E. colin auksotrofiset mutantit Mutantit MCB 261 -; CELL 267 Mutaatio tapahtuu DNA:ssa, mutta vaikutus näkyy tai tuntuu vasta jos proteiini muuttuu oleellisesti Auksotrofinen mutantti tarkoittaa sellaista mutaatiota, jolla joku tietty synteesiketju on katkennut Villityyppi eli prototrofi osaa tehdä ainetta (esimerkiksi aminohappoa), Auksotrofi elää ja jakautuu, jos saa aminohapon (tms) valmiina ulkoa moniste sivu 35
replikaatio ja repair virheellinen polypeptidi Genetiikan perusteiden luentojen miellekartta
MCB 267
Neurospora crassan (leipähome) arginiiniauksotrofeja Arginiini on aminohappo, jonka biosynteesi tässä on dissekoitu eli leikelty MCB 265; CELL 132-133
trypsiinillä hajoitettua kaseiinia Lurian brood (LB) M9 minimialusta lyysattua hiivaa moniste sivu 12-13
E. colin mutagenisointi UV-säteilyllä (MCB 478) - UV aiheuttaa pyrimidiinidimeerejä (TT tai CC: CELL 269) - usein korjataan (UvrABC - excision repair system MCB 479, CELL 270). - voi aiheuttaa double strand breakin, joka korjattuna johtaa jonkun tai usean nukleotidin puutokseen ja siis frameshiftiin yms (MCB 480, CELL 273) Ensimmäinen viikko Mutanttien rikastus ampisilliiniselektiolla - ampisilliiniresistenssigeeni koodaa β-laktamaasientsyymin (CELL 286) - sitä käytetään usein kloonausvektorissa merkkinä (MCB 209-) - nyt ampisilliinia käytetään tappamaan minimialustalla jakautuvat solut - monisteessa penisilliini ja ampisilliini sekoittuvat, ei haittaa, saman ne tekevät Auksotrofisten mutanttien eristäminen - replica plating: pesäkkeet kasvavat LA /eivät kasva M9 alustalla
E. colin mutagenisointi UV-säteilyllä (MCB 478) - UV aiheuttaa tymiinidimeerejä (CELL 269) - usein korjataan (UvrABC - excision repair system MCB 479, CELL 270). - voi aiheuttaa double strand breakin, joka korjattuna johtaa jonkun tai usean nukleotidin puutokseen ja siis frameshiftiin yms (MCB 480, CELL 273) Kolmas Mutanttien rikastus ampisilliiniselektiolla - ampisilliiniresistenssigeeni koodaa β-laktamaasientsyymin (CELL 286) - sitä käytetään usein kloonausvektorissa merkkinä (MCB 209-) - nyt ampisilliinia käytetään tappamaan minimialustalla jakautuvat solut - monisteessa penisilliini ja ampisilliini sekoittuvat, ei haittaa, saman ne tekevät viikko Auksotrofisten mutanttien eristäminen - replica plating: pesäkkeet kasvavat LA /eivät kasva M9 alustalla
Ensimmäinen viikko
- Kasvata runsaasti E. coli -soluja (ONC = overnight culture) - Säteilytä UV:lla 0, 1, 2, 5, 10, 15, 30 minuuttia - Suojaa maljat alumiinifoliolla, jotta fotoreaktivaatio ei korjaisi syntyneitä virheitä (MCB 479, ) - Varo UV:ta tarkasti: emme me opiskelijoihin halua mutaatioita (aniharvinainen) eikä silmätulehdusta (yleinen: lumisokeus), eikä palanutta ihoa (arkipäiväinen UV:n seuraus) - Edelleen pimeässä: solut kootaan talteen, tiheys määritetään maljaamalla - Pidetään soluja M9 alustalla koko viikko, viileässä (koska ei ehditä tehdä enempää)
Toinen viikko
E. colin mutagenisointi UV-säteilyllä (MCB 478) - UV aiheuttaa tymiinidimeerejä (CELL 269) - usein korjataan (UvrABC - excision repair system MCB 479, CELL 270). KORJAUSMEKANISMIT - voi aiheuttaa double strand breakin, joka korjattuna johtaa jonkun tai Toinen viikko usean nukleotidin puutokseen ja siis frameshiftiin yms (MCB 480, CELL 273) Mutanttien rikastus ampisilliiniselektiolla - ampisilliiniresistenssigeeni koodaa β-laktamaasientsyymin (CELL 286) - sitä käytetään usein kloonausvektorissa merkkinä (MCB 209-) - nyt ampisilliinia käytetään tappamaan minimialustalla jakautuvat solut - monisteessa penisilliini ja ampisilliini sekoittuvat, ei haittaa, saman ne tekevät Auksotrofisten mutanttien eristäminen - replica plating: pesäkkeet kasvavat LA /eivät kasva M9 alustalla
Kolmas viikko
1/100 1/100 1/100
pohjoisnuoli Kopio M9 -maljalla Kopio LA-maljalla Potentiaaliset auksotrofit löydetään vertaamalla replika-maljoja ja testataan viivatestillä (eli sohimalla uusille M9- ja LA-maljoille
Laskemisessa käytetään apulaitteena huopakynää ja mumistaan numerot!
Jaana Liimatainen 1996