussa, joka on kuvattu julkaisussa Meyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1984) 81:6110-6114. Esimerkki 2 Polypeptidin kytkeminen kantajaan Polypeptidin konjugoiminen tetanustoksoidin muodostamaan kantajaan glutaraldehydimenetelmää käyttäen toteutettiin siten, että yhtäsuuret määrät peptidiä ja tetanustoksoidia sekoitettiin PBS:ään lopulliseksi pitoisuudeksi 2 mg/ml. Mikäli jonkin peptidin liuottamisessa todettiin vaikeuksia, niin tällöin saadun seoksen ph kohotettiin suurin piirtein arvoon 8,0.
27 81452 Glutaraldehydistä valmistettiin ennen kutakin kytkentäreaktiota uusi käyttölaimennos siten, että 25-prosenttinen glutaraldehydin varastoliuos (w/v PBS:ssä) laimennettiin 1:65 jääkylmällä PBS:llä. Tämän jälkeen tämä uusi glutaraldehydin liuos lisättiin edellä valmistettuun, peptidin ja kantajan sisältävään liuokseen suhteessa 124 mikrolitraa 1 millilitraan, vastaavasti. Tuloksena olevaa reaktioseosta inkuboitiin sekoittaen yön yli huoneen lämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen reaktiotuotetta dialysoitiin vähintään 6 tunnin ajan tislattua vettä vastaan, jonka jälkeen tuote lyofilisoitiin. Esimerkki 3 Anti-polypeptidisten vasta-aineiden seulonta kaniinien seerumeista Kaniinien antiseerumeista määritettiin anti-polypeptidisten vasta-aineiden läsnäolo entsyymiin sidotun immunosorbentin koetta (ELISA) käyttäen. Edellä olevassa esimerkissä 1 kuvatulla tavalla valmistettu polypeptidin muodostama antigeeni adsorboitiin mikrotiitterilevyn kolojen seinämiin, jolloin saatiin kiinteän faasiin sidottu kohdeantigeeni. Kiinteään faasiin sidotun polypeptidin valmistamiseksi 25 / ul 0,1 % (w/v) BSA/PBS-seosta, joka sisälsi noin 5 pikomoolia polypeptidiä, laitettiin mikrotiitterilevyn koloon ja inkuboitiin 37 C:ssa, kunnes neste oli haihtunut täydellisesti. Täten kerrostettu polypeptidin muodostama antigeeni kiinnitettiin tähän kiinteään faasiin inkuboimalla kussakin kolossa 50 /ul metanolia 5 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen metanoli poistettiin kääntämällä levy ylösalaisin ja ravistelemalla sitä, ja antamalla levyjen kuivua ilmassa 5-10 minuutin ajan. Tämän jälkeen mikrotiitterilevyn kolojen seinämillä olevat epäspesifisen sitoutumisen kohdat suojattiin inkuboimalla kussakin kolossa 50 / ul 3 % (w/v) BSA/PBS-seosta 4 tunnin ajan 37 C:n lämpötilassa kosteassa kammiossa. Inkuboinnin jälkeen
28 81452 ylimääräinen BSA poistettiin kääntämällä ja ravistelemalla levyjä. Täten saatiin kiinteään kantajaan, jonka epäspesifisen sitoutumisen kohdat oli suojattu, sidottu polypeptidi, jota voitiin käyttää kohdeantigeenina. Anti-polypeptidisten vasta-aineiden läsnäolon määrittämiseksi kaniinien seerumeista, kustakin seerumista saadusta näytteestä valmistettiin laimennossarja laimentamalla näyte kulloinkin kaksinkertaiseksi 1 % (w/v) BSA/PBS-liuoksella. 25 mikrolitraa kutakin laimennosta saatettiin kosketuksiin kiinteään faasiin sidotun polypeptidin kanssa sekoittamalla tämä 25 mikrolitraa asianmukaiseen, edellä valmistettuun mikrotiitterilevyn koloon. Tätä kosketusta pidettiin yllä inkuboimalla näitä koloja noin 16 tunnin ajan 37 C:n lämpötilassa kostutetussa kammiossa, jolloin kaikki seerumilaimennoksissa läsnäolevat anti-polypeptidiset vasta-aineet voivat immunoreagoida kiinteään faasiin sidotun polypeptidin muodostaman kohdeantigeenin kanssa. Inkuboinnin jälkeen kiinteä ja nestemäinen faasi erotettiin täyttämällä kolot tislatulla vedellä, kääntämällä kolot ja ravistamalla niitä 10 kertaa peräkkäin. Anti-polypeptidisten vasta-aineiden ja kiinteään faasiin sidotun antigeenin välisen immunoreaktion läsnäolon toteamiseksi 25 / ul indikaattorina toimivalla peroksidaasilla (Boehringer Mannheim Biochemicals; Indianapolis, Indiana) merkittyä vuohen antikaniini IgG:tä sekoitettiin kuhunkin koloon. Sen jälkeen, kun koloja oli inkuboitu 1,5 tuntia 37 0 C:n lämpötilassa kostutetussa kammiossa, ne pestiin 10 kertaan tislatulla vedellä, kuten edellä kuvataan. Tämän jälkeen kuhunkin koloon sekoitettiin 50 mikrolitraa kehitinliuosta /55 mg ABTS:ia (2,2'-atsino-di-(3-etyylibentstiatsoliinisulfonaatti); Boehringer Mannheim7 ja 100 / ul 30 % vetyperoksidia H 2 0 2, joka oli liuotettu 100 millilitraan 0,1 M natriumsitraattia (ph 4,2), ja kutakin koloa inkuboitiin noin 40-60 minuuttia huoneen lämpötilassa. Indikaattorin reaktio pysäytettiin sekoittamalla kuhunkin koloon 50 / u1 5 % (w/v) natriumdodekyylisulfaattia (SDS) vedessä. Indikaattorireaktion suuruus (värin kehittyminen) määritettiin mittaamalla kunkin kolon absorbanssi aallonpituudella 414 nm.